KR100747042B1

KR100747042B1 - 신물질６-메틸-３-펜에틸-３,４-디히드로-１ｈ-큐나졸린-２-티온,이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 미백 효능조성물

Info

Publication number: KR100747042B1
Application number: KR1020030057135A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 정상헌; 민경락; 박준규; 이지현
Original assignee: 솔젠트 (주); 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2007-08-07
Also published as: TW200508208A; WO2005016895A1; TWI308148B; KR20050019401A; AU2003282429A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식(1)로 표시된 신물질 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온; 이의 제조방법; 이를 유효성분으로 포함하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물; 및 이를 유효성분으로 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다.

(1)

6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온, 과색소 침착, 미백화장료, 의약조성물

Description

신물질 ６-메틸-３-펜에틸-３,４-디히드로-１Ｈ-큐나졸린-２-티온, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 미백 효능 조성물{Novel compound of 6-methyl-3-phenethyl-3,4-dihydro-1H-quinazoline-2-thione, its preparation and a depigmentation composition containing the compound as an effective component}

도 1a는 실험예 1의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 cAMP/단백키나제 A를 경유하는 멜라닌 생성 억제 효과를 도시한 것이다.

도 1b는 실험예 1의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 cAMP/단백키나제 A를 경유하는 멜라닌 생성 억제 효과를 알부틴 및 코직산과 비교하여 도시한 것이다.

도 2a는 실험예 2의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 cGMP/단백키나제 G를 경유한 멜라닌 생성억제 효과를 도시한 것이다.

도 2b는 실험예 2의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 cGMP/단백키나제 G를 경유한 멜라닌 생성억제 효과를 알부틴 및 코직산과 비교하여 도시한 것이다.

도 3a는 실험예 3의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 1-올레오일-2-아세틸글리세롤(OAG)/단백키나제 C를 경유한 멜라닌 생성 억제 효과를 도시한 것이다.

도 3b는 실험예 3의 실험결과에 따른 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 1-올레오일-2-아세틸글리세롤(OAG)/단백키나제 C를 경유한 멜라닌 생성 억제 효과를 알부틴과 비교하여 도시한 것이다.

도 4는 실험예 4의 실험결과에 따라 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 만을 가하였을 때 세포주 멜라노마(melanoma) B16에 의해 생성된 티로시나제의 함량을 100으로 하여 알파-멜라노사이트 자극 호르몬과 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리하였을 때 세포주 멜라노마(melanoma) B16에 의해 생성된 티로시나제 함량을 상대 비율로 나타낸 것이다.

도 5a는 실험예 5의 실험결과에 따라 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 증식시킨 세포주 멜라노마(melanoma) B16 군 (None)과 동일한 배지에 알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 첨가하여 증식시킨 세포주 멜라노마(melanoma) B16 군 (α-MSH)의 세포 성장을 도시한 것이다.

도 5b는 실험예 5의 실험결과에 따라 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에 알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 첨가하여 증식시킨 세포주 멜라노마(melanoma) B16 군과, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬과 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온 (농도 0.5-4 μM)를 동시에 처리하여 증식시킨 세포주 멜라노마(melanoma) B16 군의 배양 4일째 되는 날의 생존 세포의 숫자를 비교하여 도시한 것이다.

(1)

피부가 검고 칙칙해지는 원인은 자외선, 호르몬 불균형, 정신적 스트레스 등으로 인하여 멜라노사이트(melanocyte)에서 필요이상의 멜라닌(melanin) 색소가 생성되기 때문이다 (Nordlund, J. J. et al., The Pigmentation System: Physiology and Pathophysiology. New York, Oxford Univ. Press, pp. 1-1025, 1998). 따라서 멜라닌 생성을 조절하는 기술은 피부에 과도한 멜라닌 색소의 침착을 방지하거나, 이미 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하여 기미, 주근깨 등의 과색소 침착 질환을 억제하는 미백제품 개발에 있어 핵심 기술에 해당된다 (Hori, W., Drug Discovery Approaches for Developing Cosmeceuticals. Advanced Skin Care and Cosmetic Products. Southborough, IBC Library Series, pp. 3.1.1-3.1.21, 1997).

멜라닌 생합성 과정은 티로신(tyrosine)을 출발물질로 티로시나제(tyrosinase)에 의해 도파(DOPA)와 도파큐논(DOPAquinone)으로 변형되고 중간체 5,6-디히드로인돌 2-카복실산(5,6-dihydroxyindole 2-carboxylic acid)과 5,6-디히드로인돌(5,6-dihydroxyindole)을 거처 유멜라닌(eumelanin)을 생성하고 도파큐론은 시스테인과 반응하여 페오멜라닌(pheomelanin)을 생성한다. 5,6-디히드로인돌 2-카복실산으로부터 만들어진 유멜라닌은 갈색, 5,6-디히드로인돌로부터 만들어진 유멜라닌은 흑색을 나타내고 페오멜라닌은 노란-적색을 나타내는 색소이다 (Hearing, V. J., FASEB J., 5:2902-9, 1991; Hearing, V. J., J. Invest. Dermatol., 4:24-8, 1999).

유전자 knockout 연구를 통하여 티로시나제가 결핍되면 흰색 (albino)의 마우스가 생성되며, 티로시나제 관련 단백질 2(tyrosinase-related protein 1; TRP-2)가 결핍되면 점박이 (slaty)를 생성하고 티로시나제 관련 단백질 1(TRP-1)은 갈색 (brown)을 나타내는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Rieder, S., et al., Mamm. Genome, 12:450-5, 2001; Tanita, M., et al., J. Hum. Genet., 47:1-6, 2002; Kameyama, K., et al., Pigment Cell Res., 8:97-104, 1995). 티로시나제 관련 단백질 1은 마우스에서는 5,6-디히드로인돌 2-카복실산 옥시다제의 효소 활성 을 나타내나 사람에서는 효소활성은 없고 티로시나제의 안정화에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Kobayashi, T., et al., J. Biol. Chem., 272:31801-5, 1998).

태양광선의 자외선은 피부 멜라닌 생성에 중요한 역할을 한다. 멜라노사이트에 자외선이 노출되면 디아실글리세롤을 통하여 단백키나제 C를 활성화시키고 이어 멜라닌의 생성을 증가시킨다 (Gilchrest, B. A., et al., Photochem. Photobiol., 93:1-10, 1996; Park, H. Y., et al., J. Biol. Chem., 274:16470-8, 1999). 태양광선에 노출된 케라티노사이트(keratinocyte)는 일산화질소, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬, 프로스타글란딘 E₂, 엔도텔린-1 등을 방출시키고 이들은 멜라노사이트로 이동하며 일산화질소는 cGMP와 단백키나제 G의 신호전이를 통하여 그리고 나머지 인자들은 cAMP와 단백키나제 A의 신호전이를 통하여 멜라닌 생성을 증가시킨다 (Romero-Graillet, C., et al., J. Biol. Chem., 271:28052-6, 1996; Rasmussen, N., et al., Neuroendocrinol. Lett., 20:265-282, 1999; Scott, M. C., et al., J. Cell. Sci. 115:2349-55, 2002).

멜라닌 생성 경로의 이해는 과색소 침착(기미, 주근깨 등)을 방지하기 위한 미백제품 개발에 매우 중요하다. 지금까지 개발된 멜라닌 생성 저해 물질로서 대표적인 것은 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 히드로퀴논(hydroquinone), 비타민 C, 상백피추출물, 감초추출물 등이 있다. 코직산은 티로시나제의 활성에 필요한 구리 이온을 킬레이트시켜 멜라닌 생성을 저해하는 효과를 나타내는데 미백효능은 우수하나 최근에 발암성이 인정되어 사용이 제한되고 있다. 비타민 C 및 그 유도체 는 비교적 낮은 미백효능을 나타내고, 히드로퀴논은 피부에 대한 자극성이 높아 안전성 문제로 그 사용이 제한되고 있다. 그리고 대부분의 식물추출물은 고농도에서만 미백효능을 나타내고 저농도에서는 거의 효과가 없는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 종래 알려져 있는 멜라닌 생성 저해제들이 갖고 있는 문제점을 극복하고 보다 우수한 미백물질을 찾기 위하여 다원화된 활성 분석법을 도입하여 스크리닝을 수행한 결과, 신물질 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온, 이를 유효성분으로 포함하는 의약 조성물 및 화장료 조성물이 우수한 미백효능을 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 신물질 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물 및 미백 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

(1)

본 발명의 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온 (화학식 1)은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온 (화학식 4)에 로슨(Lawesson's; 2,4-bis-(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia- 2,4-diphosphetane 2,4-disulfide) 시약을 반응시켜 제조할 수 있다.

상기에서 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온 (화학식 4)은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, (5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민 (화학식 2)을 환원하여 4-메틸-2-(펜에틸아미노메틸)페닐아민 (화학식 3) 얻고 여기에 1,1'-카보닐디이미다졸을 반응시켜 제조할 수 있다.

상기에서 (5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민 (화학식 2)은 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이, 5-메틸-2-니트로벤질 클로라이드와 펜에틸아민을 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온 (화학식 1)의 제조 방법을 정리하면 하기의 반응식 4와 같다.

본 발명의 또 다른 태양은, 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 포함하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 의약 조성물에는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온이 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001-1중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 등의 과멜라닌 색소 침착증을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 사용되는 것으로, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및/또는 첨가제를 포함하는 경우에는 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다. 대표적인 예로는 크림제, 연고제, 겔, 로오션제, 액제 또는 패치 등 경피용 제제를 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양은, 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 포함하는 미백 화장료 조성물에 관한 것이다. 미백 화장료 조성물에는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온이 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001-1중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 미백 화장료 조성물은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 등의 피부색소 이상증을 치료 또는 예방하기 위한 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 대표적인 예로는 유연화장수, 수렴화장수, 영양크림, 맛사지 크림, 엣센스, 팩, 젤, 로오션, 패취, 스프레이 또는 리퀴드 파우더 등을 들 수 있다.

본 발명의 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온은 세포독성이 없이 단백키나제 C를 통한 멜라닌 생성, cAMP/단백키나제 A를 통한 멜라닌 생성, cGMP/단백키나제 G를 통한 멜라닌 생성을 통합적으로 억제하며 기존의 코직산, 알부틴과 비교하여 수백배 강한 미백효능을 나타낸다.

이하에서 구체적으로 실시예, 처방예, 실험예를 들어 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온의 제조방법

실시예 1-1: (5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민의 합성

펜에틸아민 (2 당량, 3.38 ml)와 트리에틸아민 (3 당량, 5.6 ml)를 테트라히드로퓨란에 용해하고, 여기에 5-메틸-2-니트로벤질 클로라이드 (2.5 g, 0.0135몰)을 테트라히드로퓨란에 녹여 적가하였다. 실온에서 10분간 교반한 후, 60-70℃에서 12시간동안 환류하였다. 반응액을 상온으로 식힌 후, 감압증류하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한 후, 감압증류하고 컬럼으로 분리하였다.

(5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민의 특성은 다음과 같다.

오랜지색 오일;

R_f=0.26(hexane: ethyl acetate=2:1); 수율 84.8％;

IR(KBr) 3350, 3050, 3020, 2930, 2850, 1610, 1585, 1520, 1455, 1340, 1265, 1120cm^-1;

¹H NMR(CDCl₃, 89.45MHz) δ 2.40(s, 3H), 2.88(m, 4H), 4.03(s, 2H), 7.13-7.93(m, 8H)

실시예 1-2: 4-메틸-2-(펜에틸아미노메틸)페닐아민의 합성

(5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민 (3 g)을 티클로로메탄:메탄올=1:1 혼합용액으로 용해한다. 여기에 Pd 탄소 (240 mg)을 넣어준다. 이를 30 psi 수소가스 하에서 4시간 동안 교반하였다. 반응액을 셀라이트 케익(celite cake) 상에서 감압여과 하였고, 티클로로메탄으로 세척하였다. 여액을 감압증류하여 4-메틸-2-(펜에틸 아미노메틸)페닐아민을 얻었다. 이물질의 특성은 다음과 같다.

갈색 오일;

R_f=0.045(hexane: ethyl acetate=2:1); 수율 89.7％;

IR(KBr) 3550-3200, 3025, 2930, 2895, 2750, 1620, 1500, 1455, 1265cm^-1;

¹H NMR(CDCl₃, 89.45MHz) δ 2.20(s, 3H), 2.83(m, 2H), 2.91(s, 2H), 3.91(m, 2H), 4.27(br, NH2), 6.41-7.21(m, 8H)

실시예 1-3: 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-온의 합성

4-메틸-2-(펜에틸아미노메틸)페닐아민 (2 g, 0.00832몰)을 무수 테트라히드로퓨란에 용해한다. 여기에 1,1’-카보닐디이미다졸 (1.1 당량, 1.48 g)을 넣는다. 이를 50-60℃에서 12시간동안 환류하였다. 테트라히드로퓨란을 제거하고, 수화된 디클로로메탄으로 추출한 후, 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수한다. 감압증류한 다음 컬럼으로 분리한다. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온의 특성은 다음과 같다.

황색 고체;

R_f=0.34(헥산: 에틸아세테이트=5:1); 수율 81.9％; mp 174.8-175.8℃;

IR(KBr) 3200, 3100-3000, 2920, 1650, 1610, 1500, 1455, 1320, 1270, 1240, 1180cm^-1;

¹H NMR(CDCl₃, 89.45MHz) δ 2.25(s, 3H), 2.95(t, J=7.5㎐, 2H), 3.67(t, J=7.5㎐, 2H), 4.31(s, 2H), 6.57-7.01(m, 3H), 7.26(m, 5H), 7.88(br, NH)

실시예 1-4: 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온의 합성

6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온 (880 mg, 0.0033몰)을 톨루엔에 용해하여 가온한다. 여기에 Lawesson's 시약 (0.6 당량, 802 mg)을 넣는다. 이를 100℃에서 8시간 동안 환류하였다. 감압증류하여 톨루엔을 제거하고, 수화된 디클로로메탄으로로 추출한다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 탈수하고, 감압증류한 다음 컬럼으로 분리한다. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 특성은 다음과 같다.

연황색 고체; R_f=0.63(헥산: 에틸아세테이트=2:1);

수율 47.2％; mp 177.2-177.7℃;

IR(KBr) 3200, 3020, 2920, 1620, 1550-1480, 1450, 1325, 1265, 1240, 1175, 1150cm^-1;

¹H NMR(CDCl₃, 89.45MHz) δ 2.27(s, 3H), 3.10(t, J=7.7㎐, 2H), 4.12(t, J=7.7㎐, 2H), 4.36(s, 2H), 6.60-7.02(m, 3H), 7.28(m, 5H), 8.48(br, NH);

Anal. Calcd. for C17H18N2S C,72.3; H,6.42; N;9.92; S,11.3 Found: C,71.9; H,6.89; N,8.64; S,13.1

조성물의 처방예

처방예 1. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온을 포함하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물 - 연고제

성분	함량
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온	0.5g
백납	4.0 g
콜레스테롤	1.6 g
백색바세린	잔량
세탄올	1.6 g
합계	100 g

처방예 2. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온을 포함하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물 - 겔제

성분	함량
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온	0.5g
에탄올	18 g
카놀린	5 g
1,3-부탄디올	5 g
글리세린	8 g
CMC-Na	9 g
젤라틴	3 g
메틸파라벤	0.1 g
프로필파라벤	0.2 g
정제수	잔량
합계	100 g

처방예 3. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온을 포함하는 미백 화장료 조성물 - 영양크림

성분	함량
트리에탄올아민	0.1 g
글리세린	3.0 g
부틸렌글리콜	3.0 g
유동파라핀	7.0 g
베타글루칸	7.0 g
카보머	0.1 g
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온	0.5g
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0 g
스쿠알란	5.0 g
세테아릴 글루코사이드	1.5 g
소르비탄 스테아레이트	0.4 g
폴리솔베이트 60	1.2 g
메틸파라벤	0.1 g
프로필파라벤	0.1 g
향	0.1 g
정제수	잔량
합계	100 g

처방예 4. 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1 H -큐나졸린-2-티온을 포함하는 미백 화장료 조성물 - 팩

함량	성분
에탄올	6.0 g
글리세린	4.0 g
폴리비닐 알코올	15.0 g
히아루론산 추출물	5.0 g
베타글루칸	7.0 g
알란토인	0.1 g
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온	0.5g
노닐 페닐 에테르	0.4 g
폴리솔베이트 60	1.2 g
메틸파라벤	0.2 g
프로필파라벤	0.1 g
향	0.1 g
정제수	잔량
합계	100 g

실험예 1: cAMP/단백키나제 A를 경유한 멜라닌 생성의 억제효과

알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 가한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 cAMP/단백키나제 A의 신호전이를 통하여 멜라닌을 생성한다 (Rasmussen, N., et al., Neuroendocrinol. Lett., 20:265-282, 1999; Scott, M. C., et al., J. Cell. Sci. 115:2349-55, 2002). 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 37℃ 그리고 5% CO₂ 조건에서 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 96-웰 플레이트의 웰당 2,500개씩 분주한 다음 24시간 배양한 후, 무 첨가 군, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 첨가군 및 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 (최종농도 1 nM)과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군으로 나누어 각각 3일간 배양한 다음 배지로 방출된 멜라닌의 양을 파장 405 nm에서의 흡광도 측정을 통하여 정량 하였다.

실험결과 무첨가군에서 3일간 배양한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 33.2±1.4 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였고 알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 첨가한 군은 143.9±1.6 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였다. 알파-멜라노사이트 자극 호르몬과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군은 시료농도 4 μM에서는 37.9±0.8 ㎍/ml, 2 μM에서는 44.4±9.5 ㎍/ml, 1 μM에서는 101.1±1.0 ㎍/ml, 0.5 μM에서는 126.5±5.5 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하여 시료에 용량의존적으로 미백효과를 나타내었고 (도 1a), 50%의 미백효과를 나타내는 농도 (EC₅₀)는 1.5 μM이었다. 동일한 실험모델에서 알부틴과 코직산의 미백효능 EC₅₀값는 각각 151 μM과 261 μM이었다. 따라서 cAMP/단백키나제 A의 신호전이를 통한 세포주 멜라노마(melanoma) B16의 멜라닌 생성에 대한 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로- 1H-큐나졸린-2-티온의 미백효능은 EC₅₀값 측면에서 알부틴 보다는 100배 그리고 코직산 보다는 170배 강함을 관찰하였다(도 1b).

실험예 2: cGMP/단백키나제 G를 경유한 멜라닌 생성의 억제효과

프로토포르피린 IX로 자극한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 일산화질소를 매개로 cGMP/단백키나제 G를 통해 멜라닌을 생성한다 (Romero-Graillet, C., et al., J. Biol. Chem., 271:28052-6, 1996). 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 37℃ 그리고 5% CO₂ 조건에서 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 96-웰 플레이트의 웰당 2,500개씩 분주한 다음 24시간 배양한 후, 무첨가군, 프로토포르피린 IX 첨가군 및 프로토포르피린 IX (최종농도 30 μM)과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군으로 나누어 각각 3일간 배양한 후 배지로 방출된 멜라닌의 양을 파장 405 nm에서의 흡광도 측정을 통하여 정량하였다.

실험결과 무첨가군에서 3일간 배양한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 43.4±0.8 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였고 프로토포르피린 IX를 첨가한 군은 135.2±1.9 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였다. 프로토포르피린 IX와 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군은 시료농도 1 μM에서는 52.5±5.8 ㎍/ml, 0.5 μM에서는 94.4±6.0 ㎍/ml, 0.25 μM에서는 105.2±0.9 ㎍/ml, 0.13 μM에서는 118.7±3.2 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하여 시료에 용량의존적 으로 미백효과를 나타내었고 (도 2a), 50%의 미백효과를 나타내는 농도 (EC₅₀)는 0.5 μM이었다. 동일한 실험모델에서 알부틴과 코직산의 미백효능 EC₅₀값은 각각 159 μM과 122 μM이었다. 따라서 cGMP/단백키나제 G의 신호전이를 통한 세포주 멜라노마(melanoma) B16의 멜라닌 생성에 대한 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 미백효능은 EC₅₀값 측면에서 알부틴 보다는 310배 그리고 코직산 보다는 240배 강함을 관찰하였다(도 2b).

실험예 3: 1-올레오일-2-아세틸글리세롤/단백키나제 C를 경유한 멜라닌 생성의 억제효과

1-올레오닐-2-아세틸글리세롤로 자극한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 단백키나제 C를 통하여 멜라닌을 생성한다 (Gilchrest, B. A., et al., Photochem. Photobiol., 93:1-10, 1996; Park, H. Y., et al., J. Biol. Chem., 274:16470-8, 1999). 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 37℃ 그리고 5% CO₂ 조건에서 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 96-웰 플레이트의 웰당 2,500개씩 분주한 다음 24시간 배양한 후, 무첨가군, 1-올레오일-2-아세틸글리세롤 첨가군 및 1-올레오일-2-아세틸글리세롤 (최종농도 200 μM)과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군으로 나누어 각각 3일간 배양한 후 배지로 방출된 멜라닌의 양을 파장 405 nm에서의 흡광도 측정을 통하여 정량 하였다.

실험결과 무첨가군에서 3일간 배양한 세포주 멜라노마(melanoma) B16은 49.8 ±1.0 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였고 1-올레오일-2-아세틸글리세롤을 첨가한 군은 109.4±0.2 ㎍/ml의 멜라닌을 방출하였다. 1-올레오일-2-아세틸글리세롤과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리한 군은 시료농도 0.5 μM에서는 57.7±2.9 ㎍/ml, 0.25 μM에서는 82.2±6.1 ㎍/ml, 0.13 μM에서는 106.3±0.1 ㎍/ml, 0.06 μM에서는 109.7±0.4 ㎍/ml로 멜라닌을 방출하여 시료에 용량의존적으로 미백효과를 나타내었고 (도 3a) 50%의 미백효과를 나타내는 농도 (EC₅₀)는 0.3 μM이었다. 동일한 실험모델에서 알부틴의 미백효능 EC₅₀값는 473 μM이었다. 따라서 단백키나제 C의 신호전이를 통한 세포주 멜라노마(melanoma) B16의 멜라닌 생성에 대한 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 미백효능은 EC₅₀값 측면에서 알부틴 보다는 1,570배 강함을 관찰하였다(도 3b).

실험예 4: 티노시나제 함량을 감소시키는 미백 메카니즘

10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 37℃ 그리고 5% CO₂ 조건에서 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 6-웰 플레이트의 웰당 2만개씩 분주하고 24시간 배양하였다. 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 (최종농도 1 nM)과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리하고 3일간 배양한 다음 세포를 포집하였다. 세포를 파쇄한 다음 원심분리하여 얻은 상징액을 효소원으로 사용한다. 효소원 20 ㎍을 함유한 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동 하였다. 이어 겔을 100 mM 인산 완충용액 (pH 6.8)으로 세척하여 SDS를 제거한 다음, 5 mM 도파를 함 유한 100 mM 인산 완충용액 (pH 6.8)으로 옮기고 37℃, 차광 하에 방치하여 검은색으로 염색되는 티노시나제의 함량을 농도계(densitometer)로 측정하였다. 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 3일간 배양한 세포주 멜라노마(melanoma) B16가 생성한 티로시나제 함량과 비교하여 동일한 배지에 알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 첨가하였을 때의 티로시나제 함량은 6-7배 증가하였다. 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 만을 가한 세포주 멜라노마(melanoma) B16이 생성한 티로시나제의 함량을 100%로 정할 때, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리하였을 때의 티로시나제 함량은 시료농도 4 μM에서는 17%, 2 μM에서는 35%, 1 μM에서는 83%, 0.5 μM에서는 92%의 상대 비율로 용량-의존적 억제효과를 나타내었다(도 4). 따라서 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온는 티로시나제의 함량을 감소시키는 메카니즘을 통하여 미백효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 5: 세포주 멜라노마(melanoma) B16에 대한 세포독성

10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에 현탁시킨 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 96-웰 플레이트에 웰당 2,500개씩 분주한 다음 37℃ 그리고 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 (최종농도 1 nM)과 시료인 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 동시에 처리하고 24시간 간격으로 트립판 불루 염색법을 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포의 숫자를 측정하였 다. 세포주 멜라노마(melanoma) B16을 10% 소태반 혈청을 함유한 DMEM 배지에 증식한 군과 비교하여 동일한 배지에 알파-멜라노사이트 자극 호르몬을 첨가한 군은 세포의 성장을 지연시키었으나 세포를 사멸시키는 독성은 없었다 (도 5a). 그리고 4일째 되는 날, 알파-멜라노사이트 자극 호르몬과 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온 (농도 0.5-4 μM)를 동시에 처리한 군은 알파-멜라노사이트 자극 호르몬 만을 가한 군과 비교하여 살아있는 세포의 숫자가 거의 동일하였으며 또한 세포를 사멸시키는 독성도 없었다(도 5b).

본 발명은 피부에 과도한 멜라닌 색소의 침착을 예방하거나, 이미 침착된 멜라닌 색소의 색을 엷게 하여 기미, 주근깨 등의 과색소 침착 질환을 개선하는 미백효과가 뛰어난 신물질 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 제공하며, 이의 제조방법, 이를 유효성분으로 포함하는 의약 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

Claims

하기 화학식 (1)로 표시되는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온.

(1)
하기 화학식 (4)로 표시되는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온에 로슨(Lawesson's; 2,4-bis-(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia- 2,4-diphosphetane 2,4-disulfide)시약을 반응시키는 것을 특징으로 하는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 제조방법.
제2항에 있어서, 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-온이 하기 화학식 (2)로 표시되는 (5-메틸-2-니트로벤질)펜에틸아민을 환원하여 하기 화학식 (3)으로 표시되는 4-메틸-2-(펜에틸아미노메틸)페닐아민을 얻고 여기에 1,1'-카보닐디이미다졸을 반응시켜 제조되는 것임을 특징으로 하는 6-메틸-3-펜에틸-3,4-디 히드로-1H-큐나졸린-2-티온의 제조방법.
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 유효성분으로서 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001~1중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물.
제4항에 있어서, 조성물의 제형이 크림제, 연고제, 겔, 로오션제, 액제, 또는 패치임을 특징으로 하는 과색소 침착 질환의 예방 및 치료용 의약 조성물.
6-메틸-3-펜에틸-3,4-디히드로-1H-큐나졸린-2-티온을 유효성분으로서 조성물 총 중량에 대해 0.0001~1중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 조성물의 제형이 유연화장수, 수렴화장수, 영양크림, 맛사지 크림, 엣센스, 팩, 겔, 로오션, 패치, 스프레이 또는 리퀴드 파우더임을 특징으로 하는 미백 화장료 조성물.