KR100694643B1

KR100694643B1 - 은행나무 수피로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리방법

Info

Publication number: KR100694643B1
Application number: KR1020060066084A
Authority: KR
Inventors: 이현정; 이학주; 제강훈; 서정곤; 이승진; 방선이
Original assignee: 바이오비즈(주)
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2007-03-14

Abstract

본 발명은 은행나무로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 은행나무로부터 분리한 신규 화합물 및 은행나무로부터 신규 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

그 방법은 은행나무를 알코올로 조추출하는 제 1 단계와, 전기의 은행나무 조추출물을 유기용매로 용매 분획하는 제 2 단계와, 전기의 용매 분획물을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(Sephadex column chromatography)로 분취하는 제 3 단계와, 전기의 세파덱스 분취물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분취하는 제 4 단계로 분리된 신규화합물은 하기 구조식(1)의 5-(3-hydroxyprophy)-6-methoxy-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-3-benzo[b]furancarbaldehyde를 분리하는 방법을 포함한다.

구조식1

Description

은행나무 수피로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리 방법{A NEW COMPOUND ISOLATED FROM BARK OF GINKGO AND SEPARATION METHOD THEREOF}

도 1은 은행나무 수피의 분획 모식도

도 2는 도 1의 은행나무 수피 메틸렌 클로라이드(methylene chlroride, CH2Cl2) 분획물인 GBD에서 신규 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 분리 모식도

도 3은 도 2의 GBD-2-5-2A의 EI-MS 스펙트럼

도 4은 도 2의 GBD-2-5-2A의 1H-NMR 스펙트럼

도 5는 도 2의 GBD-2-5-2A의 13C-NMR 스펙트럼

도 6은 콜라겐 유도 혈소판 응집에 대한 아스피린의 혈소판 항응고 활성을 나타낸 그래프

도 7은 콜라겐 유도 혈소판 응집에 대한 도 2의 GBD-2-5-2A의 혈소판 항응고 활성을 나타낸 그래프

도 8은 콜라겐 유도 혈소판 응집에 대한 징코라이드 A, B의 혈소판 항응고 활성을 나타낸 그래프

본 발명은 은행나무로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리 방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 은행나무 수피에서 혈전 치료 원료인 신규 화합물을은행나무로부터 분리한 신규 화합물, 이 화합물을 함유하는 항혈소판제 및 은행나무로부터 신규 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

이에 본 발명에서 이룬 은행나무 수피에서의 신규 화합물의 발견은 혈전 치료 원료 물질로서 아주 좋은 자원이라고 할 수 있다.

은행나무(Ginkgo biloba)는 은행나무과(Ginkgoaceae)에 속하는 낙엽교목으로서1), 많은 성분들이 밝혀졌다. 그 중에서 플라보노이드(flavonoid)에 관한 연구가 활발해지면서 다양한 생리활성과 약리작용이 밝혀지고 임상실험을 통해 의약품으로도 많이 개발, 시판되고 있다

은행나무에는 많은 유효 생리 활성 물질이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

은행나무 열매에는 페놀(phenol)성 화합물계인 징코올(ginkgol), 빌로볼(bilobal), 징코올산(ginkgolic acid) 등이 함유되어 있으며, 은행나무의 씨에는 청산배당체(cyanogenetic glycosides), 아미노산 등이 함유되어 있다. 잎에는 방향족 화합물, 특히 페놀성 화합물계, 플라보노이드 배당체(flavonoid glycosides) 및 단순 플라보노이드인 캠페롤(keampferol), 퀘르세틴(quercetin), 아이소람네틴(isorhamnetin), 루테오린(luteolin) 등과 테르페노이드(terpenoid) 화합물로 징코라이드(ginkgolide) 및 빌로발리드(bilobalid) 등이 함유되어 있다.

지금까지의 은행나무와 관련된 연구는 대부분이 은행나무의 잎이나 열매에서 이루어졌으나, 본 발명은 거의 연구가 이루어지지 않은 은행나무의 수피에서 신규 화합물을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중, 뇌경색 등의 뇌혈관 질환 및 심장질환 등의 순환기계 질환은 사망원인 1, 2위를 차지(2000년도 통계청 자료)하고 있는 성인병이다. 이러한 성인병은 현대사회로 발전하면서 식생활 양식의 변화 및 내외부적인 환경 스트레스로 인해 중장년층에서 빈번하게 발생하고 있다. 이들 질환의 주요 발병원인으로는 혈전(thrombus)으로 알려져 있으며, 혈전은 과잉 혈소판 응집에 의해 매개되는 병리현상으로 인식되고 있다. 한편, 혈소판은 혈관 손상시 콜라겐(collagen), 트롬빈(thrombin), 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate; ADP) 등과 같은 각종 작용물질(agonists)의 자극에 의해 활성화되어 점착반응(adhesion), 방출반응(secretion) 및 응집반응(aggregation)을 일으킨다. 이러한 반응들은 지혈(hemostasis)에 관련되어 있지만, 혈전증(thrombosis) 등을 포함하는 순환계 질환의 발병에 중요한 역할을 수행한다.

종래에 보고된 바에 의하면, 혈소판에 콜라겐, 트롬빈, ADP 및 아드레날린(adrenaline) 등의 자극이 가해지면, 혈소판 막 내에 존재하는 인지질 분해효소로서 포스포리파아제 C (phospholipase C)가 활성화되고, 이로 인해 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; PIP 2)가 분해되어, 그 결과 로 디아실글리세롤(diacylglycerol; DG)과 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(inositol-1,4,5-trisphosphate; IP가 생성된다. 이때 생성된 DG는 단백질 키나아제 C (C-kinase)를 활성화시켜, 40KDa 단백질의 인산화와, DG-리파아제 및 MG-리파아제의 활성화에 의한 아라키돈산(arachidonic acid)의 세포질로의 방출을 유도한다. 방출된 아라키돈산은 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenage)에 의해PGG 2 (prostaglandin endoperoxides prostaglandin G/PGH 2 (prostaglandin endoperoxides prostaglandin H로 전환되며, 이로부터 트롬복산 A 2 (tromboxane A 2; TX A 2)가 생성된다. 이들 트롬복산은 혈액응고, 혈소판 응집 및 혈전 형성 등에 중요하게 관여한다.

오랫동안 항혈소판제로 자리 매김해 온 아스피린(aspirin)은 버드나무 수피의 활성 성분인 살리신(salicin) 유도체로 가격에 비해 높은 활성을 나타낸다. 그러나 임상 의사들이 아스피린을 처방하는 것에 대해 출혈의 위험성으로 인해 아스피린의 사용을 점차 경계를 하고 있다.

현재 항혈소판 시장에서 플라빅스(plavix)가 항혈소판 치료법의 절대 표준 치료법으로 자리잡고 있으나, 출혈, 설사, 복통 등의 부작용을 가지고 있다.

지금까지 개발된 항혈소판제로는 cAMP와 cGMP의 생성을 촉진하여 Ca 2+ 의 동원을 억제하는 것으로 알려져 있는 데오필린(theopylline), 몰시도민(molsidomine), 베라파밀(verapamil) 및 니페디핀(nifedipine) 등과, TXA 2 의 생성을 저해함으로써 항혈소판 작용을 하는 아스피린, 이미다졸, 인도메타신 등의 비스테로이드계 화합물들이 알려져 있다. 그러나, 상기 언급한 약물을 비롯한 많은 항혈소판 제재, 항응고제, 혈전용해제들은 모두 정제된 화학물질로 인체에 투여하였을 때 지혈과다억제, 불임, 소화기 장애 등의 여러 부작용을 야기하는 문제점이 있다. 즉, 뇌출혈, 뇌혈전, 뇌경색, 심혈전, 동맥경화증 및 기타 순환기계 질환의 주요 원인인 혈전의 형성과 이를 매개하는 혈소판 응집 반응을 억제함으로써 상기 질환을 예방하고 치료할 수 있으나, 현재까지 개발된 의약품들은 그 부작용으로 인하여 이용에 한계가 있다. 따라서, 천연물로부터 항혈전 효과가 있는 물질로 인체에 무해하고 부작용이 없는 천연 항혈전제를 개발하는 것이 시급한 실정이다.

이처럼, 지금까지의 항혈소판제는 천연물이 아니므로, 여러 가지 부작용을 수반하였다. 이에 반해 본 발명은 은행나무 수피로부터 분리된 신규 천연 화합물로 항혈소판 활성을 측정하였다.

천연물을 이용한 징코민, 기넥신, 써큐란 등의 혈류 개선제가 시판되고 있으나, 이들은 모두 은행나무 잎의 추출 성분을 이용한 제제이며, 단일의 화합물이 아닌 여러 가지 물질의 혼합물이라고 할 수 있다. 이에 반해 본 발명은 은행나무에서 분리된 단일 성분을 이용하여 항혈소판 활성을 확인하였다.

또한, 최근 항혈전제는 혈관질환의 급격한 증가로 인해 엄청난 성장세를 이루고 있다. 대표적인 제품이 '아스피린' 과 '플라빅스' 로, 아스피린은 아주 오랜 역사를 가진 항혈전제이며, 플라빅스는 대표적인 항혈전제로써 현재 시장을 주도하고 있다. 그러나 관상동맥경화로 인한 협심증 때문에 심장혈관을 넓혀주는 스텐트 시술을 받은 환자에게는 (이 스텐트 시술후 철망 속에 혈전이 생겨 다시 혈류가 차단되는 스텐트 혈전증 현상이 발생한다) 보통 항혈전제인 아스피린과 플라빅스를 장기간 복용하게 되는데, CYP3A5란 간 효소가 활성화되지 않는 환자의 경우 거의 효과가 없다는 것이고 ,이 같은 현상은 특히 아스피린보다 플라빅스가 더 심한 것으로 밝혀졌다. 즉 CYP3A5 간 효소의 활성도가 떨어지는 환자의 경우 이 약물의 항 혈전 효과가 5분의 1수준으로 떨어졌다는 것이 최근 밝혀졌다. 이렇게 갈수록 항혈전제 역시 보다 적절한 치료를 위해서는 다양한 경로의 혈전 치료제 개발을 하여야 하고 단독요법 보다는 다양을 기전을 가진 항혈전제간 복합요법이 각광을 받고 있다. 이는 혈전이 응고되는 기전이 다르기 때문에 역시 다양한 기전을 가진 약물의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 그 목적은 목적은 은행나무 중에서도 그 껍질인 수피에 대하여 연구하던 중 특히 은행나무 수피를 용매로 추출하고 이 추출물을 분획하여 화합물 분리한 뒤 항혈소판 활성을 측정하였던바 이 화합물이 항혈소판 활성을 나타내는 신규 화합물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 은행나무의 수피를 용매로 추출하고 이 추출물을 분획하여 항혈소판에 대하여 활성을 가지는 신규 화합물을 규명함으로써, 은행나무 수피로부터 분리한 신규 화합물, 은행나무 수피로부터 신규 화합물의 분리 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 신규 단일 화합물이 콜라겐에 의하여 유도된 혈소판 응집반응을 효과적으로 억제할 수 있고, 은행잎 추출물의 유효성분인 징코라이드 A, B와 비슷한 효능을 가지고 벌목되는 은행나무의 잎뿐만 아니라 수피에서도 신규 화합물을 분리 기술을 이용하여 항혈전제 천연물 신약 물질 자체로 사용이 가능하고 천연 신규 화합물을 선도물질로 하여 구조적 활성 관계를 통한 유도체를 만들어 신약을 개발할 수 있는 신규화합물을 제공하는데 있다.

본 발명은 은행나무 수피로부터 분리한 신규 화합물인 하기 구조식(1)의 5-(3-hydroxyprophy)-6-methoxy-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-3-benzo[b]furancarbaldehyde와 이 화합물을 함유하는 항혈소판제를 포함한다.

구조식(1)

상기 구조식(1)의 신규 화합물은 항혈소판 활성을 나타낸다.

본 발명은 구조식(1)의 신규 화합물을 포함하는 항혈소판제용 약학적 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 항혈소판제용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하고 일반적인 의약제제의 형태로 사용될 수 있다. 구조식(1)의 신규 화합물을 포함하는 의약제제의 형태는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다.

구조식(1)의 신규 화합물에 대한 항혈소판 활성은 콜라겐-자극 혈소판 응집에 대한 활성에 의해 측정할 수 있다.

본 발명은 구조식(1)의 신규 화합물을 단독으로 사용하거나 또는 약학적 및 식품학적으로 허용되는 부형제 및 희석제를 포함하여 의약품, 음료 및 식품에 이용할 수 있다.

본 발명은 은행나무 수피로부터 상기 구조식(1)으로 나타낼 수 있는 신규 화합물의 분리 방법을 포함한다.

본 발명의 은행나무의 수피로부터 상기 구조식(1)으로 나타낼 수 있는 신규 화합물의 분리방법은

은행나무의 수피와 목부를 분리하는 단계와,

수피를 분쇄하여 알코올로 조추출하는 단계와,

전기의 은행나무 수피 조추출물을 유기용매로 분획하는 단계와,

전기의 용매분획물을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(Shephadex column chromatography)로 분취하는 단계와,

전기의 세파덱스 분취물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분취하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 은행나무는 잎, 목부, 수피, 뿌리 중에서 선택된 어느 하나를 사용하거나, 또는 둘 이상이 혼합된 혼합물, 보다 바람직하게는 둘 이상이 동일한 혼합비로 이루어진 혼합물을 선택하여 상기 구조식(1)의 신규 화합물을 분리할 수 있다.

알코올을 이용하여 은행나무 수피를 조추출시 알코올은 에탄올, 메탄올을 사용할 수 있다.

은행나무 수피 조추출물은 유기 용매를 사용하여 용매 분획할 수 있다. 이때 유기용매는 통상적으로 사용하는 유기용매라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 이러한 유기용매의 예로써 본 발명에서는 석유에테르(light petroleum ether; LPE), 메틸렌 클로라이드 (methylene chloride CH2Cl2) 및 에칠아세테이트(ethyl acetate EtOAc)를 사용할 수 있다.

용매분획을 거친 은행나무 수피의 분획물들은 세파덱스 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분취하고 이 분취물들을 다시 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분취하여 얻어진 분획물은 질량 스펙트라(elcrton impact mass spectrometer; EI-MS spectra) 및 핵자기공명 스펙트라(nuclear magnetic resornance spectra NMR spectra)를 실시하여 상기 구조식(1)의 신규 화합물을 확인할 수 있다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명의 일예로서 이들에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.

＜실시예 1＞ 은행나무 수피 분획물의 분리

분쇄한 은행나무 수피를 메탄올로 추출하여 수피의 조추출물을 얻었다.

전기의 조추출물을 용매분획하여 메틸렌 클로라이드 가용부(GBD)를 얻었다.

메틸렌 클로라이드 가용부를 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(Shephadex column chromatography, MeOH:EtOH=1:1)로 이용하여 50 ml씩 분취, 90개의 분취물을 얻어, 이들 각 분취물들을 박층 크로마토그래피(thin layered chromatography TLC, silica gel 60 F254, 전개용매 - toluene:ethyl formate:formic acid=5:4:1, v/v/v)에 전개시킨 후, UV lamp (254 nm)로 검색하여 5개의 분획물(GBD-1~GBD-5)로 나누었다.

전기의 5개의 분획물 중 두번째인 GBD-2 분획물을 다시 세파덱스 칼럼(MeOH:H2O=3:1)으로 10.0 g 씩 시료 분취기(fraction collector)로 분취, 100개의 분취물을 얻어 이들을 6개의 분획물(GBD-2-1~GBD-2-6)로 분리하였다.

전기의 6개 분획물 중 다섯번째인 GBD-2-5 분획물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography, CHCl3:MeOH=100:1)로 20.0 g 씩 250개씩 분취하여 5개의 분획물(GBD-2-5-1~GBD-2-5-5)을 얻었다.

전기의 5개의 분획물 중 두번째인 GBD-2-5-2 분획물을 preparative TLC (CHCl3:MeOH=10:1~ CHCl3:MeOH=3:1)로 정제하여 GBD-2-5-2A를 얻었다.

＜실시예 2＞

상기 실시예 1에서 얻은 GBD-2-5-2A에 대하여 EI-MS 스펙트라(electron impact mass spectrometer spectra)는JEOL JMS-SX102A (JEOL LTD, Japan)를 사용하여 측정하였고, 1D NMR (1 dimensional nuclear magnetic resonance)인 1H-NMR, 13C-NMR 및 DEPT (distortionless enhancement by polarization transfer)를 비롯하여 2D NMR인 1H-1H COSY (correlation spectroscopy), NOESY (nuclear overhauser and exchange spectroscopy), TOCSY (totally correlated spectroscopy), HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence), HMBC (heteronuclear multiple bond coherence) 등의 스펙트라는 Varian Unity-Inova 500 MHz를사용하여 측정하였다. 내부 표준은 TMS (tetramethylsilane)를 사용하였으며, 용매는methanol-d4를 사용하였다. 그 결과를 도 3, 도 4, 도 5에 나타내었다.

EI-MS m/z: 356 ([M]+, molecular ion), 312 (base ion).

HREI-MS m/z: 356.1268 ([M]+, calcd. for C20H20O6, 356.1268).

1H-NMR (500 MHz, methanol-d4): δ 1.89 (2H, m, H-9), 2.76 (2H, t, J = 7.5, 15.5 Hz, H-8), 3.60 (2H, t, J = 7.0, 13.5 Hz, H-10), 3.92 (3H, s, 3'-OMe), 3.99 (3H, s, 6-OMe), 6.80 (1H, s, H-7), 6.86 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5'), 7.33 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6), 7.38 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 7.53 (1H, s, H-4), 10.19 (1H, s, 3-CHO).

13C-NMR (125 MHz, methanol-d4): δ 32.38 (t, C-8), 34.72 (t, C-9), 55.23 (q, 3'-OMe), 55.44 (q, 6-OMe), 61.13 (t, C-10), 108.70 (d, C-7), 111.41 (d, C-2'), 113.04 (d, C-4), 115.32 (s, C-3a), 116.88 (s, C-1'), 116.97 (d, C-5'), 123.89 (d, C-6'), 127.59 (s, C-3), 140.11 (s, C-5), 141.45 (s, C-7a), 144.77 (s, C-6), 149.89 (s, C-3'), 155.64 (s, C-2), 167.74 (s, C-4'), 187.36 (d, 3-CHO).

COSY: H-9 ↔ H-8/H-10, H-5' ↔ H-6'.

NOESY: H-9 ↔ H-8/H-10, H-8 ↔ H-10/H-4', 3'-OMe ↔ H-2', 6-OMe ↔ H-7, H-5' ↔ H-6', H-6' ↔ 3-CHO.

HMBC: H-9 → C-8/C-10/C-5, H-8 → C-9/C-10/C-4/C-5, H-10 → C-8/C-9, 3'-OMe → C-3, 6-OMe → C-6, H-7 → C-7a, H-5' → C-1'/C-3', H-6 → C-2'/C-2/C-4', H-2' → C-6'/C-3'/C-2/C-4', H-4 → 7a, 3-CHO → C-3a/C-3.

상기의 결과로부터 GBD-2-5-2A 분획물은 5-(3-hydroxyprophy)-6-methoxy-2- (3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-3-benzo[b]furancarbaldehyde이다

구조식(1)

상기 구조식(1) 물질의 분자식은 C20H20O6이며, 분자량은 356이다.

＜시험예 1＞ 항혈소판 활성 측정

상기 실시예 2에 의해 은행나무 수피로부터 분리한 구조식(1)의 신규 화합물인 5-(3-hydroxyprophy)-6-methoxy-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-3-benzo[b] furancarbaldehyde에 대하여 항혈소판 활성을 측정하였다.

은행나무 수피에서부터 동정한 신규 화합물로 콜라겐-자극 혈소판 응집에 대한 활성은 농축된 사람 혈소판-풍부 혈장(Platelet-Rich-Plasma PRP)를 먼저 제조한다. 본 발명에서 사용한 PRP는 한림대학교 병원에서 지원자들의 혈액을 채취하여, 1,000 rpm으로 실온에서 10분 동안 원심분리하여 상층의 순수한 PRP를 얻고, 이를 다시 3,000 rpm으로 실온에서 10분 동안 원심분리하여 상기 얻어낸 PRP를 혈소판이 없는 혈장(platelet-Poor Plasma; PPP)및 혈소판(platelet; PLTs)으로 분리하였다. 그 후, 다음과 같은 방법에 의해서 농축된 PRP를 제조하였다. 즉, 적당량의 상층 PPP로 PLTs을 현탁한 후, UV/가시 분광기의 660 nm에서의 흡광도 측정값을 이용하여, 여분의 PPP로 더 희석하여 5×108 혈소판/㎖을 함유한 농축된 PRP를 제 조하였다. 이때, 660 nm에서 OD값이 1.1이면, 1×108 개의 PLTs를 의미한다. 본 발명에 사용된 세척 완충액은 129 mM NaCl, 10.9 mM Na·시트르산 디하이드레이트, 8.9 mM NaHCO3 , 1 mg/ml 포도당, 10 mM 트리스-히드록시메틸아미노 메탄, 2.8 mM KCl, 0.8 mM KH2 PO4 , 2 mM EDTA이 함유된 pH 6.5의 완충액을 사용하였다. 또한, 본 실험에 사용된 현탁 완충액은 상기 세척 완충액 중 EDTA만을 첨가하지 않은 pH 6.9의 완충액을 사용하였다.

준비된 농축 PRP을 이용하여 신규 화합물에 대한 혈소판 응집 억제효과를 다음과 같은 방법에 의해서 검사하였다. 우선, 농축된 PRP으로 500㎕의 In vitro 반응계를 조성하였다. 농축된 PRP를 37℃에서 3분 동안 안정화시킨 후, 자극제인 콜라겐(Chrono-LogCo.)을 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 5분간 응집반응을 유도하였다. 이를 대조군으로 사용하였다. 한편, 상기와 동일한 반응계에 신규화합물을 처리하고, 3분 동안 반응시킨 후, 상기와 동일한 방법에 의해서 콜라겐으로 6분간 자극하여 응집을 유도한 후 응집된 혈소판을 측정하였다. 혈소판 응집은, 37℃에서 AGGREGOMETER(Chrono-Log Co.)를 이용하여 빛 투과도(light transmission) 변화로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 도 6, 도 7, 도 8에 나타내었다.

표 1은 아스피린, 신규 화합물, ginkgolide A, 및 B의 항혈소판 응집 활성을 정리한 것이다. 혈소판 응집 인자인 ADP, 콜라겐, 아라키돈산에 대한 결과를 나타낸 것으로 아스피린은 ADP, 콜라겐 두 응집 인자에 대해 각각 IC(inhibitory concentration)50이 316, 203 uM로 나타났고, 신규 화합물, ginkgolide A, B의 경우, 응집인자인 ADP에는 효과를 나타내지 않았으며, 콜라겐 자극 혈소판 응집 억제 에 있어서는 각각 IC50이 680, 482, 480 uM로 나타났다. 신규 화합물의 경우 아라키돈산을 응집인자로 했을 경우 1,000 uM, 즉 1 mM 이상을 처리해야만 응집이 일어났으며 ginkgolide A, B는 아라키돈산 자극 혈소판 응집 반응은 일어나지 않았다.

도 6은 콜라겐 자극 혈소판 응집에 대한 아스피린의 저해 정도를 나타내는 그래프로서 농도 의존적으로 혈소판 응집 저해의 결과를 보여주고 있다. 도 7은 콜라겐 자극 혈소판 응집에 대한 은행나무에서 분리된 신규 화합물의 저해 정도를 나타내는 그래프로서 신규 화합물이 농도 의존적으로 콜라겐 자극 혈소판 응집을 억제하는 효과를 보여주는 그래프이다. 도 8은 콜라겐 자극 혈소판 응집에 대한 징코라이드 A, B에 대한 각각의 응집 저해 효능을 보여주는 그래프이다. 역시 농도 의존적으로 혈소판 응집 억제 효능을 보여주고 있다.

표1. 아스피린, 신규 화합물, 징콜라이드 A, B의 항 혈소판 응집 활성

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 은행나무 수피로부터 분리하는 신규 한 화합물은 상기 실시예 및 시험예로부터 항혈소판 활성을 가짐을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 은행나무 수피로부터 분리하는 신규한 화합물을 함유하는 항혈소판제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 화합물은 천연물질이기 때문에 합성화합물에 의한 여러가지 부작용이 없으며 은행잎 또는 벌목되는 은행 수피에서도 혈전 효능의 천연 신규 화합물을 추출하여 콜라겐-자극 혈소판 응집 억제 효능을 가진 천연 혈전 치료제로 활용이 가능하다.

또한, 은행나무 수피로부터 분리한 신규화합물은 콜라겐에 의해 유발되는 혈전형성을 억제할 수 있다.

또한, 신규 화합물질이 혈전형성에 중요한 역할을 수행하는 콜라겐에 의한 세로토닌의 분비를 억제할 수 있고, 혈전형성에 관련된 신호전달 과정에서 매개자로서 역할을 수행하는 구아닐레이트 사이클라아제의 활성을 억제할 수 있는 가능성과 혈전형성의 이차 신호전달 물질로서 칼슘 이온의 세포질내 증가도 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 화합물이 종래에 항혈전 물질로서 이용되었던 징코라이드 A, B와 유사한 효과를 제공하여 신규화합물을 이용한 조성물은 항혈전 효과가 우수하며, 항혈전을 수반하는 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸중 뇌경색 등의 질환에 대하여 치료에 이용될 수 있다.

Claims

은행나무 수피로부터 분리한 하기 구조식의 신규 화합물.
은행나무를 알코올로 조추출하는 제 1 단계와,

전기의 은행나무 조추출물을 유기용매 메틸렌 클로라이드(methylene chloride, CH2Cl2)을 이용하여 용매 분획하는 제 2 단계와,

전기의 용매 분획물을 세파덱스 칼럼 크로마토그래피(Sephadex column chromatography)로 분취하는 제 3 단계와,

전기의 세파덱스 분취물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분취하는 제 4 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 구조식의 신규 화합물의 분리 방법.
제 2 항에 있어서,

제 1 단계의 은행나무는 은행나무의 수피, 목부, 뿌리, 잎 중에서 선택된 어느 하나를 사용하거나 또는 둘 이상의 혼합물을 선택하여 조추출함을 특징으로 하는 분리 방법.
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