KR100378748B1

KR100378748B1 - 말톨릴 파라-쿠마레이트, 이의 제조 방법 및 이를포함하는 치매 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100378748B1
Application number: KR10-1999-0058682A
Authority: KR
Inventors: 최진호; 이관순; 김동우
Original assignee: 한미약품공업 주식회사; 최진호; 유병팔
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2003-04-07
Also published as: KR20010056972A

Abstract

본 발명은 치매 치료 활성을 갖는 구조식 1의 말톨릴 p-쿠마레이트(maltolyl p-coumarate; MPC), 이의 제조 방법 및 이를 함유하는 치매 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 신규 화합물인 말톨릴 p-쿠마레이트는 아세틸콜린(ACh)의 합성을 촉진할 수 있는 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT) 효소의 탁월한 증강제(ChAT enhancer)인 동시에 도파민(DA), 노르에피네프린(NE) 등의 카테콜아민계 신경전달물질의 생성 촉진과 유지에 매우 효과적인 DA/NE 모노아민계 신경전달물질 강화제(monoaminergic enhancer)이며, ACh의 분해를 촉진하는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 효소의 활성을 촉진하는 AChE 활성화제(AChE activator)로도 작용하기 때문에 ACh를 비롯한 DA, NE 등의 신경전달물질의 합성을 촉진하고 유지할 수 있는 매우 효과적인 치매 치료제로 사용될 수 있다.

Description

말톨릴 파라-쿠마레이트, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 치매 치료용 조성물{MALTOLYL P-COUMARATE, PROCESS FOR THE PREPARATION THEREOF AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING DEMENTIA COMPRISING SAME}

본 발명은 치매 치료 활성을 갖는 구조식 1의 신규 화합물인 말톨릴 p-쿠마레이트, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 치매 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 말톨릴 p-쿠마레이트는 신경전달물질의 합성 및 분해에 관여하는 효소의 활성을 증가 또는 억제함으로써 탁월한 치매 치료효과를 나타낸다.

화학식 1

뇌신경계의 질환은 대부분 신경전달물질의 퇴행변성 질환으로서 대표적인 질환이 노인성 치매이다. 노인성 치매는 1) 혈관성 치매(vascular dementia : VaD)와 2) 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer-type : DAT)로 분류할 수 있는데, DAT의 원인은 아직 확실하게 밝혀지지 않았다. 이들 치매는 신경전달물질의 감소 및 합성효소의 활성저하 등을 수반하는 것으로 알려져 있고, 치매의 발병과 관계되는 신경전달물질로서는 1) 아세틸콜린(ACh)과 같은 콜린계 신경전달물질과 2) 도파민(DA), 노르에피네프린(NE), 에피네프린 등의 카테콜아민계를 포함하여 세로토닌(5-HT)과 같은 모노아민계 신경전달물질이 주종을 이루고 있다.

최근 알츠하이머형 치매환자의 뇌에서 콜린계 신경세포의 현저한 감소와 함께 콜린계 신경전달물질의 감소와 선택적인 퇴행변성이 관찰되어 이러한 현상이 치매와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 노인성 치매환자의 초기 치료방향은 아세틸콜린을 보충하는 방향으로 진행되었는데, 타크린(tacrine-HCl), 아리셉트(aricept: donepezil-HCl), 피조스티그민(physostigmine)과 같은 아세틸콜린에스터라제 억제제(AChE inhibitor)를 환자들에게 투여하여 아세틸콜린의 분해를 방지함으로써 아세틸콜린 함량을 유지시키면, 실질적으로 치매환자의 인지 및 학습기능이 개선되는 것으로 알려져 있다.

현대의학이 획기적인 발전을 거듭하면서 평균수명이 80세를 바라볼 정도지만, 지금까지 확실한 치매 치료제는 개발되지 못했다. 이에 따라, 노인성 치매를 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하여 삶의 질을 높이기 위해 많은 노력이 기울여지고 있다.

본 발명의 목적은 종래의 치매 치료제보다 우수한 치매 치료효과를 갖는 신규 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 함유하는 치매 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 시험관내에서 MPC가 ACh의 합성에 미치는 영향을 시판되는 치매 치료제인 니세틸(acetyl-L-carnitine), 코그넥스(tacrine-HCl), 및 아리셉트(donepezil)와 비교하여 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 노인성 치매의 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있는 하기 구조식 1의 말톨릴 p-쿠마레이트가 제공된다.

화학식 1

말톨릴 p-쿠마레이트는 분자량이 272.25이며, 분자식은 C₁₅H₁₂O₅이고,아세톤,테트라히드로퓨란, 클로로포름, 디메틸술폭시드 등에는 잘 녹으나 메탄올과 같은 알콜에는 잘 안녹는 성질을 갖고 있다.

본 발명의 말톨릴 p-쿠마레이트는, 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, (a) 구조식 2의 p-쿠마르산에 히드록시 보호기를 도입하여 구조식 3의 시남산 유도체를 제조하고, (b) 구조식 3의 시남산 유도체를 구조식 4의 말톨과 반응시켜 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체를 제조한 후, (c) 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체로부터 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 반응식에서, R은 히드록시 보호기를 의미한다.

상기 단계 (a)에서, p-쿠마르산의 히드록실기(-OH)는 여러 가지 보호기를 도입하여 보호할 수 있는데, 이러한 히드록시 보호기로서는 아세틸기 등의 통상적으로 사용되는 보호기들을 예로 들 수 있다. 특히, 도입과 제거가 비교적 용이한 아세틸기(CH₃CO-)를 보호기로 사용하는 것이 바람직한데, p-쿠마르산을 과량의 피리딘 및 무수 초산 중에서 교반함으로써 쉽게 아세틸기를 도입할 수 있다. 아세틸기의 도입 반응은 0℃ 내지 40℃, 바람직하게는 실온에서 4 내지 24 시간, 바람직하게는 14 시간동안 교반함으로써 이루어진다.

이어서, 상기 단계 (b)에서는 구조식 3의 시남산 유도체를 구조식 4의 말톨과 반응시키는데, 이때 카르복실기를 반응성 유도체로 전환시킨 후 말톨과 반응시킨다. 상기 반응성 유도체로는 산 할라이드, 산 무수물, 혼합산 무수물, 활성 에스테르, 활성 아미드 및 산 아지드 등이 속한다. 적합한 산 무수물에는 카본산 모노에스테르(예: 모노메틸 카보네이트 또는 모노이소부틸 카보네이트), 저급 알칸산 및 저급 할로알칸산 등의 무수물이 포함된다. 적합한 활성 에스테르에는 N-히드록시프탈이미드 에스테르, N-히드록시벤조트리아졸 에스테르, 벤조티아졸 에스테르 및 티오포스페이트 에스테르 등이 포함된다.

본 발명에서는 반응성 유도체로서 산 할라이드를 사용하는 것이 바람직한데, 산 할라이드의 제조를 위해 사용할 수 있는 화합물로는 티오닐 클로리드(thionyl chloride), 삼염화인(PCl₃), 삼브롬화인(PBr₃) 등을 예로 들 수 있고, 티오닐 클로리드를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 산 클로리드는 메틸렌클로리드, 클로로포름, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드에, 바람직하게는 N,N-디메틸포름아미드에 시남산 유도체와 티오닐 클로리드를 가한 후, -30℃ 내지 0℃, 바람직하게는 약 -15℃의 저온에서 1 내지 4시간, 바람직하게는 3시간동안 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 생성된 산 클로리드를 염기로서 피리딘을 가하고 구조식 4의 말톨과 혼합한 다음 실온으로 승온시키면서 반응시킴으로써 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체를 고수율로 합성할 수 있다.

마지막으로, 상기 단계 (c)에서는 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체로부터 보호기를 제거하고 말톨릴 p-쿠마레이트를 제조하기 위하여, 보호기에 따른 일반적인 반응을 수행할 수 있는데, 예를 들면, 보호기가 아세톡시기인 시남산 에스테르 유도체, 즉, p-아세톡시시남산 에스테르의 경우 이를 트리에틸아민, 메탄올 및 물의 혼합액 중에서 10 내지 40℃, 바람직하게는 20℃ 내지 25℃에서 2 내지 5시간, 바람직하게는 3시간 동안 반응시킨다. 상기 반응에서 트리에틸아민, 메탄올 및 물은 p-아세톡시시남산 에스테르에 대하여 1:5:2.5:1.5 내지 1:20:10:5의 비율, 바람직하게는 1:10:5:2.5의 비율로 사용할 수 있다.

본 발명의 MPC는 아세틸콜린(ACh)의 합성효소인 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT)의 활성 및 ACh의 분해효소인 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 활성을 증가시키고, 도파민(DA), 노르에피네프린(NE), 에피네프린, 세로토닌(5-HT) 등의 모노아민계 신경전달물질을 파괴하는 모노아민옥시다아제(monoamine oxidase)를 억제하며, 카테콜아민계 신경전달물질인 도파민(DA)과 노르에피네프린(NE)의 생성을 증가시키는 DA/NE 모노아민계 신경전달물질 강화제(DA/NE monoaminergic enhancer)로 작용한다.

현재 알려진 치매 치료제의 종류는 크게 AChE 억제제, AChE 활성화제, ChAT 증강제, NE 모노아민계 신경전달물질 강화제, 건망증 치료제(anti-amnestic agent), 무스카린 길항제(muscarine agonist) 등을 포함하여 10여종이 있다. 그런데, 모든 치매 치료제는 AChE 억제제인 것으로 잘못 인식되어 있다. ACh의 합성이 불가능한 치매 환자에게는 ACh의 분해방지가 중요하겠지만, 그렇다고 해서 모든 치매 치료제가 AChE 억제제는 아닌 것이다.

신경전달물질 중에서 가장 중요한 ACh을 합성하는 효소인 ChAT의 활성도 중요하지만, 전시냅스 말단(presynaptic ending)에서 후시냅스 종단(postsynaptic terminal)으로 신경을 전달한 ACh은 신속히 분해되어야만 신경전달이 가능하다. 그런 이유 때문에 ACh를 분해하는 AChE의 활성도 매우 중요하다. 따라서, ChAT 및 AChE의 활성을 다같이 증가시킬 수 있는 화합물은 ACh의 합성과 분해를 동시에 활발히 진행시킬 수 있기 때문에 매우 효과적인 치매 치료제로서 평가할 수 있다. 이러한 관점에서 본 발명의 화합물 MPC는 가장 이상적이고 종합적인 치매 치료제일 것으로 기대된다.

본 발명의 화합물 MPC를 사용하여 통상적인 방법에 따라 치매 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 조성물의 제조에 있어서, 활성 성분을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나 캡슐, 새세이(sachet) 또는 기타 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 매질로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물로부터 제조되는 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명의 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 속방출, 지속방출 또는 지연방출이 가능하도록 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우 MPC의 통상적인 1일 투여량은 1.25 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 2.5 내지 5.0 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 식이, 투여시간, 투여방법, 투여경로, 배설율, 질환의 중증도, 환자의 연령, 성별, 체중 및 상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하 본 발명을 실시예 및 시험예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 하나, 이는 본 발명의 구성 및 작용의 이해를 돕기 위한 것일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예 및 시험예들에서, 아세틸콜린, 도파민 등의 신경전달물질과 관련된 효소로서 콜린아세틸트란스퍼라아제, 아세틸콜린에스터라아제, 모노아민 옥시다아제 등의 시약, 및 파라-쿠마린산, 말톨, 트리에틸아민, 티오닐 클로리드 등의 합성 및 분석은 시그마제 특급시약을 사용하였고, 그밖의 추출시약은 1급 시약을 사용하였다.

제조예 1: p-아세톡시시남산의 제조

p-쿠마르산 4.0 g을 피리딘 16 ml 및 무수초산 8 ml의 혼합액에 가하고 하루 밤 실온에서 교반하였다. 여기에 물 300 ml을 넣고 1 시간동안 교반한 후, 여과하고 물 60 ml로 세척하였다. 잔사를 진공건조한 후 클로로포름 15 ml를 넣고 10분동안 교반한 다음 여과하였다. 잔사를 클로로포름 5 ml로 세척하고 실온에서 진공건조하여 순백색의 고체로 된 목적 화합물 3.0 g(수율: 60 %)을 얻었다.

¹H-NMR(δ,DMSO-d₆): 2.28(s,3H,CH₃C=O), 6.51(d,1H,CH=CH), 7.18(d,2H,벤젠 환), 7.58(d,1H, CH=CH), 7.73(d,2H,벤젠 환)

제조예 2: p-아세톡시시남산 에스테르의 제조

제조예 1에서 얻은 p-아세톡시시남산 2.8 g을 N,N-디메틸포름아미드 40 ml에 용해시키고 -15∼-20℃의 온도로 냉각시킨 다음, 티오닐 클로리드 1.05 ml를 가하고 같은 온도를 유지하면서 1시간 30분동안 교반하였다. 이 혼합물을 -15℃ 정도로 유지하면서 피리딘 2.3 ml를 넣은 다음, 곧바로 말톨 1.62 g을 넣은 후 자연승온시키며 하루 밤 교반하였다. 반응액을 물 400 ml에 동시에 넣고 1시간동안 교반한 다음, 여과하였다. 잔사를 물 40 ml로 세척하고 실온에서 진공건조하여 연미색의 고체로 된 목적 화합물 3.92 g(수율: 97 %)을 얻었다.

¹H-NMR(δ,CDCl₃): 2.31(s,3H,CH₃C=O), 2.34(s,3H,CH₃), 6.45(d,1H, 말톨 CH=CH), 6.62(d,1H, CH=CH), 7.19(d,2H,벤젠 환), 7.60(d,2H,벤젠 환), 7.71(d,1H,말톨 CH=CH), 7.87(d,1H,CH=CH)

실시예: 말톨릴 p-쿠마레이트의 제조

제조예 2에서 제조된 p-아세톡시시남산 에스테르 6.0 g을 메탄올 60 ml, 트리에틸아민 30 ml 및 물 20 ml에 넣어 용해시키고 20∼25℃ 온도를 유지하며 2시간 30분동안 교반하였다. 감압하에서 반응액을 농축시키고 황색 잔사에 메탄올 50 ml를 가한 다음 10분정도 교반한 후 여과하였다. 잔사를 메탄올 10 ml씩으로 2회 세척하고 실온에서 진공건조하여 미황색의 고체로 된 목적화합물 4.51g(수율:87%)을 얻었다.

¹H-NMR(δ,DMSO-d₆): 2.26(s,3H,CH₃), 6.42(d,1H,말톨 CH=CH), 6.58(d,1H, CH=CH), 6.82(d, 2H 벤젠 환), 7.61(d,2H,벤젠 환), 7.73(d,1H,CH=CH), 8.11(d,1H,말톨 CH=CH)

시험예

본 발명의 화합물 MPC의 치매 치료효과를 확인하기 위해, 하기에 설명하는 바와 같이 현재 가장 치매 치료효과가 뛰어난 것으로 알려진 동아제약(주)의 니세틸(Nicetyl^TM; acetyl-L-carnitine) 및 제일약품(주)의 코그넥스(Cognex^TM; tacrine-HCl)를 비교대상으로 하여 생체내(in vivo) 시험으로서 치매 동물모델 SAMP8 마우스에서의 치매 치료효과를 확인하였고, 시험관내(in vitro) 시험을 통해 콜린계 신경전달물질로서 아세틸콜린(ACh)의 합성 및 ACh 합성효소인 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT)의 활성을 평가하였다.

시험예 1: 치매모델동물을 이용한 생존률 평가

한국화학연구소에서 1개월된 치매동물모델 SAMP8 마우스(숫컷, 체중 12±2 g)를 구입하여 동물사육실에서 조제사료[조성: 탄수화물 59.0 %(α-옥수수 전분 44.0 % + 슈크로즈 15.0 %), 단백질 18.0 %(나트륨 무함유 카제인), 지질 15.0 %(라드: 10.0 % + 옥수수유: 5.0 %), 비타민과 무기질(AIN-76 혼합물) 각각 1.0 %, 3.5 %, 그리고 섬유질 3.0 %, DL-메티오닌 0.3 %, 콜린 클로리드 0.2 %를 잘 혼합하여 균질화한 것]를 사용하여 8개월동안 사육한 다음, 치매가 진행중인 9개월째부터 MPC, 니세틸 및 코그넥스를 각각 하루에 체중 kg당 1.25, 2.50, 5.00 mg이 섭취되도록 상기 조제사료에 첨가하여 제조한 실험용 조제사료를 공급하면서 100일동안 사육하였다. SAMP8 마우스는 지금까지 개발된 치매동물모델 중 가장 이상적인 치매동물모델로서 인지 및 기억장해를 수반한다.

사육실험이 종료된 후 각 그룹별로 마우스의 사망여부를 조사하여 표 1과 같은 결과를 얻었다.

표 1에서 보는 바와 같이, 하루에 5.00 mg/kg 체중의 양을 투여한 경우의 생존율을 비교해 보면 MPC 투여그룹이 100 %, 니세틸 투여그룹이 85.7 %, 코그넥스 투여그룹이 71.4 %로서, MPC가 가장 우수한 치매 치료제로 평가되었다.

시험예 2: 수동회피시험에 의한 기억력 평가

살아있는 상태에서 기억·학습장해의 개선효과를 평가하기 위한 방법으로 야기 등(Yagi et al.,Brain Research, 474, 86-93, 1988)이 사용한 수동회피시험(passive avoidance test)의 방법을 일부 수정한 최진호 등의 방법(한국노화학회지, 8(1), 99-104, 1997)에 따라 측정하였다.

실험동물을 명실(light chamber; 750 Lux)에 넣으면 습관적으로 암실(dark chamber)로 들어 가는데, 본 실험에서는 다시 AC 0.5 mA의 전류로써 3초동안 전기적 쇼크를 준 다음, 24시간이 경과한 후 다시 명실에 넣었을 때 암실에 300초까지 들어가지 않는 마우스의 수로써 기억시험(%)을 평가하였다.

본 발명의 신규 화합물인 MPC의 인지 및 기억력 개선효과를 구명하기 위하여, 시험예 1에서와 같이 MPC, 시판중인 치매 치료제인 니세틸 및 코그넥스를 각각 치매가 진행중인 SAMP8 마우스에 하루 5.00 mg/kg 체중의 양으로 100일동안 투여한 후 측정한 수동회피시험을 통한 기억력 평가의 결과는 표 2와 같다.

인지 및 기억력 개선효과를 평가하는 기억력 평가(%)을 비교하여 보면, 대조그룹은 33.03%로 가장 낮고, MPC 투여그룹이 71.40 %로 가장 높으며, 그 다음이 코그넥스 투여그룹으로서 60.01 %였고, 니세틸 투여그룹이 50.04 %로서 가장 낮았다.

또한 이들 치매 치료제의 투여에 의한 기억력 평가(%)를대조그룹(33.03±2.41; 100%)과 비교· 평가하여 보면 MPC 투여그룹이 216.2 %로 가장 높아서 가장 이상적인 인지 및 기억력 개선효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있었고, 그 다음이 코그넥스 투여그룹으로서 181.7 %였고, 니세틸 투여그룹이 151.5 %로서 가장 낮았다. 따라서 본 발명의 신규 화합물인 MPC의 투여가 현재 시판중인 치매 치료제중에서 가장 효과적인 것으로 알려진 니세틸이나 코그넥스의 투여보다 인지 및 기억력의 장해를 매우 효과적으로 개선할 수 있다는 사실이 증명되었다.

시험예 3: 신경전달물질 함량의 측정

인지 및 기억력에 관계하는 신경전달물질은 주로 아세틸콜린(ACh)과 같은 콜린계 신경전달물질과 도파민(DA), 노르에피네프린(NE)과 같은 카테콜아민계 신경전달물질로 되어 있다. MPC가 신경전달물질의 생성에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 시판중인 치매 치료제인 니세틸 및 코그넥스를 비교물질로 하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

신경전달물질인 아세틸콜린의 함량은 헤스트린 등(Hestrin et al.,J. Biol. Chem., 180, 249-154, 1949)의 방법에 의하여 염기성 하이드록실아민(alkaline hydroxylamine)을 가진 Ο-아실 유도물의 반응을 기초로 하여 측정하였다. 모든 하이드록삼산(hydroxamic acid)은 산용액에서 Fe³⁺와 결합하여 붉은 자주색을 나타낸다.

시험예 1에서와 같이 사육된 각 그룹의 SAMP8 마우스의 뇌 1 g을 5.0 ml의 인산염 완충용액에 넣고 균질화한 다음, 다시 5배 희석한 뇌 균질물 50 ㎕를 분취하여 1% 하이드록실아민 50 ㎕를 첨가·혼합한 후 HCl로 pH를 1.2로 조절하였다. 여기에 FeCl₃용액(10% in 0.1N HCl) 500 ㎕를 첨가·혼합하여 분광광도계를 사용하여 파장 530 nm에서 ACh의 함량(ng/mg 단백질)을 측정하였다.

또한, 상기와 동일한 뇌 균질물중의 카테콜아민계 신경전달물질인 도파민과 노르에피네프린의 함량(ng/mg 단백질)은 샐러 등(Saller et al.,J. Chromatography, 309, 287-298, 1984)의 방법에 따라 측정하였다.

그 결과는 하기 표 3과 같다.

표 3에서 보는 바와 같이, 하루 5.00 mg/kg 체중의 투여량을 기준으로 하여 ACh의 생성량을 비교하여 보면, MPC 투여그룹이 대조그룹에 비해 16.8 %의 증가효과가 인정되어 ACh의 생성량이 가장 높았고, 다음으로 코그넥스의 15.9%, 니세틸의 14.1%의 순으로 증가하고 있다.

또한, 도파민(DA)의 생성량을 전체농도에서 비교하여 보면 MPC 투여그룹이 대조그룹에 비해 65.5∼68.0 %나 현저히 증가하였고, 그 다음이 니세틸 투여그룹으로서 대조그룹 대비 42.4∼54.3 %의 증가효과가 인정되었지만, 코그넥스 투여그룹은 DA의 생성을 오히려 10∼20%정도로 억제하였다.

같은 방법으로 하루 5.00 mg/kg 체중 투여를 기준으로 하여 NE의 생성량을 비교하여 보면 MPC 투여그룹에서 대조그룹에 비해 64 %나 현저히 증가하였고, 그 다음이 니세틸 투여그룹의 58.0 %, 코그넥스 투여그룹의 38.5 %의 순으로 나타났다. 따라서 신규 화합물인 MPC가 시판 치매 치료제보다 ACh를 비롯한 DA, NE와 같은 주요한 신경전달물질의 생성을 가장 효과적으로 증가시킨다는 사실이 입증되었다.

시험예 4: 아세틸콜린 관련효소의 활성 측정

아세틸콜린(ACh)의 합성에 관계하는 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT) 및 시냅스사이의 신경전달에 필수적인 아세틸콜린에스터라아제(AChE)의 활성에 미치는 MPC의 효과를 다음과 같이 조사하여 니세틸 및 코그넥스의 효과와 비교하였다.

콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT)의 활성은 엘만(Ellman,Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-75, 1959)의 방법에 따라 DTB(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoate)에 의한 기질로서 아세틸-CoA를 사용하여 반응시키고, DTB의 흡수가 감소하는 것을 이용하는 방법으로 시험예 3에서와 같이 준비된 SAMP8 마우스의 뇌 균질물 중의 ChAT의 활성(단위/mg 단백질)을 측정하였다.

또한 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성은 갈가니 등(Galgani et al.,Mar. Ecol. Prog. Ser., 19, 1-6, 1992)의 방법에 따라 마이크로플레이트 리더(ELISA reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도의 변화를 5분동안 측정하여 AChE의 활성(단위/mg 단백질/분)을 정량하거나[AChE 활성(I)], 머사만등(Mersamann et al., Am. J. Vet. Res., 35, 579-583, 1974)의 방법에 따라 정량하였다[AChE 활성(II)].

실험 결과는 표 4와 같다.

표 4에서 볼 수 있듯이, 하루 5.00 mg/kg 체중 투여를 기준으로 하여 ChAT의 활성에 미치는 영향을 비교하여 보면 MPC 투여그룹이 대조그룹에 비해 25.2 %의 ChAT 활성 증가 효과를 나타내었고, 니세틸 투여그룹이 23.6 %, 코그넥스 투여그룹이 22.1 %의 활성 증가 효과를 나타내었다.

한편, AChE의 활성에 미치는 이들 치매 치료제의 영향을 전체농도에서 ELISA방법[AChE 활성 (I)]으로 측정·비교하여 보면 MPC 투여그룹이 대조그룹에 비해 17.1∼25.0 %나 효과적으로 증가하였고, 그 다음이 니세틸 투여그룹으로서 14.5∼15.6 %나 증가하였지만, AChE 억제제로서 치매 치료제로 알려진 코그넥스는 5.2∼14.3 %로서 가장 낮은 증가효과가 인정되었다.

또한, 머사만 등의 방법[AChE 활성 (II)]에 따라 측정·비교하여 보면 MPC 투여그룹이 대조그룹에 비해 10.3∼17.4 %로서 가장 효과적으로 증가하였고, 그 다음이 니세틸 투여그룹으로서 3.6∼10.6 %정도 증가하였다. 그러나 코그넥스 투여그룹은 하루 1.25∼2.50 mg/kg 체중의 낮은 농도에서는 대조그룹에 비해 2∼10 % 정도 오히려 AChE의 활성이 억제되었지만, 5.00 mg/kg 체중의 고농도 투여에서는 10.1 %의 AChE 활성 증가효과가 확인되었다. 따라서 2.50 mg/kg 체중이하의 낮은 농도에서는 코그넥스가 AChE 억제제라는 사실을 알 수 있었다.

시험예 5: MAO-B 효소의 활성 측정

모노아민옥시다아제(monoamine oxidase)는 도파민(DA), 노르에피네프린(NE), 에피네프린, 세로토닌(5-HT) 등의 모노아민계 신경전달물질을 파괴하는 효소로 알려져 있다. DA나 NE과 같은 카테콜아민계 신경전달물질의 파괴효소로 알려진 모노아민옥시다아제-B(MAO-B)의 활성에 대한 MPC의 억제효과를 확인하기 위하여 칼라리아 등(Kalaria et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3521-3525, 1987)의 방법에 따라 H₂O₂의 생성능을 기초로 측정하여 시험예 3에서와 같이 준비된 SAMP8 마우스의뇌 균질물 중 MAO-B 효소의 활성(nmol/mg 단백질/분)을 계산하였으며 그 결과를 니세틸 및 코그넥스의 MAO-B 효소활성 억제효과와 비교하여 표 5에 나타내었다.

표 5에서, 본 발명의 신규 화합물 MPC, 시판중인 치매 치료제인 니세틸 및 코그넥스를 하루 1.25, 2.50, 5.00 mg/kg 체중의 농도로 투여한 뇌세포중의 MAO-B 효소의 활성 억제효과를 비교하여 보면 MPC 투여그룹이 103.1∼89.1 %로서 MAO-B 효소의 활성을 가장 효과적으로 억제하고 있었고, 그 다음이 니세틸 투여그룹으로서 112.5∼89.1 %였으며, 코그넥스 투여그룹은 115.6∼107.0 %로서 MAO-B 효소의 활성을 거의 억제할 수 없고 오히려 약간 증가한다는 사실을 알 수 있었다.

또한 하루 5.00 mg/kg 체중의 고농도로 투여한 경우를 기준으로 하여 MAO-B 효소의 활성 억제효과를 비교하여 보면, 역시 MPC 투여그룹이 89.1 %로서 약 11 %나 MAO-B 효소의 활성 억제효과가 인정되어 카테콜아민계 신경전달물질의 파괴를 가장 효과적으로 억제함을 알 수 있었고, 그 다음으로 니세틸 투여그룹이 93.0 %로서 약 7 %의 MAO-B 효소의 활성 억제효과가 인정되었다. 그러나 코그넥스 투여그룹은 107.0 %로서 오히려 카테콜아민계 신경전달물질을 다소 파괴할 것으로 추정된다.

시험예 6: 아세틸콜린의 함량 평가(시험관내 실험)

시험관내 시험에서 뇌 균질물(brain homogenate)을 ACh의 합성기질 및 ChAT 효소의 공급원으로 하고, MPC가 ACh의 합성능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였으며, 그 결과를 니세틸, 코그넥스 및 아리셉트의 ACh 합성능과 비교하였다.

시험예 1에서와 같이 준비된 치매동물모델 SAMP8 마우스의 뇌 1 g을 5.0 ml의 인산염 완충용액에 넣고 균질화한 다음, 다시 5배 희석한 뇌 균질물 1.0 ml를 시험관에 넣고, 여기에 MPC, 니세틸, 코그넥스 및 아리셉트를 각각 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 ㎍씩 첨가하여 37℃ 수조안에서 30분간 교반한 다음, 시험예 3에서와 같은 방법으로 ACh의 생성량을 측정한 결과는 도 1과 같다.

도 1에서 보는 바와 같이, MPC 첨가그룹에서만 ACh의 생성량이 용량 의존적으로 가장 많이 증가하였고, 다음으로 아리셉트, 니세틸 첨가그룹은 약간의 용량의존성이 인정되었다. 그렇지만, 코그넥스 첨가그룹은 아무런 효과도 기대할 수 없었다. 또한, 5.0 ㎍ 첨가시 ACh의 합성을 비교해 보면, MPC가 42.2 %로서 가장 ACh 합성이 증가하였고, 그 다음이 아리셉트(24.3 %), 코그넥스(17.6 %), 니세틸(8.2 %)의 순이었다. 따라서 본 발명의 신규 화합물인 MPC가 가장 효과적으로 ACh를 합성할 수 있기 때문에 가장 이상적인 치매 치료제로서의 가치가 기대된다.

시험예 7: 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT)의 활성 평가(시험관내 실험)

시험관내 시험(in vitro)에서 뇌 균질물(brain homogenate)을 ChAT 효소의 활성기질로 하고, MPC가 ChAT의 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였으며, 그 결과를 니세틸, 코그넥스 및 아리셉트의 경우와 비교하여 평가하였다.

시험예 1에서와 같이 준비된 치매동물모델 SAMP8 마우스의 뇌 1 g을 5.0 ml의 인산염 완충용액에 넣고 균질화한 다음, 다시 5배 희석한 뇌 균질물 1.0 ml를 시험관에 넣고, 여기에 MPC, 니세틸, 코그넥스 및 아리셉트를 각각 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 ㎍씩 첨가하여 37℃ 수조안에서 30분간 교반한 다음, 시험예 4에서와 같은 방법으로 ChAT의 활성을 측정한 결과는 표 6과 같다.

표 6에서 보는 바와 같이, 뇌 균질물에 첨가한 저농도 0.5 ㎍을 기준으로하여 5.0 ㎍의 첨가량에서 ChAT의 활성을 비교해 보면, MPC 첨가그룹의 ChAT 활성이 용량 의존적으로 증가하여 40.2 %나 가장 효과적으로 증가하였고, 그 다음이 니세틸의 32.7 %, 코그넥스의 30.6 %였고, 가장 낮은 ChAT 활성은 아리셉트의 15.0 %였다. 따라서 본 발명의 신규 화합물인 MPC는 ACh를 합성하는 ChAT의 활성을 가장 효과적으로 증가시키므로 가장 이상적인 치매 치료제로서의 가치가 기대된다.

지금까지의 MPC를 이용한 생체내(in vivo) 및 시험관내 시험(in vitro) 결과를 종합하여 평가해 보면 다음과 같이 요약할 수 있다.

생체내 실험(in vivo)에서, 본 발명의 신규 화합물 MPC는 1) 합성방법이 확립되었을 뿐만 아니라, 5.00 mg/kg 체중 투여그룹에서 2) 생존율도 100%로 가장 높았고, 3) 수동회피시험을 통한 인지 및 기억력 시험도 대조그룹 대비 216.2%로서 니세틸(151.4%), 코그넥스 (181.7%) 보다도 현저히 높았으며, 4) 콜린계 신경전달물질인 아세틸콜린(ACh)의 함량 및 ACh의 합성효소인 ChAT 효소의 활성이 대조그룹에 비해 각각 17 % 및 25 %나 높아서 ChAT 증강제(ChAT enhancer)로서 작용할 것으로 판단되고, 5) 카테콜아민계 신경전달물질인 도파민(DA)과 노르에피네프린(NE)의 생성량도 대조그룹 대비 68.0 % 및 65 % 정도나 현저히 높기 때문에 DA/NE 모노아민계 신경전달물질 강화제(monoaminergic enhancer)로서 작용할 것으로 판단되며, 6) ACh의 분해효소인 AChE 효소의 활성도 대조그룹 대비 25 %정도 현저히 높기 때문에 AChE 활성화제(AChE activator)로서 작용할 것으로 판단된다. 또한 7) MAO-B 효소의 활성을 대조그룹에 비해 11 % 이상이나 억제하기 때문에 카테콜아민계 신경전달물질의 파괴가 전혀 없을 것으로 기대된다. 또한, 시험관내 실험(in vitro)에서도 MPC가 ACh의 합성 및 ACh 합성효소인 ChAT의 활성을 가장 효과적으로 증가시켰다.

따라서 치매 치료제의 성격을 평가하여 보면 MPC는 ChAT 증강제 및 AChE 활성화제인 동시에 DA/NE 모노아민계 신경전달물질 강화제(monoaminergic enhancer)이므로, 가장 이상적인 종합 치매 치료제일 것으로 기대된다.

본 발명의 신규 화합물 MPC는 노인성 치매의 치료에 매우 유용하게 사용될수 있을 것으로 기대된다. 생체(in vivo) 및 시험관내(in vitro) 실험 결과, MPC는 종래의 치매 치료제에 비하여 아세틸콜린(ACh)의 합성을 촉진할 수 있는 콜린아세틸트란스퍼라아제(ChAT) 효소의 우수한 강화제로서 ChAT 증강제로 작용하는 동시에 ACh의 분해를 촉진하는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 효소의 활성을 촉진하는 AChE 활성화제로 작용할 뿐만 아니라, 도파민(DA), 노르에피네프린(NE) 등의 카테콜아민계 신경전달물질의 생성 촉진과 유지에 매우 효과적인 DA/NE 모노아민계 신경전달물질 강화제로서도 작용하므로, ACh를 비롯한 DA, NE 등의 신경전달물질의 합성을 촉진하고 유지하는데 있어서 매우 이상적인 치매 치료제로 평가할 수 있다.

Claims

구조식 1의 말톨릴 p-쿠마레이트(maltolyl p-coumarate):

화학식 1
(a) 구조식 2의 p-쿠마르산에 히드록시 보호기를 도입하여 구조식 3의 시남산 유도체를 제조하고, (b) 구조식 3의 시남산 유도체를 구조식 4의 말톨과 반응시켜 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체를 제조한 후, (c) 구조식 5의 시남산 에스테르 유도체로부터 히드록시 보호기를 제거하는 단계를 포함하는, 구조식 1의 말톨릴 p-쿠마레이트를 제조하는 방법:

화학식 1

상기 식에서, R은 히드록시 보호기를 의미한다.

상기 식에서, R은 히드록시 보호기를 의미한다.
제2항에 있어서,

상기 단계 (b)에서 구조식 3의 시남산 유도체를 카복실산 할라이드로 제조한 후 이를 구조식 4의 말톨과 반응시킴을 특징으로 하는 방법.
활성 성분으로서 구조식 1의 말톨릴 p-쿠마레이트를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하는 치매 치료용 조성물:

화학식 1