KR100579494B1

KR100579494B1 - 피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으로 하는 경련성 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR100579494B1
Application number: KR1020040023779A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 강태천; 권오신; 박진서; 원무호
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2004-04-07
Publication date: 2006-05-12
Also published as: KR20050098517A

Abstract

본 발명은 항경련성 물질에 관한 것으로 좀더 상세히는 억제성 신경전달 물질로 알려진 감마-아미노부티레이트(γ-aminobutyrate, GABA)를 GABA 대사의 조효소인 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate)와 결합한 항경련성 효과가 있는 피리독살-감마아미노부티레이트에 관한 것이다.

피리독살-감마아미노부티레이트, 항경련성

Description

피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으로 하는 경련성 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물{Anticonvulsant Composition containing Pyridoxal-γ-aminobutyrate}

본 발명은 항경련성 물질에 관한 것으로 좀더 상세히는 억제성 신경전달 물질로 알려진 감마-아미노부티레이트(γ-aminobutyrate, GABA)를 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate)와 결합한 항경련성 효과가 있는 피리독살-감마아미노부티레이트에 관한 것이다.

GABA는 중추신경계에서 중요한 억제성 신경전달물질의 하나이다. 따라서 GABA방출 시스템(GABAergic system)의 이상은 간질을 비롯한 각종 신경과 질환을 유발하며, GABA 유사물질은 신경세포의 과흥분에 의한 신경독성을 효과적으로 차단하는 것으로 보고되어 있다. GABA는 GAD65(glutamate decarboxyrate 65) 및 GAD67의 두 종류의 효소에 의해 합성되며, 각각의 효소가 합성하는 GABA는 그 기능에 차이를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 즉 GAD65의 경우, 신경전달물질로 사용되는 GABA를 합성하는 한편, GAD67은 대사산물 및 비혈관계 방출(non-vesicular release)을 통해 GABA를 합성하는 것으로 알려져 있다(Babb et al., 1989; Benavides et al., 1982; Brooks-Kayal et al., 1998; Esclapez et al., 1999; Esclapez et al., 1997).

간질의 경우, GAD65에 비해 GAD67의 발현이 과도하게 증가되어, 신경전달물질로 사용되는 GABA 농도는 감소하는 것으로 알려져 있지만 어떠한 기전으로 인해 GAD67이 증가하는지에 대해서는 아직 명확히 규명되지는 않았다(Esclapez et al., 1999; Esclapez et al., 1997). 이와 같은 GAD의 생화학적 특성으로 인해, GAD 활성 또는 발현조절 약물의 개발은 매우 어려운 실정이다. 따라서, 현재까지 개발된 항간질약제의 대부분은 GABA 유도체의 구조를 갖고 있어, GABA 분해효소인 GABA 트랜스아미나제(transaminase; GABA-T)를 억제하는 특성을 가지고 있다. 대한민국 특허출원 제2002-63972호는 구릿대 뿌리에서 추출한 항경련성 물질에 관하여 기재하고 있으며, 이 추출물은 특히 GABA-T의 활성을 억제하는 작용이 있다고 기재하고 있다.

또한, 대한민국 특허출원 제2002-63973호는 상추(Lactuca savita)에서 분리한 항경련성 물질에 관하여 기재하고 있다. 이외에도 간질 및 발작 증세의 완화를 위하여 GABA의 수준을 높여줄 수 있는 약제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명자들은 종래의 항경련성 물질보다 뛰어난 효과를 갖는 물질을 탐색, 개발하던 중 피리독살포스페이트(PLP)와 감마아미노부티레이트(GABA)를 결합시켜 제조되는 피리독살-감마아미노부티레이트가 항경련성 효과를 나타내는 것을 밝혔다.

본 발명의 목적은 상기 피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물로 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자는 간질동물모델에서 GABA 대사에 매우 중요한 조효소인 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate, PLP)를 합성하는 효소, 피리독살 키나제(pyridoxal kinase, PK), PNP-옥시다제(PO) 등의 발현이 정상군과 현저한 차이가 있음을 확인하였으며, 기존의 항간질약제 중 일부는 이들 효소의 활성을 억제함을 확인하였다(An et al., 2004; Kang et al., 2002; Kang et al., 2002). 따라서 상기 결과에 착안하여 GAD의 조효소인 PLP와 GABA을 결합시킨 GABA 유도체인 피리독살-감마아미노부티레이트(PL-GABA)를 합성하고, 국제 공인 규정인 항경련제 개발 프로그램(Anticonvulsive Drug Development Program; ADD. NIH)을 적용하여 PL-GABA의 항간질효과를 동물실험을 통해 확인하였다.

본 발명은 항경련성 효과가 있는 피리독살-감마아미노부티레이트(PL-GABA)에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 피리독살-감마아미노부티레이트는 감마아미노부티레이트와 피리독살을 축합반응시켜 제조하는 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으 로 하는 경련성 질환에 유용한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 경련성 질환으로는 발작(seizures), 경련(convulsions) 또는 간질병(Epilepsy) 등을 들 수 있다.

피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성성분 이외에도 필요에 따라 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~500㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특 정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 시약

실험동물로는 수컷 BALB/C 및 ICR 마우스(18-25g)를 ADD 프로그램에 사용하였다. 각 실험동물은 경구(PO) 및 복강내(IP)를 통해 PL-GABA(1-300mg/kg)를 투여하였으며 피하투여(SC)를 통해 펜틸렌테트라졸(pentylenetetrazol; PTZ, 85mg/kg)을 투여하였다. 3-메캡토프로피온산(3-mercaptopropionic acid; 3-MPA, 100mg/kg)은 복강내 투여를 하였다. 모든 약제는 증류수에 희석 또는 용해하였으며, 1회 주사 양은 10㎖/㎏로 하였다.

실시예 1: PL-GABA의 합성 및 동정

본 실시예에서는 GABA를 피리독살(pyridoxal)에 축합시켜 아민(amine)유도체를 합성하였다. 메탄올:물(1:1) 용액에 피리독살과 아민을 넣고 pH>8, 25℃ 조건하에서 1시간 반응시켜 이민(imine) 유도체를 합성하였다. 합성된 이민 유도체는 피리독실기(pyridoxyl group)의 영향으로 비교적 안정하였다.

상기 합성된 이민(imine) 유도체를 수소화붕소나트륨(sodium borohydride)으 로 환원시킨 후 포름산(formic acid)을 과량으로 넣어 산성으로 만든 뒤 수산화나트륨(NaOH)으로 반응용액을 중화시켜 피리독살 아민 유도체를 제조하였다. 합성된 아민 유도체 화합물은 감압증류하여 농축시키고 양이온 교환컬럼(cation exchange column)을 통하여 분리정제하였다. 물질의 순도는 TLC를 통하여 검증하며 1-부탄올:아세트산:증류수(3:2:2) 전개용매를 사용하여 닌하이드린 스프레이(ninhydrine spray)로 확인하였다. 상기 제조된 아민 유도체 화합물의 화학적 구조를 UV와 NMR을 통하여 동정하였으며 양성자 NMR 스펙트럼과 탄소 NMR 스펙트럼의 결과로 다음과 같으며, 이 결과로 상기 아민 유도체 화합물이 PL-GABA임을 확인하였다.

¹ H NMR (500MHz, DMSO-d6);

8.45 (s, 1H, Py-H), 4.39 (s, 2H, CH₂-OH), 3.95 (s, 2H, Py-CH₂-NH), 2.54-2.52 (m, 5H, CH₃ and CH₂), 2.26 (m, 2H, CH₂), 1,68 (m, 2H, CH ₂).

¹³ C NMR (125.8MHz, DMSO-d6);

172.84 (COOH), 152.85 (Py), 145.19 (Py), 137,60 (Py), 132.63 (Py), 127.44 (Py), 58.86 (CH₂-OH), 47.86 (CH₂), 45.4 (Py-CH₂-NH), 32.96 (CH ₂), 24,51 (CH₂), 11.06 (CH₃)

실시예 2: 최대 전기충격 발작(Maximal electoshock seizure, MES) 시험

전신 강직-간대성 발작(Generalized tonic-clonic seizure)에 대한 효능을 검증하기 위해 MES 시험을 적용하였다. 각 실험동물은 30, 100 및 300mg/kg의 PL-GABA를 경구 또는 복강내 투여 후, 30분 및 4시간 후에 전기충격기(electical stimulator, Ugo Basile, Italy)를 이용하여 0.2초 동안 50mA, 60Hz의 MES을 ear clip electrodes를 통해 유발하였다. 뒷다리의 신근경련이 관찰되지 않는 경우 MES 유도 발작을 억제하는 것으로 측정하였다 (White et al., 1995).

PL-GABA 복강내 투여 30분 후에 실시한 MES 시험 결과, 30, 100, 300mg/kg 투여군 모두에서 간질발작이 완전히 억제됨을 확인할 수 있었다. 그러나, PL-GABA 복강내 투여 4시간 후에 실시한 MES 시험에서는 30mg/kg 투여군에서는 75%, 100 mg/kg 투여군에서는 87.5%, 300mg/kg 투여군에서는 모든 동물에서 간질억제 효능을 보였다(표 1).

Dose (mg/kg)	30분 (%)	4시간 (%)
1 (n = 8)	50	0
3 (n = 8)	87.5	0
4.5 (n = 8)	87.5	50
6 (n = 8)	100	37.5
10 (n = 8)	100	50
15 (n = 8)	100	62.5
30 (n = 5, 8)	100	75
100 (n = 5, 8)	100	87.5
300 (n = 5)	100	100

PL-GABA 경구투여군의 경우, 30분 후에 실시한 MES시험 결과, 30, 100, 300 mg/kg 투여군 모두에서 간질발작이 완전히 억제됨을 확인할 수 있었고, 4시간 후에 실시한 MES시험에서는 30mg/kg 투여군 및 100mg/kg 투여군에서는 87.5%, 300 mg/kg 투여군에서는 모든 동물에서 간질억제 효능을 보였다(표 2).

Dose (mg/kg)	30 min (%)	4 hr (%)
1 (n = 8)	25	0
3 (n = 8)	37.5	0
4.5 (n = 8)	37.5	12.5
6 (n = 8)	50	37.5
10 (n = 8)	62.5	62.5
15 (n = 8)	75	75
30 (n = 5, 8)	100	87.5
100 (n = 5, 8)	100	87.5
300 (n = 5)	100	100

실시예 3: 피하 PTZ(pentylenetetrazol) 시험(scPTZ)

발작역치(Seizure threshold)에 대한 PL-GABA의 영향을 측정하기 위해, 30, 100, 300mg/kg의 PL-GABA를 경구 또는 복강내 투여한 후, 30분 및 4시간 후에 PTZ(85mg/kg, SC)를 투여하였다. PTZ 투여 후 30분동안 관찰하여 간대성 발작(clonic seizures)이 나타나지 않을 경우 발작역치에 대한 PTZ의 영향을 감소시키는 것으로 판단하였다.

PL-GABA 복강내 투여 30분 후에 실시한 PTZ시험 결과, 30, 100, 300 mg/kg 투여군 모두에서 간질발작이 완전히 억제됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 4시간 후에 실시한 PTZ시험에서는 30mg/kg 투여군에서는 75%, 100 mg/kg 투여군에서는 87.5%, 300mg/kg 투여군에서는 모든 동물에서 간질억제 효능을 보였다(표 3).

Dose (mg/kg)	30 min (%)	4 hr (%)
1 (n = 8)	37.5	0
3 (n = 8)	62.5	0
4.5 (n = 8)	87.5	12.5
6 (n = 8)	100	25
10 (n = 8)	100	37.5
15 (n = 8)	100	62.5
30 (n = 5, 8)	100	75
100 (n = 5, 8)	100	87.5
300 (n = 5)	100	100

PL-GABA 경구투여군의 경우 30분 후는 모든 군에서 PTZ에 대한 항경련효과를 보였으나, 4시간 후에 실시한 PTZ시험에서는 30mg/kg 투여군에서는 75%, 100mg/kg 투여군에서는 87.5%, 300mg/kg 투여군은 모든 동물에서 간질억제 효능을 보였다(표 4).

Dose (mg/kg)	30 min (%)	4 hr (%)
1 (n = 8)	12.5	0
3 (n = 8)	37.5	0
4.5 (n = 8)	50	12.5
6 (n = 8)	75	50
10 (n = 8)	75	62.5
15 (n = 8)	87.5	62.5
30 (n = 5, 8)	100	75
100 (n = 5, 8)	100	87.5
300 (n = 5)	100	100

실시예 4: 3-MPA 시험

PL-GABA를 투여하고 30분 및 4시간 후에 3-MPA(100 mg/kg)를 투여하였다. 3-MPA 투여 후 5분동안 간질발작이 관찰되지 않으면, 3-MPA에 대한 항경련효과가 있는 것으로 간주하였다.

PL-GABA를 복강내 투여한 후 실시한 3-MPA 시험결과 30, 100, 300mg/kg 투여 군 모두에서 투여 30분 후에는 간질발작을 완전히 억제함을 확인할 수 있었다. 그러나, 4시간 후에 실시한 3-MPA 시험에서는 30mg/kg 투여군에서는 20%, 100mg/kg 투여군에서는 60%, 300mg/kg 투여군에서는 80%의 동물에서 간질억제 효능을 보였다(표 5).

Dose(mg/kg)	30min(%)	4hr(%)
30 (n = 5)	100	20
100 (n = 5)	100	60
300 (n = 5)	100	80

실시예 5: 최소 신경독성(Minimal neurotoxicity)

PL-GABA에 의한 신경독성(neurotoxicity) 유무를 판단하기 위해 the standardized rotorod mothod를 사용하였다(Dunham and Miya, 1957). PL-GABA 투여 30분 및 4시간 후에 6rpm 회전막대(rotation rod)에 동물을 올려놓은 후 평형감각의 지속유무를 1분동안 연속 3회 측정하였다. 1분동안 평형감각을 유지할 경우, 신경독성(neurotoxicity)이 없는 것으로 판단하였다.

PL-GABA를 복강내 투여하고 30분 및 4시간 후에 실시한 최소 신경독성시험(minimal neurotoxicity test) 결과 모든 군에서 신경독성이 관찰되지 않았다(표 6).

Dose (mg/kg)	30 min	4 hr
30 (n = 10, 16)	0	0
100 (n = 10, 16)	0	0
300 (n = 10)	0	0

실시예 6: ED50 측정

최소 8마리의 마우스를 한 그룹으로 하여 다양한 농도의 PL-GABA를 투여한 후 나타나는 간질발작 동물의 백분율을 선형회기분석(신뢰도 95%)을 통해 ED50을 결정하였다(Finney, 1971).

상기 실시예 1 내지 5의 결과를 바탕으로 ED50을 확인한 결과, 투여방법과 상관없이 복강내투여군은 MES 시험의 경우 투여 30분 후 군의 ED50은 2.8mg/kg, 4시간 후의 ED50은 27.6mg/kg로 나타났으며, PTZ 시험의 경우는 투여 30분 후 군의 ED50은 6.6mg/kg, 4시간 후의 ED50은 27.6mg/kg로 확인되었다. 경구투여군 역시, 투여 30분 후 군의 ED50은 2.8mg/kg, 4시간 후의 ED50은 27.6 mg/kg로 나타났으며, PTZ 시험의 경우는 투여 30분 후 군의 ED50은 6.6 mg/kg, 4시간 후의 ED50은 27.6mg/kg로 확인되었다(표 7). 표 7의 괄호 안의 농도는 측정한 농도범위를 나타내는 것이다.

시 험	30 min (mg/kg)	4 hr (mg/kg)
MES (IP)	2.8 (0.5-5.2)	27.6 (0.1 - 70)
MES (PO)	6.6 (0-13.7)	27.6 (0.1 - 70)
PTZ (IP)	2.8 (0.5-5.2)	27.6 (0.1 - 70)
PTZ (PO)	6.6 (0-13.7)	27.6 (0.1 - 70)

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 발작, 경련 또는 간질 등의 경련성 질환 등에 대하여 항경련성 작용을 하는 피리독살-감마아미노부티레이트를 제공할 수 있다. 즉, 상기 ADD 프로그램을 통해 PL-GABA의 항경련효과를 측정한 결과, MES, PTZ 및 3-MPA에 의한 간질발작을 유의하게 억제시킴을 확인하였다.

또한, 본 발명의 피리독살-감마아미노부티레이트는 이를 유효성분으로 하는 약제학적 조성물로 제공할 수 있다.

본 발명의 PL-GABA는 증류수에 잘 녹아 별다른 부형제(vehicle) 없이 투여가능할 뿐만 아니라, 경구, 복강내 투여를 통해 모두 동일한 항경련효과를 나타났고, 특히, 기존 약제투여 시 나타나는 최소 신경독성(minimal neurotoxicity)이 모든 PL-GABA 투여범위에서 관찰되지 않은 점은 기존 약제의 효용성을 능가하는 항경련성 치료제로 개발될 수 있다.

Claims

피리독살-감마아미노부티레이트를 유효성분으로 하는 경련성 질환 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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