KR100575284B1 - 치자 청색계 색소 및 그의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치자(Gardenia jasminoides Ellis)의 황색소 추출물 또는 제니포사이드(geniposide)를 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.) 및 아미노산으로 효소반응시켜 식품첨가제, 건강식품 원료, 염료 등 다양한 응용성을 지닌 천연색소 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

치자(Gardenia jasminoides Ellis), 제니포사이드(geniposide), 청색계 색소,

Description

치자 청색계 색소 및 그의 제조방법{Gardenia jasminoides Ellis blue dye and preparation method thereof}

도 1은 제니포사이드와 알라닌 혼합용액으로부터 생산된 색소의 스펙트럼의 특징을 조사한 결과이다.

도 2는 분자량이 다른 아미노산과 제니포사이드및 아이솔레이즈를 효소반응시켜 얻은 색소의 색을 측정한 결과이다.

도 3a는 반응온도에 따른 색소 생산량을 측정한 결과이다.

도 3b는 반응 pH에 따른 색소 생산량을 측정한 결과이다.

도 4는 제니포사이드와 아미노산의 혼합비율에 따른 색소 생산량을 측정한 결과이다.

도 5는 반응 시간에 따른 가수분해 효소 첨가량별 색소 생산량을 측정한 결과이다.

도 6a는 본 발명에서 제조된 색소의 반응 pH에 따른 안정성을 측정한 결과이다.

도 6b는 본 발명에서 제조된 색소의 반응 온도별 안정성을 측정한 결과이다.

본 발명은 치자(Gardenia jasminoides Ellis) 황색소 추출물 또는 황색소 추출물에서 정제한 제니포사이드(geniposide)로부터 치자 청색계 천연색소를 제조하는 방법 및 치자 청색계 색소에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 치자열매로부터 얻은 제니포사이드를 아미노산 및 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)와 함께 배양하여 보라색, 청색, 청록색 등의 청색계 천연색소를 제조하고 그 색소 생산성을 높이는 방법에 관한 것이다.

색소는 현재 식품공업, 화장품, 의약품 및 가축사료에 첨가제 또는 보조제 등으로 다양하게 사용되고 있다. 특히 제품의 색은 소비자가 최종적으로 상품을 구별, 선택하는데 결정적인 역할을 하게 되며, 상품성을 결정짓는 중요한 역할을 한다. 천연 식품들은 각기 자기 고유의 색을 가지고 있다. 그러나 이런 식품들은 가공, 또는 저장 중에 여러 식품의 성분, 즉 단백질류, 아미노산류, 당류, 향기성분, 비타민 등의 상호 물리, 화학적 작용으로 고유 색상이 변하며, 영양학적으로 변화가 생기게 된다. 식품산업이 발달하면서 이러한 색상의 변색이나 퇴색을 가리거나, 색상을 더욱 돋보이게 하여 상품성을 높이기 위한 수단으로 색소의 사용이 광범위하게 이루어지고 있다. 최근 천연식품 색소를 보다 다양한 제품에 적용시킬 수 있는 방법이 모색되고 있다. 더욱이 이들 색소는 건강에 유익한 효과를 발휘하기 때 문에 바람직한 일이라 할 수 있다. 예를 들어 안소시아닌(anthocyanins)이라 불리는 물질은 붉은색, 자주색, 파란색을 띄는 색소들로 국수, 잼, 음료, 요구르트 및 아이스크림 등의 식품에 색소로 사용될 수 있다. 또한 Food Science Australia의 식물제품개발 책임자인 Izabela Konczak 박사는 "안소시아닌이 가지고 있는 가장 큰 장점은 바로 이들의 산화 방지력과 여러 가지 건강증진 효과라 할 수 있다. 과학자들은 안소시아닌이 콜레스테롤 함량을 낮추고, 혈액응고를 지연시키며, 여러 가지 유해 발암물질들로부터 세포를 방어하는 작용에 관해 연구를 진행하고 있다."고 설명하였다. 안소시아닌은 '21세기의 비타민'이라 불리는 폴리페놀 화합물의 하나로서 이들은 의료 및 건강상 매우 유익한 효과들을 발휘한다. 이와 마찬가지로 치자로부터 얻은 황색소도 마찬가지로 식용색소로써 뿐만 아니라 치자의 여러 성분들과 함께 동의보감 치료에 따르면 소염, 진정, 열내림, 출혈 등의 치료에 한방약재로써 사용되기도 했다. 또한 당근이나 수박, 토마토의 색소는 대표적인 카로티노이드계 색소이다. 카로티노이드계 색소의 대표적인 물질은 베타-카로틴과 라이코펜인데, 이들은 색상을 부여할 뿐만 아니라 유해한 활성산소를 없애주는 역할도 한다. 또, 플라보노이드계 색소의 대표적인 물질은 메밀에서 추출되는 루틴인데, 이는 비타민 P라고도 불리는 것으로 모세혈관을 강화시키는 효과가 있다. 따라서 얼굴이 쉽게 붉어지는 민감성 피부의 치유효과가 있다. 이와 같이 다양한 천연색소는 대개 안전성이 우수하고 생리활성적 효능, 효과를 가진 것이 많아 최근 대량생산을 위한 많은 연구가 진행되고 있으며, 건강식품의 첨가제로써의 이용가치가 입증되어지고 있다.

한편, 천연색소는 염료로써도 사용되고 있는데, 19세기 중엽까지의 염료는 오직 식물, 동물, 미네랄 등의 천연원료에서만 얻을 수 있었으나, 오늘날 사람들은 값싼 합성염료 덕분에 원하는 거의 모든 색의 옷을 입을 수 있게 되었고, 이러한 합성염료는 섬유의 성질에 관계없이 얼룩이 없는 선명한 색을 나타낼 수 있다. 합성 염료의 이러한 다양한 장점에도 불구하고, 최근에 천연 염색에 관한 관심이 다시 대두되고 있다. 식물의 뿌리, 나무껍질, 꽃, 열매, 흙 등으로 염색을 하는 것은 화학 염색에 비해서 환경친화적이며 건강상품으로써 응용할 수 있는 범위가 넓기 때문에 세계적인 주목을 받고 있다. 자연의 색을 찾는 천연염색은 화학염색에서 나오는 색상과는 달리 다양한 성분이 복합되어 나온 색상이기 때문에 세탁하면서 조금씩 색이 사라지면서 천연염색 고유의 색을 즐길 수 있고, 세탁하면서 나오는 악성 폐수를 방지할 수 있다. 게다가, 천연염색 옷은 좀이 쓸지 않는다. 쪽은 독사 및 해충을 쫓아내는 제독성, 방충성이 있어서 독충이 많은 지역의 사람들은 바깥일을 할 때 천연염색 옷을 즐겨 입는다고 한다. 옛날에는 피부병이 발생하면 천연염색의 옷을 입었고, 선진국에서는 무좀 및 아토피성 피부병 환자용으로 천연염색 옷이 개발되어 팔리고 있다.

제품에 인위적으로 첨가하여 색을 발현시키는 착색료, 즉 색소는 과거에는 자연에 존재하는 물질에서 추출한 천연의 물질들이 주종을 이루었으나 추출의 어려움과 소재와 용도의 제한성이 커 제한적으로 사용되어 왔다. 그 후 1900년대 화학공업의 발달과 함께 화학적 합성 색소가 개발되면서 미국을 중심으로 발전되어 왔다. 색소의 분류는 용도, 사용목적 등에 따라 다양하지만 주요 분류 내용은 원료에 따른 분류, 용해되는 성질에 따른 분류, 허가여부에 따른 분류, 크게는 천연과 인공합성에 따른 분류 등으로 구분하고 있다. 천연색소는 동물성 색소와 안토시아닌계의 식물성 색소, 바이오 기술을 이용한 색소가 있다. 대표적 천연색소로는 코치닐추출색소, 락색소, 홍화황색소, 치자황색소, 치자청색소, 비트레드색소, 적양배추색소, 포도과피 추출색소, 베리류색소, 심황색소, 고량색소, 모나스커스색소, 파프리카추출색소, 안나토색소 등이 있다. 합성색소에는 타르계, 천연색소합성품등이 있다. 이 가운데 타르계 색소 등 합성착색료는 유해성 문제 때문에 그 수가 줄어드는 추세이며, 많은 소비자들이 건강 지향적인 상품에 관심이 높기 때문에 천연색소는 상업적으로 매우 중요한 의미를 지니고 있다.

국내의 식용색소시장은 연간 약 110억 원대로 업계는 예측한다. 그 중 타르 색소를 포함한 합성 색소 시장은 약 10억 원대, 천연색소 시장은 약 100억 원대의 시장을 형성한다. 표 1은 색소시장의 규모변화에 대하여 나타낸 것이다(참고: www. Foodi.com)(단위: 만원).

년도	시장규모
1994년	69억 8,000만원
1995년	114억 9,800만원
1996년	58억 5,300만원
1997년	95억 5,700만원
1998년	110억
1999년	120억

최근 천연색소의 수요가 증가되는 추세이기 때문에 시장규모는 점차 커질 것이나 가격에 비해 사용되는 양이 적기 때문에 물량적인 측면에서의 시장확대는 급 속하게 일어나지 않을 전망이다. 그러나 좀더 경제적인 천연색소 생산을 위한 천연색소의 생산공정 기술 개발을 통하여 단가를 낮추고 보다 응용범위를 넓힐 필요가 있다.

국내 색소제조 업체수는 전국 약 260여 곳이 있는데 이들 업체의 경우 캬라멜 색소와 몇몇 천연색소를 제외하고는 전량 외국에서 원료나 완제품을 들여와 소분, 혼합 판매하는 실정이다. 국내에서도 합성착색료의 경우는 점차 규제가 가해지고 천연 착색료의 수는 점차 종류가 늘 것으로 전망되고 있다. 그 이유로는 합성착색료에 비해 천연착색료는 안전성 및 신뢰성이 높기 때문이다. 그러나 화학 합성품의 경우도 오랜 기간 사용되어 오고 있으며, 천연물 보다 철저한 연구가 진행되고 있어 경제성과 안정성 측면에서 아직까지는 합성착색료가 많이 사용되고 있다. 이처럼 천연색소의 사용이 빠르게 확산되지 않는 이유는 화학 합성품에 비해 천연색소의 가격이 수배에서 수십배까지 비싸며, 원료의 성질에 따라 색이 변하거나 탈색이 되어 안정성이 떨어지고, 기존 합성착색료 보다 많은 양을 넣어야 하며, 색상 보존기간이 짧아 업계에서 사용을 꺼리고 있기 때문이다. 또한 색소를 국내에서 생산하기 위하여 기존 색소에 대한 연구가 많이 되어야 한다. 최근 합성 색소의 유해성 주장이 나오면서 천연색소로의 대체가 이루어지고 있다. 합성색소의 유해론이 오래 전부터 나온 이야기이고 보면 이에 대한 현실적인 대체방안과 보다 더 안전한 색소의 개발에 대한 연구가 이루어져야 한다. 따라서 현재 천연색소의 문제점을 파악하고 보면 본 발명에서와 같이 생산성 향상을 위한 효소들을 선별하여 배양조건을 최적화 함으로써 보다 값싼 천연색소 필요성이 요구되는 것이다.

현재 천연 색소에 있어서 천연 황색소는 홍화, 홍국균, 울금, 치자 등, 천연적색소는 코치닐, 홍화, 홍국균 등에서 얻어지고 있으며, 천연 청색소는 상업적으로 치자와 해조류로부터 얻고 있다. 그러나 천연 청색소의 경우 해조류로부터 얻는 피코시아닌(phycocyanin)은 알코올을 함유한 산성 음료에서 상당히 불안정해 이용이 불가능한 반면, 치자 열매의 추출액에 함유되어 있는 배당체 성분은 그 자체로는 색을 띄지 않으나 가수분해하여 글루코오스를 제거하고 일차 아민과 반응시키면 안정한 수용성 청색소를 얻을 수 있다고 알려져 있다.

치자 청색소와 적색소는 이리도이드계 꼭두서니과 치자(Gardenia augusta MERRILL Var. grandflora HORT., Gardenia jasminoides ELLIS)의 열매에서 추출하여 얻어진 이리도이드 배당체와 단백질 분해물의 혼합물에 베타 글루코시다아제를 첨가한 후 분리해서 얻어지는 색소이다. 이 색소는 pH변화에도 색조가 변하지 않으며, 열, 빛에 대해서도 비교적 안정적이다. 치자 청색소 생산 관련 연구는 보고 되어져왔으며, Fujikawa등은 치자의 제니포사이드를 가수분해하기 위해 미생물 또는 부착된 효소를 사용하는 대신에 미생물의 생장 세포를 이용하여 청색소를 연속적으로 생산할 수 있으며, 이 제니포사이드가 청색소의 생성원으로 뿐만 아니라 미생물의 세포 성장에도 유익하다고 보고되었으며(Fujikawa, S., et al. J.Ferment. Technol., 65: 419-424, 1987), 황함유 아미노산인 타우린을 사용한 경우에도 안정한 청색소를 얻을 수 있어서 여섯 개의 주요성분을 HPLC로 확인하였다는 보고도 있었다(미국특허 제 4,878,921호). 그리고 국내에서는 치자 열매로부터 유기용매 추출물을 활성탄에 흡착시켜 제니포사이드를 분리하여 셀룰라아제를 가하고 가수분해 시켜 제니핀을 수득한 다음, 아미노산, 1차 아민 또는 펩티드와 반응시켜 치자 청색소를 제조하는 방법에 관한 것을 특허화하였다(대한민국 특허출원 10-2000-0020213).

이와 같이 치자열매의 이리도이드계 배당체인 제니포사이드로부터 베타 글루코시다아제와 셀룰라아제에 의해 또는 미생물들을 배양함에 의해 청색으로 변화된다는 사실은 공지되어 있으나, 치자 열매로부터 청색계 색소를 제조하는 방법은 수율 문제로 실용화하기 어려운 문제점이 있으며, 또한 치자 청색소를 생산하는데 있어서 일부 효소에 한정되어 있다.

본 발명은 치자 황색소 추출물 또는 제니포사이드로부터 가수분해 효소와 아미노산을 반응시켜 치자 청색계 색소를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 기존의 복잡한 다단계의 반응이 아니라 한 단계의 반응만을 거쳐 색소 생산률을 향상시키며, 대량생산을 가능하게 한다.

본 발명자는 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)를 선발하고, 그 효소를 이용한 색소생산에 있어 가장 적합한 아미노산인 글라이신(glycine)및 알라닌(alanine), 타이로신(tyrosine) 등을 선별하여, 효소반응조건을 최적화함으로써 높은 수율로 색소를 생산하는 것을 특징으로 한다. 또한 다양 한 범위의 온도 및 pH에 안정한 색소를 생산하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하면 치자의 구성성분인 제니포사이드와 각 아미노산을 포함한 용액들로부터 효소반응에 의해서 보라색, 청색, 청록색 등의 청색계 색소를 제조하였다.

본 발명은 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)와 치자 황색소 추출물 및 아미노산을 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소의 제조방법에 관한 것이다.

상기 가수분해 효소는 천연 미생물 유래 외에도 유전자 재조합방법으로도 제조하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 치자 황색소 추출물 중 제니포사이드를 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 효소반응을 40-80℃, pH 4-7의 조건하에서 10-72시간 동안 정치 또는 진탕배양하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 치자 황색소 추출물 1g당 0.04-2g(160-8000IsoU) 효소량과 반응시키는 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)와 치자 황색소 추출물 및 아미노산을 효소반응시켜 얻어지는 치자 청색계 색소에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 치자 황색소 추출물 중 제니포사이드를 사용하는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소에 관한 것이다..

또한, 본 발명은 상기 색소가 건강보조식품, 식품첨가제, 보조제 또는 염료로 사용가능한 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 청색계 색소의 제조방법은 제니포사이드 0.4mM-10mM의 기질농도, 아미노산 0.4mM-10mM의 농도로 포함된 효소반응물에 제니포사이드 중량 기준에 대하여 0.04-2g/g의 효소를 첨가하여 반응을 시키며, 효소의 특성에 맞는 반응온도 즉, 40-80℃의 반응온도, pH 4.0-8.0의 조건하에서 10-72시간동안 정지 또는 진탕배양하여 얻어진 청색계 색소분말을 제조한다.

본 발명의 구체적인 내용은 실시예를 통하여 설명하였다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1: 제니포사이드로부터 알라닌과 함께 청색계 색소 생산능이 우수한 효소의 선발>

본 실시예는 청색계 색소를 나타내는 가수분해 효소를 선별하기 위하여 아미노산인 알라닌와 치자로부터 추출한 제니포사이드를 반응시켰다. 베타 및 알파 결합물질 가수분해효소를 포함하여 총 10종의 가수분해 효소를 대상으로 표 2의 반응조건에 따라 색소 생산능을 조사하였다. 표 2는 각 효소의 반응pH와 반응온도를 나타낸 것으로서, 45-55℃ 사이의 반응조건을 가진 효소들은 50℃에서 반응시키고, 재조합 효소들은 70℃에서 반응시켰다.

Enzymes	Microbial origin	pH & Temperature(℃)
β-glucosidase	Thermus caldophilus(recombinant enzyme)	7.0 & 80℃
α-glucosidase	Thermus caldophilus(recombinant enzyme)	7.0 & 80℃
Amylomaltase	Thermus caldophilus(recombinant enzyme)	7.0 & 80℃
α-amylase	Aspergillus sp.	4.5-6.0 & 55℃
β-glucanase	Bacillus sp.	4.2-7.5 & 55℃
Cellulase T	Trichoderma viride	4.5 & 45℃
Cellulase A	Aspergillus niger	4.5 & 55℃
Hemicellulase	Aspergillus niger	4.5 & 50℃
Barly-β-amylase	Barley	-
Isolase	Trichoderma longibrachiatum	4.0-8.0 & 40℃

Enzymes	흡광도(Absorbance, 590nm)
	1시간	3시간	5시간	19시간
β-glucosidase	1.0	1.4	1.4	1.3
α-glucosidase	-	-	-	-
Amylomaltase	-	-	-	0.1
Hemicellulase	0.2	0.3	0.4	0.6
Cellulase A	-	0.1	0.1	0.1
Cellulase T	0.7	1.4	1.4	1.5
Isolase	0.7	1.5	1.7	1.7
α-amylase	0.1	0.4	0.8	1.1
β-glucanase	-	-	-	0.1
Barly-β-amylase	0.2	0.4	0.9	1.2

상기 10종의 효소들이 제니포사이드와 아미노산이 포함된 반응물과 배양되면서 시간에 따라 색소가 나타나는 성질을 파악하기 위해 색소의 특성을 분석할 수 있는 분광광도계를 이용하여 청색소의 특징적인 흡수파장 590nm에서 흡광도를 측정하여 표 3에 제시하였다. 즉, 효소반응 초기에는 청색계 색소의 특징인 590nm에서 각 효소에 따른 색소 생산의 차이가 있으나, 시간이 경과함에 따라 각 효소에 따른 색소 생산의 차이가 확연히 나타나게 되며, 최종 생산량도 확인할 수 있었다. 그리고 이들 중 색소 생산능이 가장 우수하게 나타난 효소는 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)이고, 그 다음으로 트리코델마 속 유래의 셀룰레이즈 (Cellulase from Trichoderma sp.), 서머스 속 유래의 재조합 효소인 베타 글루코시다아제(β-glucosidase from Thermus sp.)가 비교적 우수한 색소 생산능을 보였다. 즉 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.), 트리코델마 속 유래의 셀룰레이즈(Cellulase from Trichoderma sp.), 서머스 속 유래의 베타 글루코시다아제(β-glucosidase from Thermus sp.), 아스퍼질러스 속 유래의 헤미셀룰라아제(Hemicellulase from Aspergillus sp.), 발레이 유래의 베타 아밀라아제(β-amylase from barley), 바실러스 속 유래의 베타 글루칸에이즈(β-glucanse from Bacillus sp.) 등의 베타 결합물질 가수분해 효소들은 그 생산량에는 다소 차이가 있으나, 청색계 색소를 나타냈으며, 나머지 알파 결합물질 가수분해 효소들은 거의 나타나지 않았다(표 3).

또한, 가장 우수한 색소 생산능을 보인 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈 (Isolase from Trichoderma sp.)효소에 의해 제니포사이드와 알라닌 혼합용액으로부터 생산된 색소의 스펙트럼의 특징을 조사한 결과 도 1과 같이 시간이 경과함에 따라 청색계 색소의 특징인 590nm에서 흡광도의 증가를 나타내었다.

<실시예 2: 제니포사이드로부터 색소 생산을 위한 아미노산 선발>

가수분해효소인 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)를 제니포사이드 0.4mM과 다양한 20종의 아미노산 4mM을 각각 반응물로 하여 50℃에서 반응한 결과 각각의 아미노산들에 따라 생산되는 색상의 차이가 나타났으며, 그 생산량에도 시간이 지남에 따라 다소 차이가 나타났음을 알 수 있다. 반응액을 시간에 따라 회수하여 각각 아미노산들에 따라 생산된 색과 생산량들을 조사하기 위해 색의 특징을 분석할 수 있는 분광광도계를 이용하여 특이 적 흡수파장을 측정하고, 각 흡수 파장에서 최대 흡광도들을 측정하여 그 값을 표 4에 제시하였다. 상기와 같이 생산된 색이 최대 흡광도를 나타내는 흡수파장의 범위는 보라색의 경우 560-580nm이였고, 청색의 경우 580-600nm이였으며, 청록색의 경우 600-620nm이였다. 또한, 이들 20종의 아미노산들 중 가장 분자량이 적은 글라이신(Glycine)의 경우 보라색의 특징인 흡수파장 570nm에서 2.5의 흡광도로 최대를 나타내었다. 도 2는 아미노산 분자량과 생산된 색의 차이를 관찰한 결과이다. 이는 아미노산의 분자량들이 증가함에 따라 생산되는 색 또한 보라색부터 청색, 청록색계로 이동함을 볼 수 있었다. 따라서 분자량 별 아미노산들에 따라 보라색에서부터 청록색까지 다양한 색소를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다. 표 4는 다양한 아미노산에 따라 제니포사이드와 아이솔레이즈를 효소반응시켜 얻은 색소의 특정 흡수파장 값과 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

<실시예 3: 효소반응의 최적 온도 및 pH 조사>

반응pH와 반응온도를 최적화하기 위하여 제니포사이드와 글라이신 혼합용액에 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)를 첨가하여 온도와 pH를 달리하여 효소반응시켰다. 그 결과는 도 3a, 3b에 나타낸 바와 같이 최대 색소생산을 위해 반응온도는 40-70℃ 더욱 바람직하게는 55℃가 적합하였으며, 반응 pH는 4.5-6가 가장 적절하고 알칼리 환경에서는 청색계 색소의 생산이 거의 없음이 관찰되었다.

<실시예 4: 청색계 색소 최대 생산을 위한 제니포사이드와 아미노산의 적합한 혼합비율>

최대 청색계 색소 생산을 위하여 제니포사이드와 글라이신의 농도를 총 10mM을 기준으로 하여 그 비율을 0:10-10:0로 조정하면서 55℃, pH 4.5에서 효소반응시켜 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보는 바와 같이 그 비율이 2:8에서 8:2, 보다 정확하게는 5:5-6:4의 비율이 색소생산에 가장 적합한 것으로 나타났다.

<실시예 5: 청색계 색소 최대 생산을 위한 적합한 효소첨가량 조사>

상기 실시예 1 내지 4에 따른 반응조건들을 기본으로 하여 장시간 반응시켰을 때 최대 색소 생산량에 적합한 효소 첨가량을 측정하였다. 효소활성이 1mg당 4IsoU 단위인 효소의 양을 기질인 제니포사이드의 g수당 증가량으로 조사한 결과 도 5에서 보는 바와 같이 반응 10시간까지는 효소의 증가량에 따라 색소 생산량의 증가하였으나 반응 22시간 이후부터는 0.04g/g 기질(160IsoU) 효소량을 제외하고는 유사한 최종 생산량을 보였으며, 따라서 0.2g/g 기질(800IsoU) 효소량의 경우 반응조업을 20시간이상 지속할 경우 가장 적합한 효소의 첨가량이다. 그리고 0.2g/g 기질 효소량과 0.04g/g 기질 효소량 사이에서 더 상세하게 조사한 결과 0.1g/g 기질(400IsoU) 효소량이 20시간이상 조업할 경우 가장 적합하게 나타났다. 따라서 반응 조업시간 및 경제성에 따라 0.04g/g 기질 효소량에서 2g/g 기질 효소량까지의 범위에서 효소량을 유동적으로 조절할 수 있다.

<실시예 6: 청색계 색소 분말의 제조>

치자로부터 얻어진 제니포사이드 25mM과 20종 아미노산 중 글라이신을 25mM 농도로 제조하여 생물반응기(bio-reactor)에 제니포사이드 600㎖와 글라이신 600㎖ 그리고 10mM 아세트산나트륨 완충액(sodium acetate buffer, pH 4.5)을 1500㎖ 첨가하여 혼합한 후 121℃에서 20분간 멸균시킨 뒤 55℃까지 식히고 멸균수 300㎖에 6g 효소를 용해하여 제조한 용액을 생물반응기에 첨가하여 반응을 시작시켜, 10-20rpm으로 교반시키면서 반응시킨다. 40시간까지 충분히 반응시킨 후 반응액을 멸균하여, 단백질을 변성시켜 효소반응을 정지하고, 원심분리(3,000 g, 20min)에 의해 변성된 단백질을 제거한다. 단백질이 제거된 보라색 색소용액을 감압 농축기에 의해 300㎖까지 농축, 그 농축액을 동결건조하여 보라색 색소 12.7g을 얻었다.

또한, 치자로부터 추출된 황색소에는 추출과정중 분리되지 않은 제니포사이드가 함유되어 있기 때문에 기질 대체 효과를 이루고자 제니포사이드 대신에 치자 추출물인 황색소를 12g으로 대체하고 글라이신 1g, 효소 1g을 반응물로 하여 위와 같은 반응조건으로 조업하고, 회수하여 농축 및 동결건조하여 청색계 색소를 얻었다.

<실시예 7: 제조된 색소의 안정성>

본 실시예에서는 실시예 6에서 제조된 색소를 pH와 온도에 따라서 색소의 특징적 흡수파장에서의 흡광도 변이율을 관찰하여 색의 퇴색정도를 측정하였다. 50mM 완충용액(buffer)으로 pH 4-12 범위(pH4-5는 아세트산나트륨 완충용액, pH6-8은 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer), pH9-12는 붕산나트륨/수산화 나트륨 완충용액(sodium borate/NaOH buffer))로 조정하여 55℃에서 정지시켜 시간에 따라 관찰하였다. 100시간이상 방치한 결과, pH 5-12 범위에서는 80% 이상의 잔존율을 나타내었다(도 6a). 또한, 온도의 안정성은 항온수욕조에서 25-75℃까지로 조정하여측정하였다. 그리고 25℃에서는 100% 잔존률을 나타내었으며, 30-55℃까지도 80% 이상의 잔존률을 보였으나, 75℃에서는 140시간에 70%이상 잔존률을 확인할 수 있었다(도 6b).

<실시예 8: 천 염색>

상기에 제조된 색소를 염색액으로 만든 후 염색액의 온도가 20-100℃가 되도록 불을 조절한 상태에서 염색 용기에 천 을 넣은 다음 약한 불로 온도를 서서히 올려서 30-60분간 서서히 저어주면서 끓인다. 염색용기에 불을 꺼내고 방치후 탈수한다. 온탕에서 세척하고 두번째 탈수를 한 후 음건하여 제품을 완성한다. 염색은 60내지 100℃에서 30내지 60분간 침지하여 행하는 것이 바람직하다.

재료에 염색한 결과 단밸질 섬유(견, 모)에는 상당히 친화력이 좋으나 셀룰로오즈 섬유에는 좋지 않아 염색이 잘 되지 않는다. 단백질 섬유의 경우 pH 4정도, 60℃에서 30분 정도면 염색이 가능하다.

이상에서 알 수 있듯이, 본 발명은 치자의 제니포사이드로부터 아미노산과 함께 우수한 효소반응을 통한 치자 청색계 색소를 고수율로 간단히 제조하는 방법을 제공하였다. 본 발명에 의하면 다양한 가수분해 효소들 중 베타 결합물질을 분해하는 가수분해효소가 제니포사이드를 분해하여 아미노산과 함께 색소를 생성을 확인 하였다.

또한, 본 발명은 비교적 중온에서 한 단계의 과정만으로 다양한 아미노산들과 함께 보라색, 청색, 청록색의 다양한 청색계 색소를 생산할 수 있다. 즉 본 발명에서는 기존의 청색소 생산방법인 효소반응에 의해 제니포사이드를 1-3일 동안 가수분해하여 제니핀을 형성시키고, 분리된 제니핀을 일차 아민들과 함께 70℃이상 고온에서 반응시킴으로써 얻는 것과는 달리, 고온을 필요로 하지 않고 비교적 중온에서 다른 분리과정을 거치지 않고 한 단계의 과정만을 거쳐 색소 생산을 할 수 있었다.

또한, 본 발명은 최대 색소생산을 위한 반응 최적화를 달성하여, 색소 생산공정을 간단히 하여 생산단가 및 생산시간을 현저히 단축하여 산업적 활용도를 높일 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 치자의 고유 효능물질들의 함유로 생리활성적 효능, 효과들을 가질 수 있어 식품첨가물 뿐만 아니라, 건강보조식품에도 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 의해 생산된 색소의 우수한 안정성으로 인해 천연염료로써 섬유에 염색하는 원료로써 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)와 치자의 황색소 추출물 및 아미노산을 효소반응시키는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 치자 황색소 추출물 중 제니포사이드를 사용하는 특징으로 하는 치자 청색계 색소의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소반응은 40-80℃, pH 4-7의 조건하에서 10-72시간 동안 정치 또는 진탕배양하는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소의 제조방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치자 황색소 추출물 1g당 0.04-2g(160-8000IsoU) 효소량과 반응시키는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소의 제조방법.
5. 트리코델마 속 유래의 아이솔레이즈(Isolase from Trichoderma sp.)와 치자 황색소 추출물 및 아미노산을 효소반응시켜 얻어지는 치자 청색계 색소.
6. 제5항에 있어서, 상기 치자 황색소 추출물 중 제니포사이드를 사용하는 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 색소는 건강보조식품, 식품첨가제, 보조제 또는 염료로 사용가능한 것을 특징으로 하는 치자 청색계 색소.

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