KR100488054B1 - 표적분자 결합장치 - Google Patents

Abstract

현미경으로 관찰하기 위해 생물학 샘플을 지지하기 위한 강체 패널 칩에서, 상기 채널 칩(10)은 상단의 평면(12), 하단 베어링 평면(14), 상기 상단에서 하단 표면으로 서로 평행하게 연장된 최소한의 채널(18)을 형성하는데, 상기 채널은 상기 생물학 샘플의 진입에 대해서 상단접근 입구(18a)를 형성하는데 있어서, 각각의 상기 채널은 상기 상단 평면에 대해서 수직인 축에 대해 예각을 만들도록 비스듬하게 기울어지고(18), 각각의 상기 채널은 유체를 저장하고 있는 생물학 샘플의 점성을 통해 흐르는 유동을 수용하는 내부 직경을 갖는다.

Description

표적분자 결합장치{DEVICE FOR BINDING A TARGET MOLECULE}

본 발명은 유생분자(biomolecule) 화상분석을 위한 다중 마이크로채널 칩과 그 활용 방법에 관련되는데, 특히 각각의 유생분자 테스트를 위한 일정한 테스트 환경을 제공할 뿐만 아니라 동시에 매우 많은 유생분자 테스트를 수행할 수 있는 마이크로채널 칩 장치를 제공하는데 관련되며, 변이체를 테스트하기 위해 통계적 테스트를 고려하지 않는다.

유체역학에서 대개는 물인 유체를 포함하는 생물학 샘플의 점성 때문에, 이러한 유체를 통과하고 다중 채널 유리패널 안으로 들어가기 위한 동적압력은 마이크로채널 직경이 줄어들수록 증가하고 유리플레이트 두께는 증가한다. 문턱값은 채널의 직경에 10 마이크로미터 이하에서 진공압력이 증가하는데 물이 마이크로패널을 통과하도록 하는데 필요하며 또한 유리 샘플의 구조적인 상태가 문제가된다. 그러나, 반면에 채널직경을 10 마이크론 이상 증가시키고 유리플레이트의 두께를 줄여서, 진공압력은 여전히 필요하지만 줄어든 범위 만큼이며, 원치 않는 인공물(artifact)은 특히 채널의 상단 접근입구(top access mouth) 주위에 증가된 확산할로(diffuse halo)에 발생된다. 이러한 원치않는 인공물 할로(artifact halo)는 화상의 품질과 테스트의 민감도를 상당히 저하시킨다.

마이크로채널의 유체역학은 물이 채워진 커피머그잔 같이 직경이 넓은 튜브와 같이 않다. 사실 커피머그잔의 넓은 내부직경으로 인해서, 물이 채워진 커피머그잔이 수직에서 측면으로 기울어질 때, 물의 부피에 대한 상단표면 메니스크(menisk)는 동시에 기울어지지 않을 것이므로, 머그잔의 종축이 기울어진 상태로 더 이상 수직이 아님에도 불구하고 양 사례의 경우에서 바닥과 평행하게 유지될 것이다. 반면에, 물의 점성과 표면장력 그리고 극미채널의 마이크로미터 단위의 직경 때문에, 마이이크로 채널이 수직상태에서 측면으로 기울어진 상태로 기울어질 때, 메니스크는 커피머그잔 같이 직경이 넓은 실린더에서처럼 바닥과 평행한 상태가 유지되지 않을 것이며, 기울어질 것이다. 기울어진 마이크로채널로, 기울어진 마이크로채널 내에서 물의 체적의 상단표면 메니스크에 대한 수직축이 기울어진 마이크로채널의 종방향 축과 공동축으로 남을 것이다.

휴스턴 어드밴스드 리서치 센터(HOUSTON ADVANCED RESEARCH CENTER)에 허여된 미국 특허 5,843,767(발명자 : 케네스 베티, 1998,12,1), 이하 "베티 특허"로 명명함, 는 가로횡단으로 연장된 여러개의 분리된 튜브를 갖는 기질로 구성된 표적분자를 결합하기 위한 장치를 공지한다. 이러한 튜브들은 기질의 상단 표면에 직각으로 연장된다. 제 1 결합 반응물은 제 1 튜브 그룹의 벽에 고정되고, 제 2 결합 반응물은 제 2 튜브 그룹의 벽에 고정된다. 이러한 장치는 다른 유생분자 뿐만 아니라 재조합형 DNA, 폴리메라아제(polymerase) 체인 반응 조각 같은 비특성 다중핵산(uncharacterized polynucleic acid)을 포함하는 샘플과 함께 핵산탐식자 합성(nucleic acid probe hybridzation)을 통해 핵산서열(nucleic acid sequence)의 특성과 식별에 사용된다.

배티 특허에서, 이러한 튜브들은 0.03에서 10 마이크로미터 사이의 범위에 있는 직경으로 제한된다. 상단 문턱 직경값에 대한 이유는 만약 배티 특허에서처럼 수직튜브나 채널을 갖는다면, 약 10 마이크로미터의 넓은 직경은 튜브의 상단접근 입구에서 광학 할로 인공물을 넓힐 것이고, 따라서 감도가 많이 줄어들 것이기 때문이다.

1990년대에, 미세구조 제작방법(microfabrication) 기술은 여러산업에서 제작공정을 최소화 및 자동화하도록 한다. 생물의학에서 미세구조 제작기술의 영향은 현재 증가추세에 있는 마이크로프로세서 제어 분석기계연구 및 게놈 지도작성 및 배열의 높은 처리량에 관련되어 실험실의 로봇이용에서 찾아볼 수 있다("인간게놈 프로젝트"참조). 형광이 칠해진 수용체를 광학적으로 감시하는 것은 특히 배열을 감시하는데 사용된다. 전하결합 소자 어레이, 혹은 DNS 현미경(TM) 같은 공촛점 이미지화 기술을 사용하여 감시할 수 있다.

모세관 유리 어레이는 결합하기 위한 DNA 표적(target) 혹은 DNA 탐침(probe)을 구속시키기 위해 높은 표면영역의 나노포러스(nanoporous) 지지구조로 이미 사용되었다. 이러한 모세관 유리 웨이퍼는 직경이 수 마이크로미터 정도로 크거나 3nm만큼 작은 튜브 혹은 평행한 구멍의 일정한 기하학적 배열을 갖는다. 이러한 구멍 혹은 튜브는 각각의 교합 위치 내에 유생분자의 실제적인 동종 샘플을 배치하기 위한 샘플웰(sample well) 역할을 한다. 오리피스는 엑시머 레이저 가공으로 제조된다.

그러나 이러한 종래의 현미경 감시장치는 보통 전하결합 소자를 필요로 하는데 전체 샘플 영역을 스캔하지는 못한다. 배티 특허에 따르면 마이크로 채널이 수직이기 때문에 10마이크로미터 이상의 직경은 더 큰 광학 할로 인공물을 발생시킬 것이기 때문이다. 이것이 배티 특허에서 청구된 마이크로채널 직경이 0.03 내지 10 마이크로미터의 범위로 제한된 이유이다.

초미세 정밀도를 갖는 표면에 초미세 나노리터의 마이크로 물방울을 유동시키는 방법이 이미 공지되었다. 그러므로 초미세 나노미터 DNA 용제를 웨이퍼 표면에 이동시킬 수 있는 미세분출 시스템 혹은 미세 스포터(microspotter)가 사용될 수 있다.

도 1은 샘플지지 유리플레이트를 관찰하기 위한 CCD 유닛에 결합된 종래기술의 현미경과 컴퓨터 시스템의 조립체를 도시하는 계략도;

도 2는 본 발명을 따르는 마이크로칩의 표본 홀더 위에서 표면 조사를 하기 위한 공촛점 이미지 시스템(confocal imaging system)에 대한 계략도;

도 3은 채널이 칩의 상단표면에 직각인 것을 나타내는 종래 기술의 마이크로칩을 확대부분 절단 사시도;

도 3A는 도 3의 상단 칩표면으로부터 두 개의 인접한 채널을 도시하는 평면도;

도 4는 유리플레이트 칩의 두께를 통해 만들어진 비스듬한 채널의 경사를 도시하는 본 발명의 다중 채널 유리플레이트를 도시하는 확대 부분 절단 사시도;

도 4A는 도 3A와 비슷하지만 본 발명의 칩에 대한 것으로써 각각의 마이크로 패널의 상단 및 하단 단부 사이에서 관찰자가 직선을 볼 수 없는 것을 도시하는 도면;

도 5는 도 3에 도시된 것과 비슷한 종래의 단일직선 마이크로 채널의 도식도인데, 빛이 반사에 대한 자체 힘을 잃어버리지 않고는 전체 마이크로채널로 들어갈 수 없으며 레이저빔이 표면에 수직으로 쏘여질때, 마이크로채널로 들어가고 총 내부반사를 하지 않고 나머지 단부로부터 나오는 것을 도시하는 도면;

도 6은 종래의 또다른 고립된 불규칙한 형상의 마이크로패널을 도시하는 계략도인데, 어떻게 빛이 반사되지 않고 전체 채널 안으로 들어갈 수 없는가를 나타내고, 비균일한 내부벽을 갖는 나노포러스(nanoporous) 실리콘은 누화(cross-talk)의 증가에 기여하는 분산된 내부반사를 나타내고 빛은 마이크로채널로부터 빠져나온다.

도 7은 도 5 및 도 6과 비슷하지만 본 발명을 따라서 유리패널칩 내부에서 기울어진 채널의 선호되는 실시예를 도시하는 도면;

도 8은 도 7의 기울어진 채널을 확대한 도면인데, 어떻게 여러 가지 유생분자들과 단백질이 유리플레이트 칩의 기울어진 마이크로 채널튜브의 내부벽에 접착되는지를 나타낸다.

도 9는 본 발명의 원형칩에 대한 선택적인 실시예를 도시하는 평면도;

도 9A는 도 9에서 원형칩의 중앙부분을 확대도시한 평면도;

도 9B는 칩의 또 다른 선택적인 실시예의 정면도인데, 마이크로 채널에 생물학적 표본액체를 채우고 배출하기 위한 진공보조장치 보다는 원심분리기에서 사용하기 위해 위쪽 방사상 안쪽으로 경사진 둘레 같이 배열된 채널과 원뿔형이 된다.

* 부호설명 *

10 : 패널 칩 12 : 상단 평면

14 : 하단 베어링 표면 18 : 채널

18a: 상단 접근 입구

그러므로 본 발명의 중요한 목적은 전술된 종래의 기술을 개선시키고, 매우 많은 유생분자 테스트를 동시에 수행하는 장치를 제공할 뿐만 아니라 각각의 유생분자 테스트에 대한 균일한 테스트 환경을 제공하며 변이체를 테스트하기 위한 통계학적인 테스트를 하지 않은 특히 배티 특허에 공지된 것을 개선시키는데 관련된다.

본 발명의 중요한 목적은 유생분자 검출 해상도와 감도를 증가시키기 위해서 "피핑효과(pipping effect)"로 알려진 내부반사를 일으킬 수 있는 환경으로써 보모세관을 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 잠복기를 줄이도록 유생분자 사이의 상호작용을 증가시키고 감도를 증가시키며 동시에 해상도를 증가시켜서 동일 효율을 위한 좀더 묽은 샘플을 사용하도록 하는 환경으로써 모세관을 사용하는 것이다.

본 발명의 일반적인 목적은 노동비용을 줄이고 장치가 작동하는데 관련된 원하는 효율적인 샘플 체적을 줄이는데 있다.

현미경으로 관찰하기 위해 생물학 샘플을 지지하기 위한 강체 패널 칩에서, 상기 채널 칩(10)은 상단의 평면(12), 하단 베어링 평면(14), 상기 상단에서 하단 표면으로 서로 평행하게 연장된 최소한의 채널(18)을 형성하는데, 상기 채널은 상기 생물학 샘플의 진입에 대해서 상단접근 입구(18a)를 형성하는데 있어서, 각각의 상기 채널은 상기 상단 평면에 대해서 수직인 축에 대해 예각을 만들도록 비스듬하게 기울어지고(18), 각각의 상기 채널은 유체를 저장하고 있는 생물학 샘플의 점성을 통해 흐르는 유동을 수용하는 내부 직경을 갖는 것을 특징으로 한다.

선호적으로 패널칩은 유리, 석영, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 나일론 혹은 용융실리카로 구성된다. 좀더 선호적으로 패널칩은 투명한 유리로 만들어질 것이다. 가장 선호적으로 유리칩은 0.5에서 5미리미터 두께가 될 것이다.

선호적으로 상기 채널은 원통형이다. 선호적으로 상기 원통형 채널은 10내지 2000마이크로미터 사이의 범위를 갖는 일정한 직경이며, 좀더 선호적으로 50내지 200 마이크로미터이고, 가장 선호적으로 100 마이크로미터가 된다.

상기 예각은 20내지 80도 사이인데, 선호적으로 약 42도가 된다.본 발명은 또한 유리패널에 있는 생물학적 표본을 평면 레이저 스캐너로 관찰하는 방법에 관련되는데, 유리패널에 있는 생물학 샘플을 평면 레이저 스캐너로 관찰하는 방법에서, 이러한 형식의 유리패널(10)은 상단 평면(12), 하단 베어링표면(14), 상기 상단에서 하단표면까지 서로 평행하게 연장된 여러개의 채널(18)을 형성하며, 각각은 생물학 샘플에 대한 상단 접근입구(18a)를 형성하고, 채널은 유리패널의 상단 평면에 대해서 수직인 축에 예각을 만들도록 기울어진 방식으로 경사지며, 각각의 상기 채널의 내부직경은 유체를 포함하는 생물학적 샘플의 점성을 통해 동력보조로 유동하는 것을 수용하기에 충분히 큰데 있어서, 상기 방법은a) 유체를 포함하는 생물학 샘플 내에 형광안료를 제공하고,b) 가간접성 레이저 광선이 선택된 상단접근 입구를 가로횡단으로 지나가고 동축으로 형광물질을 활성화시키도록 상응하는 채널 안으로 들어가는데 있어서, 상단접근 입구에 대해서 할로가 발생되지 않고 활성화된 안료로 광학적으로 투명한 빛이 발생되며,c) 형광안료가 상기 채널 상단접근 입구를 넘어서 광학적으로 투명한 빛을 위쪽으로 투영하도록 하기에 충분한 시간을 허용하며,d) 화학적 특성에 대한 증거 데이터와 생물학적 샘플의 위치를 발생시키기 위해 형광안료를 투영하는 채널 외부 위쪽으로 광학측정을 수행하는 단계로 구성된다. 본 발명은 유리패널에 있는 생물학적 샘플을 평면 레이저 스캐너로 관찰하기 위한 방법에 관련되는데, 이러한 형식의 유리패널(10)은 상단 평면(12), 하단 베어링 표면(14), 상기 상단에서 하단표면으로 서로에 대해서 평행하게 연장되고 생물학적 샘플에 대해서 각각 상단접근입구(18a)를 형성하는 여러개의 채널(18)을 형성하고, 채널은 유리패널의 상단 평면에 대해서 수직인 축에 예각을 만들도록 기울어진 방식으로 경사지며, 각각의 상기 채널의 내부직경은 유체를 포함하는 생물학적 샘플의 점성을 통해 동력보조로 유동하는 것을 수용하기에 충분히 큰데 있어서, 상기 방법은a) 가간접성 레이저 광선이 선택된 상단접근 입구를 가로횡단으로 지나가고 상응하는 채널 안으로 동축으로 들어가며,b) 채널내부벽에 유생분자를 결합할 때 빛의 강도 저하를 측정하고, c) 생물학적 샘플의 위치와 화학적 특성에 대한 증거 데이터를 발생시키기 위해 빛의 강도가 저하되는 것을 분석하는 단계로 구성된다.

도 3 및 도 5는 Beattie 특허 출원에서와 같이 종래의 마이크로채널을 도시한다. 각각의 이러한 마이크로채널은 평면에 수직한 위치에 대해서 단일 길이 형식의 규칙적으로 배열된다. 유리관찰 플레이트 내에서 수직이다. 이러한 마이크로채널은 길이와 형상이 균일하며 수직이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 검출되기 위해서는 채널의 전체 길이를 통해 스캐닝되어야 하며, 특별한 스캔을 하는 장치가 필요하기 때문에 비용이 높다. 평균 방출여기(emission excitation), 누화(cross-talk), 인공물로 구성된 상단 샘플 접근 종단입구(top sample access end mouth) 주위에 할로써클(halo circle)을 갖는다. 평균적으로 감도가 낮다. 최대 작업직경은 10마이크로미터 이하이다. 또한 마이크로 채널 직경이 너무 작아서 마이크로채널 내에 물 표본을 결합시키기 위해 진공압력과 밀봉이 필요하다.

도 3A에 종래의 기술이 도시된 바와 같이, 마이크로 채널 상단에서 바라볼 때 두 개의 인접한 채널의 평면도가 도시된다. 요소(18a)는 제 1 채널의 상단 오프닝을 나타내며, 요소(18b)는 동일 채널의 하단 오프닝을 나타낸다. 요소(18)는 마이크로채널의 내부벽을 나타낸다.

채널의 직경이 2에서 200마이크로미터로 2자리수 증가하면, 채널의 내부표면은 블랙홀의 표면영역으로 인해서 200을 2로 나눈 약 100배로 증가할 것이다. 도 3A에 도시된 종래의 시스템에는 4자리수인 10,000배로 증가한다. 그러므로 이것은 도 3A에서 채널의 내부직경이 약 10마이크로미터 이상에서 작동하지 못하도록 하는 이미지 품질의 저하에서 중요한 요소가 될 것이다. 도 3A에 대해서 다음의 계산이 성립된다.

18b=2마이크로미터 (채널 직경)

도 3A의 내부벽(18) = 2π x H, H는 높이

각각의 채널에 대한 오프닝 영역 : 2/2 x 2/2 x π = π(단위 사용 안됨)

18b=200마이크로미터(채널 직경)

도 3A의 내부벽(18) = 200π x H, H는 높이

각각의 채널에 대한 오프닝 영역 : 200/2 x 200/2 x π = 10,000π(단위 사용 안됨)

내부벽 표면영역(18)(도3A)에서 100배 증가하면 블랙홀 인공물(18b)(도3A)에서 10,000배 증가(지수함수)하게 된다. 그러나 이것은 본 발명의 경우가 아니다. 도 4A에 도시된 바와 같이 채널의 직경이 2에서 200마이크로미터로 증가할 때 나타낸 할로 인공물 혹은 블랙홀이 없기 때문이다. 종래 기술(18d)의(도 3A) 블랙홀 혹은 할로 인공물에서, 형광발광이 부족한데, 상단에서 볼 때, 이미지 캡쳐시 어둡고 할로 같은 형상을 나타낸다.

또한 도 3A에서 종래의 빛 화상분석은 도 4A에 나타난 본 발명의 표면 스캔에 대비하여 칩 마이크로채널의 전체 길이를 가로교차 층을 지루하게 여러번 스캐닝하여 수행된다.

도 2는 선택적으로 본 발명의 칩으로 사용하는 공초점 이미지 시스템을 도시한다. 시스템(M)은 샘플 저장 칩을 지지하기 위한 표본홀더(N), 빛을 표본홀더에 비추기 위한 레이저 건(O), 칩 채널 내부에 유생분자를 이미지화하기 위한 블랙홀 빛 감지기(P)를 포함한다. 광선분할기(Q) 및 경사진 거울조립체(R)는 표본홀더, 빛감지기 및 레이저 건 중간에 장착된다. 레이저 스캔 렌즈(T)는 스캐닝 거울 및 표면 홀더 사이에 장착된다. 부분 필터 및 광선 확장기(U)는 레이저 건과 광선분할기 사이에 장착된다.

도 2에서, 광선분할기는 레이저 광선이 건(O)에서 표본홀더(N)로 제 1 방향으로 자유롭게 나가도록 하며, 중간 광선분할기(Q)에 대해서 반사되어 표본홀더에서 감지기(P)까지 유생분자 이미지 광선이 되돌아오게 한다. 빛 감지기는 적합한 현미경에 결합되어야 하는데, 예를 들어 12 혹은 16비트의 동적범위로 감지하는 초미세 회절제한 해상도 및 초점면이 같은 암(arm)을 갖는 현미경인데, BIOMEDICAL PHTOMETRICS inc.(캐나나, 워털루)의 MACROSCOPE 혹은 DNAscope 라는 상표로 판매된다.

도 6은 선택적인 종래의 마이크로 채널을 도시한다. 약 0.03마이크론인 1마이크론 이하의 직경을 갖는 다공성 실리콘 나노채널은 여러개의 길이와 크기를 갖는 불규칙한 형상의 배열이다. 크기와 길이가 균일하지 않다. 여기방출(excitation emission)의 수준은 최소이다. 누화는 최대이다. 또한 1마이크로미터 이하의 작은 내부직경을 갖는데 또다시 샘플 유체가 그 안에 맞물리게 되면 높은 진공압력이 필요한데, 칩의 구조적 성질과 절충되는 결과를 가져온다. 또한 여러개의 다양한 샘플 유체는 변하는 길이와 비균일성으로 인해 서로 인접하게 된다.

도 4 및 도 7은 본 발명의 선호되는 실시예를 따르는 마이크로칩(10)을 도시한다. 유리플레이트 칩(10)은 상단 및 하단 평면(12,14)을 형성하는데, 각각은 서로에 대해서 평행하며 유리몸체(16)의 전체두께로 이격된다. 본 발명의 마이크로 채널은 길이가 균일한 마이크로 채널 튜브를 형성하고 미리 발생된 일정하게 기울어진 방향을 따라 연장된다. 좀더 자세히, 공동 마이크로 채널(18)은 상단 및 하단 평면(12,14)에 대해서 수직인 축에 비스듬하게 연장된다. 하단 평면(14)은 유리 플레이트의 베어링면(bearing surface)이다. 마이크로채널(18)의 상단 입구(18a)는 유리플레이트의 상단평면(12)에 대해서 동일 평면이고, 마이크로채널(18)의 하단 입구(18b)는 유리 플레이트의 하단평면(14)에서 열린다. 마이크로채널은 길이를 따라 균일하고 비스듬한 유체유동을 제공한다. 마이크로채널은 생물학적 샘플을 감지하기 위해 CCD(charged coupling device), PMT(photomultiplier tube) 혹은 평면 레이저 스캐너를 사용할 수 있다. 누화는 최소이다. 가장 중요한 것은 어떠한 인공물 할로 써클도 상단 입구(18a)에서 발생되지 않는다는 것인데 선호적으로 평면 레이저 스캐너에 의해 관찰이 수행된다. 본 발명의 마이크로채널은 최대 내부 반사 및 최대 감도특성을 갖는다. 종래의 것보다 마이크로 직경이 크며 연결에 관한 문제가 적게된다. 감지기(P)가 상단 채널에 놓이기 때문에, 채널에 존재하는 빛은 수직열로 되어 있으며 중앙에 블랙홀 없이 서로에 대해서 평행하다.

본 발명의 마이크로채널에서, 유리패널 상단 표면에 대해서 경사짐은 스넬의 법칙(snell's law)에서 계산된 고정된 각도값을 발생시킨다.

n1 sinθ= n2 sinψ

제조업자에 따라서 공기의 굴절지수는 1이고 물은 1.33, 유리는 1.41에서 1.61(평균 1.51)이다.

대학교 물리학 수준에서 공지된 바와 같이, 스넬의 법칙은 빛의 광선이 굴절경계와 부딛힐 때 어느 정도의 구부림을 형성하는 기하광학 법칙이다. n1은 입사광선이 이동하는 중간 매개물의 굴절지수이고, θ는 입사광선이 경계와 부딪히는 굴절경계에서 법선에 대한 각도이고, n2는 굴절된 광선이 이동하는 매개물의 굴절지수이며, ψ는 굴절된 광선이 이동하는 굴절경계에서 법선에 대한 각도이다. 만약 광선이 낮은 굴절지수의 매개물에서 높은 굴절지수의 매개물로 이동할 때, 법선 쪽으로 구부러진다. 만약 높은 굴절지수의 매개물에서 낮은 굴절지수의 매개물로 이동할 때, 접선에서 멀어지는 쪽으로 구부러진다. 총체적인 내부굴절은 높은 굴절지수의 매개물에서 빛이 임계각도 보다 큰 입사각(법선에 대해서)으로 낮은 굴절지수의 매개물의 접촉면과 부딛힐 때 발생한다. 이러한 굴절은 금속 굴절코팅(알루미늄 혹은 은)이 없을 때에라도 발생한다.

이러한 마이크로채널 경사는 레이저 빛 광선이 최대강도로 마이크로채널 내에서 유체를 포함하는 샘플을 정밀하게 관통하도록 한다.

마이크로채널의 종축과 마이크로채널이 포개어진 두께로 유리패널의 상단표면에 대한 수직축 사이의 각도 같은 마이크로채널의 경사각(β)을 계산하기 위해서, 굴절지수와 유리재료의 특성에 기초를 둔다.

α+β=90°

β+θ=90°

β=90-θ

레이저 빔의 입사광선은 샘플 유리 플레이트의 상단 표면에 수직이어서, 레이저 광선은 원치않은 굴절 없이 최대로 관통하는데, 그것이 중요하다. 왜냐하면 광선이 강할수록 채널 내의 플루오레세인(fluorescein) 염료가 더 많이 활성화될 것이기 때문이다.

도 7에 도시된 바와 같이, 일단 레이저광선(20)이 채널튜브의 유리 측벽과 부딛힐 때, 굴절광선(20')과 굴절광선(20")을 발생시킨다. 만약 각도(θ)가 90도 이면, 유리코어의 측면에 평행하며 채널튜브 내에 남아있게 된다. 반면에 만약에 각도(θ)가 0이면, 빛은 채널튜브를 빠져나올 것이다. 입계각도는 내부굴절이 최대이고 튜브(18)를 나오는 빛이 최소일 때 선택된다. 이러한 임계각도는 만약 각도가 이 값보다 작으면 얼마간의 빛은 칩 유리코어를 통과해서 빛채널 튜브(18)를 빠져나오기 때문에 중요하다. 1.46의 굴절지수를 갖는 유지재료의 임계각도는 44°와 동일하다고 가정하자. 경사각 β=α=90-44=46이다. 경사각은 줄어든 광선 때문에 최소한의 손실과 총 최대 내부반사를 일으키도록 정해진다.

선택적으로 칩은 불투명 재료로 만들어질 수 있다. 그런다음 마이크로채널(18')은 내부빛 반사 코팅(18a')으로 발라져야 하는데, 선호적으로 알루미늄과 인으로 구성된 금속 재료로 만들어진다. 이러한 형태로, 칩(10')의 선택적인 실시예는 투명할 필요가 없다. 채널은 여전히 경사진 유동의 형태로 남아 있지만, 반사 금속코팅(18a')(도 8참조)이 있다. 이러한 금속코팅은 200에서 1000nm의 사이에서평균 90%의 반사율을 갖는 알루미늄이 될 것이다. 또한 몇가지 다른 금속의 진공 증착은 매우 좋은 반사체를 만든다. 도 8에 도시된 보호용 단층(22), 차폐층(18a')은 산화되어 UV에서 적외선 영역까지 높은 반사율을 나타내기 위해 실리콘(SiO2) 혹은 마그네슘 플로라이드(MgF2) 혹은 다른 것으로 증착될 수 있다. 마이크로채널의 기울어진 흐름은 빛의 최대 레벨이 마이크로 채널을 통과하고 그로부터 방출되도록 하는 것을 돕는다. 내부 채널이 반사성 재료로 코팅되지 때문에, 빛은 코어재를 벗어나지 않고 최대값으로 방출된다. 그러므로 스넬의 법칙 혹은 임계값이 존재하지 않고 다만 경사각도만 존재한다.

지금부터 본 발명의 경사유동 기술에 대해서 설명하고자 한다. 3차원 칩으로 알려진 칩을 통한 유동은 평면 칩에 대해서 많은 이점을 갖고 있음에도 불구하고,이러한 칩이 경제성이 떨어지는 근본적인 문제점을 안고 있다. 이러한 문제점은

- 관으로 연결함,

- 검출, 그리고 비싼 현미경과 채널의 검출을 위해 길이를 스캔할 수 있는 값비싼 장치를 포함한다.

반면에 경사 유동기술로 이러한 문제점을 언급한 새로운 등급의 3차원 유전자 칩이 있다.

관연결 문제에서 유체가 마이크로채널의 상단접근 입구를 통과하는데 필요한 압력은 마이크로채널 직경이 줄어들고 유리 플레이트 두께가 증가함에 따라 증가한다. 좀더 자세히 말하자면, 종래의 마이크로패널 내부직경이 10μ(마이크로미터)이하로 감소함에 따라 높은 진공압력 레벨이 요구되며 칩의 구조적인 성질을 유지하는데 문제가 발생한다. 반면에, 마이크로채널 직경을 증가시키고 유리플레이트 칩의 두께를 감소시켜서, 원치않은 인공물이 마이크로패널의 상단접근 입구 주위에 발산 광학 할로를 포함하여 발생된다. 이러한 할로 인공물은 레이저표면 스캐너의 이미지 품질을 저하시키므로 측면강도는 다른 마이크로 채널과 비슷하다. 또한 채널 직경을 줄이고 채널의 개수를 늘려서, 칩의 구조적 강도는 절충될 것이다.

선택적으로 도 9B에 도시된 바와 같이, 칩이 직사각형이 되기보다는 원뿔형 혹은 원형이 될 수 있다. 마이크로채널(18')의 배열은 위쪽으로 방사상 안쪽으로 기울어진 방식으로 배열된다. 이러한 선택적인 칩(10')으로 진공보조장치 대신에 생물학적 샘플 용제로 마이크로 채널(18')을 채우고 배출시키기 위한 동력보조장치는 원심분리기로 대체될 수 있다. 원심분리기는 생물학적 샘플 용제가 마이크로 채널 내에 놓이고 결합되도록 하기 위해 약 2분에 2500RPM으로 작동한다. 생물학적 샘플 용제로 칩의 기울어진 마이크로채널을 채우기 위한 이러한 원심분리 기술은 수직(경사가 아님) 마이크로채널을 갖는 종래의 칩에는 효과가 없을 것이다. 사실상, 종래의 칩에서 마이크로채널 내의 액체는 하단으로부터 배출될 수 없고, 본 본 발명을 따라는 기울어진 각도의 마이크로 채널의 경우와 반대이다. 원뿔형 칩 위에 재료를 배치시키는 것은 직사각 칩보다 쉽다. 이미지 검출은 다루기가 덜 힘든데, 스캐닝이 원형 디스크의 중심을 따러 회전운동으로 인해 더욱 쉬워지기 때문이다. 휴대용 장치는 여유있게 크기가 감소함으로 이루어진다. 이것은 원치 않은 결과를 발생시키는 종래의 기술과 비교되는 차이점이다.

검출 문제에 있어서, 대부분의 종래 기술 마이크로어레이는 현미경 미끄럼 유리에 발생되는데, 결합 반응과 신호발생이 단일 평면 내에서 이루어진다. 유전자 칩의 3차원 설계에서, 이러한 결합반응은 칩의 깊이 혹은 두께를 통해 발생한다. 그러므로 필드의 깊이는 더욱더 중요하게 되는데, 신호는 칩의 두께를 통해 수집되어야 하기 때문이다. 공초점 스캐닝 광학기를 사용하는 종래의 마이크로어레이 판독기는 이러한 칩에 적합하지 않다. 오직 값비싼 기성품 CCD만 한번의 검출 단계에서 전체 마이크로어레이를 이미지화하는데 충분히 크다. 그러므로 매우 얇은 광학 슬라이스로부터 신호를 얻기 위한 공초점 개념은 칩을 통한 유동의 2차원적인 기하학과 상충된다. 개별의 점을 구별하도록 좋은 측면 해상도를 얻기 위해, 빛은 팁의 전체 두께로부터 수집되어야 한다. 그러므로 필드의 측면과 깊이 사이의 해상도 교환이 있고 영역 기준에 대해서 초과적인 무게를 가한다. DNA가 높을수록 더 큰 측면과 깊이 해상도가 얻어진다. 예를 들어, 1X 물체에 대한 이미지 영역은

8.5 x 6.8 mm이고

40 X 물체에 대해서는

0.22 x 0.17mm로 줄어든다.

본 발명의 경사유동은 매우 다르다. 실제로, 경사유동칩은 완전히 새로운 설계와 함께 전술된 문제점은 갖는다. 도 7에 도시된 바와 같이, 빛 혹은 입사광선은 마이크로 채널의 상단 종단입구를 통과해야 하고 샘플 유체 내부에 존재하는 형광분자를 활성화시켜야 하며, 방출되는 빛은 튜브 내에서부터 벗어날 수 있어야 한다. 이것은 입사광선이 칩의 상단자유표면에 대해서 수직이고 반사된 광선이 0일 때 최대효율로 이루어진다. 이러한 시나리오에서, 모든 빛은 튜브를 관통할 것이다. 최대 내부반사와 칩중심재료에 대한 굴절의 최소손실에 대해서 임계각도 θ를 선택하여, 경사각(β)이 계산될 수 있다. 채널튜브 내에서 형광 분자가 활성화된 후에 대부분의 방출되는 빛은 상단칩 표면에 수직으로 나가며, 그 결과 도 7에서 (20)으로 표시된 것 같이 광학수집 및 검출 시스템이 개선된다.

경사유동에서

a) 빛을 튜브의 전체 두께 내에서부터 수집할 필요가 없는데, 마이크로 채널 입구표면(18a)으로부터 수집될 수 있고 평면 칩의 역할을 할 수 있기 때문이다. 그러므로 공간적인 관찰렌즈를 갖는 비싼 장치가 필요하지 않게 된다.

b) 종래의 3차원 칩에서 나타나는 할로 인공물이 사라진다. 이로 인해 강도의 비교가 최종결과를 결정하는데 중요한 역할을 할 때 여러 가지 채널의 강도를 이미지화함에 있어서 좀더 균일하고 일관성 있는 결과를 낳게 된다. 다시말해서, 비어있는 튜브를 통해 한번 보았을 때, 튜브의 하단 외부단부는 보는 사람이 튜브를 기울일 때 분명히 사라질 것이다.

c) 빛의 투과와 방출을 증가시키고 총 내부 반사를 최대화하며 누화를 최소화시켜서, 차례로 검출 감도를 증가시킬 것이며, 채널 직경은 증가되어서 칩의 구조적 성질을 위태롭게 하는 고압력 진공과 채널을 통과하는 액체에 관련된 문제를 감소시킨다.

줄어든 광선이 직각 θ 혹은 임계각도를 선택하여 최소화되기 때문에, 누화는 최소화된다.

누화는 이미지 분석에서 중요한 현상이다. 대부분의 평면 칩이 레이저 빔을 사용하여 스캔되기 때문에 누화는 입사광선이 적합한 임계각도 향하도록 하여 최소화될 수 있다. 이것은 빛이 몇마일 동안 섬유 광학기를 통해 빛이 이송되어야 하는 것이 더욱 현저해진다.

반대로, 도 6에 도시된 종래의 예에서, 마이크로채널이 칩의 길이를 통해 다른 크기의 비균일한 내부 공간을 갖기 때문에, 누화는 최대값에 도달하며 대부분의 빛은 채널을 빠져나올 것이다. 또한 마이크로채널의 길이가 변하고 두 개의 채널이 동일하지 않기 때문에, 이러한 채널들에 결합되는 다양한 분량의 형광염료가 있으며, 결합분자의 고르지 못한 분량으로 인해 차례로 여러 가지 강도가 나타날 것이다.

도 8은 샘플 용제의 유생분자가 원통형 채널튜브(18)의 내부벽에 어떻게 결합되는지를 계략적으로 나타낸다. 또한 도 8에서 요소(18a')는 요소(18)보다 낮은 굴절지수를 갖는 경계층이다. 이러한 층은 내부금속 코팅으로 된 형식의 채널에 대해서 알루미늄 혹은 은 같은 반사금속 코팅으로 만들어질 수 있다. 이러한 유생분자는

- 채널튜브(18)에 항체(B)를 연결하는 항원(A);

- 항원(A')와 항체(B)의 조합에 특정한 항체(B')가 결합된 효소(C);

- 특정한 항체(B)에 결합된 금입자(gold particle)(D);

- 활성화된 형광상태(F')의 형광분자를 채널튜브(18)의 내부벽에 연결시키거나 특정한 효소와 결합된 2차 항체(B)를 채널튜브(18)의 내부벽에 연결시키는 DNA 분자(E);

- 항체(B')에 결합된 효소(C)의 색깔이 형성되는데 필요한 기질(F)을 포함한다.

선호되는 각도와 입계각의 발생은 투명칩 실시예에 적절하지만 마이크로채널의 반사금속 내부코팅을 갖는 칩에는 적절하지 않다. 반사금속 내부코팅을 갖는 칩의 실시예에서, 일단 빛이 마이크로채널로 들어가면, 금속 코팅 때문에 빠져나올 기회를 갖지 않는다. 금속 코팅된 마이크로채널 칩의 일반적인 개념은 채널의 내부벽 위에 반사내부 코팅에 대해서, 일단 입자 혹은 금붙이(gold tagged) 유생분자가 검출에 사용되면, 반사코팅 표면에 불투명하거나 검은 층이 나타나서 빛이 효과적으로 통과하지 않도록 흐려지는데, 채널 내에서 빛의 강도의 반사율 감소는 유생분자 특성을 결정할 것이며, 기술을 구현하는데 훨씬 저렴하고 쉽다. 금붙이 유생분자를 갖는데 있어서 금기술의 강도를 증가시키도록 은향상(silver enhancement) 기술을 향상 따라온다. 반면에 투명 칩 개념에서, 더 많은 빛이 활성화될 때 형광안료가 발생되며 능동적인 결과가 있음을 경고한다.

Claims (20)

1. 현미경으로 관찰하기 위해 생물학 샘플을 지지하기 위한 강체 패널 칩에서, 상기 채널 칩(10)은 상단의 평면(12), 하단 베어링 평면(14), 상기 상단에서 하단 표면으로 서로 평행하게 연장된 최소한의 채널(18)을 형성하는데, 상기 채널은 상기 생물학 샘플의 진입에 대해서 상단접근 입구(18a)를 형성하며, 각각의 상기 채널은 유체를 저장하고 있는 생물학 샘플의 점성을 통해 흐르는 유동을 수용하는 내부 직경을 갖는데 있어서,

   각각의 상기 채널은 상기 상단 평면에 대해서 수직인 축에 대해 예각을 만들도록 비스듬하게 기울어지는(18) 것을 특징으로 하는 패널칩.
2. 제 1 항에 있어서, 각각의 상기 채널은 곧은 원통형과 횡단면이 다각형 원통형으로 구성된 것으로부터 선택되고, 상기 채널은 원통형이며 원형 및 원뿔형 어레이로 구성된 것으로부터 선택된 어레이에 배열되는 것을 특징으로 하는 패널칩.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 원통형 채널은 10에서 2000 마이크로키어의 일정한 직경 범위를 갖는 것을 특징으로 하는 패널칩.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 채널 직경 범위는 50에서 200 마이크로미터 사이인 것을 특징으로 하는 패널칩.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 채널직경은 약 100 마이크로미터인 것을 특징으로 하는 패널칩.
6. 제 3 항에 있어서, 상기 예각의 범위는 30에서 60도인 것을 특징으로 하는 패널칩.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 예각은 약 42도인 것을 특징으로 하는 패널칩.
8. 제 4 항에 있어서, 상기 예각의 범위는 30에서 60도인 것을 특징으로 하는 패널칩.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 예각은 약 42도인 것을 특징으로 하는 패널칩.
10. 제 4 항에 있어서, 상기 채널이 개수는 약 수천에서 수만개이며, 상기 유리패널의 두께를 통해 연장되는 것을 특징으로 하는 패널칩.
11. 제 3 항에 있어서, 유리, 석영, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 나일론, 용융실리카, 금속 중에서 선택된 재료로 만들어지는 것을 특징으로 하는 패널칩.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 패널칩은 투명유리로 만들어지는 것을 특징으로 하는 패널칩.
13. 제 12 항에 있어서, 두께의 범위는 약 0.5에서 5mm인 것을 특징으로 하는 패널칩.
14. 제 1 항에 있어서, 각각의 상기 채널은 빛반사 금속재료로 만들어진 내부코팅으로 발라지는 것을 특징으로 하는 패널칩.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 채널내부 코팅재료는 알루미늄과 은 중에서 선택된 금속재료로 만들어지는 것을 특징으로 하는 패널칩.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 채널은 실리콘 혹은 마그네슘 플루오르화물 중에서 선택된 재료로 만들어진 보호용 단층을 갖는 것을 특징으로 하는 채널칩.
17. 유리패널에 있는 생물학 샘플을 평면 레이저 스캐너로 관찰하는 방법에서, 이러한 형식의 유리패널(10)은 상단 평면(12), 하단 베어링표면(14), 상기 상단에서 하단표면까지 서로 평행하게 연장된 여러개의 채널(18)을 형성하며, 각각은 생물학 샘플에 대한 상단 접근입구(18a)를 형성하고, 채널은 유리패널의 상단 평면에 대해서 수직인 축에 예각을 만들도록 기울어진 방식으로 경사지며, 각각의 상기 채널의 내부직경은 유체를 포함하는 생물학적 샘플의 점성을 통해 동력보조로 유동하는 것을 수용하기에 충분히 큰데 있어서, 상기 방법은

    a) 유체를 포함하는 생물학 샘플 내에 형광안료를 제공하고,

    b) 가간접성 레이저 광선이 선택된 상단접근 입구를 가로횡단으로 지나가고 동축으로 형광물질을 활성화시키도록 상응하는 채널 안으로 들어가는데 있어서, 상단접근 입구에 대해서 할로가 발생되지 않고 활성화된 안료로 광학적으로 투명한 빛이 발생되며,

    c) 형광안료가 상기 채널 상단접근 입구를 넘어서 광학적으로 투명한 빛을 위쪽으로 투영하도록 하기에 충분한 시간을 허용하며,

    d) 화학적 특성에 대한 증거 데이터와 생물학적 샘플의 위치를 발생시키기 위해 형광안료를 투영하는 채널 외부 위쪽으로 광학측정을 수행하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 생물학적 샘플을 통해 흐르는 상기 동력보조유동은 낮은 진공보조 및 원심력 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 유리패널에 있는 생물학적 샘플을 평면 레이저 스캐너로 관찰하기 위한 방법에서, 이러한 형식의 유리패널(10)은 상단 평면(12), 하단 베어링 표면(14), 상기 상단에서 하단표면으로 서로에 대해서 평행하게 연장되고 생물학적 샘플에 대해서 각각 상단접근입구(18a)를 형성하는 여러개의 채널(18)을 형성하고, 채널은 유리패널의 상단 평면에 대해서 수직인 축에 예각을 만들도록 기울어진 방식으로 경사지며, 각각의 상기 채널의 내부직경은 유체를 포함하는 생물학적 샘플의 점성을 통해 동력보조로 유동하는 것을 수용하기에 충분히 큰데 있어서, 상기 방법은

    a) 가간접성 레이저 광선이 선택된 상단접근 입구를 가로횡단으로 지나가고 상응하는 채널 안으로 동축으로 들어가며,

    b) 채널내부벽에 유생분자를 결합할 때 빛의 강도 저하를 측정하고,

    c) 생물학적 샘플의 위치와 화학적 특성에 대한 증거 데이터를 발생시키기 위해 빛의 강도가 저하되는 것을 분석하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서,

    상기 c)와 d) 단계 사이에 c1) 단계를 포함하는데 있어서, 상기 c1) 단계는

    c1) 채널에 대해서 붙이입자(tagged particle)가 결합되는데 있어서 빛의 강도가 저하되는 것을 측정하는데, 상기 붙이입자는 금과 마이크로입자(microsphere bead)로 구성된 재료로 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.