이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
본 발명에 따른 가시오가피 추출물은 물, 저급 알코올, 헥산, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합 용매로 추출, 농축 및 동결건조하여 얻을 수 있는데, 상기 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되며, 메탄올이 수득율이 높은 이유로 바람직하다. 상기 저급 알코올 이외에도 에틸 아세테이트 및 헥산도 사용가능하다.
상기 가시오가피 추출물 제조시 추출 과정은 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출 및/또는 감압농축법이 사용될 수 있으며, 이 밖에도 통상적으로 사용되는 추출법이 사용될 수 있다. 농축 및 동결과정 역시 통상적으로 알려진 방법이 다양하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 제제의 유효 성분으로는 상기의 방법으로 제조된 가시오가피 추출물 외에도 상기 가시오가피 추출물을 n-헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층 또는 물층으로 분리한 후 이를 감압농축 및 동결 건조하여 제조한 분획을 사용할 수도 있으며, 또한, 상기 가시오가피 추출물을 부탄올 층과 물층으로 각각 분리한 후 이를 물에 녹여 합한 다음 감압 농축하여 100% 에탄올을 첨가하여 분리된 에탄올 비가용성 당분획과 가용성 비당분획을 감압농축 및 동결 건조하여 제조된 성분을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 가시오가피 추출물은 골길이 성장 촉진 작용이 탁월하기 때문에 골길이 성장 장애의 치료 및 예방제로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 상기 가시오가피 추출물의 골길이 성장 촉진 활성을 확인하기 위하여 1972년 헨슨이 개발한 테트라사이클린 방법(tetracycline method)을 사용하였다(Hansson L. I. 등,Calcif. Tissue Res.10:238-51, 1972). 상기 방법은 테트라사이클린이 칼슘과 킬레이트 결합을 하며, 생성된 테트라사이클린-칼슘 복합체는 골길이 생성이 가장 활발한 성장기에 골성장판 하부의 골신생부에 가장 많이 침착하여 선을 형성한다는 원리를 이용한 것으로써 일정기간을 두고 테트라사이클린을 투여한 다음 각 선사이의 길이를 형광 현미경으로 관찰하면 성장한 길이를 측정할 수 있다.
본 발명에서는 먼저, 바람직한 테트라사이클린의 투여 간격을 알아보기 위하여 랫트에 각각 1일, 2일, 4일, 또는 7일의 간격으로 테트라사이클린을 2회 투여한 다음 족경골 근위부의 시상절편 표본을 제작하여 두 개의 밴드가 선명하게 적절한 간격으로 나타나는 지를 확인하였다. 그 결과 2일 즉, 48시간 간격으로 투여하였을 경우가 가장 바람직함을 확인하였고 이하 실험에서 이 방법을 사용하였다(도 1 참조).
가시오가피 추출물이 골길이 성장에 미치는 효과를 확인하기 위하여 랫트에 가시오가피 추출물을 투여한 후 상기한 테트라사이클린 방법으로 골길이 성장율을 측정하였다. 이때 투여된 가시오가피 추출물이 성장판에 도달하여 작용을 미치는 시간은 최소 12시간이므로(De Luca F. 등, 141:346-53, 2000) 본 발명에서는 테트라사이클린 투여 48시간 전부터 하루 1회씩 총 5일동안 가시오가피 추출물을 투여하였다. 그 결과 본 발명의 가시오가피 추출물을 투여하였을 경우 투여하지 않은 경우보다 골길이 성장률이 약 1.53배 증가됨을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 가시오가피 추출물을 n-헥산층, 에틸 아세테이트층, 부탄올층 및 물층으로 분리한 분획을 투여한 결과 정상군과 비교하여 골길이 성장율이 n-헥산층이 1.07배, 에틸 아세테이트층이 1.14배, 부탄올층이 1.56배, 및 물층이 1.54배로 증가됨을 확인하였다(도 3a 참조). 특히 골길이 성장 증가율이 높은 부탄올층 및 물층은 합친 다음 에탄올 비가용성 분획과 에탄올 가용성 분획으로 다시 분리하여 투여하였다. 투여후의 골길이 성장율을 정상군과 비교한 결과 당류 분획의 경우 정상군 대비 약 1.5배, 비당류 분획의 경우 약 1.8배의 골길이 성장율 증가가 나타남이 관찰되었다(도 3b 참조). 따라서, 상기 실험결과로 비당류 분획의 골길이 성장활성 촉진효과가 더 크다는 결론을 얻었다.
또한, 본 발명에서는 가시오가피 추출물이 성장판에 미치는 영향을 알아보기 위해 성장판 내의 연골세포를 관찰한 결과 정상군과 비교하여 휴지부, 증식부 및 비대부의 길이가 상승하였고, 특히 비대부의 길이는 가시오가피 추출물 투여후 그 길이가 현저하게 증대되었음을 확인할 수 있었는데(도 4a 및 b 참조), 상기 결과는 가시오가피 추출물이 성장판 내 연골세포 분화율 및 대사율을 증진시킴을 증명하는 것이다.
다음으로 본 발명에서는 상기 가시오가피 추출물 골길이 성장 촉진의 구체적인 기작을 규명하고자 하였다.
현재까지 골길이 성장은 성장호르몬(Growth Hormone), 인슐린양 성장인자(IGF-1) 및 이의 관련인자(Sims N. A. 등, J. Clin. Invest. 106:1095-103, 2000; Reinecke M. 등 Endocrinology 141:2847-53, 2000; Klaus G. 등, Pediatr Nephrol 14:612-5, 2000; Edmondson S. R. 등, Kidney Int. 58:62-70, 2000; Garcia-Ramirez M. 등: J. Bone Miner. Res. 15:534-40, 2000; De Los Rios P. 등, J. Cell Physiol. 183:172-81, 2000), 부갑상선호르몬(PTH; Yoshida E. 등, Exp. Cell Res. 265:64-72, 2001; Kronenberg H.M. 및 Chung U., Novartis Found Symp. 232:144-52, 2001; Guo J. 등, Endocrinology 142:1260-8, 2001; Medill N. J. 등, J. Cell Biochem. 80:504-11, 2001, Chung U. I. 등, J. Clin. Invest. 107:295-304, 2001; Mitchell J. A. 등, Endocrinology, 142:907-15, 2001; Huang W. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:160-5, 2001) 및 성호르몬(Sex hormone) 인자의 상호작용에 의해 결정된다고 알려져 있다(Grumbach M. M., J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 13:1439-55, 2000; Kniffen D. M. 등, J. Anim. Sci. 77:2886-92, 1999). 혈액내 성장호르몬과 부갑상선 호르몬 및 성호르몬 양의 분석은 그 변화가 너무 급격하고 4∼5배에 달하기 때문에 한약 투여에 따른 호르몬 생리 반응을 관찰하는 것은 별로 효과적이지 못하다. 이에 본 발명자들은 골길이 성장이 성장판 연골대사에 의해 이루어진다는 점에 착안하여 골대사 과정에서 조골세포의 기능을 증강시키는 것으로 알려진 BMP-2와 성장호르몬의 분비에 따라 연골세포에서 자가 분비하여 세포분열 촉진작용을 한다고 알려진 IGF-1의 발현이 가시오가피 추출물 투여에 따라 연골 조직 내에서 변화하는 지를 확인하고자 하였다. 구체적으로는 항체를 사용한 면역화학적 염색 방법을 사용하였는데, 그 결과 가시오가피 추출물 투여군에서 비교하였을 때 증식부(A, B, C 및 D)와 성숙부(E, F, G, 및 H)에서는 두드러진 차이가 나타나지는 않았으나, 비대부(I, J, K 및 L) 및 골화부(M, N, O 및 P)의 경우 BMP-2 및 IGF-1의 발현이 증가되었음을 뚜렷이 확인할 수 있었다(도 5a 및 b 참조). 상기 결과에 따라 가시오가피 추출물이 골길이 성장에 중요한 인자인 BMP-2 및 IGF-1의 발현을 증가시킴으로써 골길이 성장을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 가시오가피가 BMP-2 및 IGF-1의 발현만을 증가시킴으로써 골길이 성장을 촉진한다고 간주하기는 어려우며 다른 기작과의 상호작용에 의해 궁극적인 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
본 발명에서는 상기 가시오가피 추출물의 독성 여부를 랫트를 대상으로 경구 투여 및 복강 투여를 통하여 확인하였고, 독성이 없음을 확인하였다.
전술한 결과들을 통하여 확인된 상기 가시오가피 추출물의 골길이 성장 촉진 효과는 매우 뛰어난 것이다.
가시오가피 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 골길이 성장 장애 치료 및 예방을 위한 약학적 제제는 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 가시오가피 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 가시오가피 추출물의 유효 용량은 환자의 성별, 나이, 체중, 및 질환의 정도 등에 따라 차이가 있을 수 있으나, 일반적으로 10∼5000 mg/㎏을 하루에 1∼3회로 나누어 투여할 수 있으며, 100∼250 mg/㎏이 바람직하다.
결과적으로 본 발명의 가시오가피 추출물은 BMP-2 및 IGF-1의 발현율 증가 등의 기작에 의한 뛰어난 골길이 성장 촉진 활성을 가질 뿐 아니라 독성을 갖지 않는 것으로 확인되었으므로, 임상에서 소인증, 왜소증, 키 성장 저하 등의 골길이 성장 장애 환자를 위한 치료제 및/또는 예방제로 사용할 수 있다.
이하, 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보지만, 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
가시오가피 추출물의 제조
하기 실시예에 사용된 가시오가피(Acanthopanax senticosus)는 파진 바이오텍(주)에서 구입하여 경희대학교 한의과대학 본초학 교실의 검증을 받은 후 사용하였다.
가시오가피 추출물을 제조하기 위하여 먼저, 가시오가피 100 g에 70% 에탄올 1ℓ를 첨가한 후 30분간 초음파 추출하고 여과하여 1차 추출액을 얻었다. 다음으로 다시 70% 에탄올 1 ℓ를 가시오가피에 첨가한 후 30분간 초음파 추출을 2회 반복하여 2차 추출액을 얻은 후 1차 추출액과 2차 추출액을 합하여 혼합 추출액을 만들었다. 제조된 혼합 추출액을 감압농축 및 동결건조하여 18.3 %의 수율로 정제된 가시오가피 건조 추출물 18.3 g을 얻었다.
실시예 2
가시오가피 추출물 분획의 분리
상기 실시예 1에서 얻은 가시오가피 추출물을 물에 녹인 후 분획 여두를 이용하여 n-헥산층, 에틸 아세테이트층, 부탄올층 및 물층으로 각각 3회 이상 분리하였고, 각 층별로 모아 감압농축한 후 동결건조하였다. 각 분획층의 건조 분말 2 ㎎을 1 ㎖의 생리식염수에 녹이고 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음 시료로 사용하였다.
실시예 3
테트라사이클린 투여 시기 결정
가시오가피 추출물 투여에 따른 랫트의 골길이 성장 정도의 측정을 위해 Hansson의 테트라사이클린 방법(tetracycline method)을 사용하였다(Hansson L. I., Menander-Sellman K., Stenstrom A., 및 Thorngren K. G.: Rate of normal longitudinal bone growth in the rat.Calcif Tissue Res.10:238-51, 1972). 테트라사이클린은 체내에 들어가면 신속히 흡수되어 골형성이 활발한 부위나 무기질 침착부위에 집중되고 조직 절편에서 밝은 형광선으로 보이는데, 이때 적절한 형광선의 간격을 유지하기 위해서는 랫트의 성장 정도에 적절한 테트라사이클린 투여시기가 결정되어야 한다.
먼저, 대한 실험동물로부터 구입한 3주령된 80±10 g의 수컷(Sprague-Dawley계)을 1주간 실험환경에 적응시킨 다음 4개의 군으로 나누고 각각 1일, 2일, 4일 또는 7일의 간격으로 테트라사이클린을 총 2회 투여하였다.
두번째 테트라사이클린 투여 1일 후에 랫트를 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate; 純正化學, Japan, 35.0 ㎎/㎏, i.p.)로 마취시켜 개흉하고 우심이를 절개한 다음 좌심실에 니들(needle; No. 18)을 주입하고 헤파린 처리 및 5% 아질산 나트륨(sodium nitrite; Sigma, U.S.A.)을 함유한 생리 식염수를 심장에 관류시켰으며, 다음으로 고정액(0.1 M phosphate buffer;4.0 % formalin; pH 7.4)으로 관류시켰다. 관류 후 랫트의 좌우 족경골(tibia)를 떼어내고 2시간 동안 고정액에 후고정(postfixation)을 시킨 다음, 50 mM EDTA에 2∼3일 동안 방치하여 탈회하고 동결에 대한 보호를 위해 4℃에서 30% 수크로오즈(sucrose)에 하룻밤동안 담가두었다. 상기의 방법으로 고정된 골조직을 동결한 후 절단기(sliding microtome; HM440E, Zeiss, Germany)을 사용하여 40 ㎛씩 절단함으로써 족경골(tibia) 근위부(proximal part)의 시상절편(sagital section)을 수집하였다.
골길이 성장 측정을 위하여 40 ㎛로 수집된 족경골 근위부 시상절편을 슬라이드 글라스 위에 각각 올려놓고 건조한 후 형광 현미경을 통해 400 nm 파장의 자외선 하에서 관찰하였다(도 1 참조). 성장의 지표는 골 조직 내 테트라사이클린의 침착으로 형성된 2개 선사이의 길이를 사용하였다.
관찰 결과, 4일과 7일 간격으로 테트라사이클린을 투여한 경우에는 1차로 투여된 테트라사이클린의 형광선이 희미하였고, 1일 간격으로 투여한 경우 두 형광선 사이의 길이가 너무 짧아 성장 효과관찰에 적합하지 않을 것으로 판단되었다. 결과적으로 2일의 간격으로 테트라사이클린을 투여하였을 경우가 골길이 성장률 측정을 위해 가장 바람직한 것으로 판단되었다.
실시예 4
가시오가피 추출물의 효능 투여와 실험군의 설정
가시오가피 추출물 투여에 따른 랫트의 골길이 성장 정도의 측정을 위해 Hansson의 테트라싸이클린 방법(tetracycline method)을 사용하였다(Hansson L. I., Menander-Sellman K., Stenstrom A., 및 Thorngren K. G.: Rate of normal longitudinal bone growth in the rat.Calcif Tissue Res.10:238-51, 1972).
먼저, 대한 실험동물로부터 구입한 3주령된 80±10 g의 수컷(Sprague-Dawley계)을 1주간 실험환경에 적응시킨 다음 정상군, 양성 대조군, 가시오가피 추출물 투여군으로 나누었다.
가시오가피 투여군의 경우 먼저 생리식염수 1 ㎖에 실시예 1에서 준비된 가시오가피 추출물 1, 10 및 100 ㎎을 녹이고 0.45㎛ 필터로 여과하여 준비한 후 테트라싸이클린 투여 2일전 부터 실험 종료일까지 5일간, 1일 1회 가시오가피 추출물을 복강에 주사하였다. 정상 대조군의 경우 상기와 동일한 방법으로 생리 식염수를 투여하였으며, 양성 대조군은 재조합 인간 성장 호르몬이 골길이 성장을 증가시킨다는 보고에 따라(Isgaard J, Nilsson A, Lindahl A, Jansson JO, 및 Isaksson OG: Effects of local administration of GH and IGF-1 on longitudinal bone growth in rats. Am J Physiol 250:E367-72., 1986) 재조합 성장호르몬(recombinant human growth hormone) 20 ㎍/㎏을 생리 식염수에 녹여 상기와 동일한 방법으로 테트라싸이클린 투여 2일전 부터 실험 종료일까지 5일간, 1일 1회 피하 주사하였다.
다음으로 상기 모든 실험 군에서 처음 시료를 접종한 지 2일 후 테트라사이클린(oxytetracycline (OTC): Terramycin Vet, Pfizer, NY) 10 ㎎/㎏을 복강 주사하였고, 다시 2일 후 동일한 시간에 동일한 용량의 테트라사이클린을 재투여하였다. 투여 후에는 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 조직 표본을 제작하고 두 형광선 사이의 길이를 측정하였다(도 2 참조). 골길이 성장 효과의 판정을 위해서는 가시오가피 추출물 투여군을 대조군과 비교하는 Student's t-test 방법을 사용하였다.
그 결과 정상 대조군의 경우 489.0 ± 70.1 ㎛/days (n=5), 양성 대조군에선 925.0 ± 112.6 ㎛/days (n=5)의 골길이 성장률이 나타났으며(p< 0.05), 가시오가피 투여군의 경우 각각 1, 10, 100 mg/kg을 투여하였을 때 459.7 ± 142.7 ㎛/days (n=5), 509.0 ± 106.2 ㎛/days (n=5), 및 752.4 ± 24.7 ㎛/days (n=5)의 골길이 성장율을 나타냄으로써 10 mg/kg 이상을 투여하였을 경우 정상 대조군보다 증가된 골길이 성장 효과가 나타남을 확인하였다(p < 0.01).
실시예 5
가시오가피 추출물 분획 투여에 따른 골길이 성장 효과
상기 실시예 2에서 n-헥산층, 에틸 아세테이트층, 부탄올층 및 물층으로 각각 3회 이상 분리된 가시오가피 추출물 분획을 각각 감압농축한 후 동결건조하였다. 각 분획층의 건조 분말 2 ㎎을 1 ㎖의 생리식염수에 녹이고 0.45 ㎛ 필터로 여과한 다음 시료로 사용하는데 분획이라는 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 각 분획 투여에 따른 골길이 성장 효과를 비교하였다(도 3a 참조).
그 결과 정상군에서는 489.0±70.1 ㎛/days (n=5)의 골길이 성장을 보인 반면, 가시오가피 헥산 분획 투여의 경우 523.4±521 ㎛/days (n=5), 에틸 아세테이트 분획 561.1±80.6 ㎛/days (n=5), 부탄올 분획 763.1±32.84 ㎛/days (n=5; p<0.01), 물 분획 756.7±38.4 ㎛/days (n=5; p<0.05)의 골길이 성장을 나타냄으로써 모든 분획이 정상군 보다는 증가된 골길이 성장 효과를 나타냄을 확인하였으며, 특히 부탄올 분획과 물 분획을 투여한 경우 골길이 성장 효과가 매우 큼을 확인할 수 있었다.
실시예 6
상기 실시예 5에서 높은 효과를 나타낸 부탄올층과 물층은 물에 녹여 다시 합한 다음 감압 농축하고, 준비된 농축액을 100% 에탄올에 넣어 침전시키고 에탄올 비가용성 분획과 에탄올 가용성 분획으로 분리하였다. 상기 분리된 다당류와 비다당류를 각각 다시 감압농축하고 동결건조한 다음 얻어진 분말 각 2 ㎎을 1 ㎖의 생리 식염수에 녹이고 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 시료를 준비하였다.
상기 준비된 시료가 부탄올층과 물층은 물에 녹여 합한 후, 100% 에탄올에 넣어 침전시켜 에탄올 비가용성 분획과 에탄올 가용성 분획으로 분리한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 수행한 후 각 분획 투여에 따른 골길이 성장 효과를 비교하였다(도 3b 참조).
그 결과 정상군에서는 489.0±70.1 ㎛/days (n=5)의 골 길이 성장 효과가 나타난 반면 당류 분획의 경우 711.3±13.7 ㎛/days(n=5; p<0.05), 비당류 분획은 858.7±26.9 ㎛/days (n=5) (p<0.01)의 골 길이 성장을 나타냄으로써, 비당류 분획의 골길이 성장 촉진 효과가 비교적 우수함을 확인하였다.
실시예 7
가시오가피 추출물의 성장판 연골세포대사에 미치는 영향
가시오가피 추출물이 성장판에 미치는 영향의 관찰을 위해 먼저, 실시예 4와 동일한 방법으로 제작된 조직 절편 표본을 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색한 다음 성장판 내의 휴지부(resting zone), 증식부(proliferative zone)와 성숙부(maturing zone) 및 비대부(hypertrophic zone)의 연골세포를 관찰하였고 각 부위의 길이를 측정하였고(도 4a 및 b 참조), 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
|
휴지부 |
증식부 |
성숙부 |
비대부 |
정상군 |
24.3±7.4 |
118.4±9.7 |
72.4±7.7 |
170.8±10.5 |
가시오가피 투여군 |
25.0±11.4 |
132.7±12.1 |
71.2±8.2 |
218.5±12.5 |
상기 표 1에 따르면 그 결과 정상군 휴지부, 증식부와 성숙부 및 비대부의길이가 각각 24.3±7.4 ㎛, 118.4±9.7 ㎛, 72.4±7.7 ㎛ 및 170.8±10.5 ㎛인 반면 가시오가피 투여군은 25.0±11.4 ㎛, 132.7±12.1 ㎛, 71.2±8.2 ㎛ 및 218.5±12.5 ㎛으로 전체적으로 길이가 증대되었음을 확인할 수 있었다. 특히, 가시오가피 투여군 비대부의 길이는 현저하게 증대되었음을 확인할 수 있었다(P<0.05). 상기 결과는 가시오가피 추출물이 성장판 내 연골세포 분화율 및 대사율을 증진시키는 것을 알 수 있다.
실시예 8
면역화학염색(Immunohistochemistry)을 통한 BMP-2와 IGF-1의 발현양상 관찰
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 제작된 조직 절편 표본을 0.1 M PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.2)에 5분 동안 담그고, 트리톤 용액(Triton-X 100; Sigma, U.S.A.)에서 15분간 2회, 0.1M PBS + 0.5% BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma, U.S.A.) 용액에서 15분간 2회 씻어낸 다음, 1차 항체(primary antibody)인 BMP-2 항체(Santa Cruz Biotech., U.S.A.)으로 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 0.1 M PBS + 0.5 % BSA 용액으로 15분간 2회 헹군 다음 다시 2차 항체(secondary antibody)인 안티-염소 항체(anti-goat antibody; Vector Lab, U.S.A.)와 60분간 반응시키고, 다시 0.1 M PBS + 0.5% BSA로 15분간 2회 헹군 후 ABC(avidin-biotin-peroxidase) 복합체를 1:50의 농도로 첨가하여 60분 동안 실험실 온도에서 반응시켰다. 반응이 끝난 각 조직 절편들은 0.1 M PBS로 15분간 2회 세척한 다음 최종적으로 발색용액(0.05 % 3,3-diaminobenzidine(Sigma, U.S.A.) 및 0.03 % 과산화수소가 포함된 0.1 M PBS)을 첨가하여 반응시킴으로써 종결시켰다. 발색이 되면 각 조직절편을 0.1 M PBS에 넣어 반응을 중지시킨 뒤 슬라이드 표본으로 제작하여 현미경하에서 관찰하였다(도 5a 참조). 상기 발생 과정은 벡타스타틴 엘리트 ABC 키트(Vectastatin elite ABC kit; Vector Lab, U.S.A.)를 사용하였다.
IGF-1의 발현양상을 관찰하기 위하여 1차 항체로 IGF-1 항체(Santa Cruz Biotech., U.S.A.)를, 2차 항체로는 안티-래빗 항체(Vector Lab, U.S.A.)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하고 현미경하에서 관찰하였다(도 5b 참조).
그 결과 정상군과 가시오가피 추출물 투여군을 비교하였을 때 BMP-2 발현의 정도에 있어서 증식부(A 및 B)와 성숙부(E 및 F)에서는 두드러진 차이가 나타나지는 않았으나, 비대부(I 및 J) 및 골화부(M 및 N)의 경우 가시오가피 추출물 투여군에서 BMP-2 발현이 약간 증가되었다. 또한, IGF-1의 발현의 정도에 있어서 증식부(C 및 D)와 성숙부(G 및 H)에서는 가시오가피 추출물 투여군에서 IGF-1의 발현이 현저히 증가되었음을 확인할 수 있었고, 특히 비대부(K 및 L)와 골화부(O 및 P)에서 대조군보다 많은 수의 연골세포에서 IGF-1가 발현됨을 관찰하였으며, 발현도도 높아 매우 진하게 염색되었음을 관찰하였다.
실시예 9
급성독성 실험
1. 경구투여
ICR계 마우스(25±5 g, 중앙실험동물)와 SD 마우스(Sprague Dawley)를 각각10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 가시오가피 추출물을 각각 500, 725, 1000 및 5000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.
2. 복강투여
ICR계 마우스(25±5 g, 중앙실험동물)와 SD 마우스(Sprague Dawley)를 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 가시오가피 추출물을 각각 25, 250, 500 및 725 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 복강 투여후 24시간 동안 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.
제조예 1
실시예 1의 가시오가피 추출물 100 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
통상의 방법으로 상기의 성분을 혼합하여 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
제조예 2
실시예 1의 가시오가피 추출물 200 ㎎
유당 100 ㎎
전분 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.
제조예 3
실시예 1의 가시오가피추출물 100 ㎎
유당 50 ㎎
전분 50 ㎎
탈크 2 ㎎
스테아린산마그네슘 적량
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제조예 4
실시예 1의 가시오가피 추출물 1000 ㎎
설탕 20 g
이성화당 20 g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100 ㎖
통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.