KR100576079B1

KR100576079B1 - 애기수영의 잎으로부터 분리한 신규 제초활성물질크리소파닉산과 그의 분리방법

Info

Publication number: KR100576079B1
Application number: KR1020030078036A
Authority: KR
Inventors: 김성문; 김희연; 최해진; 김도순; 허수정
Original assignee: 강원도
Priority date: 2003-11-05
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2006-05-03
Also published as: KR20050043217A

Abstract

본 발명은 제초활성을 가지는 하기 구조식의 화합물(크리소파닉산, chrysophanic acid)과 그 분리 방법을 제공한다.

Description

애기수영의 잎으로부터 분리한 신규 제초활성물질 크리소파닉산과 그의 분리 방법{Chrysophanic Acid Purified from Rumex acetosella L. and Preparation Method thereof}

도 1은 본 발명에 따른 애기수영 헥산층으로부터 분획된 HA, HB 분획물의 제초활성을 나타내는 그래프

도 2는 본 발명에 따른 애기수영 HA로부터 분획된 HAA, HAB 분획물의 제초활성을 나타내는 그래프

도 3은 본 발명에 따른 애기수영 HAAB로부터 분획된 HAABA, HAABB 분획물의 제초활성을 나타내는 그래프

도 4는 애기수영 헥산 추출물에 함유되어 있는 살초활성물질 HAABBA의 구조를 구명하기 위하여 EI-MS 분석을 수행한 결과

도 5은 애기수영 헥산 추출물에 함유되어 있는 살초활성물질 HAABBA의 구조를 구명하기 위하여 ¹³C-NMR 분석을 수행한 결과

도 6는 애기수영 헥산 추출물에 함유되어 있는 살초활성물질 HAABBA의 구조를 구명하기 위하여 ¹H-NMR 분석을 수행한 결과

본 발명은 애기수영 (Rumex acetosella L.) 잎으로부터 분리한 신규한 제초활성물질인 크리소파닉산(chrysophanic acid)과 그의 분리 방법에 관한 것이다.

애기수영은 그 뿌리를 소산모라고 하여 우리나라의 민간에서는 오랜 기간동안 항암제, 폐결핵 치료제, 객혈 치료제로 사용해 왔다. 이 식물의 전초로부터 추출한 추출물은 제초효과가 있는 것으로 알려져 있었으나 제초효과를 나타내는 원인물질에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없다.

본 발명과 관련된 종래의 논문은 권(안동대학교 석사학위논문, 33 p, 1999)에 의해 애기수영에 함유된 카페익산(caffeic acid), 프로토카테추익산(protocatechuic acid), 바닐릭산(vanillic acid), 페룰릭산(ferulic acid), 피로갈롤(pyrogallol), 겐티식산(gentisic acid)이 제초효과가 있다는 보고와 김 등(한국잡초학회 학술연구발표요지, 21(2), p109, 2001)에 의해 애기수영의 제초활성 분획물에 디옥틸프탈레이트(dioctylphthalate)와 2,5-디에톡시카보닐-3,4-벤조피롤(2,5-diethoxycarbonyl-3,4-benzopyrrol)이 함유되어 있다는 보고가 있다. 그러나, 현재까지 본 발명에서와 같은 크리소파닉산에 관한 보고는 없다.

본 발명의 목적은 애기수영의 잎으로부터 신규 제초활성물질을 분리하고, 그 화학구조를 결정하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 애기수영의 잎으로부터 신규 제초활성물질을 분리하는 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 제초활성을 가지는 하기 구조식의 화합물(이하 '크리소파닉산'이라 칭한다)을 제공한다.

본 발명은 상기 크리소파닉산을 활성성분으로 함유하는 제초제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 애기수영 건조시료를 메탄올로 추출하는 단계; (b) 메탄올 추출물로부터 헥산 분획물을 얻는 단계; (c) 헥산 분획물로부터 에틸아세테이트-헥산 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HA)을 얻는 단계; (d) 단계 (c)의 높은 살초활성 분획물로부터 에틸아세테이트-디클로로메탄 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAA)을 얻는 단계; (e) 단계 (d)의 높은 살초활성 분획물로부터 메탄올-아세토니트릴 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAAB)을 얻는 단계; (f) 단계 (e)의 높은 살초활성 분획물로부터 에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAABB)을 얻는 단계; (g) 단계 (f)의 높은 살초활성 분획물로부터 메탄올-물 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 크리소파닉산을 분리하는 방법을 제공한다.

이하, 상기 구조식의 크리소파닉산을 분리하는 과정을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 크리소파닉산 화합물은 애기수영(Rumex acetosella L.)으로부터 분리된 것이다. 애기수영 건조시료를 메탄올로 추출하고, 그 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 디클로로메탄, 헥산, 물로 재분획하고, 상기 분획물을 유채(Brassica napus L.)를 대상으로 seed bioassay를 수행한다. 고활성(690 ㎍ g^-1)의 헥산 분획물을 에틸아세테이트-헥산 (1:4), 에틸아세테이트-디클로로메탄 (7:3), 메탄올-아세토니트릴 (98:2), 에틸아세테이트-메탄올 (95:5) 용액으로 흡착 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획하고 각 분획물의 살초활성을 검정한 후 가장 활성이 높은 분획물을 분리한다. 이러한 과정을 통해 얻은 고활성의 분획물을 메탄올-H₂O (9:1) 용액으로 흡착 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획한 다음 살초활성을 검정한 결과 가장 활성이 높은 분획물('HAABBA'이라 칭한다)의 GR₅₀ 값은 583 ㎍ g^-1으로 밝혀졌다. 단리된 화합물(HAABBA)의 구조를 밝히기 위하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, EI-MS 분석을 수행한 결과 애기수영 헥산 분획층에 함유되어 있는 살초활성물질은 분자량 254.24, C₁₅H₁₀O₄인 1,8-디히크록시-3-메틸-9,10-안트라센디온(크리파소닉산)[1,8-dihycroxy-3-methyl-9,10- anthracenedione(chryphasonic acid)]으로 판명되었다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세히 설명하기로 한다.

<실시예 1> 천연제초활성물질 크리소파닉산의 분리

애기수영 시료를 강원도 평창군 도암면 횡계3리 14-104 소재 양떼목장에서 채집한 다음 흐르는 물에 5분 동안 세척하고 음건하였으며 분쇄기를 이용하여 완전 마쇄하였다. 건조시료 1 kg을 200 g씩 각각 취하여 메탄올 2 L가 담겨 있는 5 L의 삼각플라스크에 넣고 100 rpm에서 24시간 진탕하여 2회 반복 추출하였다. 추출된 메탄올을 250 ml 둥근 바닥 플라스크에 담고 회전증발농축기를 이용하여 완전 농축한 다음, 증류수를 50 ml 첨가하였다. 플라스크 내의 건조물을 증류수를 이용하여 잘 용해시킨 다음 동결건조기에서 건조시켰다. 동결건조된 시료를 실온 암조건에서 보관하면서 메탄올 추출물의 살초활성검정에 사용하였다.

본 실시예에서 제초활성 검정법은 seed bioassay 법을 사용하였다. 메탄올 추출물을 증류수를 사용하여 10,000 ㎍ g^-1이 되게 스톡용액(stock solution)을 제조하였고, 이 스톡용액을 이용하여 처리액을 제조하였다. 처리액을 모래 1 g 위에 5립의 유채 종자가 치상되어 있는 24-웰 조직배양 시험플레이트에 처리하였고, 시험플레이트를 온도 25℃, 습도 70％, 광도 3,100 Lux 조건의 식물생장상에 놓고 7 일 동안 생장시켰다. 처리 7일 후 유채의 생체중을 측정하여 각 시료에 대한 GR₅₀ 값(식물의 생장을 50％ 저해할 수 있는 약의 함량)을 구하였다. 모든 실험은 3회 반복 실시되었다.

메탄올 건조물 10 g 당 각각 100 ml의 에틸아세테이트, 부탄올, 디클로로메탄, 헥산, 물로 재분획한 다음 각각의 분획층을 회전증발농축기로 완전농축하고 동결건조시켰다. 동결건조된 분획물을 물을 사용하여 스톡용액을 제조하였고, 각각의 분획층으로부터 얻은 분획물에 대한 seed bioassay를 실시하였다.

앞서 기술한 용매분획물 중 헥산 분획물이 가장 높은 살초활성을 나타내었기 때문에, 헥산 분획물을 에틸아세테이트-헥산 용액(1:4)과 에틸아세테이트-디클로로메탄용액(7:3)으로 각각 흡착 (Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 10 ml 씩 용출 분획하고, 각각의 용출분획액을 회전증발농축기로 완전농축한 다음 앞서 기술한 방법에 따라 seed bioassay를 실시하여 활성분획('HAA'이라 칭한다)을 얻었다. 활성분획 HAA를 메탄올-아세토니트릴 용액(98:2)으로 흡착 (ODS-A 150㎛, YMC) 컬럼 크로마토그라피에서 용출분획한 다음, 각각의 용출분획액을 완전농축하고 seed bioassay를 통하여 활성분획('HAAB'라 칭한다)을 얻었다. 이를 에틸아세테이트-메탄올 용액(95:5)으로 흡착(Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 컬럼 크로마토그라피에서 용출 분획하였으며, 각각의 용출분획액을 완전농축하고 seed bioassay를 통하여 활성분획('HAABB'이라 칭한다)을 얻었다. 활성분획 HAABB를 메탄올-물 용액(9:1)으로 흡착(ODS-A 150㎛, YMC) 컬럼 크로마토그라피에서 용출 분획하였고, 각각의 용출분획액을 회전증발농축기로 완전농축한 다음 동결건조시켰으며, 동결건조 분획물을 앞서 기술한 방법에 따라 seed bioassay를 실시하여 활성분획물('HAABBA'이라 칭한다)을 최종적으로 얻었다.

애기수영 헥산 분획층으로부터 단리된 활성분획물(HAABBA)의 구조를 동정하기 위하여 ¹H-NMR(400 MHz, Gemini 200, Varian), ¹³C-NMR(400 MHz, Gemini 200, Varian), EI-MS(Autospec 365 series, Micromas)를 이용하여 분석하였다.

애기수영(1 kg)으로부터 살초활성을 검정하고자 메탄올 추출물을 얻고, 그 추출물을 유채를 대상으로 seed bioassay를 수행한 결과 GR₅₀ 값은 3,120 ㎍ g^-1이었다.

애기수영으로부터 얻어진 메탄올 추출물을 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 분획한 후, 그 분획층을 감압회전증발농축기를 이용하여 얻은 분획물의 제초활성 결과는 하기 표 1과 같다.

<표 1> 애기수영 용매 분획층의 제초활성

용매분획층	GR₅₀(㎍g^-1)
에틸아세테이트	3,414
디클로로메탄	> 10,000
부탄올	4,018
헥산	690
물	> 10,000

용매분획물 중 가장 높은 살초활성을 나타내었던 헥산 분획물(13g)을 에틸아 세테이트-헥산 용액(1:4, v/v)을 이용한 흡착 (Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획한 결과, 분획물의 GR₅₀ 값은 V_e/V _t (elution volume/column bed volume) 0.00 - 0.24의 위치에서 분리된 분획물(HA)에서 1,882 ㎍g^-1으로 높았다 (도 1 참조).

HA 활성 분획물(8.3g)을 다시 에틸아세테이트-다이클로로메탄 용액(7:3, v/v)을 이용한 흡착 (Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획한 결과, V_e/V_t (elution volume/column bed volume) 0.00 - 0.54의 위치에서 높은 살초활성을 나타내는 분획물(HAA)을 얻었다 (도 2 참조).

HAA 활성 분획물(4.0g)을 메탄올-아세토니트릴 용액(98:2)을 이용한 흡착 (ODS-A, 150 ㎛, YMC) 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획한 결과, V_e/V_t > 0.65의 위치에서 높은 살초활성을 나타내는 분획물(HAAB, 2.1g)을 얻었다(표 2).

<표 2> 애기수영 HAA로부터 분획된 HAAA와 HAAB 분획물의 제초활성

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HAAA	4,225
HAAB	1,227

HAAB 활성 분획물을 에틸아세테이트-메탄올 용액(95:5)을 이용한 흡착 (Silica gel 60, 0.040 - 0.063 mm, Merck) 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획하였고, V_e/V_t 0.60 - 0.90의 위치에서 높은 살초활성을 나타내는 분획물(HAABB, 0.72g)을 얻었다(도 3 참조).

고활성의 HAABB 활성 분획물을 메탄올-H₂O 용액(9:1)을 이용한 흡착 (ODS-A, 150㎛, YMC) 칼럼 크로마토그라피에서 용출 분획한 결과, V_e/V_t 0.70의 위치에서 높은 살초활성을 나타내는 분획물(HAABBA, 0.35g)을 얻었다(표 3).

<표 3> 애기수영 HAABB로부터 분획된 HAABBA와 HAABBB 분획물의 제초활성.

분획물	GR₅₀(㎍g^-1)
HAABBA	583
HAABBB	> 1,000

애기수영 헥산 추출물에 함유되어 있는 살초활성물질 HAABBA의 구조를 구명하기 위하여 EI-MS 분석을 수행한 결과 분자이온(M+)이 m/z 254에 나타났으며, 특징적인 분획이온이 m/z 226, 197, 152에 나타났다(도 4 참조). 이 스펙트럼으로 NIST 라이브러리 검색을 실시한 결과, 크리소파닉산(chrysophanic acid)으로 알려져 있는 1,8-디히크록시-3-메틸-9,10-안트라센디온의 가능성이 시사되었다.

CDCl₃를 용매로 사용하여 ¹³C-NMR을 실시한 결과, δ(ppm)이 162.72 (C-1), 124.37 (C-2), 149.35 (C-3), 121.37 (C-4), 119.94 (C-5), 136.96 (C-6), 124.57 (C-7), 162.42 (C-8), 192.54 (C-9), 182.00 (C-10), 22.28 (-CH₃)에서 각각 탄소신호가 확인되었다(도 5 참조).

CDCl₃를 용매로 사용하여 ¹H-NMR을 실시한 결과 δ(ppm)이 2.47 (3H, s, -CH₃), 7.11 (1H, d, J=0.95 Hz, H-2), 7.30 (1H, dd, J = 1.16, 8.34 Hz, H-7), 7.66 (1H, d, J = 1.31, H-6), 7.68 (1H, t, H-4), 7.83 (1H, dd, J = 1.07, 7.5 Hz, H-5), 12.03 (1H, s, OH-1), 12.14 (1H, s, OH-8)에서 수소신호가 확인되었다(도 6 참조).

이상의 EI-MS, ¹³C-NMR , ¹H-NMR의 분석결과로부터 애기수영 헥산 추출물에 함유되어 있는 살초활성물질 HAABBA는 C₁₅H₁₀O₄의 구조를 갖는 분자량 254.24의 1,8-디히크록시-3-메틸-9,10-안트라센디온(크리소파닉산)으로 결정하였다.

<애기수영으로부터 분리된 신규 제초활성물질 크리소파닉산의 구조>

본 발명을 통하여 애기수영으로부터 분리되고 구조가 결정된 제초활성물질인 크리소파닉산은 새로운 제초제로 이용될 수 있으며, 크리소파닉산은 현재 개발된 제초제의 구조와는 다른 독특한 구조를 가지고 있어 향후 새로운 작용점을 공격하 는 새로운 제초제의 개발에 선도물질(lead compound)로 사용될 수 있을 것이라 기대된다.

Claims

애기수영(Rumex acetosella L.)의 잎으로부터 분리한 하기 구조식으로 표시되는 크리소파닉산을 활성성분으로 함유하는 제초제 조성물
(a) 애기수영(Rumex acetosella L.) 건조시료를 메탄올로 추출하는 단계; (b) 메탄올 추출물로부터 헥산 분획물을 얻는 단계; (c) 헥산 분획물로부터 에틸아세테이트-헥산 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HA)을 얻는 단계; (d) 단계 (c)의 높은 살초활성 분획물로부터 에틸아세테이트-디클로로메탄 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAA)을 얻는 단계; (e) 단계 (d)의 높은 살초활성 분획물로부터 메탄올-아세토니트릴 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAAB)을 얻는 단계; (f) 단계 (e)의 높은 살초활성 분획물로부터 에틸아세테이트-메탄올 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 분획물(HAABB)을 얻는 단계; 및 (g) 단계 (f)의 높은 살초활성 분획물로부터 메탄올-물 용액을 이용하여 컬럼 크로마토그라피에서 높은 살초활성의 크리소파닉산을 분리하는 방법
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