KR100613037B1 - 크로뮴(ⅲ) 알파 아미노산 착물 - Google Patents

Abstract

본 발명에 의해 1:3의 크로뮴(III) 알파 아미노산 착물, 및 동물의 영양소 공급원으로서의 이들의 용도가 제공된다.

Description

크로뮴(Ⅲ) 알파 아미노산 착물 {NOVEL CHROMIUM(Ⅲ) ALPHA AMINO ACID COMPLEXES}

영양소로서의 크로뮴의 중요한 역할은 슈바르츠 및 메르츠에 의해 1959년에 최초로 인지되었다 [참조: Schwarz, K. and Mertz, W., "Chromium (III) and the glucose tolerance factor", Archs Biochem. Biophys. 85:292(1959)]. 이들 연구자들은 토룰라(torula) 효모를 공급한 랫트에서 글루코스 장애가 발현되었음을 확인하였다. 그러나, 양조 효모가 공급된 랫트에서는 이러한 증상이 나타나지 않았다. 양조 효모에는 존재하나 토룰라 효모에는 존재하지 않는 물질을 글루코스 내성 인자(GTF)라 지칭하였다. 이후, GTF 중의 활성 성분이 크로뮴(III)이라는 것이 입증되었다. 이들이 초기에 확인된 후에, 크로뮴의 영양학적 역할을 보다 잘 이해하기 위해 다수의 연구가 개시되었다. 지금까지 사람과 동물의 영양소로서의 크로뮴의 역할에 대해서는 충분히 알려져 있다 하더라도, 사람 질병에 있어서 크로뮴의 효과에 대해서는 많이 알려져 있지 않으며 이는 계속적으로 논의의 여지가 남아있을 뿐만 아니라 잘 문서화되어 있지도 않다. 최근에, 영양소로서의 크로뮴의 역할에 관한 현재 지식 상태를 개괄하는 다수의 간행물이 발행되었다 [참조: "Chromium as a Supplement", Henry C. Lukaski, Ann Rev Nutr. 19:279(1999); "Chromium, Glucose Intolerance and Diabetes", Richard A. Anderson, Journal of the American College of Nutrition, 17, 548(1998); "The Biochemistry of Chromium", John B. Vincent, J. Nutr. 130: 715(2000); "Quest for the Molecular Mechanism of Chromium Action and its Relationship to Diabetes", John B. Vincent, Nutrition Reviews, 58: 67(2000)].

1959년에 최초로 제안된 글루코스 내성 인자에 대한 정확한 특성은 이해하기 어려운 채로 남아있다. 글루코스 대사를 효력화하는 크로뮴 함유 물질은 산-가수분해된 양조 효모 및 돼지 신장으로부터 부분적으로 정제되었다. 효모로부터 얻어지는 물질에 대부분의 관심이 집중되었는데, 이를 공통적으로 효모 GTF라고 지칭하였다. 효모 GTF 중의 크로뮴은 무기 크로뮴 공급원보다 더 용이하게 흡수되는 것으로 보고되었다. 또한, 효모 GTF는 크로뮴(III) 이온, 니코틴산, 글리신, 글루탐산 및 시스테인으로 이루어지는 것으로 제안되었다 [참조: "Preparation of chromium-containing material of glucose tolerance factor activity from Brewer's yeast extracts and by synthesis, E.W. Toepfer", W. Mertz, M.M. Polansky et al., J Agric Food Chem, 25:162(1977)]. 효모 GTF의 제안된 조성은 여전히 논의의 여지가 있으며, 이것의 분리는 다른 실험실에서는 재현불가능하였다. 뿐만 아니라, 분리된 효모 GTF는 특수한 크로뮴 결합 단백질의 산 가수분해에 의해 생성된 가공물일 수 있다 [참조: "Is glucose tolerance factor an artifact produced by acid hydrolysis of low-molecular-weight, chromium binding substance ?" K.H. Sumrall and J.B. Vincent, Polyhedron, 16: 4171(1997)].

최근에는, 탄수화물 및 지질 대사를 조절하는데 있어서의 크로뮴 작용에 대 한 분자적 기초를 이해하기 위한 일부 연구가 실시되었다. 저분자량 크로뮴 결합 물질(LMWCr)로서 공지된 펩티드가 분리되었는데, 이것은 이것의 수용체 상에서 인슐린의 작용을 조절하는데 있어 중요한 역할을 담당하는 것으로 추정된다. 이러한 펩티드는 포유동물 조직에서 넓게 분포하는 것으로 추정되며, 다수의 공급원으로부터 분리되었다. LMWCr은 글리신, 시스테인, 글루탐산 및 아스파르트산으로 구성된다. 글루탐산 및 아스파르트산은 반 이상이 아미노산 잔기를 나타낸다. 펩티드는 1500 Dalton이며, 4개의 크로뮴 이온에 결합된다. 이는 금속 유리 형태로 주로 조직 내에 존재한다. 이러한 단백질의 아미노산 서열, 및 이것과 크로뮴의 착물의 결정 구조는 아직 알려져 있지 않다 [참조: "The Biochemistry of Chromium", J.B. Vincent, J. Nutr. 130:715(2000)]. LMWCr-결합된 크로뮴은 음이온 브릿지된 다핵 크로뮴-카르복실레이트 어셈블리의 형태로 주로 존재한다 [참조: "Synthetic Models for Low-Molecular-Weight Chromium-Binding Substance: Synthesis and characterization of Oxo-Bridged Tetranuclear Chromium (III) Assemblies", Truitt Ellis et al., Inorg. Chem., 33:5522(1994)]. 합성 다핵 크로뮴 어셈블리는 LMWCr에서 확인된 것과 유사한 인슐린 수용체 활성을 활성화시키는 것으로 확인되었다 [참조: "Synthetic Multinuclear Chromium Assembly Activates Insulin Receptor Kinase Activity: Functional Model for Low-Molecular-Weight Chromium-Binding Substance", C.M. Davis et al, Inorg. Chem., 36:5316 (1997)].

아직까지 확인되지 않은 크로뮴(III) 유기 리간드(들) 착물이 탄수화물 및 지질 대사를 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 인지함으로써, 사람 및 동물의 영양분으로 사용하기 위한 신규한 크로뮴 함유 화합물의 개발에 대해 많은 관심이 집중되었다. 다양한 리간드에 결합되는 크로뮴을 함유하는 화합물을 개시하고 있는 다수의 특허가 등록되었다. 1975년에는, 1:1 및 1:2의 크로뮴, 알파 아미노산 착물 염을 개시하는 특허가 본 출원의 발명자중 한 사람에게 등록되었다 [US 제 3,925,433호]. 이러한 착물 염은, 양이온이 크로뮴(III) 이온과 알파 아미노산의 하나 또는 두개의 분자와의 착물로 구성되어 있는 이온쌍으로서 존재한다. 이 양이온은 착물을 형성하는 아미노산 분자의 수에 따라 1+ 또는 2+ 중 어느 하나를 수반한다. 반대 이온(음이온)은 클로라이드, 술페이트 또는 산 술페이트일 수 있다. 1:1의 크로뮴-L-메티오닌 착물을 포함하는, L-메티오닌의 중요한 금속 착물이 US 제 5,278,329호에 개시되어 있다. 크로뮴-아미노산 착물을 포함하는, 단백질의 가수분해에 의해 수득된 아미노산의 금속 착물이 US 제 5,698,724호에 개시되어 있다.

양조 효모로부터 농축된 글루코스 내성 인자를 수득하는 방법이 1982년에 등록된 US 제 4,343,905호에 기술되어 있다. 탄수화물 또는 지질 대사를 조절하는데 있어서 생물학적 활성을 보유하는 효모 또는 효모 유도체를 수득하기 위한 방법을 기술하는 다른 특허들, 예를 들어 US 제 4,348,483호; 제 6,140,107호; 제 6,159,466호 및 6,248,323호가 등록되었다.

음식물 공급원 및 약물로서의 이미 공지된 화합물, 크로뮴 아세틸아세토네이트의 용도는 US 제 4,571,391호에 기술되어 있다. 이러한 수불용성 화합물은 열 안정성이며, 산 및 약 염기의 pH 용액에 대해서도 매우 안정하다. 크로뮴 아세틸아세토네이트는 경구 투여후 위장관으로부터 급속하게 흡수되며, 글루코스 대사에 대한 인슐린 효과를 증강시키는데도 효과적인 것으로 보고되어 있다.

크로뮴 피콜리네이트를 포함하는 중요한 금속 피콜리네이트가 함유된 음식물 공급원이 Re 33,988호로서 1992년 7월 7일자로 재등록된 US 제 4,315,927호에 최초로 개시되었다. US 제 4,315,927호에는, 크로뮴 피콜리네이트의 제법이 기술되어 있다(실시예 4). Re 33,988호는, US 제 4,315,927호에 포함된 아연 및 철 이외에 크로뮴, 코발트, 구리 및 망간의 피콜리네이트 착물을 포함하도록 특이적으로 청구하고 있다. 크로뮴 피콜리네이트 착물의 제조 방법이 US 제 5,677,461호에 기술되어 있다. 다양한 질병의 치료 및 예방에 있어서의 크로뮴 피콜리네이트의 용도가 US 제 5,087,623호; 제 5,087,624호; 제 5,175,156호 및 제 6,329,361 B1호를 포함하는 다수의 특허에 개시되어 있다. 크로뮴 피콜리네이트를 함유하는 조성물 및 이들 조성물의 용도가 US 제 5,614,553호; 제 5,929,066호; 제 6,093,711호; 제 6,136,317호; 제 6,143,301호; 제 6,251,888 B1호 및 제 6,251,889 B1호에 기술되어 있다.

"GTF 크로뮴 물질"로서 기술된 크로뮴 니코티네이트 및 이의 제조 방법이 US 제 4,923,855호 및 제 5,194,615호에 개시되었다. 혈액 중 지질 수준을 저하시키기 위한 크로뮴 니코티네이트의 용도가 US 제 4,954,492호에 기술되어 있다. 크로뮴 니코티네이트를 함유하는 조성물 및 이의 용도가 US 제 5,905,075호; 제 5,948,772호; 제 5,980,905호; 제 6,100,250호; 제 6,100,251호 및 제 6,323,192호를 포함하는 다수의 특허에 개시되어 있다.

GTF와 유사한 활성을 보유하는 약제학적인, 인슐린-효력화하는 Cr (III) 착물이 US 제 5,266,560호에 개시되어 있다. 이들 착물은 Cr (III), 니코틴산 또는 이의 유도체중 하나 및 글루타티온(L-글루탐산, L-시스테인 및 글리신을 함유하는 펩티드)으로 구성된다. 여기서는 시험관 내에서 분리된 지방세포에서의 글루코스 수송에 대한 이들 착물의 인슐린 효력화되는 활성에 대해 기술하고, 이를 종래 문헌에 보고된 유사한 착물의 활성과 비교하고 있다.

크로뮴 프로피오네이트를 포함하는 금속 프로피오네이트의 용도가 US 제 5,707,679호 및 제 6,303,158 B1호에 개시되어 있다. 단쇄 지방산의 크로뮴 염을 함유하는 조성물, 및 동물 영양소로서의 이들 용도가 US 제 5,846,581호에 기술되어 있다. 동물 사료 공급원으로서 사용하기 위한 금속 카르복실레이트를 제조하는 방법이 US 제 5,591,878호 및 제 5,795,615호에 기술되어 있다.

크레아틴, 및 크로뮴을 포함하는 중요 금속의 생체 이용가능한 킬레이트가 US 제 6,114,379호에 기술되어 있다. 이 특허는 각각의 크로뮴 이온에 대해 1 내지 3당량의 리간드를 함유하는 크레아틴-크로뮴 착물을 청구하고 있다.

의학적 증상의 치료 또는 영양소 공급원으로서의, 종래 공지된 3핵 크로뮴(III) 착물의 용도가 US 제 6,149,948호 및 제 6,197,816 B1호에 기술되어 있다. 이러한 착물은 화학식 [Cr₃O(O₂CCH₂CH₃)₆(H ₂O)₃]⁺으로 표시된다. 탄수화물 및 지질 대사에 관여하는 다수의 효소에 대한 착물의 생물학적 효과가 이들 특허에 기술되어 있다. 소의 저분자량 Cr-결합 물질의 분리 방법 및 이것의 용도가 US 제 5,872,102호에 기술되어 있다. 이들 물질은 랫트의 지방세포에 의해 글루코스의 인슐린 활성화된 흡수율을 증강시켰으며, 랫트의 지방세포 막의 티로신 키나아제 및 포스포티로신 포스파타아제 활성을 활성화시켰다.

문헌에 기술된 다양한 크로뮴 착물의 유효성을 제한하는 다수의 결함이 확인되었다. 크로뮴 피콜리네이트는 시판되는 크로뮴 착물중 가장 일반적인 것이다. 그러나, 이 화합물은 수 용해성이 제한되어 있으며, 최근의 일부 연구에서는 이것의 안전성을 문제삼고 있다. 크로뮴 클로라이드 및 크로뮴 피콜리네이트의 독성 결핍이 랫트에서 입증되었다 하더라도(참조: "Lack of Toxicity of Chromium Chloride and Chromium Picolinate in Rats", Anderson et al, J. Amer. Coll. Nutr. 16: 273(1997)), 최근의 연구로부터 크로뮴 피콜리네이트가 DNA를 분열시키며, 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 크로모좀 파괴를 유도한다는 사실이 보고되었다 [참조: "The Nutritional Supplement Chromium (III) Tris (picolinate) Cleaves DNA", J.K. Speetjens et al, Chem. Res. Toxicol. 12-483(1999) & "Chromium (III) picolinate produces chromosome damage in Chinese hamster ovary cells", D.M. Stearns, FASEB J., 9:1643(1995)]. 랫트에서의 크로뮴(III) 피콜리네이트의 생체내 분포에 관한 연구로부터, 이 화합물의 생체내 짧은 수명이 이러한 음식물 공급원의 효력있는 독성 효과를 최소화시킨다는 결론이 도출되었다 [참조: "In Vivo Distribution of Chromium from Chromium Picolinate in Rats and Implications for the Safety of the Dietary Supplement", D.D.D. Hepburn and J.B. Vincent, Chem. Res. Toxicol., 15:93(2002)]. 이러한 이유로, 가용성이고 생체 이용가능하며 효능있고 안전한 음식물 크로뮴의 대안적인 공급원이 확실히 요구된다.

본 발명의 제 1 과제는 상기 요망사항을 충족시키는 것이다.

본 발명의 제 2 과제는 사람 및 사육 동물에 대한 영양소 공급원으로서 사용하기 위한 크로뮴(III) 및 알파 아미노산의 신규한 1:3 착물을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 3 과제는 이러한 신규한 착물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제 4 과제는 동물 성능에 대한 이들 착물의 바람직한 효과를 제공하고 기술하는 것이다.

본 발명의 제 5 과제는 실험실 동물에게서 신규 착물의 독성 결핍을 입증하는 것이다.

본원의 구조물은 1:3의 크로뮴(III) 알파 아미노산 착물이다. 입수가능한 영양학적으로 관련있는 크로뮴 착물의 대부분의 구조 및 특성이 종래 연구되었다. 예를 들어, 크로뮴(III) 피콜리네이트의 1핵 및 2핵 착물이 합성되었고, 이들의 구조는 X선 결정학에 의해 측정되었다. pH 4.0 미만에서 수 중에서 크로뮴(III) 클로라이드와 피콜린산을 반응시키면 1핵 착물이 형성되는데, 여기서 아미노산에 대한 금속의 비는 1:3(크로뮴: 트리-피콜리네이트)이다. 그러나, 용액의 pH가 4.0을 초과하면, 2핵 착물이 형성된다. 2핵 착물에서 아미노산에 대한 크로뮴의 비는 1:2이다 [참조: "Mononuclear and Binuclear Chromium (III) Picolinate Complexes", D.M. Stearns and W.H. Armstrong, Inorg. Chem., 31:5178(1992)].

피콜린산 및 니코틴산의 크로뮴 착물의 조성 및 생물학적 활성 또한 연구되 었다. 이들 피리딘 카르복실산으로 형성된 크로뮴 착물은, 2개 화합물의 구조 차로 인하여 상이하다. 니코틴산은 알파 아미노산이 아니므로, 이는 한자리(mono-dentate) 리간드로서 제공된다. 이는 카르복실레이트 음이온을 통해 크로뮴과 결합되며, 1핵 및 3핵 착물을 형성한다. 2개 착물은 크로뮴과 니코틴산 사이에서 1:1 및 1:2로 형성되었다. 착물 중 어느 것도, 크로뮴 디니코티네이트가 랫트의 분리된 지방세포 조직에서 인슐린 활성을 효력화시킨다는 것을 제외하고는, 본 연구에 사용된 시험 배터리에서 생물학적 활성을 나타내지 않았다. 한편, 피콜린산은 알파 아미노산이며, 이는 두자리(di-dentate) 리간드로서 작용한다. 이는 피리딘 질소 및 카르복실 산소를 통해 크로뮴 이온과 결합하여 안정한 5원 고리를 형성한다. 크로뮴 클로라이드 용액을 피콜린산으로 처리하는 경우에 반응 혼합물 내의 크로뮴에 대한 피콜린산의 비에 따라 3개의 상이한 착물이 수득되었다. 크로뮴 클로라이드 용액에 피콜린산을 1 또는 2 몰당량 첨가하였더니 용액 색깔이 변화되었고, 수산화나트륨을 사용하여 용액의 pH를 7.4로 조정하였더니 착물이 침전되었다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 이러한 착물이 균일한 것으로 확인되었다. 1 몰당량의 피콜린산을 사용한 경우에, 생성물의 화학식은 Cr Pic(H₂O)₂(OH)₂이었다. 2 몰당량의 피콜린산을 사용한 경우에 수득된 침전물의 화학식은 Cr(Pic)₂(H₂O)(OH)ㆍ(H₂O)이었다. 이들 착물이 pH ＞ 4에서 형성되었기 때문에, 이들은 2핵 착물을 가장 잘 형성하기 쉽다. 2개 착물중 어느 것도 생물학적 활성을 갖지 않았다. 크로뮴 클로라이드 수용액에 3 몰당량의 피콜린산을 첨가하면, 용액 으로부터 침전된 적색 고형물이 형성되었다. HPLC에 의해 이 침전물이 균일한 것으로 확인되었다. 침전물 분석 결과로부터, 이것이 크로뮴 트리-피콜리네이트 일수화물, 즉 Cr(Pic)₃ㆍH₂O임이 확인되었다. 이 물질은 1핵 착물에 가장 가깝다. 이 착물은, 시험관 내에서 랫트의 골격근 배양물에 의한 글루코스 흡수율을 증가시켰다. 랫트 사료에 상기 착물을 첨가하였더니, 혈장 글루코스가 현저하게 감소되었고, 헤모글로빈의 글리케이션(glycation)이 방지되었다. 크로뮴 트리피콜리네이트가 함유된 음식물을 사람에게 공급하면, 체중 미달인 여성 및 남성 모두에게서 현저한 체중 증가가 일어났다 [참조: "Composition and Biological Activity of Chromium-Pyridine Carboxylate complexes", G W Evans and D J Pouchnik, J. Inorg. Biochem., 49: 177(1993)].

따라서, 현재 입수가능한 구조 모두는, 상이한 경험식 및 상이한 입체화학을 갖는 본 발명의 크로뮴 화합물과 상이하다는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 개요

본 발명은 신규한 1:3 크로뮴(III) 착물의 제조에 관한 것이다. 이들 착물은 산화 상태가 +3인 크로뮴을 함유한다. 착물 내의 크로뮴은 알파 아미노산의 3분자와 결합한다. 극성 용매 중에 사실상 불용성인 공지된 중성의 크로뮴 착물과는 달리, 본 특허에 기술된 신규한 착물은 물 및 메탄올과 같은 극성 용매에 쉽게 가용한다. 이러한 착물은 산성 및 염기성 용액 중에서도 안정하다. 이들 수-가용성 착물은 음식물에 첨가되는 경우에 용이하게 생체 이용될 수 있는 크로뮴의 유용 한 공급원이다. 동물 영양물 내의 공급물 첨가제로서 이들 착물을 사용하면, 동물의 성능이 개선된다. 이들 착물을 실험실 랫트에게 다량으로 공급하는 경우에도, 이들은 독성을 나타내지 않았다.

크로뮴은 다수의 산화상태로 존재하나, 가장 안정하고 중요한 산화상태는 Cr (III)이다. 가장 안정한 상태인 3가 크로뮴의 배위수는 6이다. 6 배위된 3가 크로뮴은 다양한 리간드와 함께 8면체 착물을 형성한다. 이들 착물은, 수용액 중에서의 이들의 상대적인 운동 불활성으로 특징된다. 이들 착물 대부분의 리간드 변위 반응의 반감기는 몇시간에 불과하다. 이러한 운동 불활성 때문에, 대부분의 착물이 고형물로서 분리될 수 있으며, 이는 심지어 열역학적으로 불안정한 조건 하에서도 상대적으로 긴 시간 동안 수용액 중에서 안정하다.

본 발명은 신규하고 안전하며 효과적인 크로뮴-아미노산 착물의 설계, 합성 및 평가를 포함한다. 금속-아미노산 착물에 생물학적 활성을 부여하는 특징에는, 수 용해도, GI 함량의 pH에서 착물의 안정도, 착물의 피흡수성 및 생화학적 반응에 대한 이들 착물의 참여 능력이 있다. 금속-아미노산 착물의 안전성은, 천연 아미노산의 사용에 의해서 그리고 이들의 생체이용률을 개선시켜 동물의 영양학적 요구사항에 충족하도록 공급물에 첨가되는 금속의 양을 최소화시킴으로써 증가된다.

US 제 3,925,433호에는, 1:1 및 1:2의 크로뮴-알파 아미노산 착물 염이 기술되어 있다. 이들 착물이 크로뮴의 무기 공급원에 비해 중요한 영양학적 진보를 제공한다 하더라도, 이들에는 다수의 결함이 있다. 크로뮴 클로라이드를 1, 2 또는 3 몰당량의 알파 아미노산과 혼합시키면, 투명한 녹색 용액이 형성된다. 이들 용액의 pH는 각각 0.932, 1.324 및 1.627이었다. 이들 용액의 pH를 수산화나트륨 또는 탄산나트륨 용액을 조심스럽게 첨가하여 7로 조절하였더니 크로뮴 화합물이 침전되었는데, 이는 이들 착물이 위장관에서 존재할 수 있는 pH값의 범위에서 충분히 안정하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 크로뮴-알파 아미노산 착물(1:3) 용액을 3당량의 수산화나트륨으로 처리하였더니, 보라색 침전물이 형성되었다. 이 침전물은 사실상 물, 묽은 산 및 염기, 메틸 알코올, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올 및 에틸 아세테이트 중에서 불용성이었다. 이것의 FTIR을 원소 분석하여 검사함으로써, 이것이 크로뮴-아미노산(1:3)의 중성 착물과 소량의 다핵 크로뮴-아미노산 착물의 혼합물이라는 것을 알 수 있었다. 이 착물 및 이것의 불특정 조성물의 용해성 결핍으로부터, 이것이 영양학적으로 가치가 없을 것으로 제안되었다.

화학식(I)

본 발명에 기술된 신규한 착물은 상기 화학식(I)로 표시되며, 이는 1:3의 크로뮴-아미노산 착물의 염이다. 이들 착물은, 1가 양이온이 3분자의 알파 아미노산으로 착물화된 3가 크로뮴으로 구성되는 이온쌍으로서 존재한다. 아미노산 분자중 하나는 쯔비터이온 특성을 보유하고 있어서 착물에 대해 전체 + 전하를 제공한다. 이러한 아미노산의 카르복실레이트 기는, 2개 크로뮴의 6개 배위 자리를 충족시키는 팽팽한(strained) 4원 고리를 형성하는 크로뮴(III) 이온과 함께 2개의 결합을 형성한다. 다른 2개의 알파 아미노산 분자는 알파 아미노기 및 카르복실기를 통해 크로뮴에 결합하여 5원 고리를 형성한다. 이는 크로뮴(III)의 6개의 모든 배위 결합을 충족시킬 것이다. 본원에서 "X"로서 지칭되는 이온쌍의 음이온은 클로라이드와 같은 1가 음이온 또는 술페이트와 같은 2가 음이온일 수 있다. "R"은 알파 아미노산의 유기 부분인데, 이는 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린, 글리신, 알라닌, 티로신, 시스테인, 세린, 프롤린, 글루타메이트, 아스파르테이트, 글루타민 및 아스파라긴으로부터 유래할 수 있다. 글리신이 필수 아미노산은 아니라 하더라도, 이는 용이하게 입수되고 본 발명의 착물 염의 합성에 용이하게 사용될 수 있다는 점에서 바람직한 알파 아미노산이다. 2개의 가장 바람직한 천연 알파 아미노산은 글리신 및 메티오닌이다. 글리신에 대해서 R은 수소이며, 메티오닌에 대해서 R은 CH₃-SCH₂-CH₂-를 나타낸다.

이들 착물은 간단하고 실용적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 크로뮴 클로라이드 수용액을 90 내지 95℃로 가열한다. 상기 용액의 색깔은 대개 어두운 녹색을 띤다. 아미노산(3 몰당량)을 조심스럽게 첨가하고, 계속적으로 가열한다. 용액의 색깔이 천천히 어두운 청록색으로 변한다. 이 용액을 약 40℃로 냉각시키고, 수산화나트륨 용액을 천천히 그리고 조심스럽게 첨가하여 이 용액의 pH를 3.9 내지 4.0으로 조절하였다. 이러한 pH의 조절을 위해서는 2 몰당량의 수산화나트륨이 필요하다. 용액의 색깔이 어두운 보라색으로 변한다. 액체를 증발시키면, 목적하는 생성물 및 염화나트륨으로 구성되는 고형물이 제공된다. 이 생성물은, 메탄올 또는 에탄올로 추출함으로써 염화나트륨으로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 생성물은 적당한 크기별 배제 수지 상에서 크로마토그래피에 의해 염화나트륨으로부터 분리될 수 있다.

상기 기술된 방법을 사용하여 수득된 생성물은 이것이 안정한 고형물로서 존재한다는 것과, 어두운 보라색 색깔을 갖는 것과 같은 다수의 독특한 특성을 지닌다. 이 생성물은 물 및 메탄올에 용이하게 가용될 뿐 아니라 에탄올(또는 당밀(molasse))에도 가용되며, 이소프로필 알코올에는 난용성이며 에틸 아세테이트에는 불용성이다. 물에 용해시킨 0.1몰의 생성물 용액의 pH는 4.078이다. 이 용액의 UV/Vis 스펙트럼은 400nm(몰 흡광도, 44.08) 및 541nm(몰 흡광도, 50.06)에서 최대 흡광도를 갖는다. 이와는 달리, 크로뮴 클로라이드의 UV/Vis 스펙트럼은 429nm(몰 흡광도, 18.10) 및 608nm(몰 흡광도, 14.43)에서 최대 흡광도를 갖는다. 중탄산나트륨 0.1몰 용액의 최대 20몰 당량을 첨가하였더니 이 용액의 pH가 8.097로 변하였으나, 침전물은 형성되지 않았다. 하나의 실험에서, 중탄산나트륨 0.1몰 용액을 최대 80몰 당량으로 첨가하였다. 이 혼합물의 pH는 8.354이었으나, 크로뮴 화합물의 침전물은 형성되지 않았다. 이와는 대조적으로, 0.1몰 중탄산나트륨의 2초과 당량을 크로뮴 클로라이드 0.1M 용액에 첨가하였더니 다량의 침전물이 형성되었으나, 이 혼합물의 pH는 4.356에 불과했다. 20 몰당량의 염산을 첨가하여 이 착물의 0.1몰 용액의 pH를 약 1.0으로 조절하여도, 이 용액의 UV/Vis 스펙트럼에서 아무런 변화가 일어나지 않았다는 사실로부터 명백해지는 바와 같이, 착물은 분해되지 않았다.

상기 기술된 방법을 사용하여 수득된 고체상 착물은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 균일한 것으로 확인되었다. 크기별 배제 컬럼을 사용하여 메탄올 용액을 분석함으로써 단일 성분의 존재를 알 수 있었다. 2개의 상이한 파장에서 피크(이중 하나는 크로뮴을 검출하기 위한 것이고, 나머지 하나는 아미노산을 검출하기 위한 것임)를 검출하여, 이 둘 모두가 단일 피크를 형성하였음을 알 수 있었다. 크로뮴 클로라이드의 메탄올 용액을 분석하여, 이것이 다수 피크로서 얻어졌고 이들 피크중 어느 것도 착물의 그것과 유사하지 않음을 확인하였다. 또한, 크로뮴 클로라이드의 주 피크는 착물의 그것보다 더 짧은 머무름 시간을 나타내었는데, 이는 분자 크기가 더 크다는 것을 의미한다.

유사한 물리-화학적 특성을 갖는 착물은 상이한 알파 아미노산을 사용하여 수득되었다. 이러한 착물의 원소 분석으로부터 제안된 구조와 일치된 결과를 얻었다. 착물의 FTIR 스펙트럼은 착물을 형성하는데 사용된 아미노산의 그것과 상이하며, 그 밖의 금속의 아미노산 착물의 그것과는 유사하다.

크로뮴(III)과 L-메티오닌 사이에서 형성된 착물을, 젖소의 크로뮴 영양소 공급원으로서 시험하여, 이것의 성능을 개선시키는 것을 확인하였다. 크로뮴 트리-L-메티오닌 히드로클로라이드가 함유된 사료를 젖소에게 공급하였더니, 건초 섭취량에는 영향을 미치지 않으면서 우유 생산량은 증가되었다. 랫트에서의 착물 의 독성을 검사한 결과 이는 사용된 용량에서는 독성이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 1

크로뮴(III) 트리-메티오네이트 히드로클로라이드의 제조:

물(550㎖)을 2000㎖ 비이커에 넣었다. 크로뮴 클로라이드 육수화물(79.959g, 0.3몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반시키면서 비등할 때까지 가열시켰다. L-메티오닌(134.306g, 0.9몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반시키면서 고형물이 완전히 용해될 때까지 가열시켰다. 교반시키면서 추가 30분 동안 계속적으로 가열하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 녹색에서 어두운 청록색으로 변하였다. 이후, 이 용액을 30℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨(23.316g, 0.5829몰)을 100㎖의 물에 용해시키고, 이 용액을 30℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액을 교반시키면서 크로뮴-메티오닌 용액에 적가하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 청록색에서 어두운 보라색으로 변하였다. 용액을 감압하에서 증발건조시켰다. 잔류물을 메탄올로 추출하여 백색의 결정성 고형물을 수득하였다. 이 메탄올 추출물을 증발건조시켜 어두운 보라색의 결정성 고형물(161.352g, 수율: 100.91%)을 수득하였다.

브롬화칼륨 펠릿에서 이 생성물의 FTIR은 하기 흡광도를 나타내었다: 3421.5(s), 2916.2(s), 1635.5(s), 1508.2(m), 1438.8(m), 1338.8(m), 1338.5(s), 1272.9(w), 1242.1(w) 및 1145.6(m) cm^-1 (s=강, m=중, w=약).

0.01M 수용액의 가시광선 스펙트럼은 400nm(몰 흡광도, 44.08) 및 541nm(몰 흡광도, 50.60)에서 2개의 최대치를 나타내었다.

0.1몰 수용액의 pH는 4.078이었다. 10㎖ 분획물을 중탄산나트륨 0.1몰 용액 200㎖로 희석시켰다. 어떠한 침전물도 형성되지 않았다. 이 용액의 pH는 8.097이었다. 중탄산나트륨 0.1몰 용액 600㎖를 추가로 첨가하였다. 어떠한 침전물도 형성되지 않았으며, 이 용액의 pH는 8.354이었다.

0.9555mg/㎖ 당량을 함유하는 메탄올 중의 착물 용액을, 메탄올을 사용하여 0.5㎖/min의 속도에서 유동상으로서 60A 매크로스피어 GPC 컬럼[알테크 어쏘시에이트, 인코포레이티드(Alltech Associates, Inc.) 제품]상에서 HPLC에 의해 그리고 407nm에서 UV/Vis 검출기에 의해 분석하였다. 머무름 시간이 6.48분인 단일 피크가 얻어졌다. 0.4666 mg/㎖의 당량을 함유하는 크로뮴 클로라이드 육수화물 용액을 동일한 조건하에서 분석하여, 머무름 시간이 6.67분인 피크가 형성되었다. 머무름 시간이 더 길다는 것은, 크로뮴 착물이 크로뮴 클로라이드보다 더 큰 분자 크기를 갖는다는 것을 의미한다.

아미노산을 검출하기 위해 검출기를 210nm로 설정하는 것을 제외하고는, HPLC 분석을 반복하였다. 검출 감도는 405nm에서의 감도보다 100배 이상 더 높았으며, 0.009555mg/㎖의 크로뮴을 함유하도록 샘플을 희석시켜야 했다. 이렇게 희석된 샘플은 407nm에서 머무름 시간이 6.19분인 단일 피크를 나타내었다. 210nm에서 여러개의 부 피크 및 머무름 시간이 6.19분인 주 피크가 확인되었다. 동일한 조건 하에서 210nm에서 설정된 검출기를 사용하여 L-메티오닌 히드로클로라이드 샘플을 분석함으로써, 여러개의 부 피크와 머무름 시간이 7.6분인 주 피크의 존재를 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 착물이 손상되지 않은(intact) 컬럼 상으로 이동하였으며, 이것의 분자 크기가 크로뮴 클로라이드 및 L-메티오닌 히드로클로라이드의 분자 크기보다 더 크다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2

크로뮴(III) 트리-루시네이트 히드로클로라이드의 제조:

물(150㎖)을 600㎖ 비이커에 넣었다. 크로뮴 클로라이드 육수화물(13.325g, 0.05몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반시키면서 비등할 때까지 가열시켰다. L-루신(19.685g, 0.15몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 교반시키면서 고형물이 완전히 용해될 때까지 가열시켰다. 교반시키면서 추가 30분 동안 계속적으로 가열하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 녹색에서 어두운 청록색으로 변하였다. 이후, 이 용액을 30℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨(4.014g, 0.10몰)을 20㎖의 물에 용해시키고, 용액을 30℃로 냉각시켰다. 수산화나트륨 용액을 교반시키면서 크로뮴-루신 용액에 적가하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 청록색에서 어두운 보라색으로 변하였다. 용액을 감압하에서 증발건조시켰다. 잔류물을 메탄올로 추출하여 백색 결정성 고형물을 수득하였다. 이 메탄올 추출물을 증발건조시켜 어두운 보라색의 결정성 고형물(28.363g, 이론치: 23.948, 수율: 118.44%, 이는 생성물이 염화나트륨 잔류물을 함유하고 있다는 것을 나타냄)을 수득하였다.

브롬화칼륨 펠릿에서 이 생성물의 FTIR은 하기 흡광도를 나타내었다: 3425.3(m), 2916.2(s), 1635.5(s), 1508.2(m), 1438.8(m), 1384.8(m), 1338.5(s), 1272.9(w), 1242.1(w) 및 1141.8(m) cm^-1 (s=강, m=중, w=약).

0.01M 수용액의 가시광선 스펙트럼은 406nm(몰 흡광도, 38.79) 및 545nm(몰 흡광도, 42.81)에서 2개의 최대치를 나타내었다.

0.1몰 수용액의 pH는 3.996이었다. 10㎖ 분획물을 중탄산나트륨 0.1몰 용액 200㎖로 희석시켰다. 어떠한 침전물도 형성되지 않았다. 이 용액의 pH는 7.987이었다. 이 용액의 가시광선 스펙트럼은 409nm(몰 흡광도, 47.46) 및 558nm(몰 흡광도, 47.67)에서 2개의 최대치를 나타내었다.

실시예 3

크로뮴 트리-메티오네이트 히드로클로라이드 프리믹스(0.1% 크로뮴)의 제조:

증류수 100㎖를 400㎖ 비이커에 넣었다. 크로뮴 클로라이드 육수화물(6.672g, 0.0251몰)을 첨가하고, 이 혼합물을 교반시키면서 고형물이 완전히 용해될 때까지 가열시켰다. L-메티오닌(11.201g, 0.0751몰)을 첨가하고, 이 혼합물을 교반시키면서 가열하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 녹색에서 청록색으로 변하였다. 추가 60분 동안 90 내지 95℃에서 계속적으로 가열하였다. 이후, 이 용액을 30℃로 냉각시켰다. 50㎖의 물 중의 수산화나트륨(1.967g, 0.0492몰) 냉 용액을 교반시키면서 적가하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 보라색으로 변하였다. 용액을 감압하에서 증발건조시켰다. 잔류물을 100㎖의 메탄올에 용해시키고, 이 용액을 1000g의 담체에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 60℃의 오븐 내에 위치시켰다. 건조된 프리믹스 샘플을 실시예 1에 기술된 바와 같이 UV/Vis, 비색계(colorimetry) 및 HPLC에 의해 분석하였다. 이 프리믹스를 돼지의 사료 시험에 사용하였다.

실시예 4

크로뮴 트리메티오네이트 용액(1.75% 크로뮴)의 제조:

1500㎖의 물을 4ℓ 비이커에 넣었다. 크로뮴 클로라이드 육수화물(390.993g, 1.4675몰)을 첨가하고, 이 혼합물을 교반시키면서 고형물이 완전히 용해될 때까지 가열시켰다. 교반시키면서 추가 1시간 동안 계속적으로 가열하여 크로뮴 염이 완전히 수화되도록 하였다. L-메티오닌(1094.845g, 7.338몰)을 첨가하고, 이 혼합물을 교반시키면서 고형물이 모두 용해될 때까지 가열시켰다. 교반시키면서 1시간 동안 계속적으로 가열하였다. 이 용액의 색깔이 어두운 보라색으로 변하였다. 이 용액에 최종적으로 4ℓ의 증류수를 첨가하였다.

이 용액의 pH는 2.336이었다. 이는 25.61%의 메티오닌 및 1.86%의 크로뮴을 함유하고 있었다.

0.01M 수용액의 가시광선 스펙트럼은 416nm(몰 흡광도, 102.5) 및 579.5nm(몰 흡광도, 101.9)에서 2개의 최대치를 나타내었다.

0.1몰 수용액의 pH는 2.285이었다. 10㎖ 분획물을 중탄산나트륨 0.1몰 용액 200㎖로 희석시켰다. 침전물이 형성되지 않았다. 이 용액의 pH는 7.546이었다. 이 용액의 가시광선 스펙트럼은 409.5nm(몰 흡광도, 43.89) 및 558nm(몰 흡광도, 46.83)에서 2개의 최대치를 나타내었다.

실시예 5

젖소의 능력에 대한 크로뮴 트리-L-메티오네이트 히드로클로라이드의 효과

임신중인 젖소 능력에 대한, 크로뮴 트리-L-메티오닌 히드로클로라이드 형태의 크로뮴 함유 공급물의 효과를 시험하였다. 72마리의 임신 중인 젖소가, 우유 생산량 및 건초 섭취량이 크로뮴 트리-L-메티오닌 히드로클로라이드가 공급된 사료에 의해 영향을 받는지의 여부를 측정하는데 사용되었다. 이러한 젖소들에게, 비마초(nonforage) 섬유 공급원이 풍부하게 존재하거나 비섬유 탄수화물이 풍부하게 존재하는 사료를 분만하기 21일 전에서 예상되는 분만일까지 공급한 다음, 일반적인 수유용 사료를 공급하였다. 크로뮴 트리-L-메티오닌 히드로클로라이드가 젤캡(gelcap)을 통해 1일 1회 0, 0.03 또는 0.06mg Cr/kg 대사 체중의 용량으로 공급되었다. 크로뮴 공급은 예상되는 분만일 21일전에서부터 시작하여 분만후 28일까지 계속되었다. 분만한 후에 일반적인 과정에 따라 젖소로부터 우유를 채취하였다. 실험 동안 내내 각 젖소에 대한 공급물 섭취량을 매일 기록하였다. 사료 샘플을 주 단위로 채취하고, 건초 함량을 측정하였다. 개별 우유 중량을 실험의 수유 단계 동안에 각각의 우유에 대해 기록하였다. 우유 샘플은 매주중 단 하루 동안에 모든 우유로부터 채취하고, 각각의 젖소로부터 생산된 우유 양을 기초로 취합하여 이를 지방, 단백질, 락토오스 및 총 고형물에 대해 분석하였다.

크로뮴 트리-L-메티오닌 클로라이드가 함유된 사료를 공급하여도 젖소의 건초 섭취량에는 영향을 미치지 않았다. 그러나, 크로뮴을 공급하였더니 우유 생산량이 증가되는 경향을 보였다(P ＜ 0.13, 표 1).

표 1

	크로뮴 트리-L-메티오닌 HCl mg/kg BW.75
	0.00	0.03	0.06
분만전 건초 섭취량 (kg/day)	13.6	13.9	13.7
분만후 건초 섭취량 (kg/day)	17.9	18.9	19.4
우유 생산량 (kg/day)	40.4	40.6	42.8
우유 지방 (kg/day)	1.73	1.76	1.81
우유 지방 (%)	4.43	4.41	4.33
우유 단백질 (kg/day)	1.28	1.33	1.31
우유 단백질 (%)	3.32	3.37	3.15
우유 락토오스 (kg/day)	1.86	1.91	1.98
우유 락토오스 (%)	4.63	4.69	4.61
우유 고형물 (kg/day)	5.27	5.37	5.51
우유 고형물 (%)	13.38	13.39	13.03

이 실시예 및 본 발명의 크로뮴(III) 착물은 증류수 발효 가용물, 사료용 곡물, 가금류 및 어류 부산물, 굵게 간 곡식(meal), 유장(whey), 천연 염, 분쇄한 옥수수 속대, 페더밀(feathermeal) 등과 같은 종래의 불활성 영양 담체와 함께 사용될 수 있다.

실시예 6

랫트에서의 크로뮴 트리-L-메티오닌 히드로클로라이드의 독성:

크로뮴-L-메티오닌 히드로클로라이드의 독성을, 랫트 중에 단일 용량으로 경구 투여하여 시험하였다. 6주령의 랫트 50마리(25마리의 암컷과 25마리의 수컷)를 시험에 사용하였다. 이들중 수컷의 체중은 130 내지 220g이고, 암컷의 체중은 120 내지 190g이었다. 이들 랫트를 5마리씩 그룹을 지어 폴리카보네이트 재질의 우리(cage) 내의 먼지없는 톱밥 위에 위치시켰다. 이 우리를 22℃ 및 55%의 상대 습도의 공기 조절된 방 안에 놓았다. 랫트에게 펠릿화된 완전 혼합사료를 부정기적으로 공급하였다. 투여전 하룻밤 동안 랫트를 공복 상태로 유지시키고, 투여후 3 내지 4시간마다 사료를 공급하였다. 랫트에게 물을 부정기적으로 공급하였다. 랫트에게 무작위적으로 다섯가지 처리 중 하나를 실시하였다. 각각 5마리 랫트로 구성된 2개의 그룹, 즉 하나는 수컷 그룹이고 나머지 하나는 암컷 그룹에게 각각의 처리를 실시하였다. 이러한 처리는 무투여(대조군), 250 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg 및 2000 mg/kg 용량으로 실시되었다. 물에 용해시킨 화합물 용액을 위관 영양(gastric gavage)에 의해 단일 용량으로 경구 투여하였다. 이 용량으로 투여한 후에 14일 동안 랫트를 관찰하였다. 살아남아 있는 랫트를 14일째에 희생시켰다. 랫트의 체중을 처리 직전에 주당 2회(한번은 시험 기간이고, 나머지 한번은 희생시에)로 기록하였다.

시험 중에는 어떠한 랫트도 죽지 않았으며, 임의의 용량 수준에서 본 화합물을 투여한 동물에게서 처리와 관련된 임상적 증상도 나타나지 않았다. 또한, 경구 투여 후 14일째에 검시된 랫트에게서 육안으로 확인가능한 비정상적인 증상도 없었다. 그러나, 체중 증가율에 있어서의 5% 감소가 2000 mg/kg dose 투여된 수컷 랫트에게서 확인되었다. 이러한 용량은 돼지에 대한 권장량의 4000배에 상응하는 양이다. 또한, 대조군과 비교한 사료 소비율에 있어서의 용량과 관련된 감소는 1000 및 2000 mg/kg dose로 처리한 군에서 확인되었다.

이들 결과로부터, 이러한 실험 조건 하에 랫트에게 크로뮴 트리-메티오닌을 단일 용량으로 경구 투여하면, 돼지에 대한 권장량의 1000배에 상응하는 용량 수준 에서도 독성을 나타내지 않았음을 알 수 있다. 권장량의 2000배의 용량으로의 투여는 사료 소비율 감소와 관련이 있었으나, 이는 체중 증가율에 있어서의 감소와는 무관하였다. 권장량의 4000배에 상응하는 2000 mg/kg dose에서, 사료 소비율의 감소는 체중 증가율에서의 근소한 감소와 관련이 있었다.

Claims (20)

1. 하기 화학식(I)로 표시되는 크로뮴 착물:

   

   화학식(I)

   상기 식에서,

   R은 알파 아미노산에 일반적으로 존재하는 유기 부분이며,

   X는 수용성 음이온이다.
2. 제 1항에 있어서, X가 1가임을 특징으로 하는 착물.
3. 제 1항에 있어서, X가 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 술페이트, 포스페이트, 아세테이트 및 프로피오네이트로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 착물.
4. 제 1항에 있어서, R이, 알파 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 글리신으로 구성되는 군으로부터 선택되도록 선택됨을 특징으로 하는 착물.
5. 하기 화학식(I)로 표시되는 크로뮴 착물 및 동물용 영양 담체를 포함하는, 가축에 대해 증강된 생체이용률을 갖는 영양 조성물:

   

   화학식(I)
6. 제 5항에 있어서, X가 1가임을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 5항에 있어서, X가 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 술페이트, 포스페이트, 아세테이트 및 프로피오네이트로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 5항에 있어서, R이, 알파 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 글리신으로 구성되는 군으로부터 선택되도록 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 5항에 있어서, 담체가, 천연 염, 분쇄된 옥수수 속대, 옥수수 사료 및 페더밀(feathermeal)로 구성되는 불활성의 동물용 영양 담체로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
10. 투여를 요하는 동물에게, 소량이나 영양을 증강시킬 수 있는 유효량의 하기 화학식(I)의 크로뮴 착물을 투여하는 것을 포함하여, 1:3의 크로뮴(III) 착물을 사용하여 동물의 영양을 증강시키는 방법:

    

    화학식(I)

    상기 식에서,

    R은 알파 아미노산에 일반적으로 존재하는 유기 부분이며,

    X는 수용성 음이온이다.
11. 제 10항에 있어서, 동물이 돼지(porcine)이며, 용량이 300ppm 이하의 크로뮴을 제공하도록 하는 양임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10항에 있어서, 동물이 소이며, 용량이 0.03 내지 0.06 mg/kg/체중임을 특징으로 하는 방법.
13. 1:3의 크로뮴(III)과 알파 아미노산의, 극성 용매 가용성 크로뮴 알파 아미노산 착물을 형성하는 방법으로서,

    크로뮴(III) 염의 수용액을 90 내지 95℃로 가열시키는 단계;

    가열된 용액에 약 3당량의 알파 아미노산을 첨가하는 단계;

    용액의 색깔이 어두운 녹색에서 어두운 청록색으로 변할 때까지 계속적으로 가열시키는 단계; 및

    용액을 냉각시키고, 착물이 안정화되도록 pH를 3.9 내지 4.0으로 조절하여 용액 색깔을 어두운 보라색으로 변화시키는 단계를 포함하는 방법.
14. 모든 액체형 담체 중에 하기 화학식(I)의 크로뮴 착물을 포함하는, 가축에 대해 증강된 생체이용률을 갖는 영양 조성물:

    

    화학식(I)

    상기 식에서,

    R은 알파 아미노산에 일반적으로 존재하는 유기 부분이며,

    X는 수용성 음이온이다.
15. 제 14항에 있어서, X가 1가임을 특징으로 하는 조성물.
16. 제 14항에 있어서, X가 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 술페이트, 포스페이트, 아세테이트 및 프로피오네이트로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 14항에 있어서, R이, 알파 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린 및 글리신으로 구성되는 군으로부터 선택되도록 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 14항에 있어서, 액체형 담체가 물, 에탄올 및 당밀(molasse)로부터 선택된 용매임을 특징으로 하는 조성물.
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