KR100527876B1

KR100527876B1 - 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효 성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100527876B1
Application number: KR10-2002-0063972A
Authority: KR
Inventors: 최수영; 백남인; 권오신; 강태천; 이길수; 박진서; 조성우; 이현용
Original assignee: 학교법인 한림대학교; 학교법인 경희대학교
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2005-11-15
Also published as: KR20040035209A

Abstract

본 발명은 임페레이토린(imperatorin) 및/또는 팔카린다이올(falcarindiol)을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 좀더 자세히는 신경전달물질인 γ-아미노부티레이트(γ-aminobutyrate; GABA)의 결핍에 의하여 야기되는 발작, 경련, 간질 등의 경련성 질환에 대하여 GABA 분해효소인 GABA 트랜스아미나아제(GABA transaminase; GABA-T)와 숙시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinic semialdehyde dehydrogenase; SSADH)의 활성을 억제시켜 GABA의 양을 증가시킴으로서 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효 성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물{Anticonvulsant containing imperatorin and/or falcarindiol}

본 발명은 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 좀더 자세히는 신경전달물질인 γ-아미노부티레이트(γ-aminobutyrate; GABA)의 결핍에 의하여 야기되는 발작, 경련, 간질 등의 경련성 질환에 대하여 GABA 분해효소인 GABA 트랜스아미나아제(GABA transaminase; GABA-T)와 숙시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinic semialdehyde dehydrogenase; SSADH)의 활성을 억제시켜 GABA의 양을 증가시킴으로서 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

고도 산업화 사회로 발전함에 따라 다양한 신경정신질환들이 나타나고 있다. 대표적인 신경질환으로는 억제성 신경전달 물질인 GABA(γ-aminobutyrate)의 신호전달계 결함에 기인하는 간질(epilepsy), 발작(sezure) 및 경련(convulsion) 등이 있고 도파민의 신경계 결함으로 인한 파킨슨씨병(Parkinsonism)과 정신분열증 (Schizophrenia) 등이 있다. 간질(epilepsy), 발작(sezure) 및 경련(convulsion)의 신경생화학적 주원인은 신경세포사이에서 신경전달이 일어날 때 흥분성 신경전달과 억제성 신경전달사이의 균형이 깨어지면서 발생하는 것으로 신경전달에 관여하는 신경전달 물질의 대사 과정을 조절함으로써 치료가 가능하다. GABA의 농도감소가 이들 질병의 원인되므로 GABA의 농도를 높여주는 약제를 개발함으로써 항경련 치료제의 개발이 가능하다.

GABA는 포유류의 많은 조직에 분포하며, 중추신경계에 있어 주된 억제성 신경전달물질이다. 도 1에 나타난 것과 같이 GABA의 농도는 GABA 대사관련 효소인 글루타메이트 디하이드로게나제(glutamate dehydrogenase; GDH), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase; GAD), GABA 트랜스아미나아제(GABA transaminase; GABA-T), 숙시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제 (succinic semialdehyde dehydrogenase; SSADH) 및 숙시닉 세미알데하이드 환원효소(succinic semialdehyde reductase; SSAR)에 의해 조절되고 있다.

따라서 간질 및 발작 증세의 완화를 위하여 GABA의 농도를 높여 줄 수 있는 약제를 사용하게 되는데, 이는 GABA 합성효소인 GDH나 GAD의 활성제 또는 GABA분해 대사에 관여하는 GABA-T, SSADH, SSAR의 저해제를 탐색함으로써 가능하며, 현재 부작용이 적은 천연소재로부터 이러한 효능을 가진 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 경련, 발작 및 간질 등의 질환에 효과가 있는 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 구릿대 뿌리에서 분배, 추출하여 부작용이 적은 항경련성 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 임페레이토린(imperatorin) 및/또는 팔카린다이올(falcarindiol)을 유효 성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.또한, 본 발명은 상기 조성물이 GABA-T의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올이 구릿대(Angelica dahurica Benth. et Hook.) 뿌리 추출물을 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 분배 추출하여 수득하는 것임을 특징으로 한다.

상기 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물은 발작(seizures), 경련(convulsions), 간질병(Epilepsy) 중 1종 이상의 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물로 사용되는 것을 특징으로 한다.

상기 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사형태로 제형할 수 있다. 경구용 조성물로는, 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 필요에 따라 희석제(예: 락토스, 텍스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀루로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 항미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.001㎍~100 ㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다.

GABA(γ-aminobutyrate)의 분해 효소인 γ-아미노부티레이트 트랜스아미나아제(GABA transaminase; GABA-T)와 숙시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제 (succinic semialdehyde dehydrogenase; SSADH)의 활성을 억제하는 구릿대(Anglica dahurica) 뿌리의 80% 메탄올 수용액 추출물을 에틸아세테이트(ethyl acetate; EtOAc), n-부탄올(n-butanol; n-BuOH)과 물로 분배, 추출하였다. 에틸아세테이트 (ethyl acetate; EtOAc)와 n-부탄올(n-butanol; n-BuOH)분획을 컬럼 크로마토그래피를 반복하여, 알려진 6개의 쿠마린(coumarins); 이소임퍼레이토린 (isoimperatorin; 화합물 1), 임퍼레이토린(imperatorin; 화합물 3), 펠로프터린(phellopterin; 화합물 5), 옥시퍼세다닌 하이드레이트 (oxypeucedanin hydrate; 화합물 6), 노다케닌(nodakenin; 화합물 9)과 3'-하이드록시말메시닌(3'-hydroxymarmesinin; 화합물 10)과 두개의 새로운 쿠마린 (coumarins); 옥시퍼세다닌 하이드레이트-3"-부틸 에테르(oxypeucedanin hydrate-3"-butyl ether; 화합물 2)와 아이소프래로사이드IV(isopraeroside IV; 화합물 8) 그리고 두개의 폴리아세틸렌(polyacetylenes); 팔카린다이올(falcarindiol; 화합물 4)과 옥타데카-1,9-다이엔-4,6-다인-3,8,18-트리올(octadeca-1,9-dien-4,6-diyn-3,8,18-triol; 화합물 7)를 분리하였다. 분리된 순수한 화합물 중에서, 화합물 3과 화합물 4는 시간과 농도에 의존하여 GABA-T의 활성을 불활성화시킨다. 키네틱(kinetic)에 대한 연구에서 화합물 3과 4는 GABA-T와 각각 2.3 mM^-1 min^-1와 1.5 mM^-1 min-¹의 2차 반응속도 상수로 반응한다. 이것은 화합물 3과 4가 GABA 분해효소인 GABA-T를 억제시켜 중추신경계에서 신경전달물질인 GABA의 양을 증가시킬 수 있을 것으로 예상된다.

삭제

이하에서는 본 발명의 구성을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료>

구릿대(Angelica dahurica Benth. et Hook.) 뿌리는 서울의 시장에서 구입했으며, 한국생명공학연구원(대전)의 이형규 박사에 의해서 증명되었다. 표본시료 (KHU97246)는 경희대학교(수원) 천연물화학 실험실에 보관하였다.

소의 뇌조직은 서울 마장동 도축장에서 구입하였으며, 소디움 피로포스페이트, 2-머캡토에탄올, NAD⁺, GABA, α-글루타레이트, 숙시닉 세미알데하이드, 인산칼륨은 Sigma사(미국)에서 구입했으며, 수퍼로즈-6, CM-세파로즈(CM-Sepharose), 블루세파로즈(Blue-Sepharose), CC-세파덱스, DEAE-세파덱스와 하이드록시아파타이트는 Pharmacia사(스웨덴)에서 구입했다.

<실시예1: 쿠마린과 폴리아세틸렌의 분리>

가루로 분쇄된 식물 재료(1㎏)을 상온에서 하룻밤동안 80% 메탄올 수용액(4ℓ×2)으로 추출했다. 용매를 제거한 후, 에틸아세테이트(ethyl acetate; EtOAc, 42g)와 n-부탄올(n-butanol; n-BuOH, 55g)에 용해되는 분획을 얻기 위하여 EtOAc(700㎖ ×2)와 n-BuOH(500㎖ ×2)으로 추출하고 잔유물에 물(500㎖)을 가하였다.

EtOAc 분획(36g)은 실리카겔(250g) 컬럼으로 크로마토그래피하고, EtOAc의 비율을 증가시키면서(n-hexane-EtOAc=5:1→3:1→1:1→1:3, 2ℓ) n-헥산-EtOAc로 단계적으로 농도구배 용출하여, TLC로 12개의 소분획(ADE-1~ADE-12)을 확인하였다. n-헥산-삼염화탄소-에탄올(20:20:1, 800㎖)로 용출하면서 소분획 ADE-5(1.89g)을 실리카겔(100g) 컬럼(4 x 30cm) 크로마토그래피로 정제하여 화합물 1 (isoimperatorin, 628mg, CHCl₃-EtOH=12:1으로 실리카겔 TLC상에서 Rf: 0.39)을 얻었다. 이소임퍼레이토린(isoimperatorin; 화합물 1): 무색의 프리즘(CHCl₃-EtOH), m.p. 109-110℃. Lit. [12] m.p.109.5-110.5℃.

소분획 ADE-7(2.75g)는 n-헥산-삼염화탄소-에탄올(30:10:1, 1,200㎖)로 용출시키면서 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 4개의 소분획(ADE-7-1∼ADE-7-4)을 얻었으며, 그중 세번째 소분획(ADE-7-3, 540 mg)은 화합물 2(Oxypeucedanin hydrate-3"-butyl ether, 143 mg, Rf : 0.36 실리카겔 TLC상에서 삼염화탄소-에탄올=10:1)를 생산하기 위하여 n-헥산-CHCl₃-에탄올(12:12:1, 550 mL)으로 용출시켜 실리카겔(75 g) 컬럼에서 크로마토그래피했다.

옥시퍼세다닌 하이드레이트-3"-부틸 에테르(Oxypeucedanin hydrate-3"-butyl ether; 화합물 2): 연갈색의 프리즘(CHCl₃-EtOH), m.p. 102-103 ℃; [α]_D: +1.1° (c = 1.1, CHCl₃); UV: λ_max nm(MeOH, log ε) 252 (3.5), 269 (3.6), 315 (3.9); IR: γ_max cm^-1(CHCl₃) 3465, 3015, 1725, 1620, 1520; EI-MS m/z: 360(M⁺), 345, 315, 303, 185, 174; HREI-MS m/z: 360.1577 (calcd for C₂₀H₂₄O₆, 360.1573); ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃, δ) 8.14 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-4), 7.50 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-2'), 7.03 (1H, br. s, H-8), 6.93 (1H, dd, J = 2.2, 0.7 Hz, H-3'), 6.16 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-3), 4.53 (1H, dd, J = 10.0, 3.0 Hz, H-1"-a), 4.31 (1H, dd, J = 10.0, 7.8 Hz, H-1"-b), 3.85 (1H, dd, J = 7.8, 3.0 Hz, H-2"), 3.33 (2H, t, J = 6.3 Hz, H-1"'), 1.45 (2H, m, H-2"'), 1.29 (2H, m, H-3"'), 1.19 (3H, s, H-5"), 1.17 (3H, s, H-4"), 0.83 (3H, t, J = 7.3 Hz, H-4"'); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl³, δ_c) 161.68 (C-2), 158.07 (C-7), 152.50 (C-5), 148.84 (C-8a), 144.88 (C-2'), 139.43 (C-4), 113.85 (C-6), 112.57 (C-3), 107.17 (C-4a), 104.90 (C-3'), 94.22 (C-8), 76.68 (C-2"), 75.59 (C-3"), 74.21 (C-1"), 60.92 (C-1"'), 32.39 (C-2"'), 21.32 (C-4"), 21.15 (C-5"), 19.37 (C-3"'), 13.82 (C-4"').

화합물 3(imperatorin, 212 mg), 화합물 4(falcarindiol, 502 mg) 및 화합물 5 (phellopterin, 154 mg) {n-헥산-삼염화탄소-에탄올=14:14:1으로 실리카겔 TLC 상에서 Rfs : 0.58 (화합물 3), 0.51 (화합물 4), 0.42 (화합물 5)}는 용출용매로 n-헥산-CHCl₃-에탄올(25:20:1, 2,400mL)을 사용하여 ADE-8(4.0g)을 실리카겔(125g, 4x35cm) 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 수득했다. 임퍼레이토린(Imperatorin; 화합물 3): 무색 프리즘 (CHCl₃-EtOH), m.p. 101-102℃. Lit. [13] m.p.102℃. 팔카린다이올(Falcarindiol; 화합물 4): 무색 오일, [α]_D +318° (MeOH, c = 1.8). Lit. [14] [α]_D +321.4°(CH₃CN). 펠로프터린(Phellopterin; 화합물 5): 연노랑의 니들 (n-hexane-EtOAc), m.p.101-102℃. Lit.[15] m.p.103.5-104.5℃.

ADE-11(2.7 g)은 화합물 6(oxypeucedanin hydrate, 517 mg, n-헥산-에틸아세테이트-아세톤=2:7:2으로 실리카겔 TLC 상에서 Rf : 0.58)을 얻기 위해 n-헥산-CHCl₃-에탄올(4:6:1, 1,700mL)으로 용출하면서 실리카겔(120g) 컬럼 크로마토그래피를 적용했다. 옥시퍼세다닌 하이드레이트(Oxypeucedanin hydrate; 화합물 6): 무색의 니들(n-hexane-EtOAc), m.p.137-138℃; [α]_D +18.9°(MeOH, c=1.2). Lit. [16] m.p.136-137℃; [α]_D + 16.9°(EtOH)}.

ADE-12(2.76g)은 화합물 7(Octadeca-1,9-dien-4,6-diyn-3,8,18-triol, 34 mg, n-헥산-에틸아세테이트-메탄올=7:7:1으로 실리카겔 TLC 상에서 Rf : 0.48)을 얻기 위해 n-헥산-CHCl₃-메탄올(10:3:1, 1,400mL)으로 용출하면서 실리카겔(120g) 컬럼 크로마토그래피를 적용했다. 화합물 7: 무색 오일, [α]_D + 308°(CHCl₃, c=1.2). Lit. [14] [α]_D+ 318.2°(CH₃CN).

n-부탄올 분획(40g)은 10개의 소분획(ADB-1∼ ADB-10)을 얻기 위하여 CHCl₃-MeOH-H₂O=10:1:0(1,000mL) → 7:1:0(800mL) →5:1:0(800mL) → 65:35:10(1,000mL) → 6:4:1(1,000mL)으로 변화하여 용출하면서 실리카겔(250g) 컬럼(7x17cm)에 도입했다. 5개의 소분획(ADB-5-1∼ADB-5-5)을 수득하기 위하여 다섯 번째 분획(ADB-5, 914 mg)을 CHCl₃-MeOH(5:1, 1,700 mL)으로 용출하면서 실리카겔(200g) 컬럼(7x15cm) 크로마토그래피했다. 용출용매로써 n-BuOH-EtOAc(2:5, 1,200mL)을 사용하여 소분획 ADB-5-1(572mg)을 실리카겔(150g) 컬럼(5x25cm) 크로마토그래피하여 3개의 소분획(ADB-5-1-1∼ADB-5-1-3)을 얻었다. ADB-5-1-2(165mg), 피리딘(4ml) 및 아세틱안하이드라이드(4ml)의 혼합물을 상온에서 하룻밤동안 교반시켰다. 반응용액을 얼음물(150mL)에 가하고 EtOAc(150mL x 2)으로 추출하였다. 유기물층은 5% 염산 수용액(150mL), 포화 중탄산 소다 수용액(150mL)과 소금물(150mL)로 연속적으로 세척하고 안하이드로스 마그네슘 설페이드(anhydrous magnesium sulfate)로 건조하였다. 아세틸화한 혼합물은 화합물 8a(isopraeroside IV tetraacetate; 221 mg, n-hexane-EtOAc=1:2으로 실리카겔 TLC상에서 Rf : 0.42)를 얻기 위하여 n-hexane-EtOAc(1:1, 750mL)로 용출하면서 실리카겔(75g) 컬럼(3 x 24cm) 크로마토그래피로 정제하였다.

화합물 8a(Isopraeroside IV tetraacetate): 연노란색의 오일, [α]_D + 54° (MeOH, c = 1.2); IR: λ_max cm^-1 (CHCl₃) 1715, 1610, 1515; ¹H-NMR(400 MHz, CDCl₃, δ) 7.62 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-4), 7.25 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 6.71 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-6), 6.20 (1H, d, J = 9.3 Hz, H-3), 5.13 (1H, dd, J = 9.5, 9.5 Hz, glc-4), 4.94 (1H, dd, J = 9.7, 8.5 Hz, glc-2), 4.84 (1H, dd, J = 9.7, 9.5 Hz, glc-3), 4.75 (1H, d, J = 8.5 Hz, glc-1), 4.69 (1H, dd, J = 2.6, 5.6 Hz, H-2), 3.93 (1H, dd, J = 5.3, 12.2 Hz, glc-6a), 3.56 (1H, dd, J = 2.4, 12.2 Hz, glc-6b), 3.48 (1H, m, glc-5), 3.25 (1H, dd, J = 2.6, 12.0 Hz, H-1a), 3.23 (1H, dd, J = 5.6, 12.0 Hz, H-1b), 1.96, 1.95, 1.92, 1.91 (all 3H, each s, acetyl-methyl), 1.29 (3H, s, H-4), 1.22 (3H, s, H-5); ¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃, δ_c) 171.14, 170.52, 170.34, 169.32 (acetyl-carbonyl), 163.75 (C-2), 160.95 (C-7), 151.31 (C-8a), 143.87 (C-4), 128.65 (C-5), 113.96 (C-8), 113.12 (C-4a), 112.32 (C-3), 106.43 (C-6), 95.62 (glc-1), 90.40 (C-2), 78.62 (C-3), 72.90 (glc-5), 71.52 (glc-3), 71.49 (glc-2), 69.46 (glc-4), 61.68 (glc-6), 60.38 (C-2'), 27.70 (C-1), 22.75 (C-4), 22.65 (C-5), 20.59 (x2), 20.56, 20.53 (acetyl-methyl).

화합물 8a(50 mg)은 5ml 2% KOH용액(H₂O-MeOH=1:3)에 용해시키고 상온에서 30분동안 교반시켰다. 반응 혼합물은 Dowex 50w x 8 (H⁺form)을 첨가해서 중화시키고, 필터하고 증발시켜 건조한 후, 화합물 8을 얻기 위하여 실리카겔(50g) 컬럼(3x12cm)크로마토그래피(n-hexane-EtOAc=8:5, 450mL)를 수행하였다. (12.2 mg, CHCl₃-MeOH-H₂O = 65:35:10에서 실리카겔 TLC 상에서 Rf : 0.61).

화합물 8(Isopraeroside IV): 백색 가루(n-hexane-EtOAc-MeOH), m.p.117-118℃; [α]_D: + 66°(MeOH, c = 1.2); IR: λ_max cm^-1(CHCl₃) 3382, 1710, 1604, 1490; EI-MS m/z: 408(M⁺), 275, 246, 228, 187, 175; HREI-MS: Found: 408.1422, Calcd. For C₂₀H₂₄O₉: 408.1420; ¹H-NMR(400 MHz, CD₃OD, δ) 7.77 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-4), 7.30 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5), 6.67 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-6), 6.09 (1H, d, J = 9.5 Hz, H-3), 4.49 (1H, d, J = 7.8 Hz, glc-1), 4.12 (1H, dd, J = 2.1, 5.5 Hz, H-2), 3.05 (1H, dd, J = 2.1, 12.0 Hz, H-1a), 3.01 (1H, dd, J = 5.5, 12.0 Hz, H-1b), 1.28, 1.26 (both 3H, each s, H-4, 5);¹³C-NMR(100 MHz,CD₃OD,δ _c) 165.60 (C-2), 163.25 (C-7), 152.54 (C-8a), 146.33 (C-4), 130.27 (C-5), 115.53 (C-8), 114.46 (C-4a), 112.36 (C-3), 107.86 (C-6), 98.91 (glc-1), 91.90 (C-2), 79.16 (C-3), 78.13 (glc-5), 77.50 (glc-3), 75.12 (glc-2), 71.39 (glc-4), 62.35 (glc-6), 28.27 (C-1), 23.79, 22.47 (C-4, 5).

ADB-5-3(29 mg)은 ADB-5-1-2와 유사한 절차로 아세틸화시키고, 화합물 9a을 공급하기 위해 n-헥산-에틸아세테이트(5:6, 240mL)로 용출시키면서 실리카겔(30mL)컬럼(3 x 9 cm)을 적용하였다. 화합물 8a의 그것과 같은 화합물 9a의 동일한 처리와 실리카겔(30g) 컬럼(3 x 9 cm) 크로마토그래피(CHCl₃-MeOH = 4:1, 320 mL)로 정제된 화합물 9(nodakenin, 17 mg, Rf : 0.52 on silica gel TLC in CHCl3-MeOH-H2O = 65:35:10)을 얻었다. 화합물 9(Nodakenin): 백색가루 (n-hexane-EtOAc), m.p. 224-225 ℃; [α]_D + 28.0° (MeOH, c = 0.7). Lit. [12] m.p. 217-219 ℃; [α]_D+24° (EtOH-H₂O=1:1, c = 0.9).

ADB-7(1.5 g)는 5개의 소분획(ADB-7-1 ∼ ADB-7-5)을 얻기 위하여 용출용매로써 CHCl₃-EtOH(3:1, 1600mL)을 사용하여, 실리카겔(150g) 컬럼(5 x 25cm) 크로마토그래피에 도입했다. 다섯번째 분획(ADB-7-4, 44 mg)은 화합물 10(3`-hydroxymarmesinin, 22 mg, Rf : 0.33 on silica gel TLC in CHCl₃-MeOH-H₂O = 65:35:10)을 공급하기 위하여 실리카겔(50g) 컬럼(3 x 14 cm, n-hexane-EtOAc-EtOH = 2:10:3) 크로마토그래피했다. 화합물 10(3-Hydroxymarmesinin): 무색의 니들 (n-hexane-EtOAc-EtOH), m.p. 262-263℃; [α]_D -24° (MeOH, c = 0.7). Lit. [9] m.p. 217-218℃; [α]_D - 11°(pyridine, c = 0.1).

상기 추출물에 있어서 각 분획의 수율은 1: 0.063%; 2: 0.017%; 3: 0.025%; 4: 0.059%; 5: 0.018%; 6: 0.060%; 7: 0.004%; 8: 0.007%; 9: 0.002%; 10: 0.003%이다.

<실시예2: 효소정제와 어세이>

소뇌의 GABA-T의 정제는 본 연구실에서 개발한 방법에 의하여 수행했다(Choi et al. Purification and properties of GABA transaminase from bovine brain. Molecules and Cells 3, 397-401. 1993). 숙시닉 세미알데하이드 디하이드로게나제(succinic semialdehyde dehydrogenase; SSADH)는 소의 뇌조직으로부터 CM-세파로즈(CM-Sepharose), 블루세파로즈(Blue-Sepharose) 및 하이드록시아파티트 크로마토그래피법(hydroxyapatite chromatographic methods)으로 준비했다. 단백질 농도는 표준으로 우혈청 알부민을 사용하여 Bio-Rad로부터 단백질 어세이 키트를 가지고 정했다.

GABA-T와 SSADH인 두개의 정제된 효소로 구성된 커플링된 어세이 시스템은 숙시닉 세미알데하이드(succinic semialdehyde)로의 GABA의 촉매적 전환에 관한 연구에 사용된다.

GABA + a-ketoglutarate ---→succinic semialdehyde(SSA) + glutamic acid

SSA + NAD⁺ + H₂O ----→ succinate + NADH

효소에 의한 어세이는 1mM 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol), 5mM NAD⁺, 30mM GABA 및 10mM α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)를 포함하는 pH 8.4의 01.M 소디움 피로포스페이트 완충용액(sodium pyrophosphate buffer)에서 수행했다. 반응의 진행은 NAD⁺의 감소되는 양을 340㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 관찰했다. 커플링된 어세이 시스템은 SSADH의 농도가 GABA-T의 농도보다 최소 5배 높을 때 아미노기 전이율을 측정하는 것이 적절하다. 효소활성의 단위는 25℃에서 1umolㆍmin^-1의 숙시닉 세미알데하이드를 생산하는 효소의 양으로 정의했다.

SSADH의 활성을 측정하기 위하여, 340㎚에서 흡광도의 증가의 증가에 의해 NADH의 생성을 측전했다. 모든 어세이는 2개씩로 수행했고 초기 속도 데이터는 25℃의 0.1M 소디움 피로포스페이트(pH 8.4)에서 100uM가 숙시닉 세미알데하이드와 1mM의 NAD⁺를 포함하는 표준 어세이 혼합물과 서로 상관관계에 있다.

분리된 화합물들을 SSADH와 GABA-T의 활성에 대한 억제효과를 평가했으나 대부분의 화합물들이 SSADH 활성에 대한 현저한 효과를 보이지 않았다. 반면, 화합물 3과 4는 GABA-T의 활성을 현저히 억제으며, 화합물 7은 약간의 억제효과를 보였다. 각각의 화합물의 구조는 매우 유사하나 그들의 억제효과는 전혀 다르다. 표 1은 구릿대에서 분리한 화합물로 처리한 SSADH와 GABA-T의 활성을 나타낸 것이다.

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	대조군
GABA-T	80	79	15	24	75	97	50	97	76	89	100
SSADH	87	90	89	82	74	90	85	96	107	100	100

다양한 농도의 화합물 3, 4와 GABA-T와의 반응에 있어서, 시간에 따라 효소활성이 감소하는 결과를 보였다. 화합물 3은 시간과 농도에 의존하여 효소를 불활성화했다(도 3). 불활성화는 각각의 일정 농도의 샘플에서 슈도-1차 반응속도의 형태에 따른다.

커플링된 어세이 시스템은 GABA-T와 SSADH 두 효소를 포함하기 때문에 SSADH샘플의 억제 효과를 유사한 방법으로 독립적으로 조사하였다. 샘플 농도를 증가시키면서 정제된 SSADH로 전처리하는 것은 표 2에 보여지는 것처럼 촉매적 활성에 현저한 감소를 제공하지 않았다. 이 결과는 화합물 3과 화합물 4가 GABA-T 활성의 불활성화만 야기하는 것을 알수 있다.

반응 혼합물	잔존 활성도(%)
GABA-T	100
GABA-T + imperatorin(7mM)	24
GABA-T + falcarindiol(7mM)	35
SSADH (10uM)	100
SSADH + imperatorin (14mM)	89
SSADH + falcarindiol (14mM)	82

<실시예3: 구릿대 뿌리에서 분리한 순수한 화합물과 효소의 불활성화>

정제된 GABA-T(10uM)은 다양한 농도의 샘플로 처리했다. 촉매 활성의 변화는 상기의 방법으로 측정했다. 25℃ 0.1M 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.4)에 샘플이 첨가되면서 반응이 시작되었다. 불활성화 반응 개시 이후, 일정시간마다 활성 측정을 위해 소량을 덜어내었다. 샘플의 첨가로 변형이 시작되기 전에 효소를 기질(GABA 또는 α-글루타레이트)로 전처리한 것을 제외하고는 앞의 실험과 동일한 방식으로 불활성화 차단(protection)실험을 수행하였다.

억제속도상수는 Kitz & Wilson 플롯에서 데이타 포인트나 최소제곱법으로 계산한다. 여기에 나타난 모든 키네틱 데이타는 두번 이상의 실험으로 얻은 평균값이다.

반응 혼합물	잔존 활성도(%)
GABA-T(uM)	100
GABA-T + imperatorin(14mM)	14
GABA-T와α-ketoglutarate(10mM)+imperatorin(14mM)	98
GABA-T와 GABA(20mM)+imperatorin	74

표 3에서 보여지는 것처럼, 화합물 3에 의한 불활성화는 효소를 α-케토글루타레이트와 전처리시키면 완벽하게 차단(protection)되는 반면, GABA와의 부분 반응도 관찰된다. 기질차단에 대한 동일한 결과는 화합물 4(falcarindiol)에 의한 불활성화로부터 얻을 수 있었다.

반응 혼합물	잔존 활성도(%)
GABA-T(10uM)	100
GABA-T + falcarindol(14mM)	23
GABA-T와α-ketoglutarate(10mM)+falcarindol	95
GABA-T와 GABA(20mM)+falcarindol	98

이들 결과는 불활성화가 비특이적 반응 메카니즘보다는 오히려 효소 활성 중심에 있는 반응기의 선택적 변형의 결과라는 것을 나타낸다.

본 발명은 천연물 유래 화합물 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올이 GABA-T의 활성사이트와 결합하고 효소의 효율적인 비가역적 억제제로써 행동하는 것을 확인하고 항경련성 질환의 예방 및 치료를 위하여 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공할 수 있다.

상기 조성물은 뇌조직에서 신경전달물질 GABA의 특이 수준이 간질, 발작 및 경련을 포함하는 다양한 신경학적인 질환과 관련이 있기 때문에, GABA억제 효소인 GABA-T의 억제제로써 작용하여 병리학적 상태에서 GABA의 수준을 높이는 데 유용하게 제공될 수 있다.

도 1은 GABA의 대사경로를 나타낸 것이다.

도 2는 구릿대의 뿌리로부터 분리한 쿠마린과 폴리아세틸렌의 구조식을 나타낸 것이다.

도 3은 25℃, 0.1M의 인산칼륨 완충용액(pH 7.4)에서 0mM, 3.5mM, 7mM, 10.5mM, 14mM 농도의 화합물 3(imperatorin) 각각을 GABA-T(10uM)와 반응시켜 시간에 따른 GABA-T의 불활성화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 25℃, 0.1M의 인산칼륨 완충용액(pH 7.4)에서 0mM, 3.5mM, 7mM, 10.5mM, 14mM 농도의 화합물 4(falcarindiol) 각각을 GABA-T(10uM)와 반응시켜 시간에 따른 GABA-T의 불활성화를 나타낸그래프이다.

Claims

임페레이토린(imperatorin) 및/또는 팔카린다이올(falcarindiol)을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 GABA-T의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 임페레이토린(imperatorin) 및/또는 팔카린다이올(falcarindiol)은 구릿대(Angelica dahurica Benth. et Hook.) 뿌리 추출물을 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 분배 추출하여 수득하는 것을 특징으로 하는, 임페레이토린 및/또는 팔카린다이올을 유효성분으로 함유하는 경련성 질환의 예방 및 치료용 조성물.
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