KR100646825B1 - 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중한우의 선발방법 - Google Patents

한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중한우의 선발방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법에 관한 것으로, 한우의 혈액이나 조직에서 획득한 DNA를 이용하여 성장호르몬 유전자의 전사조절 영역을 증폭하고, 이를 제한효소인 Dra Ⅰ으로 처리하여 고체중 특이적 DNA 표지인자를 확인함으로써 체중이 많이 나가는 한우 개체를 조기에 선발하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 고체중 한우의 선발방법은 신속하고 간편하여 효율성과 실용성을 극대화할 수 있을 뿐만 아니라, 한우 집단 내에서도 고체중 한우 개체를 조기에 선발하여 집중 육성함으로써 한우 고기의 품질개선을 통해 농가의 소득증대는 물론 영양가 높고 품질이 좋은 고기를 생산하는 것이 가능하다.
한우, 선발방법, 고체중, PCR(Polymerase Chain Reaction), RFLP(Restriction Fragment length Ploymorphism)

Description

한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법 {Selection techniques of bovine weight trait by using the genetic marker of Hanwoo growth hormone gene}
도 1은 본 발명에 따른 고체중 한우 선발 방법을 도시한 순서도.
도 2는 본 발명에 따른 소의 성장호르몬 유전자의 전사조절영역 내 제한효소 인식부위를 도시하여 나타낸 그림.
도 3은 본 발명에 따른 제한효소 Dra Ⅰ에 의해 나타나는 다형현상의 전기영동사진.
본 발명은 한우 성장호르몬 유전자의 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한우의 혈액이나 조직에서 획득한 DNA를 이용하여 성장호르몬 유전자의 전사조절 영역을 증폭하고, 이를 제한효소인 Dra Ⅰ으로 처리하여 고체중 특이적 DNA 표지인자를 확인함으로써 체중이 많이 나가는 한우 개체를 조기에 선발하는 방법에 관한 것이다.
한우는 우리민족과 오랫동안 한반도에서 살아온 우리 고유의 소로, 농경시대에는 없어서는 안 되는 중요한 농기구와 운반용으로 사용되어 왔고, 70년대 이후 농기계의 보급으로 역용의 가치는 떨어졌으나 늘어나는 소고기의 수요량에 한우의 사육은 양적인 증산에만 치중하여 왔다.
더욱이, 우루과이라운드(UR) 협상 타결 이후 외국산 수입소고기가 국내 시장에 진출한 이래 매년 그 수입물량이 지속적으로 확대되고 있어, 가격면에서 매우 불리한 입장에 놓여지게 되었다.
따라서, 우리나라 한우 산업의 국제 경쟁력 강화 및 고품질 한우고기의 생산을 유도하여 수입소고기 또는 국내산 젖소고기와의 차별화 전략이 매우 요구되어지는 실정이다.
특히, 한우의 품질개선을 통하여 우리나라 사람들이 좋아하는 풍미와 맛을 갖고, 영양가가 높으며, 품질이 좋은 고기를 생산함으로써 가격면에서 불리한 한우 고기의 고급화를 통해 품질은 물론 가격면에서도 다른 고기에 비해 월등히 더 높이 평가받을 수 있는 차별화가 필요하다.
즉, 한우를 사육함에 있어서, 농후 사료를 중심으로 조기에 숙성시켜 18 개월령에 비육출하하는 사육 방법이 아니라 한우가 만숙종임을 고려하여, 소의 성장 단계에 따라 사육하여 육성기에는 소화기관이나 골격을 발달시키고, 비육기에는 근육의 발달이나 근내지방도가 잘 생성되도록 하며, 비육후기에는 등심 내 근내지방도가 많고, 육색도 선명하며, 지방색도 백색으로 개선하여 소비자가 원하는 한우의 고유한 맛을 갖도록 하는 것이 중요하다.
이를 위해서는 무엇보다도 한우 집단 내에서도 체중이 높은 한우 개체를 조기에 선발하여 집중 육성하는 기술의 개발이 시급하다.
종래의 한우를 판별하는 방법은 국내 등록특허 제367123호, 국내 등록특허 제344571호, 국내 등록특허 352059호 등에서와 같이 대부분이 한우와 수입소고기 혹은 젖소고기와의 판별에만 중점을 두고 있다.
이에 본 발명자는 한우의 성장호르몬 유전자의 염기서열 변이 유전자형을 이용하여 미성숙 한우로부터 고체중을 획득하는 한우의 조기선발이 가능한 방법을 연구하던 중, 고체중 특이적 DNA 표지인자를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소함과 동시에 고체중을 갖는 한우를 조기에 선발하여 경제적이고 효율적으로 육종하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 주된 목적은 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법을 제공하는데 있다.
이에 상기의 목적을 이루기 위해 본 발명은 한우의 혈액이나 조직에서 획득한 DNA를 이용하여 성장호르몬 유전자의 전사조절영역을 증폭하고, 이를 제한효소인 Dra Ⅰ으로 처리하여 고체중 특이적 DNA 표지인자를 확인함으로써 고체중 한우 개체를 선발하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은,
한우의 혈액이나 조직으로부터 시료를 추출하는 단계;
상기의 시료에서 게놈(genomic) DNA를 추출하여 정제하는 단계;
상기 단계에서 추출된 DNA를 이용하여 피씨알(PCR, Polymerase Chain Reaction) 프라이머를 제작하는 단계;
상기 단계에서 생성된 프라이머를 이용하여 피씨알을 수행하고, 상기 피씨알 반응을 통해 획득한 유전자 증폭산물을 염기서열결정법(Direct sequencing)에 의해 결정하는 단계; 및
제한효소 처리 후 전기영동을 수행하는 제한효소절편다형성(PFLP, Restriction fragment length polymorphism) 방법에 의해 새로운 유전자 변이를 관찰하는 단계;로 이루어진 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법을 제공한다.
상기에서 프라이머는 5'에서 3' 방향으로 ACG CCA TAG ACA GCA GCC의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 ACC TAT GTT CAC ATT CGG AA의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머로 제작됨을 특징으로 한다.
또한, 상기 염기서열결정법(Direct sequencing)은 피씨알 반응에 의해 증폭된 유전자 산물에 제한효소 Dra Ⅰ을 처리하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명은,
5'에서 3' 방향으로 ACG CCA TAG ACA GCA GCC의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 ACC TAT GTT CAC ATT CGG AA의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에 의해 유전자의 전사조절 영역을 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물에 제한효소 Dra Ⅰ을 처리하는 과정을 포함하는 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법을 제공한다.
또한, 상기 프라이머는 소 성장호르몬 유전자의 전사조절영역 내 -120 위치에서의 유전자 변이를 포함하는 염기 부분을 증폭할 수 있도록 제작하되, 새로운 유전자 변이는 시토신(C) 염기가 티민(T) 염기로 치환된 형태인 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예는 본 발명을 좀 더 상세하게 설명한 것으로, 본 발명의 범주를 한정하는 것은 아니며, 청구범위의 요지를 벗어남이 없는 당 발명의 기술 분야에서 다양한 변형적 실시예가 제시될 수 있음은 극히 자명하다.
실시예.
(1) 시료준비
축산기술연구소 대관령지소 및 가축개량사업소로부터 한우 78개체와 젖소(Holstein), 앵거스(Angus), 헤레폴드(Hereford), 샤롤레스(Charolais), 브라운 스위스(Brown Swiss), 지멘탈(Simmenthal) 및 리무진(Limousin)을 각각 58, 29, 28, 9, 18, 5, 28 개체씩 획득하고, 상기 소들의 혈액을 채취하였다.
(2) 게놈 DNA의 분리 추출 및 정제
상기에서 채취한 혈액으로부터 게놈(Genomic) DNA의 추출은 Blin과 Stafford's(1976) 방법에 준하여 실시되었다.
채취한 혈액을 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 분리된 백혈구층을 채취하고, 상기의 채취한 백혈구와 동량의 추출용액(10mM Tris-Cl, 0.1M EDTA, 20㎕/㎖ pancreatic RNase, 0.5% SDS)을 첨가 한 후 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
반응 후 단백질 가수분해 효소인 proteinase K(100 ㎍/㎖)를 첨가하고 50 ℃에서 3 시간 반응 시켰다.
동량의 0.5 M Tris-Cl로 처리된 phenol 용액을 첨가하여 10 분간 가볍게 흔들어 주면서 변성된 단백질을 제거한 다음, 2 배 부피(volume)의 100 % 에탄올(ethanol)과 1/10 부피의 3 M 아세트산나트륨(sodium acetate)를 첨가한 후 -70 ℃에서 3 시간 동안 정체시켰다.
상기의 용액을 다시 한번 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 70% 에탄올로 게놈 DNA를 씻어 낸 후, TE 완충용액(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.6) 30 ㎕에 녹여 획득하고, 피씨알(PCR, Polymerase chain reaction) 반응에 이용하였다.
(3) 프라이머의 제작
돌연변이 검색을 위하여 기존에 보고 된 소의 유전자 염기서열을 기초로 하여 다음과 같은 프라이머(Primer)를 제작하였다.
GH-F : 5'-ACGCCATAGACAGCAGCC-3'
GH-R : 5'-ACCTATGTTCACATTCGGAA-3'
(4) 유전자의 PCR 증폭
상기에서 합성된 프라이머를 이용하여 유전자 증폭장비인 MJ-research PTC-200(USA)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
0.2 ㎖ PCR-튜브에 주형(template) 게놈 DNA 50 ng과 상기 단계에서 제작한 프라이머를 각 2 p㏖, 200 μM dNTP, 10× PCR용 완충용액(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴), 1 단위(unit)의 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 첨가한 후, 증류수를 이용하여 전체 양을 25 ㎕로 조정하였다.
이 때 PCR 반응조건은 95 ℃에서 5 분간 예비 변성 후, 95 ℃에서 1 분, 61 ℃에서 1 분, 그리고 72 ℃에서 1 분간의 반응을 30 회 반복한 다음 최종적으로 72 ℃에서 10 분간 연장 합성 반응을 실시하였다.
새로운 유전자 돌연변이의 검색을 위하여 한우 20개체 DNA로부터 PCR 반응으로 획득한 665 bp 크기의 유전자 증폭산물을 염기서열결정법(Direct sequencing)에 의해 염기서열을 결정하고, 새로운 유전자 돌연변이를 확인하였다.
(5) 제한효소처리 및 전기영동분석
상기 단계에서 새롭게 검색된 유전자 변이는 제한효소절편다형성(RFLP, Restriction fragment length polymorphism) 방법에 의해 유전자형을 확인하였으며, 한우 및 외래소에서 유전자변이 발생 빈도와 경제형질과의 관련성을 분석하였다.
PCR 반응에 의해 증폭된 665 bp의 유전자 단편을 1 % 아가로우스(agarose) 상에서 확인한 후, 증폭된 PCR 산물 10 ㎕를 7.5 단위(unit)의 제한효소 Dra Ⅰ과 혼합하여 37 ℃에서 3 시간 동안 처리하였다.
상기와 같이 제한효소로 처리한 DNA 단편을 2 % 아가로우스 겔(gel) 상에서 전기영동(100 V, 50 분)을 한 후 Et-Br 용액(0.1 ㎍/㎖)으로 염색하여 UV 조사등 아래에서 관찰하고, 그 결과를 도 2에 도식화 하여 나타내었다.
상기 도 2에서 TTTAAA는 소 성장호르몬 유전자의 전사조절 영역 내 제한효소 Dra Ⅰ의 인식부위이며, 화살표 표시는 프라이머의 결합 위치를 나타내고, * 표시는 유전자 변이의 위치를 나타낸다.
도 2에서 보여지는 바와 같이, 제한효소로 처리된 PCR 산물은 455 bp와 210 bp 크기의 두개의 유전자 단편을 형성하데 이는 유전자 변이 부분이 아닌 추가적인 제한효소 인식부위에 의해 형성되는 단편들이다.
유전자 돌연변이 부위는 소 성장호르몬 유전자의 전사조절영역 내 -120 위치에 존재하는 염기인 시토신(cytosine, A 유전자형)이 티민(thymine, B 유전자형)으로 치환된 형태로 455 bp 단편 내에 존재하는 데에 기인하는 것으로, A 유전자형의 경우 제한효소 인식부위가 없어 새로운 유전자 단편이 형성되지 않지만, B 유전자형은 제한효소의 새로운 인식부위를 형성하여 455 bp의 단편에서 308 bp와 147 bp의 유전자 단편으로 분리되는 것이 확인되었다.
제한효소 Dra Ⅰ에 의해 나타나는 다형현상은 도 3에서도 볼 수 있듯이, 정상 유전자의 형태인 A 유전자형의 경우에는 455 bp와 210 bp의 단편을 형성하는 반면, 유전자 변이 형태인 B 유전자형은 210 bp, 147 bp 및 308 bp의 유전자 단편을 형성하였다.
단, 상기 도 3에서 M은 DNA size 표준 마커(Marker), P는 제한효소를 처리하지 않은 PCR 반응 산물을 나타낸다.
상기와 같은 결과는 한우에서만 특이적으로 관찰되었으며, 외래소 품종에서는 유전자 변이가 한개도 발견되지 않았다.
한우 및 외래소 품종의 유전자형에 따른 유전자 변이 빈도에 대한 분석결과는 하기의 표 1에 요약하여 나타내었다.
[표 1] 한우 및 외래소 품종의 유전자형과 유전자 변이 빈도
Figure 112004055579032-pat00001
이하에서는 한우의 각 체중형질에 대한 유전능력을 평가하기 위하여 개체의 혈통정보를 이용하여 개체간 혈연관계를 구하고 환경효과를 고정효과로 처리하였으며, 개체들에 대하여서는 개체들 간의 혈연관계를 고려한 상가적 효과(direct additive effects) 및 이유 전 형질에 대하여 모체효과(maternal additive effects)를 임의변량으로 간주한 개체모형으로 설정하였다.
도체형질에 대하여는 상가적 효과와 도축일령에 대하여 공변이(co-variate)로 설정하였으며, 모든 형질의 분산성분 추정은 MTDFREML program을 이용하였다.
각 형질에 대한 분석 모델은 하기와 같다.
생시체중(W0)과 3 개월 체중(W3)
Yijkl = μ + YSi + Sj + Lk + AGEl + Aijkl + Mijkl + eijkl
6 개월(W6), 12 개월(W12) 및 18 개월 체중(W18)
Yijkl = μ + YSi + Sj + Lk + Aijkl + eijkl
도체중(CW)
Yijkl = μ + YSi + Lj + Dijkl + Aijkl + eijkl
상기에서, Yijkl 는 관측치, μ은 전체평균, YSi는 i번째 연도-계절효과, Sj 는 j번째 성의 효과, Lk는 k번째 출생지역의 효과, AGEl 는 l번째 어미 연령의 효과, Aijkl는 상가적 효과, Mijkl은 모체효과, eijkl는 오차를 나타낸다.
또한, 제한효소에 의한 인식부위가 달라지는 두 가지 유전자형, 즉 A, B 유전 자형과 각 도체형질에 대한 유전자 효과는 SAS 일반선형모델에 의한 최소자승법(GLM, General Linear Model)으로 분석하였고, 그 분석모델을 다음과 같다.
Yij = μ + gi + eij
상기에서, Yij는 측정치, μ는 전체평균, gi는 성장호르몬 변이 유전자형, eij는 오차를 나타낸다.
SAS 일반선형모델을 이용하여 각 유전자형과 형질과의 관련성을 분석한 결과, 표 2 및 표 3에서도 볼 수 있듯이 한우에서만 특이적으로 나타나는 BB 유전자형이 AA 유전자형이나 AB 유전자형보다 3 개월령 체중과 도체 중에서 각각 3.1, 9.1 ㎏씩 더 높은 것으로 나타났다.
[표 2] 한우 78개체의 성장 및 도체형질에 대한 육종가 평균
Figure 112004055579032-pat00002
[표 3] 한우 성장호르몬 유전자의 유전자형과 형질에 대한 최소자승평균과 표준편차
Figure 112004055579032-pat00003
단, 상기 표 2와 표 3에서 W0, W3, W6, W12, W18은 각각 생시체중, 3 개월 체중, 6 개월 체중, 12 개월 체중 및 18 개월 체중을 나타내며, CW는 도체중, LMA는 배장근 단면적, BF는 등지방 두께, MS는 근대지방도(1~7점, 점수가 높을수록 높은 근내지방도를 나타냄)를 나타낸다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 성장호르몬 유전자의 돌연변이 유전자형을 이용하여 미성숙 한우 개체로부터 유전자형을 분석함으로써 그 유전자형에 따라 고체중을 획득하는 한우의 조기 선발이 가능하여 보다 경제적이고 효율적인 육종이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 고체중 한우의 선발방법은 신속하고 간편하여 효율성과 실용성을 극대화할 수 있을 뿐만 아니라, 한우 집단 내에서도 체중이 많이 나가는 한우 개체를 조기에 선발하여 집중 육성함으로써 고품질 한우고기의 생산을 유도하여 농가의 소득증대는 물론 우리나라 한우 산업의 국제 경쟁력 강화에도 매우 효과적이다.
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Claims (5)

  1. 5'에서 3' 방향으로 ACG CCA TAG ACA GCA GCC의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머와 5'에서 3' 방향으로 ACC TAT GTT CAC ATT CGG AA의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머에 의해 유전자의 전사조절 영역을 증폭하고, 상기 증폭된 유전자 산물에 제한효소 Dra Ⅰ을 처리하는 과정을 포함하는 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 프라이머는 소 성장호르몬 유전자의 전사조절영역 내 -120 위치에서의 유전자 변이를 포함하는 염기 부분을 증폭할 수 있도록 제작하되, 새로운 유전자 변이는 시토신(C) 염기가 티민(T) 염기로 치환된 형태임을 특징으로 하는 한우 성장호르몬의 유전자 표지인자를 이용한 고체중 한우의 선발방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
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