KR100518214B1 - 항암제, 면역기능강화제 및 간기능 강화제용 초석잠 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 초석잠 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 항암활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물, 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물 및 활성산소 소거 활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 초석잠 추출물은 항종양활성, 면역증강 활성 및 활성산소 소거 활성을 가짐으로써 항암제, 면역증강제 및 항산화제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암제, 면역기능강화제 및 간기능 강화제용 초석잠 추출물을 포함하는 조성물{Anticancer, immunopotentiatory and antioxidant composition containing Stachys Sieboldii extract}

본 발명은 항암활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물, 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물 및 활성산소 소거 활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이다.

암은 인간의 불치병으로 매우 광범위해서 특정 항암제가 어느 암에는 유효하다고 해도 다른 암에는 활성을 나타내지 못하기 때문에 아직까지 획기적인 항암제를 개발하지 못하고 있는 실정이다. 항암제(carcinostatis substance)는 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 화학요법제의 총칭으로서, 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하거나 항암활성을 나타내는 약제이다. 현재 암치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 크게 알킬화제, 대사길항제, 항생물질, 유사분열억제제, 호르몬제, 기타 제재의 6개의 범주로 분류로 분류되며, 이들 항암제는 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증 등의 여러 가지 부작용을 수반하는 문제점이 있어 왔다. 따라서, 이러한 인체의 부작용이 없으면서 항암효과를 높일 수 있는 항암제를 개발하는 것이 중요하다.

생체는 자기 항상성을 지키기 위해서 생체 내에 침입하는 이물질을 섭취하여 자기와 비자기를 식별해서 비자기를 생체 밖으로 배제하는 기구를 가지고 있다. 생체가 배제해야 하는 것은 세균이나 바이러스 등의 외래에서 들어온 이물질 뿐만 아니라 노폐조직이나 암화된 세포 등 자기 성분도 포함된다. 생체에는 피부, 점막 등의 장벽이나 식세포에 의한 식작용 등 비특이적인 방어기구가 있으며 이를 자연면역이라 한다. 반면에 침입한 이물질을 비자기물질로 식별하여 새롭게 획득한 이물질 배제를 위한 특이적인 방어 기구를 획득 면역이라 한다. 획득 면역은 항체를 생산하여 면역 반응을 일으키는 체액성 면역과 임파구가 직접적으로 항원과 면역 반응을 일으키는 세포성 면역으로 나누어지며 면역반응은 항원 인식에 의해 조절된다. 체액성 면역은 헬퍼 T세포가 마크로파지(macrophage) 등의 항원제시 세포의 표면에 있는 클래스 II MHC-항원 복합체를 인식하여 헬퍼 T세포가 림포카인을 분비하며, 분비된 림포카인이 B세포에 작용하여 B세포가 형질세포로 분화, 증식하여 항체를 만들게 되는 것이다. 한편, 세포성 면역은 상기와 같이 헬퍼 T세포로부터 분비된 림포카인이 킬러 T세포를 활성화시키고 활성화된 킬러 T세포가 바이러스에 감염된 세포의 클래스 Ⅰ MHC-항원 복합체와 결합하여 세포를 상해하게 되는 것이다. 면역 기능이 저하된 면역 질환으로는 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 백혈구 감소증, 홍반성 낭창, 중증 근무력증, 위축성 위염, 자가면역성 용혈성빈혈 등이 대표적이다. 면역 질환의 치료제로 국내에서 시판되는 의약품들은 알레르기 반응, 중추신경계 부작용, 소화불량, 구역, 구토, 식욕부진, 설사 등을 부작용으로 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 인체의 부작용이 없으면서 면역증강효과를 높일 수 있는 면역증강제를 개발하는 것이 중요하다.

또, 최근 노화와 성인병 질환의 원인이 활성 산소종에 기인된 것이라는 학설이 인정됨에 따라 활성 산소종을 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 구체적으로 활성 산소종을 조절할 수 있는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, 이하 'SOD'라고 약칭함), 퍼옥시다제 (peroxidase), 카탈라제 (catalase), 글루타치온 (glutathione), 등의 항산화 효소와 토코페롤 (tocopherol), 아스코르브산 (ascorbate), 카로테노이드 (carotenoid) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대해 연구가 많이 이루어지고 있으며, BHT, BHA 등과 같은 합성 항산화제도 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다 (Chang 등, 1977; Hammerschmidt 와 Pratt, 1977; Kitahara 등, 1992; Hatano 등, 1995; Masaki 등, 1995).

특히 SOD는 활성산소에 의해 자유 라디칼기를 형성할 수 있는 전구물질들의 불활성 자유 라디칼기의 생성을 억제시키거나, 자유 라디칼기를 직접 소거하여 분자상 산소에 의한 라티칼기 연쇄 반응을 차단하는 작용을 한다.

그러나 합성 항산화제는 발암성이 있는 것으로 보고되어 있고 소비자들이 기피하는 경향이 있으므로, 합성 항산화제의 사용은 점점 제한되고 있다 (Branen, 1975). 이로 인하여 천연 항산화제의 개발이 활발히 진행되어 여러 물질들이 보고되고 있으나, 현재까지 이들 천연 항산화제는 효력 및 생산 비용면 등에서 합성 항산화제를 능가하지 못하고 있다. 따라서 항산화 활성이 탁월하면서 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구된다.

초석잠(Stachys sieboldii Miq.)은 초석잠 풀의 뿌리를 제외한 식물체 전체를 지칭하는 약용식물이며, 석잠풀은 떡잎식물로서 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로서, 한국·중국 동북부·일본·시베리아 동부·캄차카반도 등지의 산과 들의 습지에서 널리 분포하고 크기는 보통 30-60cm이다. 초석잠의 땅속줄기는 옆으로 길게 벋고 흰색이며, 줄기는 곧게 서고 높이가 30∼60cm이며 횡단면이 사각형이고 모서리를 따라 밑을 향한 센털이 있다. 초석잠의 잎은 마주나고 길이 4∼8cm이며 끝이 뾰족하고 밑 부분이 둥글거나 수평이며 가장자리에 톱니모양이 있으며, 잎 양면에 털이 있고, 잎자루는 길이가 5∼15mm이며 줄기 윗부분의 잎은 잎자루가 없다. 초석잠의 꽃은 6∼9월에 연한 붉은 색으로 피고 가지와 줄기 윗부분의 마디마다 층층이 돌려나고 꽃받침은 길이가 6∼8mm이고 끝이 5개로 갈라지며, 갈라진 조각은 가시처럼 뾰족하다. 초석잠의 화관은 길이가 12∼15mm이고 입술 모양이며, 아랫입술은 다시 3개로 갈라진다. 초석잠의 수술은 4개 중 2개가 길고, 암술은 1개이다. 열매는 분열과에서 갈라진 각 열매이고 길이가 2mm이다.

초석잠은 한방에서 미열이 있고 배뇨가 곤란하며 몸이 붓는 증세에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 최근 연구에서 초석잠의 괴경에 뇌경색 또는 신염에 대해 효과적인 악티오사이드라는 성분이 함유되어 있는 것이 보고되어 있다(Joji Yamahara et al., a medicine magazine, 110, 932-935, 1990). 그러나, 아직까지 초석잠으로부터 유래된 항암활성, 면역기능강화활성 또는 항산화활성 물질에 관한 보고는 전혀 없었다.

그러므로, 이러한 문제점을 극복하고, 항암활성, 면역기능강화활성 또는 항산화활성을 지니는 천연약재를 탐색하던 중 초석잠 추출물이 강력한 항암활성, 면역기능강화활성 또는 항산화활성을 나타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 문제점들을 해결하기 위해 본 발명은 항암활성을 지니는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명은 활성산소 소거활성을 지니는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 항암활성을 지니는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공한다.

또, 본 발명은 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 활성산소 소거활성을 지니는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명의 초석잠 추출물은 초석잠에서 알콜 또는 알콜 수용액으로 추출한 초석잠 의 알콜 추출물이며, 상기 알콜 추출물은 시료 중량의 약 10배의 알콜을 첨가하여 제조하는 것이 바람직하고, 상기 알콜 또는 알콜 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol)로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으며 70~100%의 에틸알콜을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

투여 단위는, 예를 들면 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

상기 조성물에서, 초석잠 추출물의 유효용량은 10 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 20 내지 60 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 초석잠 추출물의 원료인 초석잠은 천연약재로서 안전성이 확보되어 있으며, 특히 본 발명의 초석잠 추출물을 랫트에 경구 투여, 복강 내 투여 및 피하 주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 복강 내 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 초석잠 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.

그리고, 상기 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 항암활성, 면역강화활성 또는 항산화활성을 지니는 기능성 식품 또는 식품 첨가물로 널리 이용될 수 있다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제시되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.

<실시예 1> 초석잠의 에탄올 추출물의 제조

환류 냉각관을 부착시킨 플라스크 내에 500g의 초석잠을 넣고 상기 초석잠 중량의 10배량의 75% 에탄올을 가하여 60℃의 수욕상에서 12시간동안 2회 반복 추출한 후 감압여과장치로 여과하였다. 여액을 회전식 진공 건조기(rotary vacuum evaporator, Eyela N-N-series, Japan)를 사용하여 농축하고 이를 동결건조한 후 밀봉하여 4℃의 냉장고에 보관하면서 사용하였다.

<실시예 2> 초석잠의 에탄올 추출물로부터의 항균 활성물질 분리 및 정제

초석잠의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 항균 활성을 확인한 결과 헥산 분획물이 다른 순차 분획물에 비하여 항균효과가 높아 헥산 분획층으로부터 도 1의 순서에 따라 항균활성 물질을 분리하였다. 헥산 분획물(28.5g)을 실리카겔(500g, 70∼230mesh, Merck)에 헥산 : 클로로포름：에탄올( 6 : 0.5 : 1, v/v) 용매로 현탁하여 충진된 컬럼(6.0×50cm)에 흡착시킨 후 클로로포름과 에탄올의 비율을 단계적으로 증가시키면서(5:1:2(v/v) → 메탄올) 용출시키고 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography:TLC)로 확인하여 총 7개의 소획분(F1∼F7)을 얻었고 이 중에서 항균활성과 수율이 우수한 F7 획분으로부터 다시 항균 활성물질을 분리하였다. 획분 F7(7.20g)을 헥산:클로로포름:에틸아세테이트:메탄올:초산(10:3:3:1:0.5, v/v)으로 현탁하여 충진된 실리카겔 컬럼(silica gel column; 180g, 4.0×35cm)에서 메탄올 비율을 단계적으로 증가시키면서 용출시켜 총 8개의 소획분(F7-1 ∼ F7-8)을 얻었고, 이 중에서 항균효과와 수율이 높은 F7-2(2.83g) 획분을 다시 헥산:에틸아세테이트:부탄올 (10:3:2, v/v) 용매계로 예비박막 크레마토그래피(preparative thin layer chromatography: PTLC, silica gel 60, 2mm, Merck Co.)에서 5개의 소획분을 얻었다. 이중에서 항균 효과가 인정되면서 수율과 정제도가 우수한 F7-2-5(0.25g) 소획분을 얻었다. 1, 2, 3차의 컬럼 크로마토그래피의 획분들은 감압농축 한 후 TLC 상에서 전개시킨 후 UV (254nm, 365nm)의 흡수 밴드(band)와 황산(분수) 발색시 나타나는 점적을 분취하였다.

초석잠 에탄올 추출물의 활성성분에 대한 유기용매별 수율은 표 1에 나타된 바와 같이, 물로써 추출한 경우 수율이 26.42%로 가장 높고, 헥산은 9.46% 정도이고 에틸아세테이트, 부탄올의 수율은 각각 5% 정도인 반면에 클로로포름 추출물의 수율은 4.53%로 가장 낮았다.

표 1. 초석잠 에탄올 추출물로부터 획득한 용매 분획에 대한 분획수율

용매	수율(%, w/w)
헥산	9.46
클로르포름	4.53
에틸아세테이트	5.74
부탄올	5.33
물	26.42
전체	51.48

<실험예 1> 항암활성 검사

1. 실험 동물

5-6 주령의 수컷, C57 BL/6계 마우스를 대한실험동물센타 (충북 음성)에서 구입하여 사용하였다. 온도는 20±2℃, 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다. 실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.

2.초석잠 추출물의 마우스에 대한 공급

초석잠 추출물 10 mL에 수돗물 100 mL로 희석하여 급수병에 담아 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다(케이지당 5마리). 초석잠 추출물의 공급은 21일 동안 하였으며 총량은 3g/5마리/21일이 되도록 하였다.

3. 공시세포

비장으로부터 림프구의 분리는 다음과 같이 시행하였다. 마우스로부터 얻은 비장은 Hanks' balanced salt solution(HBSS, Sigma, St. Louis, Mo)에서 두 장의 멸균된 슬라이드 글라스로 부드럽게 압착하여 림프구를 비장으로부터 유리시켰다. 이 속에 포함된 적혈구는 멸균된 림프구 증류수를 사용하여 저장성 쇼크(hypotonic shock)로 제거하며 분리된 림프구는 완전배지에 부유시켰다. 복강대식세포는 윤(Yoon 등)의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강 내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3일 후, 1% 태아 송아지 혈청(fetal calf serum, FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린(100 μg/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 첨가된 10mL HBSS(칼슘 및 마그네슘 무첨가)를 이용하여 복강 삼출세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 37℃에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산 완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 2.5mM 피로포스페이트(pyrophosphate)와 고무 폴리스만(rubber policeman)으로 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암 세포주로는 마우스 유방암(mouse mammary carcinoma) 세포(FM3A/S), 마우스 백혈병(mouse leukemia) 세포(P388/S), 인간 조직구성 임파종(human histocytic lymphoma, U937/S)을 사용하였다.

4. 암세포 및 정상 면역 세포의 증식에 미치는 영향 측정

상기에서와 같이 준비한 세포를 flat bottomed 96 well plate 의 각 웰에 분주한 다음 여기에 여러 농도의 초석잠 추출물을 가하여 총량이 0.2 mL씩 되도록 조정하고 37℃ 5% CO₂배양기에 넣고 72시간 배양하였다. 이 때 배양세포의 ³H-싸이미딘(³H-thymidine, specific activity: 2.0 Ci/mmol, ICN Biomedicals, High Wycombe, Bucks, England)은 0.5μCi의 ³H-싸이미딘을 각 웰에 배양종료 18시간 전에 가하여 실시하고, ³H-싸이미딘 코아퍼레이션의 측정은 세포수확기(cell harvestor)로 glass fiber에 세포를 수확한 후 β-카운터(β-counter)를 이용하였다.

비장 세포 및 암세포를 배양하면서 배양초기에 초석잠 추출물를 첨가한 후 각 세포의 증식양상을 측정한 결과는 표 2과 같다. 초석잠 추출물의 농도 증가에 따라 증식능이 비장세포의 경우 현저하게 증가하였으나 암 세포주에서는 그 증식능이 다소 억제됨을 알 수 있었다. 초석잠의 핵산 추출물이 각종암세포에 대한 억제작용을 가질 수 있음을 시사하였으며, 아울러 생체의 면역계가 다른 생체기관들과 상호 유기적으로 연관되어 있음을 고려할 때 초석잠 추출물이 면역반응 조절자(immuno response modifier)로서의 작용 가능성도 고려된다. 표 2에서 초석잠 추출물이 림프구의 증식반응에 미치는 영향을 살펴 본 바, 비장세포의 증식이 어느 정도 항진되었다. 이는 초석잠 추출물이 T 또는 B 세포를 선택적으로 증식시키는 폴리클로날 활성(polyclonal activity)로서의 작용할 수 있음을 시사한다고 하겠다.

표 2. 비장 세포 및 암세포의 증식에 관한 초석잠의 효과

Stachys Sieboldii (㎍/㎖)	CPM(count/minute)
	비장세포	FM3A/S	P388/S	U937/S
0	3081	6769	6564	6790
250	100,134	5230	4401	4875
500	100,360	3890	3843	2330
1000	3864	1060	1034	979

5. 암세포에 대한 세포독성 측정

MTT를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다. MTT를 PBS용액에 5 mg/mL의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 4℃의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다. 배양중인 마이크로플레이트(microplate)의 각 웰(well)에서 상층의 배지를 조심스럽게 160 ㎕씩 첨가하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 웰에도 MTT 희석액을 가해 주었다. 37℃, 5% CO₂에서 4시간 배양한 후 상층의 배지를 제거하여 세포 손실을 막기 위해 약 40㎕ 정도는 남겼다. 각 웰에 100 ㎕의 DMSO를 가한 후 실온에서 플레이트 셰이커(plate shaker)로 약 20-30분간 흔들어 준 다음 엘라이자 리더(ELISA reader, Micro plate EL311)를 사용하여 570 ㎚ 및 650 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 웰을 블랭크(blank)로 하고 650 ㎚는 비교치로서, 570 ㎚에서 측정한 값을 650 ㎚에서의 측정치를 감하고 이 값을 결과치로 사용하여 헥산, 아세톤, 에틸 에테르, 메탄올 및 물로써 추출한 용액들이 항암제의 세포독성에 어떠한 변화를 줄 수 있는가를 조사하였다.

초석잠 추출물을 비장세포 배양초기에 첨가하고 48시간에 세포 생존율을 검사한 결과 표 3에 나타내었다. 비장세포의 생존율은 암세포에 대한 세포 독성과 관련된다. 직접적인 세포독성활성(direct cytotoxic activity)을 관찰할 수 없었다. 또한 마우스 림프종 세포(lymphoma cell)의 증식반응은 억제되었는데 이러한 차이는 트립판 블루 염료 배제법(trypan blue dye exclusion)에 의한 세포 생존검사로 확인한 결과(표 3), 초석잠 추출물이 각 세포에 대한 직접적인 세포 독성의 차이에 기인하지는 않는 것으로 생각된다.

표 3. 비장세포 생존에 관한 초석잠의 효과

Stachys Sieboldii(㎍/㎖)	Viability(%)
	FM3A/S	P388/S	U937/S
0	46.8	46.6	47.2
100	52.8	50.9	53.8
250	48.6	48.7	50.7
500	51.4	46.0	50.2
1000	43.9	40.4	46.3

6. 흑색종 세포(B16F10)의 폐전이 실험

본 실험에 공시한 암세포주는 B16F10 마우스 흑색종 세포(Tumor Repoitory of the National Cancer Institute, Bethesda, MD)로서 10 % 소태아혈청, 소디움 피루베이트(sodium pyruvate), 비필수 아미노산(nonessential amino acids) 및 L-글루타민(L-glutamine)이 함유된 RPMI1640 배지에 유지하였다. 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 0.05 % 트립신-0.0 2% EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포(2×10⁵)를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 초석잠 추출물 투여군에서 대조군에 비하여 B16F10 세포의 폐전이는 수적으로 감소하였으며 전이된 암세포 집락의 크기도 초석잠 추출물 투여군에서 현저하게 작아 초석잠 추출물이 암세포의 전이 뿐만 아니라 일단 전이된 암세포의 증식도 억제함을 알 수 있었다.

<실험예 2> 면역활성 검사

1. T 세포 아형

T 세포 아형의 구성비는 phycoerythrin(PE)-conjugated rat anti- mouse CD4(L3T4) mAb와 FITC conjugated rat anti-mouse CD8(Ly-2)mAb를 이용하고 IL-2 수용체는 FITC-cojugated rat anti-mouse CD25 mAb를 이용하여 제조회사의 설명에 따라 분석하였다.

비장세포는 FITC-anti Lyt2 mAb 및 phycoerythin-anti L3T4 mAb로 염색되었다. CD4 및 CD8 세포의 듀얼 파라미터 다이렉트 면역형광은 플로우 싸이토메트리에 의해 분석되었다. 초석잠 추출물의 투여는 실험예 1과 동일하다.

표 4는 마우스에서 비장의 T 세포 아형에 관한 초석잠 투여 효과를 나타낸 것으로, 정상군에 비하여 초석잠 추출물 투여군의 경우에 CD4⁺ T세포 및 CD8⁺ T세포의 비율이 증가하였다. 그러나 CD4⁺/CD8⁺ 비는 양군간의 차이를 관찰할 수 없었다. 초석잠 추출물을 마우스에 투여한 후 비장세포의 T 세포 아형의 변화에서는 헬퍼 T(CD4⁺) 세포 및 써프레서(suppressor) T(CD8⁺) 세포의 증가는 보였으나 CD4⁺ /CD8⁺ T 세포의 비는 변하지 않았으며, IL-2 수용체의 발현은 항진되었는데 이는 시험관내 활성 뿐만 아니라 생체내에서도 면역계를 활성화시킬 수 있음을 보여준다.

표 4. 마우스에서 비장의 T세포 아형에 관한 초석잠 투여의 효과

	Percent of single positive cells
	CD4+CD8-(L3T4+)	CD4-CD8+(Lyt2+)	Ratio of CD4+/CD8+
Normal control	20.4	5.5	4.3
Stachys Sieboldii-fed	30.2	7.4	4.7

2. 대식세포에 의한 나이트릭 옥사이드(Nitric Oxide, NO)생산 측정

탐식기능이 있는 단핵탐식세포계 세포를 활성화 시킬 수 있는 세포가 생산하는 림포카인들의 자극을 받으면 탐식세포는 수퍼옥사이드(superoxide)나 하이드로겐 퍼옥사이드(hydrogen peroxide)와 같은 활성산소 중간물질(reactive oxygen intermediate:ROI)이나 NO와 같은 활성질소 중간물질(reactive nitrogen intermediate:RNI)을 생성하여 탐식한 세포내 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제한다. NO는 산화를 통하여 효소의 작용을 조절하고 혈소판의 기능과 신경전달기능 및 림프구 증식을 변화시켜 암세포와 미생물에 대한 대식세포의 세포독성을 매개한다.

복강대식세포를 세포배양판에 5×10⁵/mL의 세포가 되도록 재부유하여 IFN-γ (10 U/mL)와 LPS (1 ㎍/mL)의 자극하에 48시간 배양하고 그 배양 상청액 내의 NO를 그리스(Griess)반응에 의해 측정하였다. 즉 100 uL의 배양 상청액에 1% sulfanilamie(30% acetic acid)와 0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride(60% acetic acid) 혼합액 100 uL를 가하여 실온에서 방치하였다. 20분 후 ELISA 판독기 (Bio Tek Instruments Inc, model EL311 SL)를 사용하여 800 ㎍/mL의 유지 농도에서 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

복강 대식세포로부터의 NO의 생산능에 미치는 초석잠 추출물의 영향을 측정한 결과, 표 5와 같이 초석잠 추출물은 NO 생산을 약간 자극하였다.

표 5. 정상 마우스 복강 대식세포로부터 아질산 생성

Stimuli	NO2 - concentration (uM)
Media only Stachys Sieboldii LPS(1 ㎍/mL)+γ-IFN(10U/㎖)LPS(1 ㎍/mL)+γ-IFN(10U/㎖)+Stachys Sieboldii(500 ㎍/mL)	12±0.428±0.638±0.337.3±0.4

또한, 하기의 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, NO 생산에 대한 초석잠 추출물의 최적 자극농도는 250 ㎍/mL이었다.

표 6. 다양한 농도의 초석잠으로 유도된 복강 대식세포로부터 아질산 생성

S. Sieboldii(㎍/㎖)	NO2 -concentration(uM)
0	4.57±0.3
50	12.4±0.2
250	16.0±0.1
500	22.0±0.2
1000	17.0±0.2

3. 종양괴사인자(Tumor necrosis factor)의 역가 측정

TNF-α는 활성화된 대식세포로부터 생산되는 물질로서 특정 암 세포주에 대한 세포 독성과 항바이러스 작용이 있고 급성 및 만성 염증 질환에서 일어나는 생체반응에도 중요한 역할을 하는 사이토카인이다.

마우스에서 TNF-α생성에 대한 초석잠 용액 투여의 효과를 확인하기 위해, 초석잠 투여군은 21일 동안 수도물에 초석잠 추출물 용액을 주입하였다(3g/200mL/5 마우스). 마우스 모든 군은 심장천자에 의해 희생되었다. 혈청이 준비되고 엘라이자 리드에 의해 TNF-α에 관한 분석이 수행되었다. TNF-α의 측정은 엘라이자 키트(ELISA kit, Genzyme, Boston, MA)를 사용하여 시행하였다. 즉 24시간동안 항 TNF 항체를 96well plate에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 100 uL를 넣고 1시간 동안 96 well plate에서 반응시켰다. Tween 20이 10%가 되게 첨가된 인산완충액(PBS)으로 세척 후 90분 동안 항 TNF 단세포군 항체와 반응시켰다. 이를 세척한 후 60분 동안 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 항 IgG 항체를 반응시키고 다시 세척한 다음 ο-페닐렌 디아민(orthophenylene diamine)용액을 15분간 반응시켰다. 0.5N HCl용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 TNF용액을 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 및 50pg/㎖의 농도로 조절하여 함께 측정하고 표준용액에서 측정된 흡광도를 근거로 polynomial standard regression curve를 작성하고 작성된 곡선방정식을 기준으로 검체내에 포함된 TNF의 양을 구하였다.

마우스에서 TNF-α생성에 대한 초석잠 용액 투여의 효과는 도2에 나타나 있다. 즉, TNF-α 농도는 각각 정상군이 262 pg/mL이고, 초석잠 투여군이 443 pg/mL를 나타내었고 따라서, TNF-α 생산도 어느 정도 항진시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다. 또한, 초석잠 추출물이 기회성 진균인 C. neoformans의 제거능에 미치는 영향을 실험한 결과 초석잠 추출물 급식 마우스의 장기로부터의 C. neoformans의 검출이 감소하였다.

<실험예 3> 항산화 활성 검사

1. 실험 동물 및 사료 조성

본 실험에 사용된 스프라그-돌리(Sprague-Dawley, SD)계 수컷 랫트는 화학 연구소에서 분양받아 2주 이상 실험 사육장의 환경에 적응시킨 후 7마리씩 4군으로 나누어 삼양 유지의 기본사료(control group)로써 사육하면서 초석잠의 농축액을 SD계 랫트에 하루 200 및 500 mg/kg씩 각각 사료에 첨가하여 사육하였다. SD 수컷 랫트는 몸무게 200∼220 g의 암컷, 8주령 되는 것을 사용하였고, 동물 사육실은 항온 항습 (22±2℃, 65±2% RH)하에서 삼양유지의 마우스용 펠렛 사료를 주었으며, 물은 자유롭게 먹게 하고, 12시간 주기의 조건하에서 실험하였다.

2. 슈퍼옥사이드 디스뮤다아제(SOD) 활성 측정

생체의 대사 과정에서 발생하는 유해 산소 종의 하나인 슈퍼옥사이드(superoxide, O₂ ^-)는 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD)에 의하여 소거된다.

SOD의 활성 측정은 프리도빅(Fridovich) 방법에 준해서 측정하였다. 잔틴/잔틴 옥시다아제(Xanthine/xanthine oxidase) 반응으로 생성된 슈퍼옥사이드 음이온에 의해 싸이토크롬 c(cytochrome c)가 환원되는 것을 측정하였고, SOD에 의하여 슈퍼옥사이드 음이온의 양이 감소하여 싸이토크롬 c의 변화속도가 감소하는 것으로 SOD 활성을 측정하였다.

시아노크롬 c(Cyochrome c) 38 mg, 2μM 잔틴 10 mL(0.001N NaOH), 50 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.8, 0.1 mM EDTA)100 mL를 혼합한 기질액 2 mL에 희석한 시료를 넣고 2분간 안정화 시킨 후 잔틴 옥시다아제(0.2 unit/mL, 0.1mM EDTA) 50 μL를 큐베트(cuvette)에 넣고 혼합하여 분광광도계(UV-2100, Shimagu co. Japan)를 이용하여 550 nm에서 2분간 흡광도를 측정하였다.

초석잠의 SOD 유사 활성을 표 7에 나타나 있다. 즉, 초석잠의 SOD 활성을 확인하기 위하여 항산화 활성이 높은 것으로 알려진 플라보노이드인 쿼세틴(quercetin) 및 녹차의 카테친(catechin)과 비교한 결과, 초석잠 추출물은 쿼세틴보다는 약간 낮았으나 녹차의 카테친보다는 높은 항산화 활성을 나타내었다.

표 7. SOD 활성이 강한 물질과 초석잠 에탄올 추출물의 SOD활성 비교

(unit /mg, protein)

DMSO	0
카테친 (catechin) (50 ㎍/mL)	50.06±0.10
쿼세틴 (quercetin) (50 ㎍/mL)	60.37±2.40
초석잠 추출물 (50 ㎍/mL)	54.53±2.60

4. 생체외 지질과산화 측정

1) 랫트의 간 마이크로좀 분획의 조제

랫트의 간을 0.15 M KCl로 관류(perfusion)한 후 적출하여 잘게 자른 후 미리 냉각시킨 4배 용량의 완충 용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 넣고 균질기를 이용하여 조직을 균일화하였다. 이것을 8,000×g로 15분간 원심 분리한 후 상등액을 다시 10,000×g로 20분간 원심분리하여 절편을 제거하였다. 1시간 원심 분리한 후 침강한 침전을 균질화 용액에 현탁 시키고 100,000×g로 다시 한번 원심 분리하여 침강한 침전을 마이크로좀 분획으로 분취하였다. 조제한 이들 분획의 단백질을 정량하고 -70℃에서 냉동 보관하여 사용하였다.

2) 철/아스코르베이트계 (Fe/ascorbate system)에서 항산화 활성 검토

50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.5) 1.6 mL에 초석잠 추출물 0.1 mL, 간 마이크로좀 분획(1mL 중 1 mg의 단백질 함유) 0.1 mL, 0.1 mM 아스코르베이트 0.1 mL, 5 mM FeSO₄ 0.1 mL를 차례로 가하여 반응액을 조제하였다. 과산화물 값(Peroxide value, POV) 측정을 위해 리놀레인산(linoleic acid)을 기질로 사용하여 노스(Nose)의 방법에 따라 POV를 측정하였다. 리놀레인산(Linoleic acid) 100㎕와 각 시료(5 mg/mL) 10㎕를 1.6cm×6cm의 시험관에 넣어 50℃ 항온기에서 24시간 저장하여 산화를 촉진시킨 후 클로로포름/아세트산(2:3, v/v) 35 ml를 첨가하고 1분간 격렬하게 혼합한 후 암소에서 5분간 방치시키고, 여기에 증류수 75 mL와 전분 시액 1 mL를 첨가하고, 0.01N 소듐 치오설페이트(sodium thiosulfate) 용액으로 요오드를 역적정하여 POV를 측정하였다.

철/아스코르베이트계로 유도된 과산화지질에 대한 POV에 대한 초석잠 추출물의 억제효과는 표 8과 같다. 즉, 과산화지질은 대조군의 POV가 1245.2 meq/kg에 대하여 초석잠은 POV가 182.2 meq/kg으로 대조군에 비하여 85.4 %의 억제 효과를 나타내었고 현재 사용되고 있거나 알려진 항산화제로서 대조구인 카테친의 경우는 85.0 %의 억제율을 나타내었고, 쿼세틴은 86.4 %의 억제율을 나타내었다. 따라서, 초석잠의 경우 항산화제로 알려진 카테친 및 쿼세틴과 유사한 지질과산화 억제 효과를 나타낸다.

표 8. 랫트 간의 마이크로좀에서 철-아스코르베이트계에 의한 과산화 지질에 대한 초석잠 추출물의 효과

샘플	POV (meq/kg)	Inhibition (%)
대조군	1,220.2	-
카테친 (50 ㎍)	186.0	85.0
쿼세틴 (50 ㎍)	174.3	86.4
초석잠 추출물 (50 ㎍)	180.2	85.4

5. 사염화탄소에 의한 유발된 지질과산화에 관한 항산화 활성 검토

CCl₄는 씨토크롬에 의해서 C-Cl 결합이 깨어지면서 트리클로로메틸 라디칼(trichloromethyl radecals)을 생성하고 O₂와 반응하여 트리클로로메틸 퍼옥시 라디칼(trichloromethyl peroxy radicals)을 생성한다. 이렇게 생성된 라디칼은 세포막의 인지질인 폴리에노익 지방산(polyenoic fatty acid)의 메틸 카본(methyl carbon)을 공격하여 과산화 지질을 야기하여 간세포를 괴사시킨다.

랫트 1군을 7마리로 하여 두 군은 2주간 시료를 200 mg/kg, 500 mg/kg씩 생리식염수에 녹여서 경구 투여하였고, 두 군은 검액 대신 생리식염수를 투여하였다. 투여 마지막 날 미리 6시간 절식시키고 옥수수 오일에 용해시켜 CCl₄ 0.4mL/kg씩 경구 투여하였다. 검액은 투여하지 않고 CCl₄ 만 투여하여 양성 대조군으로 하였고, CCl₄ 및 검액을 투여하지 않고 옥수수 오일만 투여하여 정상군으로 하였다.

1) 지질과산화 함량 측정

상기의 간 마이크로좀 분획의 균질액에 10 % 소듐 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate) 용액을 첨가하고 실온에서 30분간 방치한 다음 0.1 M HCl과 0.37 % 티오바뷰티릭산(thiobarbituric acid) 용액을 가한 후 혼합액을 끓는 물에서 45분간 반응시킨 후, 냉각하여 부칠 알코올를 가해 혼합하고 1,000×g에서 원심분리한 후 상층의 부칠 알코올 층을 532nm에서 흡광도를 측정하였고, 테트라메톡시프로판(tetramethoxypropane)을 표준액으로 사용하여 MDA량을 정량하였다.

실험동물인 랫트에 사염화탄소(CCl₄)를 처리하여 간에 과산화 지질을 유발시킨 후 SOD의 활성을 측정한 결과는 도 4 에서 도시된 바와 같다. 즉, 정상 사육한 대조군의 SOD 활성은 25.0±3.00U/mg 단백질, CCl₄ 처리군은 10.64±1.52 U/mg 단백질이었다. 59 %정도의 활성이 높았으나, 초석잠을 200 mg/kg 첨가군에서 16.02±2.04 U/mg 단백질로 CCl₄ 처리군에 비하여 40 % 증가하였으며, 500 mg/kg 첨가군에서는 22.48±2.32 U/mg 단백질로 50.73%의 증가로 1% 수준에서 유의성이 인정되었다. 따라서, 초석잠 추출물은 사염화탄소로 유도된 과산화 지질을 억제한다.

2) 카탈라아제 활성 측정

과산화수소를 기질로 하여 과산화수소를 소모하는 속도를 측정하여 간 마이크로좀의 카탈라아제 활성을 측정하였다. 30% 과산화수소(hydrogen perxide) 30 μL를 0.05 M 인산 칼륨 버퍼 5mL(pH 7.0)에 녹여서 기질로 사용하였고, 효소로 간 마이크로좀 분획을 100배 농도로 희석하여 사용하였다. 0.05 M 인산 칼륨 버퍼(pH7.0) 570 μL, 기질 330 μL와 효소원으로 간 균질화물 희석액 100 μL를 넣고 혼합한 후 240nm에서 10초간격으로 40초간 흡광도를 측정하였다.

마이크로좀 분획에 존재하는 카탈라아제 활성에 대한 초석잠의 영향에 관하여 도 5에서 도시한다. 즉, 정상 사육한 대조군의 카탈라아제 활성은 20.56±2.34 U/mg 단백질였으나, CCl₄ 처리군에서는 9.64±2.03 U/mg 단백질로 CCl₄ 대조군에 비하여 58.5% 감소하였으나 초석잠 200 mg/kg 첨가군에서는 14.06±1.14 U/mg 단백질로 CCl₄ 처리군에 비하여 31.94 % 증가하였고 500 mg/kg 첨가군에서는 18.15±1.37 U/mg 단백질로 40.98 %의 증가를 나타내어 유의성이 있었다.

3) 글루타치온 퍼옥시다아제의 활성

간의 시토졸 획분에서 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase : GSHPx)의 활성의 측정하였다. 시험관에 시토졸에 인산완충용액(0.3 M phosphate buffer with 4.0 mM EDTA, pH 7.2) 0.1ml, 증류수 1,295 ml, 26.56 mM 소듐 아자이드(sodium azide) 용액 0.5 ml, 294.37 mM GSH용액 60 ul, 8.4 mM NADPH (35.0 mg NADPH/5.0 ml of 0.3 M phosphate buffer with 4.0 mM EDTA)110 ul, 글루타치온 환원효소(glutathione reductase) 5 ml, 1 mM hydroperoxide 320 ul를 첨가하여 5초간 잘 혼합한 후, 분광광도계를 사용하여 340 nm에서 흡광도를 15초 간격으로 2분간 측정하여 표준검량선에 의해 GSHPx (IU/g protein)의 활성을 계산하였다.

글루타치온 퍼옥시다제(glutathion peroxidase)의 활성에 대한 초석잠의 영향에 관하여 도 6에서 도시한다. 대조군에서는 10.20±0.23 IU/g 단백질이였으나, CCl₄ 처리군에서는 2.48±0.13 IU/g 단백질로 대조군에 비하여 77.0% 감소하였다. 그러나 초석잠을 200 mg/kg 투여한 경우 5.20±0.16 IU/g 단백질로 대조군에 비하여 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathion peroxidase)의 활성이 23.54% 증가하였고, 500 mg/kg 투여군에서는 9.04±0.24 IU/g 단백질로 35.03% 증가하였다.

<실험예 4> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 초석잠 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏, 5 g/㎏ 및 10 g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 초석잠 추출물은 랫트에서 10 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD₅₀)은 실시예 1에 따라 조제된 초석잠 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 정제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 초석잠 에탄올 추출물 100.0 mg, 옥수수전분 90.0 mg, 유당 175.0 mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0 mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0 mg 및 에탄올 적량의 원료를 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8 mg을 가하여 혼합한 후 1정이 400mg이 되도록 타정하였다.

<제제예 2> 캅셀제의 제조

실시예 1에 따라 제조된 초석잠 에탄올 추출물 100.0 mg, 옥수수전분 83.2 mg, 유당 175.0 mg 및 스테아린산 마그네슘 1.8 mg의 원료를 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360mg이 함유되도록 충전하였다.

본 발명은 초석잠 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 항암활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물, 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물 및 활성산소 소거 활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화제 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 초석잠 추출물은 뛰어난 항종양활성, 면역증강 활성 및 활성산소 소거 활성을 가지고 있기 때문에 의약용 항암제, 면역증강제 및 항산화제로 유용하게 이용될 수 있을 뿐 아니라 건강식품으로도 이용될 수 있고, 상기 조성물은 천연약재의 추출물이므로 그 안정성이 매우 높다.

도 1은 초석잠으로부터 얻은 항균화합물의 분리흐름도를 나타내고,

도 2는 마우스에서 정상군 및 초석잠 추출물 투여군의 TNF-α생성의 정도를 나타내고,

도 3은 초석잠 추출물 투여군의 21일 동안 폐 콜로니 형성 억제를 나타내고,

도 4는실험 랫트에 사염화탄소(CCl₄)를 처리하여 간에 과산화지질을 유발시킨 후 SOD의 활성을 측정한 것이고,

★ : p<0.05, 정상군과 유의성있게 차이남

★★: p<0.05, CCl₄ 처리군과 유의성있게 차이남

도. 5는 초석잠을 랫트에 2주일간 투여한 후 랫트 간의 마이크로좀 분획에 존재하는 카탈라아제 활성을 비교한 결과를 나타내고,

★ : p<0.05, 정상군과 유의성있게 차이남

★★: p<0.05, CCl₄ 처리군과 유의성있게 차이남

도 6은 초석잠 추출물을 사료에 첨가하여 2주간 사육한 후 글루타치온 퍼옥시다제(glutathion peroxidase)의 활성을 측정한 것이고,

FS .: 발효콩

★ : p<0.05, 정상군과 유의성있게 차이남

★★: p<0.05, CCl₄ 처리군과 유의성있게 차이남

Claims (3)

1. 항암활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물.
2. 대식세포의 활성을 증강시키는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역기능강화제 조성물.
3. 활성산소 소거 활성이 있는 초석잠 추출물을 유효성분으로 함유하는 간기능 강화제 조성물.