KR100471499B1

KR100471499B1 - 크로만 유도체 및 이를 활성성분으로 함유하는 약학적조성물

Info

Publication number: KR100471499B1
Application number: KR10-2002-0000914A
Authority: KR
Inventors: 김원기; 정장현; 조동협; 김희선; 이희순
Original assignee: 학교법인 이화학당
Priority date: 2002-01-08
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2005-03-09
Also published as: KR20030060286A

Abstract

본 발명은 소교세포 활성 억제, 신경세포 사멸억제 효과를 나타내는 하기 화학식 1의 신규 크로만 유도체, 그 제조방법, 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 뇌졸중, 알쯔하이머병, 피킨슨씨병의 예방 및 치료에 유용하다.

상기 식에서,

R은 H, C₁-C₄ 저급 알킬, 벤질 또는 페닐기이고,

X는 C=O 또는 CH₂이다.

Description

크로만 유도체 및 이를 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물{CHROMAN DERIVATIVES AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING SAME}

뇌졸중 (중풍), 알쯔하이머병 (치매), 파킨슨씨병 등의 퇴행성 신경질환은 운동, 감각기능의 손상 및 기억, 학습, 연산, 추리 등 고차원적 기능을 저해하여 삶의 질을 저하하며, 환자가 사망에 이를 때까지 본인과 그 가족에게 많은 정신적, 육체적 고통을 야기한다. 또한 현대 사회의 노령화 추세로 노인 인구의 급속한 증가가 이루어지고 있는 최근의 경향에 비추어 볼 때 퇴행성 신경질환의 발생율이 증가하게 되고 발생 후 생존 기간이 증가하게 됨에 따라 큰 사회적 문제로 대두되고 있다. 우리나라 통계청의 1997년도 보고에 따르면 뇌졸중은 단일 질환으로서 우리나라에서 사망원인 제 1 - 2 위를 차지하는 것으로 되어 있다. 현재 우리나라에서 뇌졸중에 의한 사망률은 미국, 캐나다, 호주 등의 나라에 비해 높은 것으로 나타나 있다. 따라서 뇌졸중은 이제 우리나라에서도 좌시할 수 없는 중요한 사회적 문제가 되어있다.

퇴행성 신경질환은 급격히 혹은 천천히 진행되는 괴사(necrosis)나 아폽토시스 (apoptosis)에 의한 신경세포의 사멸로 특징지어 진다. 따라서 신경세포의 사멸기전에 대한 이해는 외상, 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨씨병, 다발성 경화증 등의 다양한 중추질환의 예방, 조절 및 치료법 개발을 위하여 반드시 이루어져야 한다. 이러한 이유로 인하여 지난 수십년간 뇌질환을 치료하고자 하는 많은 노력은 신경세포의 사멸에 대한 기전을 연구하고 이를 억제하는 방법을 찾는데 기울여져 왔다.

교세포 활성화와 신경세포의 사멸

중추신경계는 약 10%의 신경세포와 90%의 교세포로 이루어져 있고, 교세포는 다시 90%의 성상세포 (astrocytes)와 나머지를 차지하는 소교세포 및 희소돌기아교세포(oligodendrocytes)로 이루어져 있으며, 다양한 종류의 퇴행성 신경질환에서 교세포의 활성화가 관찰되어왔다. 뇌졸중의 경우 교세포의 활성화가 매우 빠른 시간 내에 일어나는 바, 허혈성 뇌졸중의 경우 발병 후 수시간 내에 소교세포의 활성화가 관찰되며, 수십시간 후에 성상세포의 활성화가 관찰되고 이는 수개월간 유지되기도 한다. 알쯔하이머병의 경우에도 노용균반점(senile plague)의 형성에 소교세포가 중요한 역할을 한다는 것은 매우 잘 알려져 있다 (Wegiel, J. 등, Acta Neuropathol (Berl), 100(4):356-64 (2000)). 이브프로펜 등과 같은 소염제가 노용균반점의 형성을 억제하며 치매 발병을 예방할 수 있다는 것이 중요한 예이다 (Weggen, S. 등, Nature, 414:212-216 (2001); Wyss-Coray, T. 및 Mucke, L., Nat. Med., 6:973-974 (2000); Lim, G. P. 등, J. Neurosci., 20:5709-5714 (2000)). 최근 말초 혈액 혹은 활성화된 교세포에서 생성되는 사이토카인류 등이 흥분성 신경전달 물질, 간질, 퇴행성 신경질환에 의한 신경세포 독성을 유발하는 인자임이 밝혀졌다.

휴에트(Hewette) 등은 활성화된 교세포가 신경세포의 사멸에 영향을 미칠 수 있다는 것을 발견하였다 (Hewett, S.J. 등, Neuron, 13 :487-494 (1994); Hewett, S.J. 등, Stroke, 27 :1586-1591(1996)). 본 발명자는 활성화된 교세포와 신경세포의 사멸에 관한 상호관계에 대하여 연구해 왔으며 활성화된 소교세포에 의해 N-methyl-D-aspartate (NMDA) 혹은 포도당 결핍에 의한 신경세포 독성이 증가되고 이러한 신경세포 사멸 증가는 유도 가능한 NO 신테이즈 (iNOS)의 발현증가에 기인한다는 것을 밝힌 바 있다 (Choi, J. J. 및 Kim, W. K., J. Neurosci. Res., 54:870-875 (1998); Kim, W. K. 등, Neurosci. Res., 33:281-289 (1999)). 따라서 신경세포의 사멸과 기능의 저하를 억제하기 위하여 교세포, 특히 소교세포의 활성화를 억제하는 것은 뇌졸중, 알쯔하이머병, 두부 외상, 등의 퇴행성 뇌질환 치료제 개발에 매우 중요하다.

활성화된 교세포의 사멸의 증가

일반적으로 뇌질환에서 교세포의 생존률은 신경세포에 비하여 높은 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근 뇌허혈시 교세포가 신경세포에 비하여 먼저 죽게 된다는 보고도 있어 이에 대한 관심이 크게 증가하고 있다 (Borlongan, C. V. 등, FASEB J., 14:1307-1317 (2000)). 허혈 후 교세포의 사멸은 신경세포에서와 같이 활성산소종의 과생성, 에너지원의 공급 저하, 산소 공급저하에 기인하는 것으로 보인다. 그러나 최근 본 발명자는 교세포의 사멸이 정상적인 조건에서는 쉽지 않으나 교세포가 활성화된 후에 세포독성에 매우 취약하게 된다는 것을 밝힌 바 있다 (Choi and Kim, 상기 문헌 참조). 본 발명자는 일차 배양한 교세포를 IFN-γ와 IL-1β 혹은 IFN-γ와 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 활성화시키면 이들 교세포가 에너지원 결핍이나 산소결핍에 매우 민감하게 반응하여 빠르게 죽게 된다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 활성화되지 않은 정상적인 교세포의 생존률은 신경세포에 비하여 높고 이는 교세포의 항산화시스템(환원성 글루타치온(reducible glutathione)이 주된 항산화시스템임)에 기인하며, 면역활성화된 교세포는 정상 교세포와 달리 세포내 환원성 글루타치온을 급격히 소실하게 되어 페록시나이트라이트의 산화적 손상에 쉽게 취약해 지는 것을 밝혔다(Ju, C. 등, J. Neurochem., 74:1989-1998 (2000)). 본 발명자는 이러한 교세포의 사멸에도 소교세포의 활성화가 매우 중요한 역할을 하는 것을 발견하였다.

허혈에 의한 중추면역계 활성화에 대한 면역 억제제의 효과

허혈은 소교세포 및 성상세포의 활성화를 유발한다. 허혈동물모델에서 교세포의 활성은 면역억제제인 사이클로스포린 A(cyclosporin A)의 투여로 억제된다고 보고되어 있다 (Li, P. A. 등, Exp. Neurol., 165:153-163 (2000); Wakita, H. 등, Stroke, 26(8):1415-1422 (1995); Kondo, Y. 등, Neurosci. Res., 22(1):123-127 (1995); Pakzaban, P. 등, Neuroscience, 65(4):983-996 (1995)). 또한 이러한 교세포의 활성은 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)나 사이타라빈 A(cytarabine-A, Cyt-A)에 의해서도 억제되는 것으로 보고되었다 (Gould, D.J. 및 Goshgarian, H. G.. Exp. Neurol. 158(2):394-402 (1999)). 사이클로포스파미드나 Cyt-A에 의한 교세포의 활성 억제는 세포분열 억제작용에 기인하는 것으로 보인다. 사이클로스포린 A에 의한 교세포 활성의 억제는 프레드니솔론 (prednisolone)과 아자티오프린(azathioprine)의 병용 투여에 의하여 효과가 증강되는 것으로 보고되었다 (Pedersen, E. B. 등, Neuroscience, 78(3):685-701(1997)). 일반적으로 성상세포 (astrocytes)는 신경세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. 그러나 소교세포는 사이토카인에 의하여 활성화되면 리소좀 활성을 가지거나 식작용 활성을 가지는 말초조직의 대식세포와 비슷한 기능을 갖게 된다. 소교세포의 지나친 활성은 주변 세포에 독성을 미치는 것으로 여겨지고 있다. 따라서 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨씨병 등의 뇌질환에서 신경세포의 사멸을 억제하기 위해서는 소교세포의 활성화를 억제하는 것이 매우 중요할 것으로 사료된다.

소교세포 활성화 억제제 개발

최근 메틸도파민 유도체가 소교세포의 활성화에 따른 여러 사이토카인 및 NO의 발현을 억제하며 뇌졸중 쥐에서 신경세포의 손상을 감소시키는 것으로 보고된 바 있다 (Cho, S. 등, J. Cereb. Blood Flow Metab., 21:550-556 (2001); Cho, S. 등, J. Neurosci., 19:878-889 (1999)). 본 발명자들은 이와 유사한 유도체를 개발하는 과정에서 수종의 크로만계 유도체들을 합성하여 소교세포의 활성화 억제에 대한 효과를 확인하였다.

본 발명의 목적은 소교세포 활성화 억제제로서 유용한 신규 크로만계 유도체 화합물을 제공 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 함유하는 소교세포 활성화 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소교세포 활성화 억제제로서 유용한 하기 화학식 1의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

화학식 1

상기 식에서,

R은 H, C₁-C₄ 저급 알킬, 벤질 또는 페닐기이고, X는 C=O 또는 CH₂이다.

본 발명에서 "C₁-C₄ 저급 알킬"은 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸을 포함한다.

본 발명의 바람직한 화합물은 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 프로필아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 부틸아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 페닐아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 벤질아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 부틸아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 프로필아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 페닐아마이드 및 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 벤질아마이드를 포함한다.

본 발명의 가장 바람직한 화합물은 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 프로필아마이드 및 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 부틸아마이드를 포함한다,

본 발명은 통상적인 방법에 따라 제조되는, 예를 들어, 알칼리 금속염(예: 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리토금속염(마그네슘염, 칼슘염 등)과 같은 무기금속염, 암모늄염, 유기염기염(예: 트리메틸아민염, 트리에틸아민염, 피리딘염, 피콜린염 등) 등 당업계에 공지된 다양한 약제학적으로 허용가능한 염의 형태의 화합물들도 포함한다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1 화합물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 화합물은 하기의 반응식들에 도시된 방법에 의해 제조될 수 있지만, 이들 예로만 한정되는 것은 아니다. 하기의 반응식들은 본 발명의 대표적인 화합물들의 제조방법을 제조 단계별로 나타내는 것으로 다른 화합물들은 당업자들에 의해 숙지된 시약 및 출발물질의 적당한 변화에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 유도체들은 프리델-크라프트스(Friedel-Crafts) 아실화 반응을 주 단계로 이용하여 얻어진다.

화학식 1 화합물을 제조하는 방법은 하기 반응식 1에 기재된 바에 의해 설명되어진다.

메톡시히드로퀴논과 말레익산 무수물을 알루미늄클로라이드 촉매하에 프리델-크래프트스 아실화 반응을 하여 중간체를 얻고 소듐아세테이트를 처리해서 고리화하여 중간체 KL-1055를 제조하고, 이 중간체에 옥살릴클로라이드 또는 디시클로헥실카보디아마이드(DCC)를 처리한 후 대응하는 암모니아, 프로필아민, 부틸아민, 아닐린, 벤질아민 등을 처리하여 유도체 KL-1090, KL-1037, KL-1044, KL-1134, 및 KL-1135 등을 제조할 수 있다.

벤질릭 케톤이 제거된 카복사마이드 유도체 화합물들의 제조는, 중간체 KL-1055를 에탄올-초산 용매에서 10% pd/c 촉매하에 접촉환원하여 중간체 KL-1073을 제조하고, 이 중간체 KL-1073을 케토아마이드 유도체들의 합성과 동일한 방법으로 부틸아민, 프로필아민, 아닐린, 벤질아민 등을 처리하여 유도체 KL-1154, KL-1155, KL-1056 및 KL-1157 등을 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1의 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 유효 활성 성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 뇌졸중, 알쯔하이머병 및 파킨슨씨병으로부터 선택되는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.활성화된 소교세포는 뇌신경세포의 사멸을 유도하므로, 소교세포의 활성화를 억제하는 본 발명의 약학 조성물은 활성화된 교세포에 의하여 영향을 받을 수 있는 뇌졸중, 알쯔하이머병, 파킨슨씨병과 같은 뇌질환들의 예방 및 치료를 위해 사용될 수 있다.

화학식 1의 크로만 유도체를 통상적인 방법에 따라 적절한 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 상기 질환 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 크로만 유도체의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 500mg/kg, 바람직하게는 0.5 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 4-(2,5-디하이드록시-4-메톡시페닐)-4-옥소뷰트-2-이노산의 제조

메톡시히드로퀴논 (5g, 35.68 mmol)을 500ml 둥근 플라스크에 넣고 질소기류하에서 환류시키고 디클로로메탄 (250ml)을 넣어 녹인 후 말레익 산 무수물 (5.948g, 60.66mmol)을 넣어 다시 교반하였다. 그 후 얼음욕에서 알루미늄클로라이드 (16.651g 128.87mmol)를 조금씩 가한 후 24시간동안 환류 교반하였다. 교반하면서 냉각시킨 후 얼음욕에서 15ml의 증류수를 10분에 걸쳐 서서히 첨가하고 증류수 35mL을 다시 10분에 걸쳐 첨가하였다 (주의 :많은 양의 증류수를 한번에 첨가하면 많은 열과 가스가 방출된다). 열이 방출된 후, 진한 염산 5ml를 넣고 교반하며 40분간 방치하였다. 감압하에서 농축하여 디클로로메탄을 제거하고, 60℃의 물 100 ml로 녹이고 비이커로 옮겨 2시간동안 냉각하여 결정화해서 생성물을 얻었다.

수율: 28.8%, 2.45g

m. p. 177∼179℃

IR(KBr): 3346, 1634 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.05(s, 1H, Ar-H), 6.90(d, J=12Hz, 1H, =C-H ), 6.47(s, 1H, Ar-H), 6.28(d, J=12Hz, =C-H), 3,93(s, 3H, OMe)

제조예 2: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 (KL-1055)의 제조

4-(2,5-디하이드록시-4-메톡시페닐)-4-옥소뷰트-2-이노산 (2g, 8.4mmol)을 에탄올 200ml에 녹이고 소듐아세테이트를 증류수 50ml에 녹인 후 500ml 둥근 플라스크에 넣고 6시간동안 환류 교반하였다. 1N 염산 50ml을 넣어 산성화시키고, 에탄올만을 감압농축했다. 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출하고 감압농축하여 결정화하였다.

수율: 67%, 1.34g

m. p.: 200∼204℃

IR(KBr): 3441, 1680, 1624 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.91 (s, 1H, Ar-H), 6.72 (s, 1H, Ar-H), 5.48 (s, 1H, OCH(CH₂)COOH), 3.94 (s, 3H, OMe), 2.96 (d, J=16.7Hz, 1H, COC H ₂), 2.68 (dd, J=16.7Hz, J=7.6Hz, 1H, COCH ₂)

제조예 3: 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 (KL-1073)의 제조

6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 (KL-1055) (1g, 4.20mmol)을 에탄올에 녹여 250ml 플라스크에 넣고 여기에 10% pd/c (500mg) 과 AcOH (0.3ml)을 첨가하여 수소기류하에서 하루동안 교반하였다. 셀라이트(celite) 패드를 통하여 백금 촉매를 여과하고 농축한 후 3% MeOH/CH₂Cl₂ (500ml) + AcOH (2ml)를 전개용매로 사용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그라피(실리카겔 230-400 메쉬, 머크 9385)로 정제하여 생성물 KL-1073을 얻었다.

수율: 55.8%, 525mg

m. p.: 129∼131.1℃

IR(KBr): 3426, 1707 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.37 (s, 1H, Ar-H), 6.13 (s, 1H, Ar-H), 4.78 (t, 1H, J=7.2Hz, 1H, OCH(CH₂)CO), 3.51 (s, 3H, OMe), 3.00-2.95 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.57-2.50 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.47-2.33 (m, 2H, CH₂).

실시예 1: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 아마이드 (KL-1090)의 제조

6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 (KL-1055) (300mg, 1.26mmol)을 100ml 플라스크에 넣고 디클로로메탄 40ml로 녹였다. 0.45ml의 옥살릴클로라이드를 넣은 후 디메틸포름아마이드 두방울을 첨가하고 질소상태에서 18시간동안 교반하였다. 반응액을 감압농축하여 디클로로메탄 6ml로 녹이고, 암모니아수(2ml)를 디클로로메탄 12ml에 녹인 후 섞어서 18시간동안 교반하였다. 에틸아세테이트로 추출하고 무수소듐설페이트로 건조시킨 후 농축하여 5% 메탄올/디클로로메탄을 전개용매로 사용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그라피(실리카겔 230-400 메쉬, 머크 9385)로 정제하여 유도체 KL-1090을 얻었다.

수율: 65.6%, 196mg

m. p.: 219℃ (dec)

IR(KBr): 3518, 3386, 1729 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.11(s, 1H, Ar-H), 6.78(s, 1H, Ar-H), 3.80(s, 3H, OMe), 3.62(s, 2H, COCH ₂ ), 3.15(s, 2H, NH ₂ )

실시예 2: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 프로필아마이드 (KL-1037)의 제조

(제법 1)

6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산(KL-1055) (200mg, 0.84mmol)을 디클로로메탄 10ml에 녹이고 0.3ml의 옥살릴클로라이드를 첨가하고 질소 상태에서 18시간동안 교반하였다. 반응액을 농축하여 디클로로메탄 4ml에 녹이고, 디클로로메탄 (8ml)중의 프로필아민 0.26ml (3.17mmol) 용액을 조금씩 넣고 18시간동안 교반하였다. 반응액을 농축하여 EtOAc : 헥산 (1:2)을 전개용매로 사용하여 플래쉬 컬럼 크로마토그라피(실리카겔 230-400 메쉬, 머크 9385)로 정제하여 유도체 KL-1037을 얻었다.

수율: 15.2%, 36mg

m. p.: 115.9∼157.6℃

IR(KBr): 3436, 3285, 1646 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.09(s, 1H, Ar-H), 6.79(s, 1H, Ar-H), 3.88(s, 3H, OMe), 3.30(s, 2H, COCH₂), 3.30(s, 1H, NH), 3.16(t, J=7Hz, 2H, NHCH ₂ CH₂CH₃), 1.57-1.47(m, 2H, NHCH₂CH ₂ CH₃), 0.92(t, J=7.4Hz, 3H, NHCH ₂CH₂CH ₃ )

(제법 2)

6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 (KL-1055) (238mg, 1mmol)을 무수 테트라하이드로퓨란 (THF) 10ml에 녹이고 질소치환하였다. 0℃로 냉각해서 디시클로헥실카보디아마이드 (DCC) (206mg, 1mmol)를 첨가하여 5분간 교반하고, 히드록시벤조트리아졸 (HOBT) (163mg, 1mmol)을 첨가하여 10분동안 0℃에서 교반하였다. 상온에서 3시간동안 반응시킨 후 40℃에서 감압농축하였다. 농축물을 디클로로메탄 10ml에 녹이고 8.23mmol 프로필아민 0.7ml를 과량으로 첨가하여 질소치환상태로 3시간동안 반응시켰다. 생성되는 디시클로헥실유레아 (DCU)를 여과하여 제거하고, 농축한 후 EtOAc : CH₂Cl₂(1:1)을 전개용매로 플래쉬 컬럼 크로마토그라피(실리카겔 230-400 메쉬, 머크 9385) 정제하여 유도체 KL-1037을 얻었다.

수율: 63%, 176mg

실시예 3: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 부틸아마이드 (KL-1044)의 제조

(제법 1) : 프로필아민 대신에 3.17mmol 부틸 아민 0.33ml를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2의 제법 1과 동일하게 실시하여 유도체 KL-1044를 얻었다

수율: 18.1%, 45mg

m. p.: 67∼69.3℃

IR(KBr): 3371, 2928, 1697 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.86 (s, 1H, Ar-H), 6.66 (s, 1H, Ar-H), 3.89 (s, 3H, OMe), 3.11 (t, J=6.8Hz, 2H, NHCH ₂ CH₂CH₂CH ₃), 2.75 (dd, J=15.2Hz, J=3.6Hz, 1H, COCH ₂), 2.48 (dd, J=15.2Hz, J=8.4Hz, 1H, COCH ₂), 1.45-1.36 (m, 2H, NHCH ₂ CH ₂ CH₂CH₃), 1.32-1.22 (m, 2H, NHCH ₂ CH₂CH ₂ CH₃), 0.87 (t, J=7.2Hz, 3H, NHCH ₂ CH₂CH₂CH ₃ )

제법 2 : 프로필아민 대신에 6.72mmol 부틸 아민 0.7ml를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2의 제법 2와 동일하게 실시하여 유도체 KL-1044를 얻었다.

수율: 75%, 220mg

실시예 4: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 페닐아마이드 (KL-1134)의 제조

프로필아민 대신에 10.9 mmol 아닐린 1ml를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2의 제법 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 89%, 313mg

m. p.: 145∼165℃

IR(KBr): 3325, 2928, 1690 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.70 (d, J=7.8Hz, 2H, Ar-H), 7.46 (t, J=7.7Hz, 2H, Ar-H), 7.26 (t, J=7.3Hz, 1H, Ar-H) 7.11 (s, 1H, Ar-H), 6.91 (s, 1H, Ar-H), 5.18-5.14 (m, 1H, OCH(CH₂)CO), 4.11 (s, 3H, OMe), 3.20 (dd, J=15.5Hz, J=3.3Hz, 1H, COCH ₂), 2.91(dd, J=15.5Hz, J=8.6Hz, 1H, COCH ₂)

실시예 5: 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 벤질아마이드 (KL-1135)의 제조

프로필아민 대신에 9.1mmol 벤질 아민 1ml를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2의 제법 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 61.5%, 200mg

m. p.: 97.2∼99.9℃

IR(KBr): 3289, 3096, 1682 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.89-6.82 (m, 5H, Ar-H), 6.47 (s, 1H, Ar-H), 6.26 (s, 1H, Ar-H), 3.91 (s, 2H, NHCH ₂ ), 3.50 (s, 3H, OMe), 2.44 (d, J= 15.2Hz, 1H, COCH ₂), 2.17 (d, J=15.2Hz, 1H, COCH ₂)

실시예 6: 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 부틸아마이드 (KL-1154)의 제조

6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 (KL-1073) (100mg, 0.45mmol)을 출발물질로 사용하여, 실시예 3의 제법 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 89%, 113.4mg

m. p.: 90∼160℃

IR(KBr): 3325, 2929, 1627 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.55 (s, 1H, Ar-H), 6.31 (s, 1H, Ar-H), 4.96 (s, 1H, OCH(CH₂)CO), 3.68 (s, 3H, OMe), 3.35 (s, 1H, CH ₂Ph), 3.18-3.10 (m, 2H, NHCH ₂ CH₂CH₂CH₃), 2.75-2.68 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.56 (m, 2H, CH₂), 1.77-1.73 (m, 2H, NHCH ₂ CH ₂ CH₂CH₃), 1.38-1.36 (m, 2H, NHCH ₂ CH₂CH ₂ CH₃), 0.86-0.84 (m, 3H, NHCH ₂ CH₂CH₂CH ₃ ).

실시예 7: 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 프로필아마이드 (KL-1155)의 제조

6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 (KL-1073) (100mg, 0.45mmol)을 출발물질로 사용하여, 실시예 2의 제법 2와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 77.7%, 92mg

m. p.: 120.9∼124.5℃

IR(KBr): 3308, 2931, 1643 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 6.80 (s, 1H, Ar-H), 6.55 (s, 1H, Ar-H), 5.20 (t, 1H, J=7.3Hz, 1H, OCH(CH₂)CO), 3.92 (s, 3H, OMe), 3.60-3.46 (m, 2H, NHCH ₂ CH₂CH₃), 3.33-3.25 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.98-2.93 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.76-2.66 (m, 2H, CH₂), 1.68-1.48 (m, 2H, NHCH ₂ CH ₂ CH₃), 1.08 (t, J=7.4Hz, 3H, NHCH₂CH₂CH ₃ )

실시예 8: 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 페닐아마이드 (KL-1156)의 제조

6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 (KL-1073) (100mg, 0.45mmol)을 출발물질로 사용하여, 실시예 4와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 70.4%, 94mgg

m. p.: 115.4∼116.9℃

IR(KBr): 3346, 1634 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.68 (d, J=7.2Hz, 2H, Ar-H), 7.43 (t, J=7.2Hz, 2H, Ar-H), 7.22 (t, J=7.2Hz, 1H, Ar-H), 6.80 (s, 1H, Ar-H), 6.57 (s, 1H, Ar-H), 5.29 (t, J=7.2Hz, 1H, OCH(CH₂)CO), 3.90 (s, 3H, OMe), 3.32 (s, 1H, CH ₂Ph), 2.83-2.79 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.76-2.62 (m, 2H, CH₂).

실시예 9: 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 벤질아마이드 (KL-1157)

6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 (KL-1073) (100mg, 0.45mmol)을 출발물질로 사용하여, 실시예 5와 동일한 방법으로 제조하였다.

수율: 61.6%, 111mg

m. p.: 159.8∼161.5℃

IR(KBr): 3323, 2926, 1625 cm^-1

¹H-NMR (CD₃OD, TMS) δ: 7.46 (s, 5H, Ar-H), 6.81 (s, 1H, Ar-H), 6.56 (s, 1H, Ar-H), 5.26 (t, J=7.3Hz, 1H, OCH(CH₂)CO), 4.56 (s, 2H, NHCH ₂ ), 3.94 (s, 3H, OMe), 3.42-3.37 (m, 1H, CH ₂Ph), 3.04-2.96 (m, 1H, CH ₂Ph), 2.89-2.70 (m, 2H, CH₂).

상기 제조방법들로부터 얻어진 목적 화합물의 생물학적 효능에 대해서 하기한 바와 같이, 아질산염 생성과 iNOS 발현억제, 및 TNF-α 생성억제를 통하여 소교세포 활성화 억제 효과를 측정하였고, LDH 분석을 통하여 활성화된 소교세포에 의한 신경세포 사멸 억제 효과를 측정하였다.

시험예 1: 크로만계 화합물들의 소교세포 활성화 억제 확인

활성화된 소교세포에 의한 아질산염의 생성 및 iNOS 발현 억제

마우스 소교세포(microglial cell)계 BV2 세포(Weill Medical College of Cornell University at Burke Medical Research Institute, White Plains, NY, USA)를 24웰판에 웰당 10만개씩 분주하고 배지에서 하룻밤 배양한 후 100ng/ml의 LPS와 시험 약물들(용량은 도 1 참조)을 배양액에 넣어주고 24시간 더 배양한 후 그리스(Griess) 시약을 사용하여 배지로 유리되어 나온 아질산염의 양을 측정하였다 (Choi, J. J. 및 Kim, W. K., J. Neurosci. Res., 54:870-875 (1998)). 세포에 RIPA 완충용액 (1x 인산염 완충 식염수(PBS), 1% NP40, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 0.4mM PMSF, 30 ug/ml 아프로티닌(aprotinin), 1 nM sodiumorthovanadate)을 처리하여 단백질을 분리하고 10% SDS 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동한 후 iNOS 항체(BD Biosciences, USA)를 이용하여 웨스턴 분석을 실시하여 발현된 iNOS 단백질양을 비교하였다 (Cho, S. 등, Glia. 33:324-33 (2001)).

도 1A에서 보는 바와 같이, KL1037은 40μM의 농도에서 LPS (100 ng/ml)에 의해 유리되는 NO의 양을 약 2/3으로 감소시켰으며, 400μM의 농도에서는 약 1/12로 감소시켰다.

도 1B에서 보는 바와 같이, KL1044는 20μM의 농도에서 LPS (100 ng/ml)에 의해 유리되는 NO의 양을 약 2/3로 감소시켰으며, 200μM의 농도에서는 약 1/4로 감소시켰다.

도 1C에서 보는 바와 같이, iNOS 항체를 이용한 웨스턴 분석시 KL1037 (400μM)및 KL1044 (200μM)에 의하여 iNOS 단백질의 생성이 현저히 감소하였음을 확인하였다.

KL1037과 KL1044의 NO 억제 작용 및 iNOS 발현 억제 작용은 일차 배양한 (primary culture) 랫트의 소신경교세포에서도 같은 결과를 얻었다.

활성화된 소교세포에 의한 TNF-α생성 억제

BV2 마우스 소교세포를 상기 방법과 동일하게 LPS와 시험 약물들로 처리하고 6시간 또는 24시간 배양 후 배지로 유리되어 나온 TNF-α를 TNF-α ELISA kit(DIACLONE Research, USA)를 이용하여 측정하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, 0.4 mM KL1037은 100 ng/ml LPS에 의해 유리되는 TNF-α를 약 1/20 내지 1/10로 감소시켰으며 (거의 기저 수준으로 감소), 0.2 mM의 KL1044는 약 1/3 내지 1/4배로 감소시켰다. 감소시키는 정도는 6시간 및 24시간에서 동일하였다.

KL1037과 KL1044의 TNF-α 유리 억제 작용은 일차배양한 (primary culture) 래트 소신경교세포에서도 같은 결과를 얻었다.

활성화된 소교세포의 NO 및 TNF-α 유리 억제 작용에 대한 IC ₅₀ 값

KL1037 및 KL1044를 포함하는 본 발명의 화합물들의 활성화된 소교세포에서 생성 유리되는 NO 및 TNF-α 유리 억제 작용에 대한 IC₅₀ 값은 표 1 및 2과 같이 나타내어진다

화합물	NHR	IC₅₀ (μM)
화합물	NHR	NO 유리	TNF-α 유리
KL-1055	-OH	>500	>500
KL-1037	-NHCH₂CH₂CH₃	94	88
KL-1044	-NHCH₂CH₂CH₂CH₃	42	43
KL-1134	-NHC₆H₅	22	32
KL-1135	-NHCH₂C₆H₅	29	33

화합물	NHR	IC₅₀ (μM)
화합물	NHR	NO 유리	TNF-α 유리
KL-1073	-OH	>500	>500
KL-1154	-NHCH₂CH₂CH₂CH₃	32	41
KL-1155	-NHCH₂CH₂CH₃	33	37
KL-1156	-NHC₆H₅	39	40
KL-1157	-NHCH₂C₆H₅	40	42

시험예 2: 크로만계 화합물의 신경세포사멸 억제 확인

활성화된 소교세포에 의한 신경세포 사멸의 억제

마우스 소신경교세포계 BV2 세포를 트랜스웰 세포배양 삽입물 (Transwell cell culture inserts, NUNC, USA)의 미세공 막에서 키운 후 100 ng/ml의 LPS를 6시간 동안 처리하여 소신경교세포를 활성화시켰다. 활성화된 소신경교세포를 포함하는 insert를 SK-N-BE(2)C 신경아세포종 세포(ATCC #: CRL-2271, USA)을 포함하고 있는 웰에 올려놓아 공배양하였다. 이 때 KL1037 및 KL1044를 각각 0.4 mM, 0.2 mM로 공배양 배지에 첨가하였다. 36 시간 배양 후, SK-N-BE(2)C 신경아세포종 세포의 형태를 관찰하고 세포사멸의 지표인 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH) 유리 분석을 통하여 세포 사멸의 정도를 비교하였다 (Choi, J. J. 및 Kim, W. K., J. Neurosci. Res., 54:870-875 (1998)).

도 3에서 보는 바와 같이, 0.4 mM의 KL1037은 활성화된 소신경교세포에 의한 신경세포의 사멸을 약 70 % 정도로 감소시켰으며 0.2 mM의 KL1044는 약 77 %로 감소시켰다.

KL1037과 KL1044의 신경세포사멸 억제 작용은 일차 배양한 (primary culture) 래트 소신경교세포에서도 같은 결과를 얻었다.

본 발명의 신규 크로만계 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물은 소교세포의 활성화 억제제로서 작용하여, 신경세포의 사멸을 억제함으로써 뇌졸중, 알쯔하이머병 및 파킨슨씨병 등의 뇌질환 치료제로서 유용하다.

도 1a 내지 1c: BV2 소교세포에서의 본원 화합물에 의한 아질산염 생성 감소. 도 1a: 화합물 KL1037; 도 1b: 화합물 KL1044; 도 1c: iNOS 항체를 이용한 웨스턴 분석.

도 2: 본원 화합물에 의한 TNF-α 생성 감소.

도 3: BV2/SK-N-BE(2)C 공배양으로부터 방출되는 LDH의 양.

Claims

하기 화학식 1의 크로만 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

화학식 1

상기 식에서,

R은 H, C₁-C₄ 저급 알킬, 벤질 또는 페닐기이고, X는 C=O 또는 CH₂이다.
제 1 항에 있어서,

하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 크로만 유도체:

6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 프로필아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 부틸아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 페닐아마이드, 6-히드록시-7-메톡시-4-옥소크로만-2-카복실산 벤질아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 부틸아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 프로필아마이드, 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 페닐아마이드 및 6-히드록시-7-메톡시크로만-2-카복실산 벤질아마이드.
제 1항의 크로만 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 활성 성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 뇌졸중, 알쯔하이머병 및 파킨슨씨병으로부터 선택되는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
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