KR100648086B1

KR100648086B1 - 히스타민 방출, 인터루킨-6의 분비 및/또는 호중구에 의한활성산소의 분비 억제제로서의 부들 줄기 추출물

Info

Publication number: KR100648086B1
Application number: KR1020040042170A
Authority: KR
Inventors: 남기혜
Original assignee: 남기혜
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2006-11-24
Also published as: KR20050117013A

Abstract

히스타민 방출, 인터루킨-6의 분비 및/또는 호중구에 의한 활성산소의 분비 억제제로서의 부들(Typha Latifolia L.) 줄기 추출물이 개시된다. 이러한 부들 줄기 추출물은 히스타민 방출과 관련된 알레르기성 질환, 특히 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 및 알레르기성 피부염, 인터루킨-6의 분비와 관련되고/거나 호중구에 의한 활성 산소의 분비에 관련된 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

부들, 인터루킨-6, 히스타민, 호중구

Description

히스타민 방출, 인터루킨-6의 분비 및/또는 호중구에 의한 활성산소의 분비 억제제로서의 부들 줄기 추출물 {Extract extracted from a Typha Latifolia's stem as an inhibitor of histamine release, Interleukin-6 secretion and/or secretion of reactive oxygen species by neutrophil}

도 1은 본 발명의 부들 줄기 추출물이 자극제(PMA+A23187)에 의한 SD 래트 비만 세포의 자극으로 인해 분비되는 인터루킨-6과 인터루킨-8의 분비 억제에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 부들 줄기 추출물이 호중구의 수적 변화에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 3은 본 발명의 부들 줄기 추출물의 NTP 환원능에 대한 그래프이다.

도 4는 본 발명의 부들 줄기 추출물의 세포 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 항알레르기성 및/또는 항염증성 생약 추출물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 히스타민 방출, 인터루킨-6의 분비 및/또는 호중구에 의한 활성산소 의 분비 억제제로서의 부들(Typha Latifolia L.) 줄기 추출물에 관한 것이다.

최근에, 다양한 원인에 의한 알레르기성 질환이 급증하고 있다. 이러한 알레르기성 질환의 대표적인 예로는 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 알레르기성 피부염 등이 포함된다. 현재, 알레르기 질환을 앓고 있는 환자의 수는 전체 인구의 약 20% 정도로 추정되며, 어린이의 경우에는 20%를 넘는 것으로 추정된다. 이러한 알레르기를 유발시키는 원인(알레르겐)의 비제한적인 대표적인 예로는 꽃가루, 곰팡이, 집먼지진드기, 바퀴벌레, 애완동물(예, 개, 고양이 등), 음식물(예, 식품 첨가물 포함), 환경의 변화, 각종 대기 오염물질 등을 들 수 있다.

알레르기성 질환은 알레르겐(allergen)이라 불리우는 알레르기 유발물질이 특이체질의 생체에 접촉되거나 생체 내로 유입(침투)됨으로써 촉발된다. 이후, 생체 내에서는 유입(침투)된 알레르겐(항원)에 대항하여 면역글로불린 E(IgE)라는 항체가 생성되고, 생성된 IgE는 비만 세포(mast cell)에 결합된다. 비만세포 내에는 알레르기를 유발시키는 히스타민을 포함한 화학물질이 함유되어 있다. 이후, 알레르겐이 생체내로 재차 유입(침입)되면 IgE와 결합하여 면역반응(항원-항체 반응)이 일어나고, 이 과정에서 비만 세포의 벽이 파괴되면서 히스타민과 같은 화학물질이 분비된다. 이러한 알레르기성 질환은 IgE의 생성을 억제하거나 세포-표면 IgE의 교차 결합에 의해 활성화되는 효과 과정을 차단함으로써 치료될 수 있다. 또는, 이러한 알레르기성 질환은 히스타민의 방출을 억제함으로써 예방 및 치료될 수 있다. 이러한 알레르기성 질환의 대부분은 염증으로 발현되거나 염증을 동반한다.

염증은 외부 세균의 침입에 의하거나 면역반응의 결과에 의해 생기는 농양의 병리적 상태를 의미한다. 염증 반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 원상태로 재생시키기 위한 생체 방어 반응으로서, 생체의 세포나 조직의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종의 알레르기 유발물질)에 의해 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개 인자 및 면역 세포가 관련되어 효소활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증 반응은 외부 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증 반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성염증)이 되며, 수혈, 약물 투여, 장기 이식 등의 치료 과정에서도 장애요인이 된다.

이러한 염증 반응에는 사이토카인(cytokine)이라는 생물활성인자가 관여하는데, 이러한 사이토카인은 면역계, 조혈계, 내분비계 등 생체의 여러 가지 고차 기능을 유지하는 데에 중요한 역할을 하며, 면역반응, 염증반응 및 조혈반응 등의 생체 방어에 중요한 역할을 담당하고 있다. 사이토카인의 결손은 면역부전 등의 중대한 선천 이상을 일으키는 한편, 그 과잉 생산은 궤양성 대장염 등의 만성 염증성 질환, 위염, 만성 관절 류마티즘 등의 자가 면역 질환 등과 같은 질환과 관련이 있다.

사이토카인은 히스타민이나 프로스타글린딘 등의 저분자화학물질은 포함하지 않고, 면역글로불린이나 호르몬도 여기에서는 제외한다. 이러한 사이토카인은 임파구에 의해 생성되는 림포카인(lymphokine)과 단구 및 매크로파아지에 의해 생성되는 모노카인(monokine) 뿐만 아니라 백혈구의 세포간 전달 물질로서의 인터루킨(interleukin; IL), 바이러스 감염시에 생성되는 인터페론, 조혈에 작용하는 콜로니 자극 인자, 그밖에 종양괴사인자(tumor necrosis factor: TNF), 혈구계 세포, 상피세포, 섬유아세포를 포함한 각종 세포에서 분비되는 생리활성물질이 포함된다.

이들 중에서, 인터루킨(interleukin)은 백혈구에 의해 생성되고 그 자신 혹은 그 밖의 백혈구의 분화, 증식, 기능 등에 영향을 주는 분자의 총칭으로서, 면역 응답의 발현이나 조절에는 면역계의 세포에서 유래하는 많은 액성 인자가 관여하여 복잡한 네트워크를 형성한다. 염증 반응에 관여하는 대표적인 인터루킨으로는 인터루킨-1, 인터루킨-6 및 인터루킨-8이 있으며, 인터루킨-1 (IL-1; "내인성발열인자"로도 언급됨)은 전신염증반응의 대부분에 관여하고, 인터루킨-6 (IL-6; "B 세포분화인자"로도 언급됨)은 대부분의 염증 반응 발현에 관여, B 세포를 플라스마세포로 분화시켜 항체 생성을 증강시키며, 인터루킨-8 (IL-8)은 호중구의 강력한 유주인자로 염증발현에 관여한다. 이러한 인터루킨 이외에, 종양괴사인자(TNF)도 염증 반응에 관여한다.

원치 않는 사이토카인 활성과 관련된 질환의 비제한적인 예로는 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 패혈성 관절염(septic arthritis), 소리아틱 관절염(psoriatic arthritis), 류마티스열(rheumatic fever), 통풍(gout), 리이터 증후군(Reiter's syndrome), 골다공증(osteoporosis), 당뇨병(diabetes), 및 크론즈 질환(Crohn's disease)과 궤양성결장염(ulcerative colitis)을 포함한 염증장병(inflammatory bowel diseases), 췌장염(pancreatitis), 게실염(diverticulitis), 패혈증(sepsis), 셉틱 쇼크(septic shock), 독소충격증후군(toxic shock syndrome), 및 천식(asthma), 만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 기관지염(bronchitis), 공기증(emphysema), 낭섬유증(cystic fibrosis) 및 급성호흡곤란증(acute respiratory distress)을 포함한 호흡계 질환, 폐 및 간의 유착성 질환(fibrotic diseases), 중추신경계 질환, 예컨대 알쯔하이머 질환, 근위축성축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 근육퇴행위축(muscular dystrophy) 및 다발성경화증(multiple sclerosis), 감염 또는 암에 이차적인 카켁시아(cachexia), 후천성면역결핍증에 이차적인 카켁시아(cachexia), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 다발골수종(multiple myeloma), 신장염(nephritis), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 대장염 및 간염이 있다. 특히, 인터루킨-6의 분비량 증가와 관련된 질환의 비제한적인 예로는 골다공증, 류마티스관절염, 고칼슘혈증, 다발골수종, 카켁시아, 신장염 및 전신홍반루푸스가 있다.

이러한 염증과 관련한 질환에는 다양한 항염증제가 이용된다. 이러한 항염증제의 대표적인 예로는 인도메타신(indomethacin)이 있다. 인도메타신은 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug)의 일종으로서, 관절염(arthritis)에 동반하는 심한 통증을 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 최근에 는 이의 종양 성장 저해 효능도 보고되어 있다.

그러나, 이러한 인도메타신은 아스피린천식(비스테로이드성 항염증진통제 등에 의한 천식발작의 유발) 또는 그 병력이 있는 환자와 디플루니살, 트리암테렌을 투여중인 환자에게는 금기되어야 하고, 드물게 재생불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 과립구 감소, 백혈구 감소, 혈소판 감소, 점상 출혈, 골수 장애 또는 자반, 혈소판 기능저하(출혈시간 연장) 등의 혈액 장애가 나타날 수 있다. 또한, 고령자에게 투여하는 경우에는 상기한 부작용이 나타나기 쉬우므로 각별히 유의해야 한다.

한편, 부들은 주로 연못이나 습지에서 서식하는 다년생 수생 식물로서, 큰부들(Typha Latifolia L.), 부들(Typha orientalis Prosl), 애기부들(Typha angustata Bory et Chaub), 좀부들 등이 있다. 부들은 화서가 크고 굵으며 수꽃이 암꽃의 바로 위에 붙어 있으며, 애기부들은 암꽃이 가늘고 수꽃도 가느다란 것이 암꽃과 사이를 두고 위쪽에 붙는다. 좀부들은 암꽃의 화서가 비엔나 소시지 모양으로 타원형을 하고 있다. 부들과 애기부들이 다년초인데 비해 좀부들은 1년초이며 얕은 물이 있는 곳이나 습지에서 서식한다. 본원에서 사용되는 용어 "부들"은 달리 명시되지 않는 한 상기한 부들 중에서 큰부들을 언급하는 것으로 이해되어야 한다.

이러한 부들은 예부터 여러 가지 용도로 이용되어 왔는데, 그 중에서 줄기는 돗자리를 만드는데 이용되었고, 잎은 자리, 발, 멍석 등을 만드는데 이용되어 왔다. 또한, 부들은 전통적으로 한방뿐만 아니라 민간요법으로도 많이 이용되어 왔다. 특히, 한방에서는 포황이라 불리우는 꽃가루를 이뇨제, 지혈제, 통경제 뿐만 아니라 산후 복통, 폐경으로 아랫배가 늘 더부룩할 때에 효과가 있다고 알려져 있다. 민간요법으로는 잎을 달여 당뇨병 치료제, 방부제 등으로 이용되고 있다. 부들의 근경도 또한 약재로서 이용되는데, 특히 장출혈, 괴혈병, 사마귀와 종기를 치료하기 위한 약재로서 이용된다. 그러나 이러한 부들의 효능에도 불구하고 어떤 부들은 독성도 있는 것으로 알려져 있어 이들의 사용에 유의해야 한다.

또한, 부들은 생육이 빨라 1년에 거의 1.5~2m까지 성장하며, 수질 정화 능력이 우수하여 수질 정화용 자원식물로도 이용된다. 그러나 부들의 줄기와 잎의 대량 사용처가 마땅치 않아 문제가 되고 있다. 이들의 줄기를 베는 데에는 많은 노력과 경비가 들어가며, 그렇다고 해서 방치하게 되면 수중에 잠겨 또 다른 수질오염의 원인이 된다.

놀랍게도, 본 발명자는 부들의 줄기로부터 수득한 추출물이 항알레르기성 효능과 항염증 효능이 탁월함을 후술하는 실험을 통해 확인하였다. 또한, 본 발명자는 부들 줄기 추출물의 항염증 효능이 인도메타신의 항염증 효능 보다 우수하다는 것도 후술하는 대조 실험을 통해 확인하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 세포 독성이 없으면서 항알레르기성 효능 뿐만 아니라 항염증성 효능도 우수한 천연 추출물을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소정의 추출 방법으로 추출 한 부들 줄기 추출물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 부들 줄기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 저급 알코올 또는 이들의 혼합물에 의해 추출될 수 있다. 또한, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트에 의해서도 추출될 수 있다. 또한, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 용매로서 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트를 이용하여 부들 줄기의 분획 추출물 형태로 추출될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 소정의 온도, 예를 들어 25℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 80℃, 보다 특히 약 60℃의 온도에서 중탕에 의한 방식으로 추출될 수 있다. 가장 바람직한 방법은 60℃의 온도 조건하에 중탕에 의한 방식으로 추출하는 것이다.

본 발명의 부들 줄기 추출물은 후술되어 있는 실시예에 입증된 바와 같이 비만 세포에서의 히스타민 방출, 인터루킨-6의 분비 및/또는 호중구에 의한 활성산소의 분비를 억제하는 데에 효과적이다.

따라서, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 히스타민 방출과 관련된 알레르기성 질환, 인터루킨-6이 원인이 되고/거나 호중구의 활성산소 분비와 관련된 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

하나의 구체예로서, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식, 알레르기성 피부염 등을 예방하거나 치료하는데 유용하다.

또 다른 구체예로서, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 단독으로 또는 약제학적 으로 허용되는 담체와 함께 원치 않는 사이토카인 활성과 관련된 질환의 예방 및 치료에도 이용될 수 있다.

상기한 구체예에서, 상기 원치 않는 사이토카인 활성과 관련된 질환으로는 골관절염(osteoarthritis), 류마티스관절염(rheumatoid arthritis), 패혈성 관절염(septic arthritis), 소리아틱 관절염(psoriatic arthritis), 류마티스열(rheumatic fever), 통풍(gout), 리이터 증후군(Reiter's syndrome), 골다공증(osteoporosis), 당뇨병(diabetes), 및 크론즈 질환(Crohn's disease)과 궤양성결장염(ulcerative colitis)을 포함한 염증장병(inflammatory bowel diseases), 췌장염(pancreatitis), 게실염(diverticulitis), 패혈증(sepsis), 셉틱 쇼크(septic shock), 독소충격증후군(toxic shock syndrome), 및 천식(asthma), 만성폐쇄폐질환(chronic obstructive pulmonary disease: COPD), 기관지염(bronchitis), 공기증(emphysema), 낭섬유증(cystic fibrosis) 및 급성호흡곤란증(acute respiratory distress)을 포함한 호흡계 질환, 폐 및 간의 유착성 질환(fibrotic diseases), 중추신경계 질환, 예컨대 알쯔하이머 질환, 근위축성축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 근육퇴행위축(muscular dystrophy) 및 다발성경화증(multiple sclerosis), 감염 또는 암에 이차적인 카켁시아(cachexia), 후천성면역결핍증에 이차적인 카켁시아(cachexia), 고칼슘혈증(hypercalcemia), 다발골수종(multiple myeloma), 신장염(nephritis), 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus), 대장염 및 간염이 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 인터루킨-6의 분비량 증가와 관련된 질환을 예방하거나 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 인터루킨-6의 분비량 증가와 관련된 질환의 예로는 골다공증, 류마티스관절염, 고칼슘혈증, 다발골수종, 카켁시아, 신장염 및 전신홍반루푸스가 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 환자의 체중(kg) 당 0.1mg 내지 200mg의 양(건조 중량)으로 투여하는 것이 바람직하다. 이러한 투여량은 환자의 질환, 연령, 성별 및 체중 및 투여 경로, 및 질환의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 이러한 투여량은 당업자에 의해 환자의 상기한 면과 그 밖에 고려될 수 있는 사항을 고려하여 충분히 선택될 수 있다.

또한, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 약제 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이러한 담체, 부형제, 및 희석제의 비제한적인 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일이 있다.

본 발명에 따른 부들 줄기 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀션, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 외용제 및 멸균 주사 액제 형태로 제형화될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용 되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구 투여용 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함된다.

또한, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 알레르기 반응과 관련된 하나 이상의 증상을 경감시키는 데에 활성인 하나 이상의 추가 성분과 함께 이용될 수 있다. 상기 추가 성분의 예로는 단기간 작용성 β2 아드레날린성 아고니스트, 장기간 작용성 β2 아드레날린성 아고니스트, 항히스타민제, 포스포다이에스테라제 억제제, 항콜린성 작용제, 코르티코스테로이드, 염증 매개물질 방출 억제제, 및 류코트리엔 수용체 안타고니스트가 있으며, 이들로 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명은 첨부된 도면과 함께 하기의 실시예로 설명된다. 본 발명이 하기의 실시예로 설명되지만, 본 발명이 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 부들 줄기 추출물의 제조

건조 상태의 부들 줄기 260g을 3차 증류수 10L에 가한 후, 60℃의 온도 조건하에서 셰이킹 인큐베이터(shaking incubator)에서 총 10시간 동안(4시간, 2시간, 4시간) 추출하였다(6L). 그런 다음, 이를 3회 여과한 후, 증발기에 의해 농축시켰다(농축액 300mL). 그런 다음, 생성된 농축액(300mL)을 -40℃에서 동결 건조시켜 원하는 부들 줄기 추출물(14.37g, 5.52%)을 수득하였다.

실시예 2 : 부들 줄기 추출물의 항알레르기 효능

본 실시예에서는, 하기와 같은 일련의 실험을 통해 부들 줄기 추출물(실시예 1로부터 수득한 추출물 이용)의 항알레르기성 효능을 평가하였다. 실험 동물로는 성장이 완료된 체중이 200g인 6주령 SD (Sprague-Dawley) 래트(rat)를 이용하였고, 부들 줄기 추출물의 알레르기 억제능 평가의 척도로는 히스타민 분비량의 억제 정도를 기준으로 하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

(1) 비만 세포의 유리

래트(체중: 200g; 연령: 6주령)를 클로로포름으로 마취시킨 후, 0.1% 젤라틴을 함유하는 티로드 완충액 B (137mM NaCl, 12mM NaHCO₃, 2.7mM KCl, 0.3mM NaH₂PO _4, 및 5.6mM 글루코오스, pH 7.4) 약 30mL를 복강내로 주입하고, 90초 동안 복벽을 가볍게 마사지하여 비만 세포가 분리되게 하였다. 그런 다음, 상기 래트의 복벽 중앙선을 조심스럽게 절개하여 복강 세포를 함유한 액을 파스퇴르(pasteur) 피펫으로 뽑아낸 후 튜브에 담았다(전체 비만 세포 중 26~28% 포함). 수득한 복강 세포를 실온에서 150xg로 10분씩 2회 원심분리시킨 후, 분리된 상층액은 버리고 나머지는 1mL의 티로드 완충액 B로 재부유시켰다(원심분리기 1500rpm, 5분). 부유액 중의 비만 세포는 22.5% w/v MTZ (metrizamide; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 이용하여 분리, 정제하였다. 즉, 1mL의 부유액을 2mL의 22.5% w/v MTZ에 살며시 올린 후 섞이지 않도록 조심스럽게 400xg로 15분 동안 원심분리한 후, 침전된 세포를 취하였다. 이때, MTZ의 밀도(1.120g/mL)가 높아서 가벼운 세포는 위에 뜨고 무거운 세포(즉, 비만세포)는 밑에 가라앉는다. 분리된 상층액은 진공 펌프를 이용하여 제거하였다. 분리된 래트의 복강 비만 세포에 α-F (α-MEM과 FBS의 1:1 혼 합 용액) 3mL를 넣고 세척하였다. 이때, 상기 혼합 용액은 가온된 상태로 사용하였다(차가운 상태이면 비만 세포가 심한 충격에 의해 히스타민을 분비하게 되므로 피해야 함). 세척된 상기 비만 세포를 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 튜브에 α-F 배지 1mL를 첨가하고 혼합시켰다. 그런 다음, 이로부터 10μL를 뽑아낸 후 슬라이드글라스(Hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하고, 세포의 수가 2x10⁵ cells/mL가 되도록 에펜돌프 튜브에 담았다.

(2) 비만 세포로부터 히스타민의 유리

그런 다음, 분리한 비만 세포(2x10⁵ cells/mL)를 α-MEM과 FBS를 1:1로 혼합한 배지에서 20분 동안 배양하여 안정화시킨 후, 실시예 1에서 제조한 부들 줄기 추출물을 농도별로 처리하여 배양하였다. 비만 세포의 수를 동일하게 하여 A (어떠한 처리도 하지 않은 대조군), B (Compound 48/80 (6mg/L; Sigma)를 첨가한 실험군) 및 C (실시예 1로부터 수득한 부들 줄기 추출물 + Compound 48/80을 첨가한 실험군) 군으로 나누어 담았다. A 대조군은 세포의 안정을 위해 인큐베이터 배양기에서 10분 동안 안정화시켰고, B 실험군은 세포의 안정을 위해 Compound 48/80을 첨가한 후 20분 동안 안정화시켰으며, C 실험군은 실시예 1로부터의 부들 줄기 추출물을 첨가하여 30분 동안 안정화시킨 후 Compound 48/80을 첨가하여 다시 20분 동안 안정화시켰다. 그런 다음, A, B 및 C를 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다.

(3) 비만 세포에서 유리된 히스타민의 분리

래트의 복강 비만 세포로부터 유리된 히스타민을 측정하기 위해 에펜돌프 튜브에 샘플 500μL, 0.1N HCl 450μL 및 60% 과염소산 용액 50μL를 첨가하여 혼합한 후, 원심분리(1,500rpm, 20분)하였다. 분리된 상층액 800μL를 5N NaOH 용액 500μL, 증류수 3mL, n-부탄올 10mL 및 NaCl 1.2g이 혼합된 혼합물이 들어 있는 시험관에 넣고, 이를 20분 동안 교반시킨 후 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상기 부탄올층 8mL를 50mL 용량의 시험관에 넣고, 여기에 0.1N HCl 용액 37mL 및 n-헵탄 10mL를 첨가하여 20분 동안 교반시킨 후, 2,000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 수득된 수층 2mL에 1N NaOH 용액 400μL와 1% o-프탈디알데히드 용액 100μL를 첨가하고 수욕상(37℃)에서 3분 동안 반응시킨 다음, 3N HCl 용액 200μL를 첨가하고 혼합한 후 형광흡광광도계(λex=360nm, λem=440nm)를 이용하여 형광도를 측정하여 분석하고, 히스타민 유리 억제율(%)을 하기 수학식 1에 따라 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.

	히스타민 분비 억제율 (%)
부들의 줄기 2g/증류수 240mL	12.2% (평균)
부들의 줄기 200g/증류수 360mL	30.0% (평균)

상기 표 1를 통해 알 수 있는 바와 같이, 증류수 200mL에 부들 줄기 2g을 넣어 추출한 추출물의 경우에는 12.2% (10.7%와 13.6%의 평균 억제율)의 히스타민 분비 억제율을 나타내었고, 증류수 360mL에 부들 줄기 200g을 넣어 추출한 추출물의 경우에는 30.0%의 히스타민 분비 억제율을 나타내었다. 이는 부들의 줄기 추출물이 히스타민의 분비 억제에 효능이 있음을 입증한다. 더 나아가, 상기한 표 1의 데이터는 부들 줄기 추출물의 농도 증가에 따라 히스타민 분비 억제율이 증가함을 보여준다. 요약하면, 부들 줄기 추출물이 히스타민 수준 증가와 관련된 알레르기성 질환에 농도 비례적으로 효능이 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 3 : 부들 줄기 추출물의 항염증 효능

본 실시예에서는 부들 줄기 추출물의 항염증 효능을 알아보기 위해 SD 래트의 비만 세포를 이용하여 분비되는 염증성 사이토카인, 즉, 인터루킨-6 (IL-6) 및 인터루킨-8 (IL-8)의 양을 측정하였다. 본 실시예의 실험에서 사용한 비만 세포는 IgE 수용체를 가지고 있지 않기 때문에 세포 자극을 위해서 PMA (phorbol-12-myristate-13-acetate)와 A23187을 처리하였다. PMA는 세포분열 촉진제로서 비만 세포를 활성화시키며, A23187은 칼슘 이온투과 담체(ionophore)로서 세포내 칼슘의 농도를 증가시켜 비만 세포를 활성화시킨다. 이렇게 활성화된 비만 세포는 많은 양의 사이토카인을 분비하게 된다. 본 실시예에서는 부들 줄기 추출물을 전처리하여 사이토카인의 분비 경향을 확인함으로써 항염증 효능을 평가하였다. 이의 실험 방법은 다음과 같다.

단계 1 : 세포 플레이팅.

세포수를 동일하게 하기 위해 무균 작업대에서 다음과 같은 방식으로 세포 플레이팅을 수행하였다: 현미경을 이용하여 비만 세포(세포주: 살아있어야 함: 비만 세포를 배양액에 담가놓음)를 관찰하면서 피펫으로 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겼다(배지: IMDM). 이를 3,000rpm에서 300초 동안 원심분리하여 세포만을 분리하였다. 그런 다음, 뭉쳐져 있는 세포를 골고루 섞이도록 하기 위해 조심스럽게 피펫팅하고, 세포의 수를 측정하였다. 이를 30분 동안 인큐베이터에서 안정화시켰다(4웰x3).

단계 2 : 부들 줄기 추출물 처리.

분말화된 부들 줄기 추출물(실시예 1의 추출 방법과 동일한 방법으로 제조하여 분말화시킨 부들 줄기 추출물) 300mg을 칭량하고, 여기에 PBS (Phosphate Bufferred Saline) 용액을 혼합하여 1/10으로 희석시켰다(농도의 차별). 상기 단계 1로부터의 안정화된 세포에 농도별로 부들 줄기 추출물을 처리하여 30분 동안 인큐베이터에서 안정화시켰다. 대조군은 비만 세포에 어떠한 처리도 하지 않은 집단(2개의 웰)으로 하고, 실험군은 다음과 같이 설정하였다 : 실험군 1 - 비만 세포에 자극제(PMA, A23187)만 처리(2개의 웰), 실험군 2 - 비만 세포에 부들 줄기 추출물만 처리(2개의 웰), 실험군 3 - 비만 세포에 부들과 자극제 처리 (부들 줄기 추출물의 농도 1mg/mL, 100μg/mL, 10μg/mL, 각 농도별로 2개의 웰로 총 6개의 웰).

단계 3 : 자극제에 의한 처리.

PMA 50nM와 A23187 2μM을 1/200으로 처리한 후(사이토카인의 상승효과를 눈에 띄게 알기 위해 함께 이용), 8시간 동안 방치하였다.

단계 4 : 샘플링.

8시간 방치한 것을 꺼내어 피펫에 의해 에펜돌프 튜브로 옮겼다. 이들을 4 ℃ 및 5,000rpm에서 4분 동안 원심분리하여 세포와 분리하였다. 그런 다음, 상층액을 에펜돌프 튜브(12개의 에펜돌프 튜브)로 옮겼다. 그리고 나서, 이를 -75℃에서 보관하였다.

단계 5 : ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, 효소면역결합분석법)에 의한 분석.

5mg/mL의 IL-8과 IL-6의 1차 항체를 카운팅 완충액에 넣어 희석하여 1μg/mL의 농도가 되게 하였다. 그런 다음, 1μg/mL의 상기 항체를 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣었다.

단계 6 : 샘플 넣기 전 준비단계

비교용으로 다음과 같은 농도(5mg/L에서 출발하여 1/2씩 희석)로 표준물(standard)을 만든다 : 5mg/mL, 2.5mg/mL, 1.25mg/mL, 0.625mg/mL, 0.3125mg/mL.

단계 7 : ELISA 샘플 로딩(loading)

상기 단계 5의 96웰 플레이트의 각 웰을 블로킹한 후, 이를 세척 완충액(3차 증류수: PBS 9:1 및 Tween-20 소량)(200μLx3)으로 세척하였다. 그런 다음, 표준물과 샘플을 동일한 양 및 동일한 조건에서 2시간 동안 방치한 후 세척 완충액(200μLx4)으로 세척하였다. 그런 다음, 2차 항체를 처리하여 효소가 붙을 수 있게 하였다. 이후, 이들을 실온에서 1시간 동안 방치한 후 세척 완충액(200μLx4)으로 세척하였다. 반응하는 효소-아비딘 퍼옥시라아제-를 처리하였다. 효소가 2차 항체와 반응하도록 30분 동안 방치한 후 세척 완충액(200μLx5)으로 세척하였다. 이 들을 기질로 처리하여(촉매로는 과산화수소 이용) 색의 변화를 관찰하였다.

단계 7 : 흡광도 측정

마이크로플레이트 리더(microplate reader)(546nm)를 이용하여 흡광도를 측정하여, 비만 세포로부터 유리된 IL-6 및 IL-8의 억제율을 평가하였다. 결과는 도 1에 도시하였다.

도 1의 그래프를 보면, 부들 줄기 추출물(1mg/mL)에 의한 전처리에 의해 PMA + A23187로 자극된 비만 세포로부터 IL-6의 분비를 약 40% 억제하였음을 알 수 있다. 그러나, IL-8의 분비 억제 효과는 없었다. 이는 부들 줄기 추출물이 IL-6의 분비와 관련된 질환에 효능이 있음을 시사한다.

실시예 3 : 호중구(neutrophil)의 변화 여부 확인

호중구의 화학주성을 저하시켜 이물질이 체내 침입시 침입 부위에 과다하게 모여드는 호중구의 수를 줄이고, 호중구의 활성을 저하시켜 분비하는 활성 산소의 양을 감소시킨다면 체내에서 일어나는 염증 반응을 경감시킬 수 있으므로 본 실시예에서는 염증 억제 작용의 측정 항목으로써 카세인(casein) 투여 후 호중구의 복강내에서의 시간별 수적 변화, 각 시간에서 분리한 호중구의 활성 변화(호중구가 분비하는 활성 산소의 일종인 수퍼옥사이드 라디칼을 정량함), 장기 내에서 조직 손상에 의한 출혈 여부를 확인하였으며, 또한 부들 줄기 추출물의 이러한 측정 항목에서의 효과를 표준화하기 위하여 현재 항염증 약물로서 이용되고 있는 인도메타신(indomethacin)을 양성 대조군으로 하여 효과를 비교, 평가하였다.

(1) 실험 과정

1) 실험 일반

① 실험 물질과 대조 약물의 농도(건조 중량 기준)

- 실험 물질 : 부들 줄기 추출물 - 6주령의 SD 래트 체중(kg) 당 100mg, 300mg, 600mg.

- 대조 약물 : 인도메타신 : 6주령의 SD 래트 체중(kg) 당 10mg.

② 실험 동물

체중이 200g인 6주령의 SD (Sprague-Dawley) 래트.

③ 염증의 유도

유도 물질로서 단백질의 일종인 카세인(casein)을 증류수에 6%의 농도로 용해시켜 래트의 체중 g 당 0.0375mL 씩 복강내로 주사함으로써 염증 유도.

④ 항염증 작용의 검색을 위한 측정 항목

복강 내에서의 호중구의 수, 호중구의 활성도 측정, 복강 내의 조직 장해 정도의 사진 측정.

⑤ 항목 4)에 열거된 항목을 복강내 주사 후, 0시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간에 측정.

2) 실험 상세

① 호중구의 분리

에틸 에테르로 래트를 마취사시킨 후에 개복하고 헤파린(Heparin)을 500IU/mL의 농도로 함유한 생리식염수 10mL를 래트의 복강에 넣어 세척한 후, 그 액을 다시 수집하여 1200rpm에서 7분 동안 원심분리한 후, 상층액은 버리고 침전물 에는 트리스-NH₄Cl (pH 7.2) 5mL를 가하여 현탁시킨 후, 빙욕중에서 30분 동안 방치하였다. 다시 1200rpm에서 7분 동안 원심분리하여 상층액은 버리고, HBSS (Hank's Balanced Sodium Salt) 용액으로 3회 세척함으로써 호중구(neutrophil)를 분리해냈다.

② 호중구의 수 측정

상기 분리한 호중구에 PBS 5mL를 넣고 헤마토시토미터(Hematocytometer)를 이용하여 호중구의 수를 계산하였다.

③ 호중구의 활성 측정

호중구의 활성은 호중구가 체내 방어 물질로 방출하는 수퍼옥사이드 라디칼의 양을 측정함으로써 측정할 수 있는데, 본 실험에서는 수퍼옥사이드 라디칼이 니트로 블루 테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium : NBT)이라는 물질을 환원시켜 발색하는 정도를 흡광광도계로 측정함으로써 그 활성을 측정하였다.

분리한 호중구를 10⁶개/mL의 농도로 액을 만든 후, 그 액 0.1mL와 NBT를 1mg/mL의 농도로 조제한 액 0.8mL를 넣고 1분 동안 방치하였다. 그런 다음, 이를 2500rpm에서 10분 동안 원심분리시키고, 분리된 상층액은 버리고 침전물은 0.5M의 HCl 1mL와 디메틸술폭시드(DMSO) 0.5mL를 넣고 잘 섞어 호중구를 용해시킨 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험 결과를 도 2 (호중구의 수적 변화 그래프) 및 도 3 (NTP 환원능에 대한 그래프)의 그래프에 나타내었다.

(2) 실험 결과

호중구의 수적 변화에서는 부들 줄기 추출물 100mg/kg, 300mg/kg, 600mg/kg 모두 인도메타신 10mg/kg 투여군 보다 대부분의 시간에서 더 적은 수의 호중구의 동원을 보였고, 피크 타임(peak time)인 12시간에서 부들 줄기 추출물 600mg/kg 투여군은 호중구의 동원 능력을 반으로 줄이는 것으로 나타내었다(도 2의 그래프 참조). 따라서, 부들 줄기 추출물은 호중구의 화학 주성을 줄여 동원을 감소시켜 염증 반응을 줄일 수 있다고 할 수 있다.

한편, 호중구의 활성에서는 부들 줄기 추출물 100mg/kg 투여군이 인도메타신 10mg/kg 보다 활성이 높게 나오긴 하였지만 나머지 용량군에서는 대조 약물군보다 활성이 낮게 나옴으로써 호중그이 활성을 줄임으로써, 즉, 호중구가 체내 방어를 위해 방출하는 독성 물질인 활성 산소(Reactive oxygen species: ROS)의 양을 줄임으로써 활성 산소의 조직 장해에 의한 염증 반응을 농도 의존적으로 줄일 수 있다(도 3의 그래프 참조).

실시예 3 : 부들 줄기 추출물의 독성 실험

본 실시예에서는 부들 줄기 추출물을 비만 세포에 주입하여 비만 세포의 생존율을 확인함으로써 부들 줄기 추출물의 독성 유무를 확인하였다.

(1) 실험 과정 (MTT 검정)

본 실시예에서는 MTT 용액으로 MTT 0.5g과 DMSO 1mL (500mg/mL)의 혼합물을 PBS로 희석하여 제조한 5mg/mL의 MTT 용액을 사용하여 통상의 절차에 따라 MTT 검정을 수행하였다. 세부적인 파라미터는 다음과 같다 :

- 부들 줄기 추출물을 비만 세포에 주입

- 메디아(media)로 1~2회 세척

- 새로운 메디아 400μL

- MTT 용액(5mg/mL) 40μL 첨가

- 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 포마잔(formazane)이 다량 형성될 때까지(약 30분) 방치

- 피펫으로 에펜돌프 튜브로 옮김

- 원심분리(10,000rpm, 4℃, 10분)

- 상층액 제거

- DMSO 500μL 첨가 (펠릿의 양에 따라 조절)

- 보텍싱(vortexing)

- 96웰에 50μL 플레이팅 (이중)

- DMSO 180μL + 샘플 20μL

- ELISA 리더 (540nm).

- 그래프 작성(도 4)

(2) 독성 유무의 판단

도 4의 그래프를 통해 알 수 있는 바와 같이, 부들 줄기 추출물은 비만 세포의 생존에 별다른 영향을 미치지 않았다. 이는 부들 줄기 추출물이 세포에 독성이 없음을 시사한다.

제형예 1 : 주사제의 제조

실시예 1의 부들 줄기 추출물 …………………… 100mg

소듐 메타비술파이트………………………………… 3.0mg

메틸 파라벤…………………………………………… 0.8mg

프로필파라벤…………………………………………… 0.1mg

주사용 멸균 증류수…………………… 2mL가 되게 하는 양

이들 성분을 혼합한 후 2mL 용량의 앰플에 충전 및 멸균하여 제조하였다.

제형예 2 : 정제의 제조

실시예 1의 부들 줄기 추출물 …………………… 200mg

유당 ………………………………………………… 100mg

전분 ………………………………………………… 100mg

마그네슘 스테아레이트 …………………………… 적량

제형예 3 : 캡슐제의 제조

실시예 1의 부들 줄기 추출물 …………………… 200mg

유당 …………………………………………………… 50mg

전분 …………………………………………………… 50mg

탈크 …………………………………………………… 2mg

마그네슘 스테아레이트 …………………………… 적량

이상에서와 같이, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 세포 독성이 없으면서 히스타민 방출을 억제할 뿐만 아니라 인터루킨-6(IL-6)의 분비를 억제하는 데에도 효과 적이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 호중구에 의한 활성산소의 분비를 억제하는 데에도 효과적이다. 따라서, 본 발명의 부들 줄기 추출물은 히스타민 방출과 관련된 질환, 인터루킨-6이 원인이 되는 질환 및/또는 호중구의 활성산소 분비와 관련된 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 뿐만 아니라, 건강 식품의 재료 또는 화장료로도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims

50℃ 내지 80℃의 온도에서 중탕으로 추출된, 히스타민 방출과 관련된 질환의 예방 또는 치료를 위한 부들 줄기 추출물로서,

상기 히스타민 방출과 관련된 질환이 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 천식 및 알레르기성 피부염임을 특징으로 하는 부들 줄기 추출물.
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