KR100573246B1

KR100573246B1 - 알파-리포익산 또는 디하이드로리포익산을 함유한골다공증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100573246B1
Application number: KR1020030084739A
Authority: KR
Inventors: 김기수; 이기업; 박중열; 고정민
Original assignee: 김기수; 이기업; 박중열; 고정민
Priority date: 2003-11-26
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2006-04-24
Also published as: KR20050051054A

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표기되는 α-리포익산(α-lipoic acid) 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산(dihydrolipoic acid)을 유효성분으로 함유한 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 조골세포 증식 및 파골세포 억제 활성이 뛰어나므로, 골다공증 치료제 또는 예방제로서 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강 식품으로도 응용될 수 있다.

<화학식 1>

<화학식 2>

Description

알파-리포익산 또는 디하이드로리포익산을 함유한 골다공증의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising alpha-lipoic acid or dihydrolipoic acid for the prevention and treatment of osteoporosis}

도 1의 a 및 b는 α-리포익산이 사람 골수기질세포(human bone marrow stromal cell ; hBMSC)의 생존능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 이때, α-리포익산을 hBMSC에 24시간 동안 처리하여, 처리농도에 따른 생존 세포수의 변화(a) 및 ELISA를 실시한 경우의 세포 사멸수의 변화(b)를 나타낸 것이다.

● : 상등액(supernatant)에 존재하는 네크로시스(necrosis) 구역

◇ : 세포 융해물(cell lysate)에 존재하는 아팝토시스(apoptosis) 구역

도 2의 a 및 b는 hBMSC에 α-리포익산을 24시간 또는 48시간 동안 처리한 후, 오스테오칼신(osteocalcin) 분비(a) 및 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성도(b)를 나타낸 그래프이다.

도 3의 a 및 b는 hBMSC와 사람말초혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell ; hPBMC)에 α-리포익산을 처리하고, 5일간(a) 또는 7일간(b) 상기 세포들을 동시배양한 후, 타르트레이트-내성 산 포스파타제(Tartrate-resistant acid phosphatase ; TRAP) 염색을 실시하여 성숙 파골세포(osteoclasts)의 수를 관 찰한 그래프이다. 이때, 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP-양성 다핵세포를 성숙 파골세포로 간주하였다.

도 4는 용해성 RANKL 및 M-CSF를 이용하여 α-리포익산의 처리가 hPBMC의 성숙 파골세포로의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 이때, 3개 이상의 핵을 포함하는 TRAP-양성 다핵세포를 성숙 파골세포로 간주하였다.

본 발명은 화학식 1로 표기되는 α-리포익산 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산을 유효성분으로 함유한 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

<화학식 1>

<화학식 2>

뼈의 발생, 성장 및 대사과정에는 뼈의 형성(bone modelling)과 재형성(remodelling) 과정이 중요한 역할을 한다. 뼈의 형성은 태생기부터 시작하여 이후 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되어 20대에서 30대 초반까지 최대 골량을 형성하게 된다. 이후 약 30년 동안은 뼈를 제거하고 다시 이를 보충하는 골재형성 과정을 반복하게 되는데 이때는 골형성과 골흡수가 서로 짝을 이루어 균형을 유지하게 된다. 이 시기가 지난 후에는 골흡수에 따른 골소실을 골형성이 충분히 따라갈 수 없어 결국 연 0.3 ~ 0.5% 정도의 골량 감소를 겪게 되며, 특히 여성의 경우에는 폐경 초기에 연 2 ~ 3%의 상당한 골소실을 겪게 된다.

뼈는 크게 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 라이닝세포(lining cell) 및 골세포(osteocyte)의 네 가지 세포로 구성되어 있다. 이때, 골수내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래되는 조골세포는 골기질을 합성하는 분화된 세포로서 골형성을 주도하며, 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 골흡수를 주도한다.

골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골량은 유전적 요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등이 알려져 있다. 한편, 개인차는 있지만 백인보다는 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 골량이 더 높으며, 대개 골량은 14 ~ 18세에 가장 높고 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다. 특히, 여성의 경우 30세 이후부터 골 감소가 지속적으로 진행되며, 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 골 감소가 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로젠 농도가 급속히 감소하는데, 이때, IL-7(interleukin-7)에 의한 것처럼 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되어 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적되고, 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골 세포의 활성을 증가시키므로 결국 골량이 감소하게 된다.

이와 같이, 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가되고 있다. 또한, 전세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있으며, 앞으로 더 증가할 것으로 예상되기 때문에 세계적인 각 연구 기관과 제약회사에서는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다. 국내에서도 근래에 평균수명이 80세에 육박하면서 골다공증 유병률이 급격하게 증가하고 있는데, 최근 지역 주민을 대상으로 실시된 연구에 의하면 전국 인구로 표준화하였을 경우 남성의 4.5%, 여성의 19.8%가 골다공증을 갖고 있다고 보고된 바 있다. 이는 골다공증이 당뇨병이나 심혈관계 질환보다 더 흔한 질환이며, 골절로 인해 받는 환자들의 고통이나 치료를 위해 들어가는 비용을 추정할 때 골다공증은 매우 중요한 보건 문제임을 시사한다.

현재, 임상에서 사용되고 있는 골다공증 치료제는 여성호르몬, 여성호르몬 수용체 변형체(selective estrogen receptor modulators ; SERMs), 칼시토닌, 비스포스포네이트 등의 골흡수제와, 부갑상선 호르몬 제재(Teriparatide) 등의 골형성 촉진제가 있다. 그러나, 상기 약제들은 골흡수와 골형성을 동시에 감소시키거나 증가시키며, 골다공증 치료제로써 골량을 증가시키는 효과는 골흡수의 양과 골형성 양 사이의 상대적인 차이를 그 주 기전으로 하는 바, 획기적으로 골량을 증가시키는 데에는 한계가 있다.

한편, 산화 스트레스가 세포 기능에 중요한 작용을 한다는 사실은 1970년대 초에 이미 알려지기 시작하였는데, 초기의 연구들은 주로 세포 독성학적 관점에서 연구가 진행되었다(Boveris, A. and Chance, B., Biochem J., 134: 707-716, 1973). 즉, 산화 스트레스가 세포에 직접 작용하여 세포막의 지질 과산화 반응, DNA 손상, 세포내 지질과 단백질의 산화, poly(ADP-ribosylation) 및 세포 내 에너지 고갈 등을 일으킴으로써, 세포의 사멸을 촉진하여 다양한 여러 가지 질환을 야기할 수 있다는 것이다(Beckman, K.B. and Ames, B.N., Physiol. Rev., 78: 547-581, 1998). 그러나, 이후의 연구들은 산화 스트레스가 직접적인 세포 독성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 세포 내 이차전령물질로서 작용하는 등 다양한 세포 기능 조절작용을 가지고 있음을 제시하고 있다(Hensley, K. et al., Free Radic Biol Med., 28: 1456-1462, 2000). 즉, 산화 스트레스의 작용이 단순한 세포 독성 작용이 아닌, 다양한 세포에 다양한 작용을 일으킴으로써 인간의 건강 및 질환에 직간 접적인 영향을 줄 수 있음을 의미한다.

따라서, 많은 질환 모델에서 산화 스트레스의 작용에 대한 연구들이 활발히 진행되어 왔는 바, 현재까지의 연구들은 혈관염, 사구체신염 및 전신성 홍반성 루프스 등의 염증성 질환, 허혈성 심질환, 중풍 및 장 허혈등의 심혈관계 질환, 파킨슨씨병, 근육위축증 및 치매 등의 신경-근육계 질환, 암, 알코올 중독, 흡연과 연관된 질환, AIDS, 위궤양, 고혈압 등 수많은 질환이 산화 스트레스와 연관되어 있다(McCord, J.M., Am. J. Med., 108: 652-659, 2000). 최근, 이와 같은 질환에서 산화 스트레스의 세포내 작용 및 그 신호전달 기전과 이를 억제하는 항산화제의 개발에 많은 관심을 불러일으키고 있다.

산화 스트레스는 파골세포를 활성화시킨다. 즉, 산화 스트레스는 파골세포의 형성 및 활성을 증가시켜 골 흡수를 증가시킬 수 있으며(Yang, S. et al., Calcif Tissue Int., 63: 346-350, 1998), 특히 IL-1, TNF-α와 같이 파골세포의 활성을 증가시키는 것으로 잘 알려진 여러 싸이토카인들도 부분적이나마 과산화물(superoxide) 등 산화 스트레스의 매개에 의해 작용한다(Garrett, I.R. et al., J. Clin. Invest., 85: 632-639, 1990). 또한, 파골세포의 신호전달 체계 중 필수적인 NFκB, c-Jun 아미노-말단 키나아제(amino-terminal kinase)(JNK), PI3K 및 p38 MAP 키나아제 등도 산화스트레스에 의해 활성화될 수 있다(Paolicchi, A. et al., Biochem. Pharmacol., 64: 1027-1035, 2002).

그러나, 조골세포에 대한 산화 스트레스의 작용은 많이 알려져 있지 않다. 일부 연구에서, 산화 스트레스가 조골세포의 괴사(necrosis)(Kennedy, J.G. et al., Orthopedics., 23: 481-485, 2000) 및 세포자멸사(apoptosis)(Chen, R.M. et al., J. Orthop. Res., 20: 295-302, 2002)를 일으키고 성숙한 조골세포로의 분화를 억제할 수 있다(Mody, N. et al., Free Radic. Biol. Med., 31: 509-519, 2001)는 보고가 있다. 상기 연구들에 의하면, 산화 스트레스가 파골세포를 활성화하는 반면, 조골세포의 활성은 억제하여 골흡수를 증가시키고 골형성은 감소시킴으로써 골다공증을 일으킬 수 있다고 추론할 수 있을 뿐이다. 그러나, 아직까지 항산화제로 산화 스트레스를 조절함으로써 골다공증의 치료에 활용할 수 있다는 연구는 전무한 상태이다.

한편, 본 발명에서 이용된 알파-리포익산(α-lipoic acid)은 그 자체로서, 또는 체내에서 디하이드로리포익산(dihydrolopoic acid)으로 전환된 후, 미생물에서 사람에 이르기까지 에너지 대사과정 및 세포호흡에서 필수적으로 작용하는 조효소이다(Packer, L. et al., Free Radic. Biol. Med., 19: 227-250, 1995). 1950년대에 분리 동정된 이후 현재까지 그 효능을 연구해 온 결과, 현재 강력한 항산화제로서의 역할이 인정되고 있다. 알파-리포익산 또는 체내에서 전환된 디하이드로리포익산 자체가 항산화제로 작용하기도 하고, 체내의 또다른 항산화 물질인 글루타치온의 생성을 촉진시켜주거나 비타민 E 및 비타민 C의 기능과 재생을 도와 체내의 항산화 작용을 강화시키는 역할을 한다. 이러한 알파-리포익산의 효능을 이용하여 현재 당뇨병, 신경질환, 백내장, 심장발작, 죽상동맥 경화증 등의 치료에 사용되고 있다.

이에, 본 발명자들은 항산화제를 산화 스트레스를 조절하기 위한 골다공증 치료제로의 용도를 연구하던 중, 당뇨병성 신경 합병증에 광범위하게 처방되어 장기간의 안정성이 이미 입증되어 있는 α-리포익산 또는 디하이드로리포익산이 골다공증의 예방 또는 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 골다공증 예방 또는 치료용 화합물에 사용될 수 있는 화학식 1로 표기되는 α-리포익산 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표기되는 α-리포익산 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 α-리포익산 또는 디하이드로리포익산을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표기되는 α-리포익산 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 디하이드로리포익산은 알파-리포익산의 환원형으로서, 체내에서 두 형태는 가역적으로 전환된다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 화학식 1의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들 면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 칼슘, 비타민 D 및 식물성 에스트로겐으로 구성된 군으로부터 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것이 골다공증 예방 및 치료제로서의 효능 증진을 위해 바람직하다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 조성물의 유효용량은 5 ~ 100 mg/kg이고, 바람직하게는 10 ~ 30 mg/kg이며, 하루 1 ~ 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 조성물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 400 ~ 500 mg/kg로서 안전한 물질로 판명되었다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 α-리포익산 또는 화학식 2의 디하이드로리포익산을 유효 성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 건강 식품을 제공한다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 디하이드로리포익산이 α-리포익산의 체내 전환 형태이므로, α-리포익산으로만 실시하였다. 그러나, 본 발명에 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 디하이드로리포익산이 α-리포익산과 동일한 기능을 할 것임을 알 수 있을 것이다. 동물 실험을 통해 골량증가 효과를 살펴본 결과, 4 주간의 비교적 짧은 기간 동안 α-리포익산을 투여한 경우, 난소 절제 대조 군에 비해 BMD(bone mineral density)는 15.1%, BMC(bone mineral content)는 17.4%의 증가를 나타낸다(표 1 참조). 지금까지 항산화제를 사용하여 골다공증을 치료한 연구는 극히 드문 상태로, 특히 당뇨병성 신경병증의 치료제로 장기간의 안정성이 이미 확증되어 있는 α-리포익산이 골량 증가 효과가 있다는 보고는 없다. 본 발명의 난소 절제 동물은 골다공증의 가장 많은 형태인 폐경기 후 골다공증 모델로써, 본 발명에 의해 폐경기 후 골다공증 치료에 있어서 α-리포익산 또는 디하이드로리포익산이 사용될 수 있음을 알 수 있다. 그러나, 노화 과정에서 산화 스트레스가 증가한다는 것은 공지된 사실이며(Droge, W., Exp. Gerontol., 37: 1333-1345, 2002), 류마티스 관절염(Hagfors, L. et al., Nutr. J., 2: 5, 2003), 홍반성 낭창(Mohan, I.K. and Das, U.N., Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids., 56: 193-198, 1997), 혈관염(Warren, J.S. et al., Free Radic. Biol. Med., 8: 163-172, 1990) 등 골다공증과 연관된 염증성 질환에서도 산화 스트레스가 증가되어 있다고 알려져 있어, α-리포익산 또는 디하이드로리포익산은 폐경기 후에 발생하는 골다공증 뿐만 아니라, 노화 과정에서 발생하는 골다공증 및 만성 염증성 질환에 의한 골다공증에도 효과적일 것임을 예측할 수 있다.

한편, 본 발명의 바람직한 실시예에서 고농도의 α-리포익산에서 hBMSC의 영향을 살펴본 결과, 세포 괴사는 모든 농도에서 유의한 차이를 보이지 않으나, 세포 자멸사는 고농도의 α-리포익산(10^-3 M)의 처리시 증가한다(도 1 참조). 이는 10^-3 M 이하의 농도에서는 사람 골수기질세포(human bone marrow stromal cell ; hBMSC) 의 세포 생존능에는 영향을 주지않으면서 오스테오칼신 분비능과 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성도를 증가시키고, 사람말초혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell ; hPBMC)가 파골세포로 분화하는 것을 유의하게 억제시킴을 의미한다. 따라서, 매우 높은 용량의 α-리포익산을 처리하지 않도록 주의하면 안전하게 골량 증가 목적으로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 동물에서 골량 증가 효과의 기전을 살펴본 결과, 적어도 10^-4 M 이하의 농도에서는 항산화제인 α-리포익산이 hBMSC의 세포 생존능에는 전혀 영향을 주지 않으면서, 오스테오칼신(osteocalcin) 분비능이나 알칼라인 포스파타제 활성도를 증가시켜 조골세포로의 분화 및 그 기능을 촉진시킨다(도 2 참조). 즉, α-리포익산의 투여로 인해 골형성을 촉진함으로써 골량 증가 효과를 보였음을 확인할 수 있다.

나아가, 본 발명의 α-리포익산은 용량-의존적으로 성숙한 파골세포로의 분화를 억제시킨다. 가능한 기전으로서, α-리포익산이 조골세포 계열세포에 작용하여 간접적으로 파골세포로의 분화를 억제하였을 가능성과, 직접적으로 파골세포 전구 세포 단계에 영향을 주어 파골세포로의 분화를 억제하였을 가능성을 생각할 수 있다. 그러나, hBMSC과 hPBMC의 동시배양 시스템(도 3 참조)에서 뿐만 아니라 hPBMC 단독 배양 시스템(도 4 참조)에서도 동일한 결과를 나타낸 바, α-리포익산이 파골세포 전구 세포에 직접 작용하였음을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 α-리포익산의 골량 증가 효과는 조골세포 계열세포의 분화 및 기능을 촉진하여 골형성을 증진시키고, 파골세포로의 형성은 억제하여 골흡수를 억제하는 효과를 모두 가지고 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 난소 절제 동물 모델에 α-리포익산 투여후 골밀도 측정

이하, 실시예의 실험은 6번씩 반복하였으며, 그 실험 결과와 동물 실험 결과는 모두 평균 ±표준편차로 표시하였다. 각 군 사이의 결과는 편차분석(analysis of variance)으로 비교하였다. 통계적 유의성은 p-value<0.05로 정의하였고, SPSS 10.0 프로그램(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다.

10주령의 350 ~ 400 g 암컷 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 쥐(오리엔트(주))를 겉보기 수술군(sham operation)(n=9), 난소절제 대조군(n=9), 난소절제 치료군(n=18)으로 나누었다. 11주령에 겉보기 수술과 난소절제를 시행한 후, 겉보기 수술군과 난소절제 대조군에는 0.9% NaCl을 각 1 ㎖씩, 난소절제 치료군에는 10 ㎎/㎏(n=9) 및 100 ㎎/㎏(n=9)의 α-리포익산을 복강 내 주사하였다.

α-리포익산 주사제(600 ㎎/24 ㎖, ASTA Media, Germany)는 ㈜부광약품으로 부터 공급받아, 주 5회 총 4주간 투여하였다. 4주 경과후, 이중에너지 X-선 흡수계측기(dual energy X-ray absorptiometry: QDR-4500A, Hologic, USA)를 이용하여 대퇴부에서 골밀도(bone mineral density ; BMD)와 골광물량(bone mineral content ; BMC)을 측정하였다(표 1).

		BMD(㎎/㎠)	BMC(㎎)
실험 시작전	Sham	232.6 ±5.3	399.7 ±16.5
	Ovx	234.7 ±7.6	402.3 ±12.7
	Ovx + α-리포익산(10 ㎎/㎏)	231.5 ±4.3	396.4 ±10.3
	Ovx + α-리포익산(100 ㎎/㎏)	235.8 ±6.7	404.8 ±17.1
4주후	Sham	262.5 ±9.1	478.7 ±31.7
	Ovx	221.9 ±8.9	386.2 ±24.2
	Ovx + α-리포익산(10 ㎎/㎏)	243.8 ±6.9	412.3 ±13.2
	Ovx + α-리포익산(100 ㎎/㎏)	255.5 ±10.1	453.5 ±9.5

주; sham : 겉보기 수술군, Ovx : 난소절제 치료군

그 결과, 실험 시작전 4가지 실험군 사이의 BMD와 BMC는 모두 유사하였으나, 4주 후 난소절제 대조군의 BMD와 BMC는 겉보기 수술군에 비해 유의하게 감소되었다(각각 p<0.05와 p=0.001). 그러나, 난소절제 치료군에 10 ㎎/㎏의 α-리포익산을 복강내로 투여하였을 때(저용량 투여군), BMD와 BMC 모두 난소절제 대조군에 비해 높은 경향을 보였으며, 특히 100 ㎎/㎏의 α-리포익산을 투여하였을 때(고용량 투여군)에는 통계적으로 유의하게 BMD와 BMC가 증가하여, 난소절제를 받지않은 겉보기 수술군과 유사한 수준을 나타냈다(모두 p<0.05). 이는 용량-의존적으로 α-리포익산 투여시 골다공증 동물 모델인 난소절제 동물의 골량을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

<실시예 2> α-리포익산의 사람 골수기질 세포(Human bone marrow stromal cell; hBMSC)에 대한 세포 생존능과 세포사 측정

<2-1> hBMSC의 분리 및 세포의 특징

골대사에 이상이 없는 환자의 늑골에서 공지의 방법(Cheng, S.L. et al., Endocrinology, 134: 277-286, 1994)을 이용하여 골수기질세포를 분리하였다.

구체적으로, 무균 상태에서 환자의 연부조직을 제거한 후 늑골을 장축에 따라 개방하여 골수를 노출시켰다. 노출된 골수를 혈청이 유리된 α-최소 필수배지(α-minimum essential medium ; α-MEM)(Sigma, St. Louis, MO, USA)로 몇차례 세척한 후, 10분간 1400 rpm으로 원심 분리하였다. 침전된 세포를 적당량의 α-MEM 배양액으로 부유액을 만든후, 피콜/하이파크(Ficoll/Hypaque)(비중 1.077; Nycomed, Oslo, Norway) 밀도구배 원심법으로 분리하였다. 분리된 사람골수 기질세포를 3 x 10⁷ 세포/75 ㎠ 의 농도로 75 ㎠ 플라스틱 배양 플라스크에 넣고 10% 우태아 혈청(FBS; Gibco, Grand Island, NY), 페니실린 및 스트렙토마이신(각각 100 U/㎖ 100 g/㎖; Sigma)이 함유된 α-MEM에서 배양하였다. 배양된 세포는 2주째부터 2주일에 2회씩 배양액을 바꾸어 주면서 80 ~ 90%로 포화될 때까지 배양하였고, 0.01% 트립신과 0.05% 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid ; EDTA)을 사용하여 계대배양하였다. 실험을 2차 계대배양된 세포에서 수행하였다.

상기와 같이 분리된 사람 골수 기질세포는 분화된 조골세포의 형태학적 특징을 보였다(Kim, et al., Endor. Res., 23: 181-190, 1997). 즉, 제1형 전교원질(procollagen)을 생성할 수 있고 골결절을 만들 수 있으며, 세포외 기질에 칼슘을 침착시킬 수 있었다. 또한, 조골세포의 표지자로 알려진 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 제1형 콜라겐 및 오스테오폰틴(osteopontin)을 나타내었다. 또한, 비특이적 에스테라제(nonspecific esterase) 염색에 의하면 단구세포(monocytic cell)는 없었다.

<2-2> 세포 생존능 측정

살아있는 세포는 트립판 블루(trypan blue)에 염색되지 않는 원리를 이용하여, 살아있는 세포 개수를 직접 측정함으로써 세포 생존능의 지표로 하였다. 먼저, 실시예 <2-1>에서 분리된 사람 골수기질세포를 96-웰 플레이트에 5 x 10³ 세포/웰(well)로 분주한 후, 10% FBS를 함유한 100 ㎕의 α-MEM 에서 이틀 동안 배양하였다. 이후, FBS의 농도를 0.1%로 낮추어 24시간 동안 배양한 후, α-리포익산을 처리하였다. 처리가 종료된 후, 0.01% 트립신과 0.05% EDTA를 사용하여 개별 세포를 분리한 후, 0.1% 트립판 블루로 10분간 염색하고, 헤마시토미터(hemacytometer)로 염색되지 않은 세포 개수를 현미경으로 직접 측정하였다. 즉, 24시간 동안 α-리포익산을 처리한 후 살아있는 골수기질 세포 개수를 측정하여, 처리하지 않은 대 조군의 %로 비교하였다(도 1의 a).

그 결과, 10^-6 M, 10^-5 M 및 10^-4 M의 농도로 α-리포익산을 처리하였을 때, 각각 104.2 ±4.4%, 95.3 ±5.3% 및 98.6 ±5.9%로 세포 개수는 비슷하였으며, 10^-3 M의 농도에서는 88.0 ±31.2%로 감소하는 경향을 보이기는 하였으나 통계적으로 유의하지는 않았다.

<2-3> 세포사 측정

실시예 <2-1>에서 분리된 사람 골수기질 세포를 세포를 96-웰플레이트에 5 x 10³ 세포/웰(well)로 분주한 후, 10% FBS를 함유한 100 ㎕의 α-MEM에서 이틀 동안 배양하였다. 이후, FBS의 농도를 0.1%로 낮추어 24시간 동안 배양한 후 α-리포익산을 처리하였다. 24시간 경과후, 1500 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액(괴사된 세포 구역)과 침전된 세포부분(세포 자멸사 구역)으로 나누고, 침전된 세포부분에 200 ㎕의 융해(lysis) 버퍼를 처리하였다. 이후, 융해 버퍼가 처리된 침전액 20 ㎕를 스트랩트아비딘-코팅된 웰(streptavidin-coated well)에서 80 ㎕ 면역제 복합체(immunoreagent complex)(Cell death ELISA, Roche)로 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) ELISA reader(SPECTRAmax 340 PC; Molecular Devices, Palo Alto, CA)로 405 ㎚의 파장에서 흡광도 및 각 구역에서의 세포사 정도를 측정하였다(도 1의 b).

그 결과, 10^-4 M, 5 x 10^-4 M 및 10^-3 M의 α-리포익산을 처리하였을 때, 상등액의 세포사는 대조군에 비해 각각 101.1 ±8.7%, 109.6 ±12.4% 및 110.3 ±5.7%로 유의한 차이를 보이지 않았다. 침전된 세포부분의 세포사는 고농도의 α-리포익산(10^-3 M)의 경우 대조군에 비해 164.2 ±7.1%로 증가하기는 하였으나(p<0.05), 10^-4 M 및 5 x 10^-4 M의 농도에서는 105.1 ±6.3% 및 97.2 ±19.4%로 유의한 증가를 관찰할 수 없었다. 즉, 5 x 10^-4 M 이하의 α-리포익산 농도는 골수기질세포의 세포괴사(necrosis)나 자멸사(apoptosis)에 큰 영향을 미치지 아니함을 확인하였다.

<실시예 3> α-리포익산에 의한 알칼라인 포스파타제 활성도와 오스테오칼신(osteocalcin) 분비능 분석

실시예 <2-1>에서 분리된 사람 골수기질 세포를 6-웰플레이트에 1 x 10⁵/웰(well)로 분주시킨 후, 10% FBS를 함유한 α-MEM에서 이틀동안 배양하였다. 여기에 α-리포익산을 처리하여 0.1% 우태아혈청 알부민(Gibco, Grand Island, NY, USA)과 50 nmol/ℓ의 1,25(OH)₂D₃(1,25-dihydroxyvitamin D, Darmstadt, Germany)가 함유된 α-MEM에서 배양하였다. 24시간 및 48시간 후, 배양액을 분리하여 오스테오칼신 분비능 검사를 위해 -80℃에서 보관하고, 세포층은 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하여 p-니트로페닐 포스파테이트(p-nitrophenyl phosphatate) 가수분해를 정량함으로써 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성도를 측정하 였다. 오스테오칼신 분비능 검사는 노보칼신(Novocalcin) 상용화 키트(Metra Biosystems, Mountain View, CA)를 사용하여 측정하였다. 알칼라인 포스파타제 활성도와 오스테오칼신 농도는 모두 로우리(Lowry)법으로 세포 단백을 측정하여 이를 보정한 후 분석에 이용하였다.

그 결과, 오스테오칼신 분비능이 대조군의 경우 24시간 및 48시간 경과후 8.7 ±0.4 ng/㎎ 단백질 및 9.0 ±0.5 ng/㎎ 단백질이었으나, 5 x 10^-4 M 의 α-리포익산을 처리한 경우에는 각각 10.4 ±0.7 ng/㎎ 단백질 및 15.2 ±0.9 ng/㎎ 단백질로 증가하여 48시간 후에는 통계적으로 유의한 증가를 관찰할 수 있었다(p<0.01, 도 2의 a). 10^-3 M의 α-리포익산을 처리한 경우에는, 24시간 및 48시간 경과후에 각각 14.0 ±0.5 ng/㎎ 단백질 및 24.4 ±1.1 ng/㎎ 단백질로 더욱 증가하였다(모두 p<0.001, 도 2의 a).

α-리포익산은 오스테오칼신 분비능 뿐만 아니라 알칼라인 포스파타제 활성도 역시 증가시켰는 바, 10^-3 M의 α-리포익산을 24시간 및 48시간 처리한 경우에는 66.1 ±1.8 nmol/㎎ 단백질/분 및 96.7 ±4.4 nmol/㎎ 단백질/분으로, 대조군의 48.3 ±2.7 nmol/㎎ 단백질/분 및 65.0 ±1.8 nmol/㎎ 단백질/분에 비해 유의하게 증가하였다(각각, p<0.05 및 p<0.001, 도 2의 b).

<실시예 4> 사람 말초혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell ; hPBMC)와 사람 골수기질세포의 동시 배양

<4-1> hPBMC의 배양

건강한 사람의 말초 혈액으로부터 단핵세포를 추출하였다. 말초 혈액을 RPMI 1640(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)과 1:1로 희석한 후, 피콜/하이파크(Ficoll/Hypaque)에 넣고 30분간 400 g로 원심분리한 다음, 경계면을 RPMI 1640으로 3번 세척하였다. 분리된 단핵세포(2 x 10⁶ 세포/웰)을 20% 말혈청(horse serum)을 포함하는 α-MEM과 M-CSF(Sigma) 2 ng/㎖ 혼합액에서 부유시킨 후, 12-웰 플레이트(Falcon 3503, Becton Dickinson)에서 하루동안 배양하였다. 이후, 부유된 세포를 제거하고, α-MEM으로 세척한 후, M-CSF(50 ng/㎖)와 30 ng/㎖의 용해성 RANKL(Insight Biotechnology, Wembley, Middlesex, United Kingdom)을 처리하여 배양하였다.

<4-2> hPBMC과 hBMSC의 동시 배양 및 TRAP 염색

실시예 <2-1>에서 분리된 사람 골수 기질세포와 실시예 <4-1>에서 분리된 사람 말초혈액 단핵세포의 동시 배양은, 말초혈액 단핵세포가 배양된 12-웰 플레이트에 골수 기질세포(2 x 10⁵ 세포/웰)를 첨가한 후, 10^-7M 1,25(OH)₂D₃, 2 ng/㎖ M-CSF, 20% 말혈청을 포함한 α-MEM에서 5~7일간 배양하였다. 상기 배양후, 프로나제 E(pronase E)(0.002% 프로나제, 0.02% EDTA)를 5분간 처리하였다.

이후, 남아 있는 세포에 타르트레이트-내성 산 포스파타제(Tartrate-resistant acid phosphatase ; TRAP) 염색을 수행하였다. 배양웰(Culture well)에 남은 세포를 3% 포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포를 상온에서 20분간 아세테이트 버퍼(0.1 M 소듐 아세테이트, pH 5.0), 나프톨(naphthol) AS-MX 포스페이트, 붉은보라 LB 염(red violet LB salt) 및 10 mM 소디움 타르트레이트(sodium tartrate)(Sigma, St. Louis, MO)를 처리한 후, TRAP 염색 유무를 관찰하였다. 이때, TRAP 양성인 세포는 진한 적색을 띄게 되므로, TRAP 염색에서 3개 이상의 핵이 염색되는 세포를 성숙한 파골세포로 간주하였다.

그 결과, 5일 동안 5 x 10^-5 M, 10^-4 M, 2.5 10^-4 M 및 5 10^-4 M의 농도로 α-리포익산을 처리하였을 경우, 대조군(270 ±33 세포/웰)에 비해 성숙한 파골세포의 개수가 각각 198 ±17 세포/웰, 170 ±15 세포/웰, 120 ±35 세포/웰 및 35 ±5 세포/웰로 용량-의존적으로 감소함을 관찰할 수 있었으며(p<0.01, 도 3의 a), 7일 동안 배양하여 비교하였을 때에는 더욱 현저한 용량-의존적 감소를 관찰할 수 있었다(p<0.001, 도 3의 b).

<4-3> hPBMC의 파골세포로의 분화과정 중 hBMSC와의 동시 배양 및 TRAP 염색

한편, 골수기질세포와 말초혈액 단핵세포의 동시 배양에서 관찰된 α-리포익산에 의한 파골세포의 감소가, 골수기질세포를 통한 2차적 영향인지 아니면 직접적으로 단핵세포의 분화를 억제하여 발생한 것인지 여부를 알아보기 위하여, 사람 말초혈액 단핵세포를 M-CSF와 용해성 RANKL을 이용하여 파골세포로 분화시키면서 α-리포익산을 처리한 뒤, hBMSC와 동시 배양하면서 그 변화를 관찰하였다.

그 결과, 5일 동안 5 x 10^-5 M, 10^-4 M, 2.5 x 10^-4 M 및 5 x 10^-4 M의 α-리포익산을 처리하였을 경우, 성숙한 파골세포는 대조군(176 ±12 세포/웰)에 비해 각각 48 ±5 세포/웰, 23 ±6 세포/웰, 8 ±1 세포/웰로 용량-의존적으로 감소하였으며(p<0.001), 5 x 10^-4 M의 농도에서는 전혀 관찰되지 않았다(도 4). 즉, α-리포익산이 직접적으로 말초혈액 단핵세포가 파골세포로로 분화하는 과정에 직접 관여하여 파골세포로의 분화를 억제한 것임을 알 수 있었다.

<실험예 5> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체-부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 α-리포익산을 400 mg/kg의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명의 α-리포익산은 모두 랫트에서 400 mg/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 400 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다(Packer, L. et al., Free Radic Biol Med., 19: 227-250, 1995).

상기에서 살펴본 바와 같이, α-리포익산 또는 디하이드로리포익산은 조골세포 계열세포의 분화 및 기능을 촉진하여 골형성을 증진시키고, 파골세포로의 형성은 억제하여 골흡수를 억제하는 효과를 모두 가지고 있다. 따라서, α-리포익산 또는 생체내 전환 물질인 디하이드로리포익산은 폐경기 후에 발생하는 골다공증, 노화 과정에서 발생하는 골다공증 및 만성 염증성 질환에 의한 골다공증의 예방제 또는 치료제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 건강식품으로도 응용될 수 있다.

Claims

화학식 1로 표기되는 α-리포익산(α-lipoic acid) 또는 화학식 2로 표기되는 디하이드로리포익산(dihydrolipoic acid)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 또는 치료용 약학 조성물.

<화학식 1>

<화학식 2>
제 1항에 있어서, 칼슘, 비타민 D 및 식물성 에스트로겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 α-리포익산 또는 디하이드로리포익산은 체중 1 ㎏당 5 ~ 100 ㎎으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
알파 리포익산 또는 디하이드로리포익산을 이용하여 세포 생존능의 저하 없이 골수 기질세포(bone marrow stroma cell)가 조골세포(造骨細胞, osteoblast)로 분화하는 과정을 촉진하는 조골세포 분화 촉진제.
제5항에 있어서, 상기 골수 기질 세포 주변 세포외 공간의 알파-리포익산 또는 디하이드로리포익산 농도는 0.01 mM에서 1 mM인 것을 특징으로 하는 조골세포 분화 촉진제.
알파 리포익산 또는 디하이드로리포익산을 이용하여 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)가 파골세포(破骨細胞, osteoclast)로 분화하는 과정을 억제하는 파골세포 분화 억제제.
제7항에 있어서, 상기 말초 혈액 단핵세포 주변 세포외 공간의 알파-리포익산 또는 디하이드로리포익산 농도는 0.01 mM에서 1 mM인 것을 특징으로 하는 파골세포 분화 억제제.