KR100780255B1 - 히스타민 분비능이 있는 결실형 ＩｇＥ-의존적 히스타민방출인자, ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents
히스타민 분비능이 있는 결실형 ＩｇＥ-의존적 히스타민방출인자, ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100780255B1 KR100780255B1 KR1020060007663A KR20060007663A KR100780255B1 KR 100780255 B1 KR100780255 B1 KR 100780255B1 KR 1020060007663 A KR1020060007663 A KR 1020060007663A KR 20060007663 A KR20060007663 A KR 20060007663A KR 100780255 B1 KR100780255 B1 KR 100780255B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- hrf
- del
- seq
- deleted
- ige
- Prior art date
Links
- 102100029887 Translationally-controlled tumor protein Human genes 0.000 title claims abstract description 330
- 101710175870 Translationally-controlled tumor protein homolog Proteins 0.000 title claims abstract description 295
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 106
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 55
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims abstract description 48
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 101000653679 Homo sapiens Translationally-controlled tumor protein Proteins 0.000 title claims description 37
- 101000800524 Loxosceles intermedia Translationally-controlled tumor protein homolog Proteins 0.000 title claims description 37
- 101000851936 Mus musculus Endothelial PAS domain-containing protein 1 Proteins 0.000 title claims description 37
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 title claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 78
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 42
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims abstract description 34
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims abstract description 32
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 21
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 14
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(C)N1C(=O)C=CC1=O RVRLFABOQXZUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 238000002005 protein protein interaction detection Methods 0.000 claims description 5
- 238000002762 protein-protein interaction assay Methods 0.000 claims description 5
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SGVWDRVQIYUSRA-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethyldisulfanyl]ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCSSCCN1C(=O)C=CC1=O SGVWDRVQIYUSRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 4
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 claims description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 claims description 3
- LTDQGCFMTVHZKP-UHFFFAOYSA-N (4-bromophenyl)-(4,6-dimethoxy-3-methyl-1-benzofuran-2-yl)methanone Chemical compound O1C2=CC(OC)=CC(OC)=C2C(C)=C1C(=O)C1=CC=C(Br)C=C1 LTDQGCFMTVHZKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FERLGYOHRKHQJP-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)ethoxy]ethoxy]ethyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCOCCOCCN1C(=O)C=CC1=O FERLGYOHRKHQJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AXWOZJRNFLVYIB-UHFFFAOYSA-N 1-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butan-2-yl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1(C=CC(N1C(C(C)N1C(C=CC1=O)=O)C)=O)=O AXWOZJRNFLVYIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- VNJBTKQBKFMEHH-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-2,3-dihydroxybutyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CC(O)C(O)CN1C(=O)C=CC1=O VNJBTKQBKFMEHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WXXSHAKLDCERGU-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1CCCCN1C(=O)C=CC1=O WXXSHAKLDCERGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)-n-[4-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]butyl]propanamide Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSCCC(=O)NCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JMUAKWNHKQBPGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 claims description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001273 butane Substances 0.000 claims description 2
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 claims 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 17
- 239000013566 allergen Substances 0.000 abstract description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 15
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 3
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 150000007650 D alpha amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004866 Microtubule-associated protein 1B Human genes 0.000 description 2
- 108090001040 Microtubule-associated protein 1B Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960004191 artemisinin Drugs 0.000 description 2
- BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N artemisinin Chemical compound C([C@](OO1)(C)O2)C[C@H]3[C@H](C)CC[C@@H]4[C@@]31[C@@H]2OC(=O)[C@@H]4C BLUAFEHZUWYNDE-NNWCWBAJSA-N 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010381 tandem affinity purification Methods 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJMGRJLQRLFQQX-HYXAFXHYSA-N 2-isopropylmaleic acid Chemical compound CC(C)C(\C(O)=O)=C\C(O)=O NJMGRJLQRLFQQX-HYXAFXHYSA-N 0.000 description 1
- WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylethanol Chemical compound OCCS.OCCS WAPPRYMYMNVAFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039636 3-isopropylmalate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100022969 HMG box transcription factor BBX Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100024594 Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Human genes 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101000903732 Homo sapiens HMG box transcription factor BBX Proteins 0.000 description 1
- 101000686942 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase PRDM16 Proteins 0.000 description 1
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000030882 L-Aminoadipate-Semialdehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010016900 L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015930 Lon proteases Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100027330 Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710157927 Translationally-controlled tumor protein Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930101531 artemisinin Natural products 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009267 bronchiectasis Diseases 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 102000021160 microtubule binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011150 microtubule binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000955 peptide mass fingerprinting Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035774 phosphoribosylaminoimidazole carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000013636 protein dimer Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003158 yeast two-hybrid assay Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
- A61P33/06—Antimalarials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/862—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgE or IgD
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/868—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving autoimmunity, allergy, immediate hypersensitivity, delayed hypersensitivity, immunosuppression, or immunotolerance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine releasing factor, HRF) 및 이에 결합하는 펩타이드에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF, 상기 결실형 HRF를 코딩하는 유전자 및 HRF의 활성을 억제할 수 있는 신규한 HRF 결합 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF는 세포에서 히스타민 및 IL-8 분비를 가능하게 하므로, HRF에 의한 알러지 발생을 억제할 수 있는 약물 및 알러지 환자 혈청 내 HRF 검출을 위한 키트 개발 및 동물의 천식, 비염, 등과 같은 알러지 질환 또는 말라리아의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
HRF, 알러지, 히스타민, IL-8
Description
도 1과 도 2는 본 발명에서 제조한 다양한 결실형 HRF들의 모식도이고,
도 3은 도 1과 도 2에 기재된 각각의 재조합 결실형 HRF (pRSET-A-RrHRF, pRSET-A-Del-N11HRF, pRSET-A-Del-N35HRF, pRSET-A-Del-C112HRF, pRSET-A-Del-N39C110HRF, pRSET-A-Del-C38HRF, pRSET-A-Del-N111HRF, pRSET-A-Del-N84C108HRF) 제조를 위한 pRSET-A 벡터의 유전자 지도를 나타낸 모식도이고,
도 4는 도 3에 기재된 pRSET-A 벡터의 MCS(multiple cloning site)를 나타낸 유전자 서열 및 상기 유전자의 코딩부위에 해당하는 아미노산 서열이고,
도 5는 도 1에 기재된 결실형 HRF들에 의한 BEAS-2B 세포주에서의 IL-8 분비량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 6은 IgE 존재하에서 도 1에 기재된 결실형 HRF들에 의한 인간 호염기구에서의 히스타민 분비율을 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 7은 도 1에 기재된 RrHRF의 환원제 유무에 따른 이동성(mobility)의 차이를 나타낸 젤 전기영동 사진이고,
도 8은 도 1에 기재된 결실형 HRF들의 환원제 유무에 따른 이동성의 차이를 나타낸 젤 전기영동 사진이고,
도 9는 재조합 결실형 HRF인 pRSET-A-Del-N11HRF와 pRSET-A-Del-N11HRF의 mutant인 pRSET-A-Del-N11HRF-C28S와 pRSET-A-Del-N11HRF-C172S의 젤 전기영동 사진이고,
도 10은 재조합 결실형 HRF인 pRSET-A-Del-N11HRF와 pRSET-A-Del-N11HRF의 mutant인 pRSET-A-Del-N11HRF-C28S와 pRSET-A-Del-N11HRF-C172S에 의한 BEAS-2B 세포주에서의 IL-8 분비량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 11은 재조합 결실형 HRF인 pRSET-A-Del-N35HRF와 pRSET-A-Del-N35HRF의 mutant인 pRSET-A-Del-N35HRF-C172S의 젤 전기영동 사진이고,
도 12는 재조합 결실형 HRF인 pRSET-A-Del-N35HRF와 pRSET-A-Del-N35HRF의 mutant인 pRSET-A-Del-N35HRF-C172S에 의한 BEAS-2B 세포주에서의 IL-8 분비량을 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 13은 가교제를 이용하여 결실형 HRF와 야생형 HRF의 이량체 형성 능력을 확인한 결과를 나타낸 SDS-PAGE 사진이고,
도 14은 HRF 결합 펩타이드를 발현하고 있는 파아지(phage)인 Φ-HBP-2와 도 1에 기재된 결실형 HRF들과의 친화도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 15는 HRF 결합 펩타이드를 발현하고 있는 파아지(phage)인 Φ-HBP-2와 도 2에 기재된 결실형 HRF들과의 친화도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이고,
도 16은 HRF 결합 펩타이드인 HBP-2가 BEAS-2B 세포주에서 결실형 HRF에 의한 IL-8 분비를 억제함을 나타낸 그래프이고,
도 17는 HRF 결합 펩타이드인 HBP-2가 RBL-2H3 세포주에서 결실형 HRF에 의한 히스타민 분비를 억제함을 나타낸 그래프이고,
도 18은 HRF 결합 펩타이드인 HBP-2, 그 알라닌 치환체 (HBP2-M1,HBP2-M2, HBP2-M3, HBP2-M4, HBP2-M5, HBP2-M6, HBP2-M7) 및 1번 잔기가 결실된 6mer HRF 결합 펩타이드 (HBP2-D1)에 의한 IL-8 분비 억제 정도를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine releasing factor, HRF) 및 이에 결합하는 펩타이드에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF, HRF의 활성을 억제할 수 있는 신규한 HRF 결합 펩타이드 및 이들의 의약 분야에 있어서의 용도에 관한 것이다.
천식, 비염, 담마진, 아나필락시스(anaphylaxis), 알러지성 기관지 확장증, 음식ㆍ약물ㆍ화분ㆍ벌레로 인한 알러지, 고초열(hay fever), 한랭두드러기, 아토피 성 피부염 등의 알러지(Bachert et al., Clinical and Experimental Allergy, 28, 15-19, 1998; MacDonald and Lichtenstein, Springer Semin Immunopathol., 12, 415-428, 1990)는 유전적으로 알러지 항원(allergen)에 대하여 과민하게 반응하여 대량 생성된 IgE(Immunoglobulin E) 및 IgE 분비 조절에 관여하는 사이토카인 (cytokine) 간의 균형 파괴로부터 기인한다고 알려져 있다.
일단 알러지 항원에 노출되면, 즉발 반응(immediate reaction)이 일어나고, 비만세포(mast cell)에서 분비된 사이토카인 등에 의해 염증에 관련된 세포들이 항원 노출부위에 모이게 된다. 수 시간 후에는 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 림프구(lymphocyte)로부터 분비되는 히스타민과 여러 사이토카인 등에 의해 후기 반응(late-phase reaction, 이하 "LPR"이라 함)이 일어나게 되는데, 알러지 환자의 절반 정도가 LPR로 진행된다. LPR에서는 호염기구로부터 히스타민이 분비되는데, 이때에는 즉발 반응을 유발한 알러지 항원이 없으므로, 호염기구에서 히스타민 분비 및 LPR로의 진행을 유발하는 원인 물질을 규명하는 것이 주요 관심사였다. 그 동안 MCP-3(Monocyte Chemotatic Protein-3), MCP-1(Monocyte Chemotatic Protein-1) 또는 RANTES(Regulated upon Activation Normal T-cell Expressed and Secreted)와 같은 사이토카인(cytokine)이 히스타민을 분비하게 하는 것으로 알려져 있었으나, IgE-의존적 LPR에서는 "HRF"라고 명칭된 단백질만이 호염기구에서 히스타민을 분비시킬 수 있음이 밝혀졌다(MacDonald et al., Science, 269, 688-690, 1995). 그러나, HRF가 어떠한 작용기전에 의해서 호염기구로부터 히스타민 분비를 유도하는지에 대해서는 알려진 바가 없다.
HRF는 모든 세포질에 존재하는, 172 개의 아미노산으로 구성된 공지의 단백질이다(Bohm et al., Biochem. Int., 19, 277-286, 1989). 그 중 79-123번 아미노산은 염기성 도메인(basic domain)을 형성하고 있으며, 이 부위는 미소관 결합 단백질인 MAP-1B(microtubule-associated protein-1B)와 약 46%의 상동성을 나타내므로, 미소관에 결합하는 기능을 가질 것으로 추정되고 있다. 고쉐 등은 공촛점 현미경(confocal microscope)을 이용하여 HRF의 분포와 세포골격망 분포가 어느 정도 일치함을 관찰하였는데(Gachet et al., J. Cell Sci., 112, 1257-1271, 1999), 이것은 HRF가 세포골격과 결합되어 있음을 시사하는 것이다. 한편, 산체스 등은 HRF가 일반적인 칼슘 결합 단백질 패밀리에 속하지 않음에도 불구하고, Ca2+과 결합함을 발표하였다. 또한, 사카로마이세스 세레비지에(Saccaromyces cerevisiae)에서 HRF 유전자를 결실시켜도 효모가 생존할 수 있음을 확인하였다(Sanchez et al., Electrophoresis, 18, 150-155, 1997). 이는 HRF가 중복 경로(redundant pathway)를 갖고 있는 유전자 패밀리에 속한다는 사실을 암시하는 것이다.
한편, HRF는 친수성이며 세포질 내에 존재하는 단백질임에도 불구하고, 맥도날드 등은 HRF를 세포 밖에서 발견하였으며, LPR 알러지 환자의 혈장에서 다량으로 검출되므로, 세포사멸(apoptosis)이나 다른 작용기전에 의해 세포외로 분비된 후, 세포막에 존재하는 HRF 수용체를 통해 히스타민을 유리시키는 것으로 생각되고 있다(MacDonald et al., Science, 269, 688-690, 1995). 또한, HRF는 IgE-감작된(sensitized) 호염기구를 자극하여 히스타민을 분비하게 하는 것으로 알려져 있으 나 이에 대한 IgE의 작용기전은 아직 규명되지 않았다. 한편, Bheekha-Escura 등은 IgE 수용체가 없는 세포에서도 HRF가 염증 반응을 일으킬 수 있음을 관찰함으로써 HRF가 IgE와 결합하여 작용하는 것이 아니라, 특이한 세포막 수용체에 결합하여 작용함을 제시하였다(Bheekha-Escura et al., Blood, 96, 2191-2198, 2000).
본 발명자들은 ⅰ) HRF가 친수성임에도 불구하고 세포막을 통과할 수 있다는 사실, ⅱ) 효모 2-하이브리드 분석(yeast two-hybrid)에 의하여 HRF 수용체가 (Na,K)ATPase의 제3 세포질 도메인(CD3)이라는 사실을 밝힌 바 있다(대한민국 특허출원 제2001-27896호 및 제2001-27921호). 아울러, 세포외로 분비된 HRF가 호염기구 세포내에서 히스타민 분비를 촉진하는 작용기전도 밝힌 바 있다.
또한, ⅰ) HRF가 세포내로 들어가는 단계를 차단하고/차단하거나, ⅱ) HRF가 (Na,K)ATPase에 결합하는 단계를 차단하여 HRF의 히스타민 분비를 저해할 수 있는 펩타이드를 발견하여 알러지 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 입증한 바 있다(대한민국 특허출원 제2001-27896호).
최근 부데 등은 활성화된 단핵구 배양 상등액에서 분리한 HRF(HRFmn)와 재조합 HRF(recombinant HRF, rHRF)는 호염기구에서의 히스타민 분비능이 동일하지 않음을 보고하였는데, 이는 HRFmn과 rHRF가 동일한 작용인자(factor)가 아닐 가능성을 제시한다(Budde et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 89, 606-612, 2002). 또한, 인간 HRF 특이적인 효소 면역흡착검출법(enzyme-linked immunoabsorbant assay)에 의해 HRFmn에서 HRF가 검출되지 않음을 언급하였는데, 이 또한 HRFmn과 rHRF와의 구조적 차이점을 시사한다고 할 수 있다.
이에, 본 발명자 등은 HRFmn과 rHRF의 활성의 차이는 알러지 환자의 혈액 속에 다량 존재하는 단백질 분해 효소(protease)에 의한 것이라 판단하고, 히스타민 분비능을 갖는 HRF를 찾고자 노력한 결과, 야생형 HRF에 비해 월등한 활성을 갖는 결실형 HRF를 발견하였다. 이들 결실형 HRF는 야생형 HRF와는 달리 세포간 이황화 결합(disulfide bond)을 가지고 있으며 이 이황화 결합에 의한 이량체 형성(dimerization)에 의해 활성을 가지게 됨을 확인하였다. 또한, 이미 발견한 바 있는 HRF 결합 펩타이드를 변형시킨 후 이 역시 결실형 HRF에 결합하여 HRF의 히스타민 및 IL-8 분비능을 효과적으로 방해함을 확인하고 이들 결실형 HRF 및 이의 결합 펩타이드가 항 알러지 약물 개발에 유효하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 세포에서 히스타민 및 IL-8을 분비시킬 수 있는 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF, HRF의 작용을 억제할 수 있는 신규한 HRF 결합 펩타이드 및 이들의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출인자의 N-말단이 제거됨으로써 이량체를 형성할수 있어 히스타민 및 IL-8 분비능이 향상된 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine releasing factor, HRF)를 제공한다.
또한, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF를 제공한다.
또한, 상기 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 또는 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 사이에 형성되는 동형 또는 이형 이량체 및 그의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 유효성분으로 함유하는 히스타민 및 IL-8 방출 유도제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 이용한 HRF에 의한 알러지 발생을 억제할 수 있는 약물의 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 이용한 알러지 환자 혈청 내 HRF 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M) 서열을 갖는 신규한 HRF 결합 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HRF 결합 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알러지 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HRF 결합 펩타이드 및 항-HRF 모노클로날 항체를 포함하는 알러지 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HRF 결합 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 말라리아 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 단백질-단백질 상호작용 분석을 수행하는 단계를 포함하는 상기 결실형 HRF 또는 상기 동형 또는 이형 HRF 이량체를 이용하여 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출인자의 N-말단이 제거됨으로써 이량체 형성이 가능하고 히스타민 및 IL-8 분비능이 향상된 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine releasing factor, HRF)를 제공한다.
본 발명의 결실형 HRF는 본 발명이 제공하는 서열에 의하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 결실형 HRF는 이를 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA가 삽입된 발현벡터를 이용하는 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 상기 벡터는 생체 내에 존재하도록 제조되며, 삼브룩 등의 방법(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 따라 적당한 숙주세포로 형질전환 되고 적당한 조건하에서 발현되도록 제조된다. 또한, 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 융합단백질을 이용하여 본 발명의 결실형 HRF를 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 결실형 HRF의 아미노산 서열은 당업계의 공지된 통상의 기술에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결실형 HRF는 아미노산 수를 증가시키거나 감소시킴으로써 변형될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 결실형 HRF의 활성을 감소시키지 않는 범위 내에서, 특정 잔기나 그 순서를 바꿈으로써 변형될 수 있다. 변형 가능한 아미노산은 자연적으로 존재하는 L-α-아미노산만이 아니라, β, γ, δ 아미노산은 물론 D-α-아미노산의 유도체로도 변형 가능하다.
따라서, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 결실형 HRF를 그의 히스타민 분비 활성을 유지 내지 증가시키거나 손상시키지 않는 범위 내에서 통상의 기술을 사용하여 변형시킬 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 속하는 것이다.
본 발명에서는 서열번호 1로 기재되는 래트의 전장 서열(Accession number U20525, 아미노산 1-172), 서열번호 2로 기재되는 아미노산 11-172 절편, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 35-172 절편, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 1-112 절편, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 39-110 절편, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 1-38 절편, 서열번호 7로 기재되는 아미노산 111-172 절편, 서열번호 8로 기재되는 아미노산 84-108 절편을 가지는 다양한 결실형 HRF를 제조하기 위하여, 서열번호 9로 기재되는 래트 HRF 전장 서열(Accession number U20525) 유전자로부터 상기 단편을 코딩하는 유전자를 pRSET-A 벡터에 클로닝(도 1 내지 도 4 참조)하여 대장균에 형질전환 시키고 이로부터 발현을 유도하여 분리, 정제하였다.
이어, 제조된 각 결실형 HRF의 N-말단의 결실에 따른 각 결실형 HRF의 BEAS-2B 세 포주에서의 IL-8 분비능(도 5 참조)과 호염기구에서의 히스타민 분비능(도 6 참조)을 비교하였다. 그 결과, 서열번호 2로 기재되는 야생형 HRF의 N-말단의 10개 아미노산 잔기가 결실된 단백질(Del-N11HRF) 및 서열번호 3으로 기재되는 야생형 HRF의 N-말단의 34개 아미노산 잔기가 결실된 단백질(Del-N35HRF)은 BEAS-2B 세포주에서 야생형 HRF에 비하여 증가된 IL-8 분비능을 보였고, 특히 이들은 야생형 HRF의 경우 측정 가능한 IL-8을 분비하지 못하는 저농도(1 ㎍/㎖)에서도 IL-8 분비를 유도하였다. 또한, 이들 결실형 HRF들은 IgE로 감작된 인간 호염기구 세포에서도 야생형 HRF에 비해 증가된 히스타민 분비능을 보였다.
따라서, HRF는 그 활성에 주요 역할을 하는 부위가 N-말단에 의해 가려져 있는 것으로 보이며, 후기 반응(LPR) 알러지 환자의 경우, 히스타민 및 IL-8의 분비를 유발하는 활성형의 HRF를 가지고 있을 것으로 추정된다. N-말단의 일부 아미노산 잔기를 제거한 경우(Del-N11HRF와 Del-N35HRF)는 히스타민 분비능이 증가하나 C-말단만을 제거한 경우(Del-C112HRF)에는 야생형 HRF와 동일한 활성을 보이는 것도 HRF의 N-말단이 HRF 기능 조절에 중요한 역할을 한다는 사실을 뒷받침해 준다.
결실형 HRF 단백질들은 HRF에 대해 특이적 결합을 보이는 헵타머 펩타이드를 발현하고 있는 파아지에 대한 친화도의 면에서도 차이를 보였는데, 야생형 HRF와 Del-C112HRF가 파아지에 대해 약한 친화도를 보인 반면, Del-N11HRF와 Del-N35HRF는 아주 강한 친화도를 보였다(도 14 참조). 이는 각 HRF 단백질의 활성과 상응하는 것이며 이상 언급한 결과들로부터 실험적으로 HRF를 타겟으로 하는 알러지 제어 약물 개발에 있어 이용할 수 있는 HRF의 형태가 몇가지 결실형에 국한됨을 확인하였다.
본 발명에 의해 결실형 HRF의 활성형과 그 기전이 밝혀진 이상, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 생쥐, 인간, 토끼, 닭 등에서 활성형 HRF를 용이하게 동정할 수 있다. 따라서, 생쥐, 인간, 토끼, 닭의 활성형 HRF 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것이다.
본 발명은 서열번호 3(Del-N35HRF)으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF를 제공한다.
서열번호 3의 HRF는 서열번호 1로 기재되는 래트(Rattus norvegicus)의 전장 HRF 아미노산 서열의 N 말단을 34개 결실시킨 형태로서 상기 아미노산 서열을 포함하는 결실형 HRF가 히스타민 및 IL-8 분비능이 뛰어난 것을 확인하였고 이 활성이 분자간 이황화결합에 의한 이량체화에 의한 것임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 또는 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 사이에 형성되는 동형 또는 이형 이량체 및 이의 제조방법을 제공한다.
상기에서와 같이 HRF의 N-말단이 HRF 기능 조절에 중요한 역할을 한다고 여겨짐에 따라, 본 발명자들은 결실형 HRF와 야생형 HRF 사이에 구조적 차이점이 있으리라 추정하고 이들이 환원제인 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 유무에 따라 그 이동성에 변화를 보이는지 확인해 보았다(도 7, 도 8 참조). 비환원 SDS-PAGE 결과 강한 활성을 보이는 결실형 HRF들은 약한 활성을 보이는 야생형 HRF나 C 말단 결실형 HRF와는 달리 이량체 위치에서 관찰되었고 이는 이들 N 말단 결실형 HRF들이 분자간 이황화결합에 의한 이량체 구조를 이루고 있음을 시사한다. HRF의 경우 아미노산 잔기 28번과 172번에 시스테인을 포함하고 있으므로 pRSET-A-Del-N11HRF의 경우는 이들 아미노산을 각각 세린으로 바꾸는 돌연변이화를 실시하였고 pRSET-A-Del-N35HRF의 경우는 172번의 시스테인만을 세린으로 바꾸는 돌연변이화를 실시한 후 이들의 비환원 SDS-PAGE에서의 이동성을 비교해 보았다(도 9, 도 11 참조). pRSET-A-Del-N11HRF와 pRSET-A-Del-N11HRF-C28S, pRSET-A-Del-N35HRF가 이량체 위치로 이동하는 것과는 달리 pRSET-A-Del-N11HRF-C172S, pRSET-A-Del-N35HRF-C172S는 단량체 위치로 이동하는 것이 관찰되었는데 이는 172번 시스테인이 HRF의 이량체화에 주요한 역할을 함을 의미한다.
본 발명자들은 이량체화(dimaerization)가 HRF의 활성에 영향을 미치는지 알아보기 위해 BEAS-2B 세포주에서의 IL-8 분비능을 비교하였다(도 10, 도 12 참조). 분비된 IL-8의 양은 pRSET-A-Del-N11HRF-C172S의 경우 야생형의 46%, pRSET-A-Del-N35HRF-C172S의 경우 야생형의 26%로 각각 감소된 활성을 보였다. 이는 HRF내에서 28번 시스테인에 비해 172번 시스테인의 활성에 기여하는 바가 큼을 시사하며 이는 PAGE에서의 이동성 결과와 상응한다. 이상의 결과들은 결실형 HRF는 야생형 HRF와는 달리 분자간 이황화결합(intermolecular disulfide bond)에 의해 이량체 형태로 존재하며 이 구조적 차이점이 이들 간의 활성차를 유발하는 원인임을 보여준다.
본 발명자들은 가교제(crosslinker)를 이용하여 야생형 HRF도 이량체를 형성할 수 있는지 알아보았다(도 13 참조). 그 결과, 결실형 HRF와는 달리 야생형 HRF 는 분자간 이황화 결합(intermolecular disulfide)을 거의 형성할 수 없었으며 대부분 분자내 이황화 결합(intramolecular disulfide bond)을 형성하였다. 이는 결실형 HRF와 야생형 HRF의 구조적 차이점을 다시 한 번 보여주는 결과로 HRF의 경우 화학적 교차결합 보다는 N 말단 결실이 그 활성에 있어 더욱 효과적임을 알 수 있다.
다만, 상기 야생형 HRF의 이량체 형성 실패는 분자간 이황화결합의 부재에 기인하는 것인만큼, 이황화 결합 이외의 다른 방법에 의한 시험관 내 이량체의 제조방법에 의한 히스타민 및 IL-8 분비능이 향상된 야생형 HRF의 동형 이량체의 존재 가능성을 배제하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 이량체에는 상기 다양한 길이를 갖는 결실형 HRF 사이에 형성되는 동형 또는 이형 이량체 외에도 이황화 결합 이외의 방법을 사용하여 형성되는 야생형 HRF의 동형 이량체 또는 상기 다양한 길이를 갖는 결실형 HRF와 야생형 HRF 사이에 형성되는 이형 이량체까지도 포함된다.
본 발명의 HRF 동형 또는 이형 이량체의 제조방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지의 모든 단백질 이량체 제조방법이 사용가능하나, EP0261616A2, JP1993-032941A, JP1986-069759, WO05/105994A1 및 WO92/013965A1 등에 기재된 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 문헌들은 모두 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된다.
본 발명의 결실형 HRF는 본 발명이 제공하는 서열에 의하여 제조된 후 시판되는 가교제를 처리함으로써 화학적으로 이량체를 형성하게 할 수 있다. 예를 들 어, -SH를 표적으로 하는 가교제 등을 사용하여 황을 교차결합시켜 이량체를 제조할 수 있다. 상기 가교제로는 1,4-Di-[3'-(2'pyridyldithio)propionamido]butane (DPDPB), 1,8-Bis-maleimidodiethylene glycol (BM[PEO]2), 1,11-Bis-maleimidotriethylene glycol (BM[PEO]3), Bis-maleimidoethane (BMOE), 1,4-Bis-maleimidobutane (BMB), Bis-maleimidohexane(BMH), 1,6-Hexane-bis-vinylsulfone (HBVS), Dithio-bis-maleimidoethane(DTME) 및 1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane(BMDB) 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명에서는 서열번호 9로 기재되는 래트 HRF 전장 서열로부터 하기 프라이머 서열을 이용하여 서열번호 10부터 서열번호 16까지의 다양한 결실형 HRF 유전자를 클로닝하였다.
서열번호 9의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) ATG ATT ATC TAC CGG GAC(서열번호 22)
서열번호 9의 클로닝을 위한 reverse primer: CCG CTCGAG(XhoⅠ)TGT CCT AAG TCC TGG TGT(서열번호 23)
서열번호 10의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) GAC GAG CTG TCC TCC GAC AT(서열번호 24)
서열번호 10의 클로닝을 위한 reverse primer: CCC AAGCTT(HindⅢ) ACA TTT TTC CAT CTC TAA(서열번호 25)
서열번호 11의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) AGT GTC AGT AGA ACA GAG(서열번호 26)
서열번호 11의 클로닝을 위한 reverse primer: CCC AAGCTT(HindⅢ) ACA TTT TTC CAT CTC TAA(서열번호 27)
서열번호 12의 클로닝을 위한 forward primer: TAACAAATTGGATCTATCGCCCGCGGAC(서열번호 28)
서열번호 12의 클로닝을 위한 reverse primer: CTTTACCCTTTCTGGTTTCTGTTCTTC(서열번호 29)
서열번호 13의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) ACA GAG GGT GCC ATC GA(서열번호 30)
서열번호 13의 클로닝을 위한 reverse primer: G GAATTC(EcoRⅠ) CCT TTC TGG TTT CTG TT(서열번호 31)
서열번호 14의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) ATG ATT ATC TAC CGG GAC(서열번호 32)
서열번호 14의 클로닝을 위한 reverse primer: G GAATTC(EcoRⅠ) TCT ACT GAC CAT CTT GC(서열번호 33)
서열번호 15의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) GTA AAG CCT TTT ATG ACT(서열번호 34)
서열번호 15의 클로닝을 위한 reverse primer: CCC AAGCTT(HindⅢ) ACA TTT TTC CAT CTC TAA(서열번호 35)
서열번호 16의 클로닝을 위한 forward primer: CG GGATCC(BamHⅠ) ACA AAA GAG GCC TAC AAA(서열번호 36)
서열번호 16의 클로닝을 위한 reverse primer: CG GGATCC(BamHⅠ) TGG TTT CTG TTC TTC AAG(서열번호 37)
서열번호 10은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 11-172 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 11은 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 35-172 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 12는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 1-112 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 13은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 39-110 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 14는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 1-38 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 15는 서열번호 7로 기재되는 아미노산 111-172 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열이고,
서열번호 16은 서열번호 8로 기재되는 아미노산 84-108 절편을 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸다.
본 발명의 결실형 HRF 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염기서열의 어느 것일 수 있으나 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 10 또는 서열번호 11로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 특별히 한정되는 것이 아니라, 결실형 HRF를 코딩하는 유전자를 포함하는 것이면 미생물, 식물 또는 동물 형질전환용 재조합 발현 벡터 어느 것이나 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서는 대장균 발현 벡터 pRSET-A를 이용하여 서열번호 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 염기서열로 군으로부터 선택되는 유전자를 클로닝하여 각각의 재조합 벡터 pRSET-A-RrHRF, pRSET-A-Del-N11HRF, pRSET-A-Del-N35HRF, pRSET-A-Del-C112HRF, pRSET-A-Del-N39C110HRF, pRSET-A-Del-C38HRF, pRSET-A-Del-N111HRF, pRSET-A-Del-N84C108HRF를 제조하였다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 형질전환체는 특별히 한정되는 것이 아니라 본 발명의 결실형 HRF를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 것이면, 대장균, 식물, 동물세포 어느 것이나 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명자 등은 대장균 BL21(DE3) 또는 BL21(DE3)pLysS 균주에 상기 재조합 발현 벡터를 도입하여 형질전환체를 제조하였다. 그 중, 상기 재조합 발현 벡터 pRSET-A-Del-N11HRF를 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환 시킨 것을 각각 BL21(DE3)-pRSET-A-Del-N11HRF, BL21(DE3)pLysS-pRSET-A-Del-N11HRF으로, 재조합 발현 벡터 pRSET-A-Del-N35HRF를 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)pLysS 균주에 형질전환 시킨 것을 BL21(DE3)-pRSET-A-Del-N35HRF, BL21(DE3)pLysS-pRSET-A-Del-N35HRF로 명명하였다. 이들 대장균은 lacUV5 프로모터 조절 하에서만 T7 RNA 중합효소가 전사되도록 고안된 것으로 IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 첨가 시 T7 RNA 중합효소 발현이 유도되고 결실형 HRF가 전사되게 된다. 또한 정제 중 단백질을 분해할 수 있는 lon 프로테아제와 omp T 외막 프로테아제가 결핍되어 있어 다량의 결실형 HRF를 얻을 수 있게 하는 잇점이 있다.
또한, 본 발명은 상기 결실형 HRF를 유효성분으로 함유하는 히스타민 및 IL-8 방출 유도제를 제공한다.
서열번호 2와 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 결실형 HRF 단백질은 야생형 HRF에 비해 BEAS-2B 세포주에서 증가된 IL-8 분비능을 보였고 인간 호염기구에서도 비슷한 방식으로 히스타민 방출을 유도하였다. 따라서, 상기 결실형 HRF는 IL-8 및 히스타민 방출유도제로 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 IL-8 및 히스타민 방출 유도제는 알러지 치료를 목적으로 하는 약물 개발에 있어서의 실험적 모델을 제시한다. 즉, 본 발명의 유도제는 다량의 알러지 유발 물질을 필요로 하는 알러지 제어 약물의 개발 및 검증 과정에 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 결실형 HRF를 이용한 HRF에 의한 알러지 발생을 억제할 수 있는 약물의 검출방법을 제공한다.
즉, 본 발명의 결실형 HRF는 HRF 결합 펩타이드의 결합 부위를 제공하므로, 이를 이용하여 HRF 억제를 통한 알러지 제어 약물 개발에 이용할 수 있다. HBP2 펩타이드(대한민국 특허출원 제2001-27896호)를 이용한 친화성 실험에서는 서열번호 5 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 가지는 결실형 HRF가 상기 펩타이드에의 친화도가 높은 것으로 나타났다(도 9 참조). 따라서, 이들 서열을 가지는 HRF 펩타이드는 이와 결합하는 물질이나 화합물의 검색에 이용될 수 있고, 이러한 물질, 화합물은 알러지 제어 약물의 후보가 될 수 있다.
즉, 경쟁 결합 분석을 사용하여, 결실형 HRF를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포로부터 결실형 HRF를 분리해낸 후 시험 약물 및 상기 결실형 HRF와 상호 작용하는 것이 알려진 물질[예를 들어, HRF 결합 펩타이드(대한민국 특허출원 제2001-27896호)]과 함께 반응시키고, 상기 시험 약물 중에서 결실형 HRF와 HRF 결합 펩타이드 간의 상호작용을 감소시키는 약물을 선별하게 된다. 최종적으로, HRF 결합 펩타이드와 비슷한 구조를 가지는, 세포에서 HRF에 의한 히스타민 분비를 억제할 수 있는 약물을 스크리닝 할 수 있다.
또한, 본 발명은 결실형 HRF를 이용한 알러지 환자의 혈청 내 HRF의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 결실형 HRF를 이용하여 통상의 방법에 따라 항-결실형 HRF의 모노클로날 항체를 제조할 수 있으며, 제조된 항-결실형 HRF 모노클로날 항체도 본 발명의 범주에 포함된다.
이를 이용하여 환자의 혈청 내 HRF를 검출하는 방법을 설명하면, 바닥에 HRF-결합 펩타이드 또는 항-결실형 HRF 모노클로날 항체를 부착시킨 후 혈액 샘플과 반응시키고, 여기에 통상의 표지 물질[HRP(horse reddish peroxydase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 형광물질(fluorescein) 또는 색소(dye) 등]이 컨쥬게이트 된 항-결실형 HRF 모노클로날 항체 또는 항-HRF 모노클로날 항체를 가한다. 발색 또는 형광을 발하여 양성으로 판정되면 혈액 내 활성형 HRF가 포함되어 있으므로 알러젠이 없어도 알러지를 일으킬 수 있는 질환을 갖고 있는 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 HRF에 특이적으로 높은 친화도로 결합하여 히스타민 분비를 저해하는 신규한 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 HRF 결합 펩타이드는 (V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)의 아미노산 서열을 가질 수 있으며 바람직하게는 서열번호 17에 기재된 YVYPSM 서열을 갖는다.
본 발명의 HRF 결합 펩타이드는 펩타이드의 활성을 감소시키지 않는 범위 내에서, 결합에 직접적으로 관여하거나 보존되어야 하는 잔기를 제외한 특정 잔기 성분이나 그 순서를 바꿈으로써 변형될 수도 있다. 변형가능한 아미노산은 자연적으 로 존재하는 L-α-아미노산 뿐만 아니라, β, γ, δ 아미노산은 물론 D-α-아미노산의 유도체로도 변형가능하다.
전형적으로, 하나의 아미노산이 치환된 펩타이드를 이용하여 정전기력이나 친수성이 결합에 미치는 영향을 조사한 결과, 양전하를 띄는 아미노산(예: Lys, Arg)이나 음전하를 띄는 아미노산(예: Glu)이 치환되면 민감도가 변화함을 알 수 있다. 이와 같이, 치환되거나 부가되는 잔기의 수나 형태는 필수적인 결합점 사이에 필요한 공간과 친수성 또는 소수성과 같이 요구되는 기능에 의해 결정된다. 이러한 치환에 의해 본 발명에 따른 펩타이드의 목적 단백질에 대한 친화도를 더 증가시킬 수 있다.
치환으로 인해 기능에 있어서 중요한 변화가 나타나기도 한다. 변화되는 잔기의 선택은 목적 위치에 존재하는 분자의 전기도, 소수성, 측쇄의 변화 또는 나선구조의 변화 등과 같이 펩타이드의 기본 골격을 유지하는데 큰 영향을 미치기도 한다. 일반적으로, 펩타이드의 성질에 중대한 변화를 일으키는 것은 세린과 같은 친수성 잔기가 루이신, 이소루이신, 페닐알라닌, 발린 또는 알라닌과 같은 소수성 잔기로 치환되거나, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘과 같이 전기적으로 양성인 잔기가 글루탐산이나 아스파르트산과 같은 전기적으로 음성인 잔기로 치환되거나, 글리신과 같이 측쇄를 갖지 않는 아미노산이 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기로 치환되는 경우이다.
이상 언급한 바와 같은 사실을 고려하여, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 HRF 결합 펩타이드를 그의 결실형 HRF에 대한 결합력 및 그에 따른 히스타민 분비 저해 활성을 유지 내지 증가시키거나 손상시키지 않는 범위 내에서 통상의 기술을 이용하여 변형시킬 수 있으며, 이는 본 발명의 범주 내에 속한다.
본 발명자 등은 상기 펩타이드를 파아지 디스플레이 라이브러리 스크리닝을 통해 얻고 합성 펩타이드로 다시 확인하였다. 본 발명의 펩타이드는 화학적으로 합성되거나 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 또는 본 발명의 펩타이드를 구성하는 도메인을 혈액 내에 존재하는 단백질이나 그 일부로부터 제조할 수 있다. 또 다른 방법으로, 본 발명의 펩타이드는 그를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA가 삽입된 발현 벡터를 이용하는 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 상기 벡터는 삼브룩(Sambrook) 등(Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press)의 방법에 따라 적당한 숙주세포로 형질전환 되고 적당한 조건하에서 발현되도록 제조된다. 또한, 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 이용하여 본 발명의 펩타이드를 제조할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 HRF 결합 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알러지 또는 말라리아 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 HRF 결합 펩타이드는 HRF에 결합하여 이의 히스타민 및 IL-8 분비능을 억제하는 것으로 나타났으므로(도 16 및 도 17, 도 18 참조) 효과적인 알러지 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인하였다.
한편, HRF는 번역에 의해 조절되는 종양 단백질(translationlly controlled tumor protein)이라고도 불리는데, 1998년 비수티반 등에 의하여 항 말라리아제인 아르테미시닌(Artemisinin)이 말라리아 단백질인 HRF에 결합하여 작용하는 것이 밝혀진 바 있다. 따라서, HRF에 결합하는 활성을 가진 본 발명의 HRF 결합 펩타이드도 상기 아르테미신과 마찬가지로 말라리아의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 HRF 결합 펩타이드의 유효량은 체중 1 kg 당 약 30 ㎍ ~1 mg이다. 본 발명의 조성물은 용액 또는 미셀 형태로 직접 주입되거나 제제화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있는데, 정맥주사, 피하주사, 내피주사, 근육주사 등 주사에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 본 발명의 펩타이드를 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 특히 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 HRF 결합 펩타이드 및 항-HRF 모노클로날 항체를 포함하는 알려진 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 HRF 결합 펩타이드와 항-HRF 모노클로날 항체를 포함하는 진단 키트를 이용하는 시험에서, 혈액 반응시 양성으로 판정되면 알러젠이 없어도 알러지를 갖고 있는 것으로 판단할 수 잇다. 즉, LPR 알러지 환자의 혈액에는 HRF가 부유하고 있으므로, 혈액 검사시 본 키트를 이용하면 HRF가 혈액에 존재하는지 여부를 알 수 있고 이로써 LPR 환자인지 여부를 확인할 수 있다. 본 발명에서는 바닥에 본 발명의 HRF 결합 펩타이드를 부착시킨 후 혈액과 반응시키고, 여기에 표지물질이 컨쥬게이트된 항 HRF 모노클로날 항체를 가하는 방법을 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명은 단백질-단백질 상호작용 분석을 수행하는 단계를 포함하는 상기 결실형 HRF 또는 상기 동형 또는 이형 HRF 이량체를 이용하여 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법을 제공한다. 이때 상기 단백질-단백질 상호작용 분석은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 지금까지 공지된 통상의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로는 동시정제방법(Co-purification), 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-Hybrid system), 단백질칩 등을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시태양에서, 동시정제방법은 i) HRF-HRF 수용체 복합체를 적절한 방법으로 분리하는 단계, ii) 상기 분리된 복합체를 정제하는 단계; iii) 상기 정제된 복합체로부터 HRF 수용체의 정체를 확인하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 단계 i은 1차원 전기영동(1D)나 이차원 전기영동(2D) 또는 액체 크로마토그래피(ligquid chromatography) 방법을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서 단계 ii는 내재 단백질 복합체(endogenous protein complex)를 직접 항체로 정제하거나 항원 결정기 표식(epitope tagging)을 한 후 항체로 정제하는 면역침전법(immunoprecipitation, Barrett et al., J. Lab. Clin. Med. 1960, 55:605-15), GST-침전법(GST-pulldown, Magnaghi-Jaulin et al., Nucleic Acids Res., 1996, 24(6):1052-8)과 같은 비면역적 친화정제법(affinity purification) 및 비특이적 반응 억제와 회수율 및 재현성을 높이기 위해 2개 이상의 표식을 이용한 tandem affinity purification (TAP) 시 스템(Russell et al., Infect Immun., 1980 29(3):999-1006)과 같은 다표식 친화정제법(multi-tag affinity purification)으로 구성된 군으로부터 선택되는 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 단계 iii은 기질-보조 레이져 탈리/이온화 비행시간 질량분광법(matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS, Hill et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 1991, 5(9):395-9)와 같은 펩타이드 질량분석(peptide mass fingerprinting) 또는 나노엘렉트로스프레이 이온화 질량분광법(nanoelectrospray ionization (nanoES)-MS/MS, Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93(25):14440-5), 나노LC-질량분광법(nanoLC-MS/MS, Oosterkamp et al., J. Mass Spectrom. 1998, 33(10):976-83) 및 LC/LC-MS/MS으로 구성된 군으로부터 선택되는 탠덤 질량분광법(tandem MS (MS/MS))이 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 HRF-특이적 수용체의 동정방법은 선택적으로 하기의 단계를 포함한다: iv) 단계 iii에서 확인된 HRF 수용체가 실제 생체 내 또는 시험관 내 조건에서 HRF에 의하여 매개되는 히스타민 방출과정에 관여하는 지 여부를 판정하는 단계. 이때 상기 판정단계는 지금까지 공지된 단백질의 기능분석방법을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로는 상기 단계 iv는 상기 확인된 HRF 수용체를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 단계, 이를 포유동물 세포 발현벡터에 클로닝하는 단계, 상기 클로닝된 발현벡터로 히스타민 방출 세포주를 형질감염시키는 단계; 및 본 발명의 결실형 HRF 또는 HRF 이량체를 처리한 뒤 목 벡 터(mock vector)로 형질감염된 대조 세포주와 비교하여 히스타민 방출 정도가 유의하게 증가하는지 여부를 관찰하는 단계를 통해 달성될 수 있고, 선택적으로는 HRF 수용체 유전자가 결손된 넉아웃 형질전환 동물 또는 세포주를 제조하는 단계, 상기 형질전환 동물 또는 세포주에 HRF를 투여한 후 야생형과 비교하여 히스타민 방출이 유의하게 감소하는 지 여부를 분석하는 단계를 통해 달성될 수 있다.
효모 투하이브리드 시스템(Fields S. and Song O., Nature., 1989, 340(6230):245-6)은 DNA 결합도메인(DBD; DNA binding domain)과 전사활성도메인(TAD; transcription activation domain)을 유전자 재조합 방법으로 분리하고 상호작용하는 두 단백질(X, Y)의 유전자를 각각 DBD와 TAD에 클로닝한 후, 이들을 효모(yeast)내에서 발현되도록 유도하면 DBD와 TAD가 물리적으로 분리된 단백질이 발현되지만 X/Y 단백질 상호작용에 의해 전사인자로 재구성되어 지시유전자(reporter gene)의 유전자발현이 가능해진다는 점을 이용한 분석방법이다. 상기 시스템은 유전자 조작기술을 기반기술로 하여 단백질의 특성에 관계없이 동일한 실험방법으로 상호작용을 검색할 수 있기 때문에 상기 시스템은 대규모 상호작용 분석에 용이하다.
본 발명의 일 실시태양에서, 지시유전자는 i) 색소선별(color selection) 유전자인 β-갈락토시다제(β-galactosidase, LacZ), α-갈락토시다제(α-galactosidase(MEL1), β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, gusA), 녹색형광 단백질(green fluorescence protein, GFP), 글루코아밀라제(glucoamylase) 등과 ii) 성장선별(growth selection) 유전자인 이미다졸클리세롤-포스페이트 디하이드라타제 (imidazoleglycerol-phosphate dehydratase, HIS3), 포스포리보실아미노이미다졸-카르복실라제(phosphoribosylaminoimidazole-carboxylase, ADE2), α-아미노아디페이트 리덕타제(α-aminoadipate reductase, LYS2), β-이소프로필말레이트 디하으드로게나제(β-isopropylmalate dehydrogenase, LEU2), 오르티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제(orotidine-5'-phosphate decarboxylase, URA3) 등을 포함한다.
단백질칩은 마이크로어레이에 의하여 고체 기판 위에 점적된 단백질과 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 콜레스테롤 또는 다른 작은 화합물과 같은 다른 분자 사이의 상호작용을 분석하는데 사용되는 바이오칩을 의미한다. 생체분자(biomolecule)간의 상호작용을 측정할 수 있는 Biacore의 센서칩(sensor chip)이 1990년대 상용화가 된 이래, 단백질칩 개발이 가속화되었다. 단백질칩 기술은 질병진단, 단백질 활성연구, 신약후보물질 검색, 생체분자 상호작용 검색 등의 분야에 응용될 수 있기 때문에 단백질체학의 핵심기술로 부각되고 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 단백질 칩을 이용한 본 발명의 HRF-특이적 수용체의 동정방법은 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance; SPR)분석, 질량분석(surface enhanced laser desorption/ ionization time of flight mass spectrometry; SELDI-TOF), 형광분석, 전기화학적 분석 등을 통해 수행될 수 있다.
따라서, 단백질 칩을 이용한본 발명의 HRF 특이적 수용체의 동정은
1) 기능이 밝혀지거나 밝혀지지 않은 다양한 단백질들이 집적된 단백질 칩에 본 발명의 결실형 HRF 또는 본 발명의 동형 또는 이형 HRF 이량체를 처리하는 단계
2) 상기 결실형 HRF 또는 HRF 이량체에 특이적인 항체가 없거나 있는 상태에서 상기 언급된 분석방법을 이용하여 단백질-단백질 상호작용이 일어나는지 여부를 확인하는 단계를 통해 수행될 수 있다.
이외에도 현재까지 공지된 다양한 단백질-단백질 상호작용 분석방법이 본 발명의 HRF 수용체의 동정방법에 사용될 수 있다. 그 예로는 EP1003853B1, EP1098967B1, EP1184463A1, EP1224324B1, US6114111, US6562576, US6828112, US20020094519A1, US20020106693A1, US20020106698A1, US20020142348A1, US20020177217A1, US20030003439A1, US20030040012A1, US20030170723A1, US20030211523A1, US20040146931A1, US20040157279A1, US20050106636A1, US20050176005A1 또는 US20050221280A1에 개시된 방법이 사용될 수 있다. 상기 문헌들은 모두 본 발명에 참고문헌으로 삽입된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 다양한 결실형 HRF의 제조
<1-1> 유전자의 분리 및 증폭
먼저, 대한민국 특허출원 제2001-27896호 및 제2001-27921호에 기재된 방법 에 따라 HRF를 코딩하는 유전자의 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 래트(Rattus norvegicus) 골격근으로부터 총 세포질 RNA를 추출한 후, pJG4-5 벡터(Invitrogen, Inc., USA)를 이용하여 효모 2-하이브리드 분석을 위한 cDNA 라이브러리를 제조하였다. (Na,K) ATPase의 α2 서브유닛을 이용하여 CD3 부위를 pEG202 벡터(Brent, R., and Finley, R. L., Jr. Annu. Rev. Genet. 31: 663-704, 1997)의 LexA DNA 결합 도메인에 삽입한 후, 이를 스크리닝하기 위한 바이트(bait)로 사용하였다. 리포터 유전자를 활성화시킨 양성 클론을 선택하여 염기서열 분석(sequencing), 제한효소 맵핑과 BLAST 서치를 통한 서열분석을 행하였다. 이들 중 하나의 클론이 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(HRF)와 완전 일치하였다.
상기 rHRF cDNA 유전자로부터 서열번호 1로 기재되는 래트 HRF 전장 서열(Accession number U20525, 아미노산 1-172)을 코딩하는 유전자를 서열번호 9, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 11-172 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 10, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 35-172 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 11, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 1-112 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 12, 서열번호 5로 기재되는 아미노산 39-110 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 13, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 1-38 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 14, 서열번호 7로 기재되는 아미노산 111-172 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 15, 서열번호 8로 기재되는 아미노산 84-108 절편을 코딩하는 유전자를 서열번호 16으로 나타내었고, 각각의 유전자를 PCR을 수행하여 증폭시켰다(도 1 및 도 2). PCR은 전변성(pre-denaturation) 단계로 94℃에서 5분, 변성(denaturation) 단계로 94℃ 에서 1분, 어닐링 단계로 45-50℃에서 1분, 연장(elongation) 단계로 72℃에서 1분, 후 연장(post-elongation) 단계로 72℃에서 7분의 조건으로 30 사이클 동안 반응시켰다. PCR 반응에 사용된 프라이머 서열은 상기 기재한 바 있다.
<1-2> 재조합 발현벡터의 제조
실시예 <1-1>에서 증폭시킨 서열번호 9 내지 서열번호 16의 유전자를 각각 pRSET-A 벡터(Invitrogen)에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하고, 이를 각각 pRSET-A-RrHRF, pRSET-A-Del-N11HRF, pRSET-A-Del-N35HRF, pRSET-A-Del-C112HRF, pRSET-A-Del-N39C110HRF, pRSET-A-Del-C38HRF, pRSET-A-Del-N111HRF, pRSET-A-Del-N84C108HRF로 명명하였다(도 3 및 도 4).
<1-3> 형질전환체의 제조 및 각 결실형 HRF의 분리ㆍ 정제
각 결실형 HRF를 과발현(overexpression)시키기 위하여 실시예 <1-2>에서 제조한 재조합 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)(Novagen) 또는 BL21(DE3) pLysS(Novagen)에 형질전환 시켰다.
상기 대장균 형질전환체는 암피실린 혹은 암피실린과 클로람페니콜을 함유한 LB 배지에서 배양한 후 OD가 0.6에 도달하였을 때 0.4 mM이 되게 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactoside)를 첨가하고 세 시간 더 배양한 후 5,500 x g에서 5분간 원심분리 하였다. 회수한 대장균을 바인딩 버퍼(5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)에 재현탁시킨 후 초음파를 사용하여 분쇄하였다. 용균된 대 장균을 39,000 x g에서 원심분리한 후 상등액은 Ni 칼럼(Novagen)을 이용하여 정제하였다. pRSET-A vector에 클로닝한 결실형 HRF들은 N-말단에 6개의 histidine을 갖게 되므로 니켈로 충전한 HIS-결합 컬럼에 붙게 된다. 이들 단백질을 고농도의 imidazone (1 M imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-Hcl, pH 7.9)을 함유한 일루션 버퍼를 사용하여 추출한 후 PD-10 컬럼을 이용하여 다량의 염분을 제거하였다. 정제된 결실형 HRF들을 mono-Q 음이온 교환(anion exchange) 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)에서 NaCl 농도 구배를 이용하여 다시 정제한 후, 이하의 실시예에서 BEAS-2B 세포(ATCC)와 인간 호염기구를 자극하기 위해 사용하였다.
<실시예 2> BEAS-2B 세포에서 HRF 형태에 따른 IL-8 분비능의 검사
각 결실형 HRF들의 활성을 BEAS-2B 세포(ATCC)에서의 IL-8 분비능을 통해 비교하였다. BEAS-2B 세포를 48-well 플레이트에서 70% 정도 자랄 때까지 배양한 후 1 % 페니실린-스트렙토마이신/BEBM (Clonetics)에서 2회 세척하였다. 실시예 <1-3>에서 분리한 각각의 재조합 단백질(RrHRF 또는 각 결실형 HRF)을 1 ㎍/㎖ 또는 10 ㎍/㎖씩 첨가하였다. 48시간 또는 24시간 후 상등액을 취하여 유리된 IL-8을 효소 면역흡착검출법(PIERCE)을 이용해 정량하였다(도 5).
<실시예 3> 인간 호염기구에서 HRF 형태에 따른 히스타민 분비능의 검사
각 결실형 HRF들의 활성을 인간 호염기구에서의 히스타민 분비능을 통해 비교하였다. 아토피성 피부염을 가지고 있는 혈액 제공자로부터 40 ㎖의 정맥혈을 채취한 후 항응혈제인 EDTA를 10 mM가 되게 첨가하고 식염수에 6%가 되도록 녹인 덱스트란 10 ㎖을 넣고 섞어주었다. 실온에서 90분간 정치한 후 백혈구가 모여있는 상층을 분리하고 150 x g에서 8분간 원심분리 하였다. 회수한 백혈구들을 PAG-EDTA (4 mM EDTA, 25 mM PIPES, 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.003% HSA, 0.1% D-glucose)로 두 번 세척하였고, 차가운 젖산 버퍼 (13.4 mM lactic acid, 140 mM NaCl, 5 mM Kcl, pH 3.9)에서 3, 5분 동안 정치하는 과정을 통해 세포 표면에 있는 IgE를 제거하였다. 이어, 즉시 30 ㎖의 PAG-EDTA를 가하여 두 번 세척하고 다시 PAG-EDTA에 현탁시킨 후 인간 IgE(1 ㎍/㎖, Serotec)로 2시간 동안 감작시켰다. 5% FBS를 첨가한 IMDM 배지(Gibco BRL)로 2회 세척한 후 실시예 <1-3>에서 분리한 각각의 재조합 단백질(rHRF 또는 각 결실형 HRF)을 20 ㎍/㎖ 씩 첨가하였다. 15분 후 인간 항IgE 항체를 가하고 4시간 후 상등액을 취하여 유리된 히스타민을 히스타민 애널라이저(Astoria Analyzer, Series 300 system)를 이용해 정량하였다(도 6).
그 결과, 서열번호 2로 기재되는 N-말단의 11개 아미노산 잔기가 결실된 단백질(Del-N11HRF) 및 서열번호 3으로 기재되는 N-말단의 35개 아미노산 잔기가 결실된 단백질(Del-N35HRF)은 BEAS-2B 세포에서처럼 야생형 HRF에 비해 효과적으로 히스타민 방출을 유도함을 확인하였다.
<실시예 4> 세포간 이황화 결합에 의한 이량체 형성이 HRF 활성에 비치는 영향 비교
<4-1> Non-reducing SDS-PAGE에 의한 이동성 차이 비교
실시예 <1-3>에서 제조한 야생형 HRF와 각 결실형 HRF의 N-말단의 결실에 따른 전기영동에서의 이동성(mobility) 변화를 확인하였다(도 7, 도 8). SDS-PAGE는 Laemmli (Laemmli U.K., Nature, 227, 680-685)의 방법을 변형하여 사용하였고 각 단백질들을 환원 시료 완충용액(reducing sample buffer)[0.125 M Tris-HCl, pH6.8, 4% (w/v) SDS, 20% (v/v) glycerol, and 2% β-mercaptoethanol(β-ME)] 또는 비-환 원시료 완충용액(non-reducing sample buffer)(w/o β-ME)와 섞은 후 15% 젤에서 분리하였다. 그 결과 N-말단을 제거한 단백질들은 야생형 HRF와 C-말단을 제거한 단백질과는 달리 이량체 위치로 이동함이 관찰되었다. 이는 N-말단 결실형 HRF와 야생형 HRF의 구조적 차이를 뒷받침해주며, HRF의 N-말단이 HRF 기능 조절에 중요한 역할을 한다는 사실을 뒷받침해 준다. 또한 N-말단을 제거한 단백질들이 세포간 이황화 결합(intermolecular disulfide bond)를 가지고 있음을 시사해준다.
<4-2> 이황화 결합을 제거하기 위한 부위 특이적 돌연변이 제작
N 말단 결실형 HRF에 있는 시스테인 잔기를 세린으로 치환하여 이황화 결합이 형성되는 것을 저해하였을 경우 HRF 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 부위 특이적 돌연변이 키트(site-directed mutagenesis kit, stratagene)를 이용하여 돌연변이를 만들었다. HRF의 경우 28번과 172번 잔기에 시스테인을 포함하고 있으므로 프라이머로 CG GAC GGG CTG TCT CTG GAG GTG GA(서열번호 19) 와 TC CAC CTC CAG AGA CAG CCC GTC CG(서열번호 20)를 사용하여 pRSET-A-Del-N11HRF-C28S를 제조하였고 또다른 프라이머로 GAG ATG GAA AAA TCT AAG CTT GAT CCG(서열번호 21)와 CGG ATC AAG CTT AGA TTT TTC CAT CTC(서열번호 22)를 사용하여 pRSET-A-Del-N11HRF-C172S와 pRSET-A-Del-N35HRF-C172S를 제조하였다. PCR 증폭 조건은 DNA 중합효소 (Pfu DNA polymerase, Stratagene)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 95℃에서 5분 동안 전변성시키고, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 68℃에서 7분간 16회 반응시키고, 68℃에서 7분간 후연장시킨 후 반응을 종결하였다. 이 반응액에 DpnⅠ(Stratagene)을 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 주형 DNA만을 선택적으로 절단시킨 후 XL1-blue에 형질전환시켰다.
만들어진 컨스트럭트들은 DNA 서열분석을 통하여 돌연변이 생성 여부를 확인한 후 BL21(DE3)/pLysS에 형질전환시키고 실시예 <1-3>에 따라 분리, 정제하였다. 이들 돌연변이 중 특히 pRSET-A-Del-N35HRF-C172S는 비환원적(non-reducing) SDS-PAGE를 통해 세포간 이황화 결합(intermolecular disulfide bond)을 형성하지 않는 것으로 나타났고 BEAS-2B 세포주에서 IL-8을 분비시키는 능력도 현저히 감소되었음을 확인할 수 있었다(도 11, 도 12). 이는 N 말단 결실형 HRF의 활성에 있어 중요한 역할을 하는 것이 172번 잔기에 있는 시스테인에 의한 세포간 이황화 결합임을 시사하는 결과로 HRF 활성에 있어 이량체 형성이 매우 중요함을 알 수 있다.
<4-3> 화학적 방법을 이용한 HRF의 교차결합
가교제(crosslinker)를 이용하여 야생형 HRF와 결실형 HRF가 이량체를 형성하는 능력면에서 어떠한 차이가 있는지 살펴보았다. -SH와 반응하는 두 종류의 가교제(BMOE, BM(PEO)3, Pierce, USA)를 사용하여 야생형 HRF와 Del-N35HRF를 교차결 합 시켰다. Del-N35HRF의 경우 가교제와 반응할 수 있는 -SH를 만들어 주기 위해 미리 20 mM의 DTT를 사용하여 세포간 이황화 결합을 환원시킨 다음 칼럼(Vivaspin column, Vivascience, USA)을 사용하여 DTT를 제거한 후 PBS로 완충용액 조성을 마꿔 주었다. 이후 5배 과량의 가교제를 처리한 후 BMOE의 경우 4℃에서 4시간, BM(PEO)3의 경우 37℃에서 30분 방치한 후 상기 칼럼(vivaspin column)을 사용하여 과량의 가교제를 제거하였다. 이들 단백질을 정량한 후 SDS-PAGE로 분리하였다(도 13). 환원된 Del-N35HRF가 가교제에 의해 세포간 이황화 결합을 형성함에 비해 야생형 HRF는 세포내 이황화 결합을 형성하였으며 가교제에 의해서도 이량체를 형성하지는 못했다.
<실시예 5> HRF 형태에 따른 파아지 디스플레이 펩타이드 클론의 결합능 차이 비교
각각의 결실형 HRF를 플라스틱 웰에 고정(immobilization)시킨 후, 이미 HRF와 결합함이 알려진 펩타이드를 발현하고 있는 파아지(phage)를 첨가해 그 결합능에 차이가 있는지를 알아보았다.
구체적으로, 코팅 완충액(0.1 M NaHCO3, pH 8.6)에 20 ㎍/㎖ 농도로 용해시킨 각각의 결실형 HRF를 50 ㎕씩 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에 가하고, 4℃에서 밤새 코팅한 후 BSA로 비특이적 결합을 차단하였다. 0.1% Tween/TBS (TBST)로 6 회 세척한 후 파아지 용액 30 ㎕를 6% BSA/PBS 30 ㎕에 희석한 용액을 가하고 실온에서 2 시간동안 정치하였다. PBST로 5회 세척한 후, 3% BSA/PBS에 1:5000으 로 희석한 HRP-컨쥬게이트된 항-M13 항체(Pharmacia) 100 ㎕씩을 가하고 1 시간 동안 정치하였다. PBST로 6회, PBS로 1회 세척한 후 퍼옥시다아제(peroxydase) 기질 용액 100 ㎕씩을 가하여 발색 정도를 ELISA 리더(Bio-Rad)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.
그 결과, 상기 HRF들은 HRF에 대해 특이적 결합을 보이는 헵타머 펩타이드를 발현하고 있는 파아지에 대한 친화도에도 차이를 보였는데, RrHRF와 Del-C112HRF가 파아지에 대해 아주 약한 친화도를 보인 반면 Del-N11HRF와 Del-N35HRF는 아주 강한 친화도를 보였다(도 14). 이는 각 HRF 단백질간의 히스타민 분비능과 상응하는 것이며 이상 언급한 결과들로부터 실험적으로 HRF를 타겟으로 하는 알러지 제어 약물 개발에 있어 이용할 수 있는 HRF의 형태가 몇가지 결실형에 국한됨을 알 수 있다.
또한, HRF 내 HRF 결합 펩타이드의 결합 부위를 알아보고자 HRF를 세 등분한 후 HRF 결합 펩타이드와의 친화도를 비교해 보았다. Del-N39C110HRF의 경우 상기 결실형 HRF와 비슷한 정도의 친화도를 보였고, 아미노산을 좀 더 제거한 Del-N84C108HRF 역시 높은 친화도를 보였다(도 15). 이는 HRF 결합 펩타이드가 HRF의 아미노산 84-108 부위에 결합함을 의미하며 이로써, HRF 억제를 통한 알러지 제어 약물 개발의 검색에 이용할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 6> 결실형 HRF의 활성을 억제할 수 있는 HRF 결합 펩타이드들의 작용 비교
RBL-2H3(ATCC)을 5×104 세포로 24-웰에서 증식시킨 후, 래트 IgE 항체(0.2 ㎍/㎖, Serotec)로 60 분간 감작시키고 5% FBS/MEM 배지에서 재조합 HRF 단백질을 1.56 mM로 처리하였다(양성 대조군). 또한 상기에서 준비한 세포에 헵타머 펩타이드(대한민국 특허출원 제2001-27896호)를 용량-의존적 방법으로 처리하였다 (0.0156-15.6 mM). 15분 후 래트 항IgE 항체를 가하고 4시간 후 상등액을 취하여 유리된 히스타민을 히스타민 어날라이저(Astoria Analyzer, Series 300 system)를 이용하여 정량하였다.
HRF 결합 펩타이드들의 결실형 HRF에 대한 작용은 BEAS-2B 세포주에서도 분석되었다. <실시예 3>과 동일한 방법으로 Del-N35HRF (61 nM)를 BEAS-2B에 처리하였는데, 이때 HRF 결합 펩타이드 및 그 알라닌 치환체(대한민국 특허출원 제2001-27896호), 1번 또는 7번 아미노산이 결실된 본 발명의 HRF 결합 펩타이드를 여러 농도(6.1-610 nM)로 Del-N35HRF에 섞고 실온에서 10분 정치 후 첨가하였다. 24시간 후 상등액을 취하여 유리된 IL-8을 효소 면역흡착검출법을 이용하여 정량하였다.
그 결과, 도 16과 도 17에 나타낸 바와 같이, HRF 결합 펩타이드는 RBL-2H3 세포에서 농도 의존적으로 결실형 HRF에 의한 히스타민 분비를 저해하였고, BEAS-2B 세포에서도 농도 의존적으로 결실형 HRF에 의한 IL-8 분비를 억제하였다. WYVYPSM 서열을 가지는 HRF 결합 펩타이드는 변형된 아미노산 위치에 따라 활성의 차이를 보였는데, N-말단으로부터 2 및 6 위치의 아미노산 잔기를 알라닌으로 바꾼 치환체는 결실형 HRF에 대한 억제능을 상실하는 것으로 보아 HRF 결합 펩타이드의 작용에 있어 티로신 잔기와 세린 잔기가 중요한 작용을 할 것으로 생각된다(도 18). 또한 상기 펩타이드의 N-말단의 트립토판 잔기를 제거한 본 발명의 서열번호 17의 HRF 결합 펩타이드(HBP2-D1)의 경우도 원래의 7-mer 펩타이드와 거의 비슷한 활성을 나타내었으므로 2-6번 잔기들만으로도 활성형 HRF에 대한 억제능을 가짐을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 이량체를 형성할 수 있는 결실형 HRF는 활성형의 HRF를 제공함으로써 HRF에 의한 알러지 제어 약물 개발 및 알러지 환자 혈청 내의 HRF양을 검출하기 위한 키트 제작 등에도 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 결실형 HRF 결합 펩타이드는 세포내에서 IL-8 및 히스타민 분비를 효과적으로 제어함으로써, 동물의 천식이나 비염 등과 같은 알러지 질환 및 말라리아 예방 또는 치료용 약물 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (33)
- 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출인자의 N-말단의 11 내지 35 아미노산이 결실되어 이량체의 형성이 가능하고 히스타민 및 IL-8 분비능이 향상된 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine releasing factor, HRF).
- 제 1항에 있어서, HRF는 척추동물의 HRF인 것을 특징으로 하는 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 HRF는 서열번호 2(Del-N11HRF) 또는 서열번호 3(Del-N35HRF)으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자.
- 제 1항의 재조합 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 또는 야생형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 사이에 형성되는 IgE-의존적 히스타민 방출 인자의 동형 또는 이형 이량체.
- 제 1항의 결실형 HRF 또는 제 6항의 HRF 동형 또는 이형 이량체에 특이적인 항체.
- 제 1항의 결실형 HRF 또는 야생형 HRF에 가교제를 처리하는 단계를 포함하는 제 6항의 동형 또는 이형 이량체를 제조하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 가교제는 1,4-Di-[3'-(2'pyridyldithio)propionamido]butane(DPDPB), 1,8-Bis-maleimidodiethylene glycol(BM[PEO]2), 1,11-Bis-maleimidotriethylene glycol(BM[PEO]3), Bis- maleimidoethane(BMOE), 1,4-Bis-maleimidobutane(BMB), Bis-maleimidohexane(BMH), 1,6-Hexane-bis-vinylsulfone(HBVS), Dithio-bis-maleimidoethane(DTME) 및 1,4-bismaleimidyl-2,3-dihydroxybutane(BMDB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 결실형 HRF의 동형 또는 이형 이량체를 제조하는 방법.
- 제 1항 또는 제 2항의 결실형 HRF를 코딩하는 유전자.
- 삭제
- 제 10항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 10(Del-N11HRF) 또는 서열번호 11(Del-N35HRF)로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 10항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 13항에 있어서, pRSET-A-Del-N11HRF 또는 pRSET-A-Del-N35HRF인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 13항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 제 15항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제 16항에 있어서, BL21(DE3)-pRSET-A-Del-N11HRF, BL21(DE3)-pRSET-A-Del-N35HRF BL21(DE3)pLysS-pRSET-A- Del-N11HRF, 또는 BL21(DE3)pLysS-pRSET-A-Del-N35HRF인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제 1항의 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 또는 제 6항의 동형 또는 이형 이량체를 유효성분으로 함유하는 히스타민 방출유도제.
- 제 1항의 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자 또는 제 6항의 동형 또는 이형 이량체를 이용한 HRF에 의한 알러지 발생을 억제할 수 있는 약물의 검출방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 결실형 IgE-의존적 히스타민 방출 인자는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- (V, Y, E 또는 A)-(T, V, F 또는 A)-(Y, P 또는 A)-(P, G 또는 K)-(A, L, S 또는 W)-(A, P 또는 M)의 아미노산 서열을 갖는 HRF 결합 펩타이드.
- 제 22항에 있어서, 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
- 제 22항에 있어서, L-아미노산, D-아미노산, 또는 L-아미노산 및 D-아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 펩타이드.
- 제 22항에 있어서, 아미노산 유도체 및 알킬화된 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형 아미노산을 포함하는 펩타이드.
- 삭제
- 제 22항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 알러지 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 22항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 말라리아 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제 22항의 펩타이드 및 항-HRF 모노클로날 항체를 포함하는 알러지 진단 키 트.
- 단백질-단백질 상호작용 분석을 수행하는 단계를 포함하는 결실형 HRF 또는 상기 동형 또는 이형 HRF 이량체를 이용하여 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법.
- 제 30항에 있어서, 단백질-단백질 상호작용 분석은 동시정제(Co-purification), 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-Hybrid system) 또는 단백질 칩 시스템을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 상기 동시정제는i) HRF-HRF 수용체 복합체를 분리하는 단계,ii) 상기 분리된 복합체를 정제하는 단계 및iii) 상기 정제된 복합체로부터 HRF 수용체의 정체를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법.
- 제 31항에 있어서, 단백질 칩 시스템은1) 기능이 밝혀지거나 밝혀지지 않은 다양한 단백질들이 집적된 단백질 칩에 본 발명의 결실형 HRF 또는 본 발명의 동형 또는 이형 HRF 이량체를 처리하는 단계; 및2) 상기 결실형 HRF 또는 HRF 이량체에 특이적인 항체가 없거나 있는 상태에서 상기 언급된 분석방법을 이용하여 단백질-단백질 상호작용이 일어나는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 HRF 특이적 수용체를 동정하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050006712 | 2005-01-25 | ||
| KR20050006712 | 2005-01-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060086867A KR20060086867A (ko) | 2006-08-01 |
| KR100780255B1 true KR100780255B1 (ko) | 2007-11-28 |
Family
ID=36051401
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060007663A KR100780255B1 (ko) | 2005-01-25 | 2006-01-25 | 히스타민 분비능이 있는 결실형 ＩｇＥ-의존적 히스타민방출인자, ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그 용도 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7772368B2 (ko) |
| EP (1) | EP1683866B1 (ko) |
| JP (2) | JP4564926B2 (ko) |
| KR (1) | KR100780255B1 (ko) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097561A1 (en) * | 2006-02-20 | 2007-08-30 | Ewha University - Industry Collaboration Foundation | Peptide having cell membrane penetrating activity |
| WO2011123697A2 (en) * | 2010-03-31 | 2011-10-06 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Histamine-releasing factor (hrf), hrf-receptor and methods of modulating inflammation |
| WO2015102418A2 (ko) * | 2014-01-03 | 2015-07-09 | 이화여자대학교 산학협력단 | 펩티도미메틱 화합물 및 이를 포함하는 알레르기성 질환 치료용 약학조성물 |
| WO2015194831A1 (ko) * | 2014-06-16 | 2015-12-23 | 이화여자대학교 산학협력단 | TCTP 이량체형 IgE-의존성 히스타민 방출인자와 이의 수용체 간의 결합 억제제 및 이의 용도 |
| US20160109460A1 (en) * | 2014-10-16 | 2016-04-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods And Compositions For Determining Fortilin Levels |
| KR20160148362A (ko) * | 2015-06-16 | 2016-12-26 | 이화여자대학교 산학협력단 | IgE-의존적 히스타민 방출인자(HRF) 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산의 신규한 용도 |
| WO2020102108A1 (en) * | 2018-11-12 | 2020-05-22 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Compositions and methods of modulating inflammation |
| KR102522579B1 (ko) * | 2021-02-08 | 2023-04-18 | 중앙대학교 산학협력단 | 히스타민 특이 결합 펩타이드 및 이를 이용한 히스타민 검출용 조성물 |
| WO2024010373A1 (ko) * | 2022-07-05 | 2024-01-11 | 이화여자대학교 산학협력단 | IgE-의존성 히스타민 방출인자와 결합하는 항체 및 이의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010109481A (ko) * | 2000-06-01 | 2001-12-10 | 이경림 | ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도 |
| KR20020088879A (ko) * | 2001-05-22 | 2002-11-29 | 이경림 | ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ) 및 그에결합하는 펩타이드의 용도 |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1335748C (en) | 1986-09-25 | 1995-05-30 | Jeffrey Lawrence Finnan | Crosslinked gelatins |
| US5439829A (en) | 1991-01-30 | 1995-08-08 | Eli Lilly And Company | Immobilization of biologically active molecules by changing the Oxidation state of a chelated transition metal ion |
| ATE311443T1 (de) | 1997-09-03 | 2005-12-15 | Biovation Ltd | Methoden zur durchforstung (screenen) von proteinen |
| US20050221280A1 (en) * | 1998-02-02 | 2005-10-06 | Odyssey Thera, Inc. | Protein-protein interactions for pharmacological profiling |
| US6114111A (en) * | 1998-03-30 | 2000-09-05 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Mammalian protein interaction cloning system |
| IL128017A0 (en) | 1998-07-22 | 1999-11-30 | Technion Res & Dev Foundation | Method for detecting protein-protein interactions and a kit therefor |
| JP2002544522A (ja) * | 1999-05-14 | 2002-12-24 | マクギル ユニバーシティー | タンパク質間相互作用並びに相互作用するタンパク質および相互作用部位のアミノ酸配列を同定する方法 |
| GB9921155D0 (en) | 1999-09-08 | 1999-11-10 | Medical Res Council | Selection system |
| JP2001327296A (ja) | 2000-03-15 | 2001-11-27 | Japan Science & Technology Corp | 蛋白質−蛋白質相互作用検出方法 |
| US20030044787A1 (en) * | 2000-05-16 | 2003-03-06 | Joung J. Keith | Methods and compositions for interaction trap assays |
| AU2002232407A1 (en) * | 2000-10-30 | 2002-05-15 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods, compositions and therapeutic applications relating to fortilin (= translationally controlled tumor protein, tctp) and modulators thereof |
| US6551786B2 (en) * | 2001-01-04 | 2003-04-22 | Myriad Genetics, Inc. | Screen assay for selecting protein-protein interaction modulators |
| US20020177217A1 (en) * | 2001-03-26 | 2002-11-28 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for studying protein-protein interactions |
| WO2002083846A2 (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-24 | Children's Medical Center Corporation | Methods of analysis and labeling of protein-protein interactions |
| US6841352B2 (en) * | 2001-06-29 | 2005-01-11 | Myriad Genetics, Inc. | Mating-based method for detecting protein—protein interaction |
| AU2003205186A1 (en) * | 2002-01-16 | 2003-09-02 | Regents Of The University Of California | Functional ligand display |
| US20030211523A1 (en) * | 2002-02-01 | 2003-11-13 | Shuang Zhang | Two-hybrid double screening system and method |
| US6743630B2 (en) * | 2002-03-06 | 2004-06-01 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method of preparing a protein array based on biochemical protein-protein interaction |
| US20020094519A1 (en) * | 2002-03-07 | 2002-07-18 | Agencourt Bioscience Corporation | Detection of protein interactions |
| ATE348190T1 (de) * | 2002-03-28 | 2007-01-15 | Dualsystems Biotech Ag | Verfahren zum nachweis von protein- proteininteraktionen in membranen |
| US8603775B2 (en) | 2004-04-30 | 2013-12-10 | Biocomber Co., Ltd. | Method of disulfide crosslink forming in vitro protein synthesis |
-
2006
- 2006-01-24 JP JP2006015614A patent/JP4564926B2/ja active Active
- 2006-01-25 US US11/307,141 patent/US7772368B2/en active Active
- 2006-01-25 EP EP06001565.8A patent/EP1683866B1/en active Active
- 2006-01-25 KR KR1020060007663A patent/KR100780255B1/ko active IP Right Grant
-
2010
- 2010-02-18 JP JP2010033371A patent/JP2010158246A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20010109481A (ko) * | 2000-06-01 | 2001-12-10 | 이경림 | ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ)의 수용체,ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그들을 코딩하는 핵산, 및그들의 용도 |
| KR20020088879A (ko) * | 2001-05-22 | 2002-11-29 | 이경림 | ＩｇＥ-의존적 히스타민 방출인자(ＨＲＦ) 및 그에결합하는 펩타이드의 용도 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 논문 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1683866A3 (en) | 2006-08-02 |
| US7772368B2 (en) | 2010-08-10 |
| EP1683866A2 (en) | 2006-07-26 |
| JP4564926B2 (ja) | 2010-10-20 |
| US20060165677A1 (en) | 2006-07-27 |
| EP1683866B1 (en) | 2017-03-01 |
| KR20060086867A (ko) | 2006-08-01 |
| JP2010158246A (ja) | 2010-07-22 |
| JP2006212029A (ja) | 2006-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100780255B1 (ko) | 히스타민 분비능이 있는 결실형 ＩｇＥ-의존적 히스타민방출인자, ＨＲＦ 결합 펩타이드 및 그 용도 | |
| Lu et al. | Ephrin-B reverse signaling is mediated by a novel PDZ-RGS protein and selectively inhibits G protein–coupled chemoattraction | |
| Middleton et al. | Two tarantula peptides inhibit activation of multiple sodium channels | |
| Árnadóttir et al. | Eukaryotic mechanosensitive channels | |
| US6331613B1 (en) | Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFS), the proteins encoded, and uses thereof | |
| US6274710B1 (en) | Antibodies which specifically bind T Cell inducible factors (TIFs) | |
| US6635251B1 (en) | Eotaxin-specific antibodies | |
| US20050260218A1 (en) | House dust mite allergen, Der f VII, and uses therefor | |
| US6793917B1 (en) | Type CC chemokine-like protein | |
| Timmermann et al. | Interaction of soluble CD163 with activated T lymphocytes involves its association with non‐muscle myosin heavy chain type A | |
| HU227959B1 (en) | Methods for designing recombitope peptides | |
| EP1280895B1 (en) | Polypeptide inhibiting a proton-gated na+ channel | |
| US20040110189A1 (en) | Isolated nucleic acid molecules which encode T cell inducible factors (TIFs), the proteins encoded, and uses thereof | |
| US20030023033A1 (en) | Novel class II cytokine receptors and uses thereof | |
| US7132505B1 (en) | Polypeptide inhibiting a proton-gated Na+ channel, a nucleic acid coding for such polypeptide and a method of manufacturing an ASIC1a channel blocker | |
| KR20040004481A (ko) | Ｄｅｒ ｐ Ⅲ 단백질 알레르겐을 암호화하는 분리된 핵산 | |
| US20040236075A1 (en) | Novel glass II cytokine receptors, and uses thereof | |
| JP4734256B2 (ja) | Ｃｃｒｌ２の活性を調節する薬剤及びそれを使用する方法 | |
| Schäfer et al. | Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization | |
| JP5311117B2 (ja) | 免疫細胞刺激活性を有する機能ペプチド | |
| Strong et al. | Synthetic chemokines directly labeled with a fluorescent dye as tools for studying chemokine and chemokine receptor interactions | |
| US5652111A (en) | Binding assay utilizing a nucleic acid encoding apamin binding protein | |
| JP4001246B2 (ja) | 新規ヒトｃｃ型ケモカインｌａｒｃ | |
| KR100733887B1 (ko) | DerpⅢ단백질알레르겐을암호화하는분리된핵산 | |
| Lubeseder-Martellato | The guanylate binding protein-1 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121123 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131016 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141125 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151016 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161123 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171117 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191001 Year of fee payment: 13 |