KR20160063717A

KR20160063717A - 가시오가피 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 가시오가피 추출물을 함유하는 기능성 식품 조성물

Info

Publication number: KR20160063717A
Application number: KR1020140167337A
Authority: KR
Inventors: 이상한; 박성선; 최보화; 김도진
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 김도진
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2016-06-07

Abstract

본 발명은 가시오가피 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 가시오가피 추출물을 함유하는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 가시오가피 추출물은 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 나타내는 유효성분인 엘레우테로사이드 화합물을 높은 농도로 함유하고 있으며, 피로도와 관련된 체내 크레아틴 키나아제(creatine kinase), LDH 및 요산(uric acid) 수치를 감소시키면서도 세포독성을 나타내지 않기 때문에, 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 나타내는 기능성 식품으로 이용될 수 있다.

Description

가시오가피 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 가시오가피 추출물을 함유하는 기능성 식품 조성물{Method for producing Acanthopanax senticosus extract and functional food composition containing the extract made therefrom}

본 발명은 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 우수한 가시오가피 추출물의 제조방법 및 이로부터 제조된 가시오가피 추출물을 함유하는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

가시오가피는 두릅나무과의 낙엽 관목으로, 오갈피나무속(屬)에 속한다. 오갈피나무속 식물은 전 세계적으로 약 35종이 보고되어 있으며, 우리나라에는 오갈피나무, 섬오갈피, 서울오갈피, 지리산오갈피, 털오갈피, 가시오갈피, 왕가시오갈피 등 7종이 자생하는 것으로 알려져 있다. 그 뿌리와 근경 및 수피 등은 예로부터 민간이나 한방에서 약재로 사용되었으며, 카로틴(carotene), 리구스트린(ligustrin), 갈락토사이드(galactoside) 등 다종의 배당체와 플라본(flavone), 클로로겐산(chlorogenic acid), 세사민(sesamin), 카페산(caffeic acid), 정유, 다당류 등을 함유한다.

가시오가피의 약리 작용으로는 진정작용, 항산화작용, 항스트레스작용, 면역증강작용, 근육이완작용 등이 알려져 있으며, 요통, 손발저림, 관절염, 중풍, 고혈압, 암 등의 질병에 대한 치료제로 이용되기도 한다. 또한, 가시오가피는 효능이 뛰어나면서도 불면증 등 다른 부작용이 보고되어 있지 않아 이를 의약품이나 기능성 식품으로 이용하려는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 가령, 대한민국 등록특허 제10-0463263호는 가시오가피 추출물의 골길이 성장 촉진 효과를, 대한민국 등록특허 제10-1072905호는 항당뇨 효과를, 대한민국 등록특허 제10-1281988호는 숙취 해소 및 간기능 개선 효과를, 대한민국 등록특허 제10-0853439호는 발기부전 치료 효과를, 대한민국 등록특허 제10-0458131호는 신경보호효과를 각각 개시하고 있다. 이외에도 가시오가피를 함유하는 의약 또는 식품 조성물을 개시한 여러 문헌들을 확인할 수 있는데, 그 중 일부는 종래 밝혀지지 않았던 가시오가피의 새로운 효과를 개시한 것이나, 대부분은 예로부터 민간이나 한방에서 사용되면서 알려진 가시오가피의 효능을 과학적으로 입증한 것들이다.

그러나 실제로 위와 같은 가시오가피의 효능을 최대로 나타내는 우수한 의약품 또는 식품 조성물을 개발하기 위해서는 가시오가피 추출물의 추출방법과 유효성분 및 효능과의 상관관계를 분석하여 제조공정을 최적화할 필요가 있음에도 이에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이에 본 발명자들은 가시오가피의 효능 중 특히 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 최대화할 수 있는 가시오가피 추출물의 제조방법을 개발하고자 노력한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

1. 대한민국 등록특허 제10-0463263호 2. 대한민국 등록특허 제10-1072905호 3. 대한민국 등록특허 제10-1281988호 4. 대한민국 등록특허 제10-0853439호 5. 대한민국 등록특허 제10-0458131호

본 발명의 목적은 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 우수한 가시오가피 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 위 제조방법을 이용하여 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 우수한 기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 가시오가피 원재료를 준비하는 단계; 에탄올을 용매로 사용하여 추출을 2회 반복하는 단계; 정제수 또는 에탄올을 용매로 사용하여 추출을 2회 더 반복하는 단계를 포함하는 가시오가피 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 추출 용매로 사용되는 상기 에탄올은 가시오가피 원재료 무게의 약 8~10배의 양만큼 사용되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에탄올은 바람직하게는 20% 내지 60% 에탄올이며, 더욱 바람직하게는 40% 내지 60% 에탄올, 가장 바람직하게는 60% 에탄올이다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출 공정은 70~90℃에서 2~4시간 이상 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가시오가피 원재료는 가시오가피 줄기, 뿌리, 열매 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 줄기, 뿌리 또는 이들의 혼합물이며, 더욱 바람직하게는 줄기이다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 원재료가 줄기와 뿌리의 혼합물인 경우 6(줄기):4(뿌리) 또는 7(줄기):3(뿌리)의 중량비로 혼합된 것이 바람직하다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제조방법은 가시오가피 줄기, 뿌리 또는 이들의 혼합물로 이루어진 원재료를 준비하는 단계; 상기 원재료 무게의 10배 중량의 60% 에탄올을 가하고, 80℃에서 3시간 동안 추출하는 과정을 2번 반복하는 단계(1~2차 추출); 상기 원재료 무게의 10배 중량의 60% 에탄올 또는 같은 무게의 정제수를 가하고, 80℃에서 3시간 동안 추출하는 과정을 2번 더 반복하는 단계(3~4차 추출); 상기 추출물을 여과한 뒤 농축하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 농축은 80℃에서 20brix까지 감압 농축시키는 단계일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 갖는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 엘레우테로사이드(Eleutheroside) 화합물, 바람직하게는 엘레우테로사이드 B 및/또는 엘레우테로사이드 E를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 체내의 크레아틴 키나아제(creatine kinase) 활성을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 체내 LDH 및 요산(uric acid) 수치를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 가시오가피 추출물은 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 나타내는 유효성분인 엘레우테로사이드 화합물을 높은 농도로 함유하고 있으며, 피로도와 관련된 체내 크레아틴 키나아제(creatine kinase), LDH 및 요산(uric acid) 수치를 감소시키면서도 세포독성을 나타내지 않기 때문에, 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 나타내는 기능성 식품으로 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 정제수, 20% 에탄올(주정), 40% 에탄올 및 60% 에탄올을 용매로 사용하여 제조한 가시오가피 줄기(a) 및 뿌리(b) 추출물에 함유된 엘레우테로사이드(Eleutheroside) 화합물의 함량을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 추출 횟수를 1회부터 4회까지 증가시키면서 각각의 줄기(a) 및 뿌리(b) 추출물에 함유된 엘레우테로사이드(Eleutheroside) 화합물의 함량을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 가시오가피 추출물의 항산화능을 측정하기 위하여 ORAC 어세이(Oxygen Radical Absorbance Capacity assay)를 수행하여 AAPH 제거능을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 가시오가피 추출물의 세포독성을 조사하기 위하여, L6 근육세포 및 3T3-L1 지방세포를 이용한 MTT 어세이를 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 가시오가피 추출물의 항산화능을 평가하기 위하여, 세포의 주된 항산화제 기능을 하는 GSH 활성을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 가시오가피 추출물의 피로회복 활성을 평가하기 위하여, 3T3-L1 세포와 L6 세포를 이용하여 근육이 피로해질 때 혈액 내로 방출되는 크레아틴 키나아제 활성을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 가시오가피 추출물의 피로회복 및 운동능력 향상을 평가하기 위한 트레드밀 시험의 프로토콜을 나타낸 것이다(Cell 127, 1109-1122, 2006).
도 8 및 도 9는 60% 에탄올을 사용하여 1번 추출한 것(60%-1)과 2번 추출한 것(60%-2)을 이용하여 가시오가피 줄기 추출물의 피로회복 및 운동능력 향상을 평가하기 위해 마우스를 대상으로 트레드밀 실험을 수행한 결과이다.
도 10은 상기 트레드밀 실험을 수행한 마우스의 혈액에 대해 혈청학적 분석을 수행한 결과이다.

본 발명은 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 우수한 가시오가피 추출물을 제조하는 방법 및 이로부터 제조된 가시오가피 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 이전의 연구들을 근거로 가시오가피에 함유된 엘레우테로사이드(Eleutheroside) 화합물을 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 나타내는 유효성분으로 설정하고 HPLC 분석을 통해 위 유효성분의 함량이 높은 추출법을 확인하였다. 그 결과, 위 유효성분의 함량은 줄기>뿌리>열매의 순으로 높은 것을 확인하였고(표 2), 이에 따라 줄기 및 뿌리 추출물에 대하여 추출 용매별 유효성분 함량을 분석한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두 60% 에탄올> 40% 에탄올> 20% 에탄올> 정제수 순으로 함량이 높은 것을 확인하였다(도 1). 또한, 가시오가피 추출물의 수율을 분석하기 위하여 4회 추출을 수행한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물 모두에서 1차 및 2차 추출 시 유효성분 함량이 높았으며, 3차 및 4차 추출 시에도 소량의 유효성분이 검출되었고, 추출 용매별 분석에서는 줄기 추출물의 경우 1차, 2차, 3차, 4차 모두 60% 에탄올 추출 시 유효성분 함량이 가장 높았던 반면, 뿌리 추출물의 경우 1차, 2차, 4차는 60% 에탄올 추출 시, 3차는 40% 에탄올 추출 시 유효성분 함량이 가장 높았다(도 2). 또한, 가시오가피 줄기, 뿌리, 열매의 혼합 원료를 추출하여 분석해 본 결과, 혼합비율에 따른 차이는 있으나 전체적으로 가시오가피 줄기와 뿌리를 혼합한 경우 더 높은 유효성분 함량을 나타냈다(표 5-7). 그러나, 가시오가피 줄기와 열매 혼합 농축액의 유효성분 함량보다 가시오가피 줄기 농축액의 유효성분 함량이 더 높은 것으로 나타났으며, 다만 가시오가피 줄기와 열매 혼합 농축액의 수율이 가시오가피 줄기 농축액의 수율보다는 4.5배 높았다(표 8). 위 결과들을 종합하면, 구체적인 혼합비율에 따라 차이가 있을 수는 있으나 전체적으로 가시오가피 줄기를 60% 에탄올로 2회 이상 추출한 추출물의 활성이 높을 것으로 예상되며, 이를 확인하기 위하여 항산화, 피로회복 및 체력 증가 효과를 실험하였다.

우선, 항산화 활성을 측정하는 표준화된 방법인 ORAC 어세이(Oxygen Radical Absorbance Capacity assay)를 실시한 결과, 특히 줄기의 40% 에탄올 추출물과, 뿌리의 60% 에탄올 추출물 샘플 처리군에서 약 50% 이상에 해당하는 항산화활성이 측정되었고, 이는 양성대조군으로 이용한 Trolox가 단일 화합물인 것을 감안하였을 때 상당히 높은 수준의 항산화 활성을 가지는 것으로 판단된다(표 9). 또한, L6 근육세포 및 3T3-L1 지방세포를 이용한 MTT 어세이 결과, 본 발명의 가시오가피 추출물은 200 /mL 이하의 농도에서 독성을 거의 나타내지 않았으며(도 4), 세포의 주된 항산화제 기능을 하는 GSH 활성을 측정한 결과, 양 세포 모두에서 GSH 함량 변화는 나타나지 않았다(도 5). 또한, 근육이 피로해지면 혈액 내로 크레아틴 키나아제 방출이 증가해 쉽게 피로해지고 병증이 나타나므로, 본 발명의 추출물의 피로회복 활성을 평가하기 위해, 3T3-L1 세포와 L6 세포를 이용하여 크레아틴 키나아제 활성 측정하였다. 그 결과, 3T3-L1 세포에서는 효소 활성에 변화를 일으키지 않는 것으로 관찰되었지만, L6 세포에서는 줄기 40% 에탄올 추출물과 뿌리 60% 에탄올 추출물이 효소 활성을 감소시키는 것으로 관찰되었다(도 6).

또한, 마우스를 대상으로 가시오가피 줄기의 60% 에탄올 추출물의 체력 향상 효과를 트레드밀 시험법으로 측정한 결과, 가시오가피 줄기 추출물을 투여한 마우스에서 운동수행거리가 음성대조군에 비해 약 30 ~ 35% 증가되었으며, 국내에서 가장 효과가 좋다고 밝혀진 홍삼보다도 월등한 효과가 있는 것을 확인하였다(도 8, 9). 또한, 위 마우스에 대한 혈청학적 분석결과 양성대조군인 홍삼군보다 LDH 및 요산(uric acid)의 수치가 낮게 나타났으므로(도 10), 위 추출물은 피로를 예방하고 그 회복을 촉진시키는 효능이 높을 것으로 예상된다.

그러므로 본 발명은 가시오가피 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 우수한 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에서 기능성 식품이란 경구 섭취에 의해 항산화 활성, 피로회복 및 운동능력 향상 효과가 나타나는 식품을 의미한다.

상기 식품은 용이한 섭취를 위해 식품 조성물에 사용될 수 있는 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있으며, 그 형태는 음료인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상, 겔, 수 분산액, 에탄올 용액, 식용유 용액의 형태로도 제조될 수 있다. 상기 분말, 정제, 캡슐제에 사용하는 담체로서는 덱스트린, 사이클로덱스트린, 감자 전분, 옥수수 전분, 락토스 등이 있으며, 겔에 사용하는 담체로서는 젤라틴, 한천, 구아 검, 아라비아 검, 곤약 만난 등이 있다. 수 분산액에 사용하는 물은 특별히 제한되지 않으며 온천물이나 해양 심층수 등도 사용될 수 있고, 당류나 아미노산, 무기염류, 과즙, 탄산수 또는 유화제도 함유할 수 있다. 상기 유화제의 예로는 슈크로스 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 대두 레시틴 등을 들 수 있다. 에탄올 용액의 에탄올은 양조 알콜을 사용하는 것이 바람직하며, 농도는 특별히 제한되지 않는다. 상기 식용유 용액에 사용하는 식용유는 특별히 제한되지 않으며, 대두유, 채종유, 올리브유, 참기름, 홍화유, 밀 배아유 등을 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 제한이 없으며, 예를 들어, 음료류, 과자류, 당류, 아이스크림류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류, 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 특수영양식품, 건강보조식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치·절임식품, 건포류, 기타 식품류 등 모든 종류의 식품이 포함될 수 있다. 또한, 상기 식품은 살균제, 향신료, 조미제, 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등 여러 식품첨가제를 포함할 수 있다. 위 식품첨가제는 식품에 침지, 분무 또는 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 일반적인 첨가 비율은 식품 조성물 100 중량부당 0 내지 약 20 중량부의 범위 내이다. 또한, 위 식품 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 각종 식물 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등이 추가로 포함될 수 있다. 상기 식품 조성물은 필수 성분으로 본 발명의 추출물을 함유하는 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 향미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐 등과 같은 합성 향미제 등이 있으며, 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드, 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

추출 조건에 따른 가시오가피 추출물의 유효성분 분석

<1-1> 가시오가피 추출물의 제조

추출탱크에 가시오가피 원료 무게 대비 10배수의 추출 용매[정제수, 20% 에탄올, 40% 에탄올 또는 60% 에탄올]를 투입한 후, 부직포에 세척이 완료된 가시오가피 원료(줄기, 뿌리 또는 열매)를 포장하여 넣고, 80℃에서 3시간 이상 동안 추출한 후 여과하여 각각의 추출물을 제조하였다.

<1-2> 가시오가피 추출물의 유효성분 분석

종래의 연구에 따르면, 가시오가피 추출물의 성분 중 엘레우테로사이드(Eleutheroside) 화합물이 동물모델의 피로감 개선과 스트레스 완화 및 지구력에 영향을 미치는 성분인 것으로 분석되었기 때문에(Huang LZ et al. Bioactivity guided fractionation for anti fatigue property of Acanthopanax senticosus. J Ethnopharmacol 133, 213-219 (2011) 및 Kuo J et al. The effect of eight weeks of supplementation with Eleutherococcus senticosus on endurance capacity and metabolism in human. Chinese J Physiology 53, 105-111 (2010) 참조), 엘레우테로사이드 B 및 엘레우테로사이드 E를 유효성분(지표성분)으로 설정하여, 이들의 함량을 기준으로 최적의 가시오가피 추출 조건을 확립하였다. 엘레우테로사이드 B 및 엘레우테로사이드 E 화합물의 특성은 하기 표 1과 같다.

위 유효성분은 UV 검출기(detector)와 Kromasil 100-5 C18 (4.6×250 mm, 5 μm)컬럼을 사용하여 고속액체크로마토그래피(HPLC, JASCO PV-2089, JAPAN)로 분석하였다. 추출물 10 g, 농축액 2～5 g을 각각 취하여 증류수 10 mL과 혼합하여 30분 동안 초음파 진탕한 다음 25 mL로 정용하고 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 0.45 μm의 membrane filter로 여과한 뒤 시험용액으로 사용하였고, 표준물질 적정량을 50% MeOH로 용해하여 100 μg/mL이 되게 녹여 표준원액으로 하였다. 컬럼온도 35℃, 유속 1.0 mL/min, 주입량 20 μL, 이동상은 물과 아세토니트릴로 하여 실험을 수행하였다. 엘레우테로사이드 함량은 다음 계산식으로 계산하였다.

엘레우테로사이드 함량(μg/g) = C × V / W [여기에서, C : 시험용액중의 Eleutheroside 농도 (μg/mL), V : 시험용액의 전량 (mL), W : 시료채취량 (g)]

<1-3> 가시오가피 부위별 유효성분 함량 측정

가시오가피의 줄기, 뿌리, 열매를 각각 정제수로 추출하여 유효성분의 함량을 분석한 결과 줄기에서는 엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E가 모두 검출되었으나, 뿌리와 열매에서는 엘레우테로사이드 B만 검출되었다. 전체적인 유효성분의 함량은 줄기(103.75 μg/g)>뿌리(39.25 μg/g)>열매(24.93 μg/g)의 순으로 높았다(표 2).

<1-4> 추출 용매별 유효성분 함량 측정

위 실시예 <1-3>의 가시오가피 부위별 유효성분 함량과 단가를 고려하여 가시오가피 줄기 및 뿌리를 사용하여 추출 용매별 유효성분 함량을 측정하였다.

가시오가피 줄기 추출물의 경우, 추출물의 유효성분 함량을 엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E의 합으로써 분석한 결과, 60% 에탄올(260.52 μg/g)> 40% 에탄올(176.96 μg/g)> 20% 에탄올(61.17 μg/g)> 정제수(35.63 μg/g) 순으로 함량이 높게 나타났으며(도 1a), 뿌리 추출물의 경우에도 60% 에탄올(64.77 μg/g)> 40% 에탄올(46.70 μg/g)> 20% 에탄올(38.17 μg/g)> 정제수(12.61 μg/g) 순으로 유효성분 함량이 높게 나타났다(도 1b).

<1-5> 추출 횟수별 유효성분 함량 측정

추출 횟수에 따른 수율 변화를 측정하기 위해 실시예 <1-1>과 같은 조건으로 추출을 4회 수행하였다.

그 결과, 가시오가피 줄기 및 뿌리 추출물 모두 1차 및 2차 추출 시 유효성분 함량이 높았으며, 3차와 4차 추출 시에도 유효성분이 소량 검출되었다(도 2a,b). 또한, 추출 용매별로 분석해 본 결과, 줄기 추출물의 경우 1차, 2차, 3차, 4차 모두 60% 에탄올 추출 시 유효성분 함량이 가장 높았고(도 2a), 뿌리 추출물의 경우 1차, 2차, 4차는 60% 에탄올 추출 시, 3차는 40% 에탄올 추출 시 유효성분 함량이 가장 높았다(도 2b).

<1-6> 가시오가피 농축액의 수율 및 유효성분 함량 측정

하기 두 가지 방법으로 가시오가피 줄기 및 뿌리를 각각 4회 추출하여 얻은 추출물들을 혼합한 후 20 brix로 농축시킨 뒤, 유효성분의 함량이 높고 수율이 개선된 농축액을 확인하였다.

[추출조건 1]

가시오가피 줄기 또는 뿌리에 추출 용매인 정제수, 20% 에탄올, 40% 에탄올, 60% 에탄올을 각각 가시오가피 원료 무게 대비 10배수 가하여 80℃에서 3시간 동안 4회 추출한 후 여과하여 80℃에서 20 brix 까지 감압 농축하였다.

[추출조건 2]

가시오가피 줄기 또는 뿌리에 60% 에탄올을 가시오가피 원료 무게 대비 10배수 가하여 80℃에서 3시간 추출을 2회 반복한 다음 정제수를 10배수 가하여 80℃에서 3시간 추출을 2회 반복한 후 여과하여 20 brix까지 감압 농축한 샘플을 제조하였다.

그 결과, 가시오가피 줄기 농축액(20 brix)의 경우, 60% 에탄올로 4회 추출한 농축액(추출조건 1)의 유효성분(엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E의 합) 함량은 1984.01 μg/g 이었고, 60% 에탄올로 2회 및 정제수로 2회 추출한 후 농축한 농축액(추출조건 2)의 유효성분 함량은 1971.48 μg/g으로, 두 가지 추출조건에 따른 유효성분 함량의 차이는 거의 없었으며, 수율은 60% 에탄올로 4회 추출 시 29%, 60% 에탄올과 정제수로 각각 2회씩 추출하였을 시 26%였다(표 3).

가시오가피 뿌리 농축액(20 brix)의 경우, 60% 에탄올로 4회 추출한 농축액(추출조건 1)의 유효성분(엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E의 합) 함량은 707.54 μg/g 이었고, 60% 에탄올로 2회 및 정제수로 2회 추출한 후 농축한 농축액(추출조건 2)의 유효성분 함량은 678.93 μg/g으로, 두 가지 추출조건에 따른 유효성분 함량의 차이가 거의 없었으며, 수율은 60% 에탄올로 4회 추출 시 50%, 60% 에탄올과 정제수로 각각 2회씩 추출하였을 시 66%였다(표 4).

<1-7> 가시오가피 줄기, 뿌리, 열매의 혼합 비율별 유효성분 함량 측정

가시오가피 농축액의 효율적인 생산을 위한 적정 추출 조건을 확립하기 위하여, 다음과 같이 가시오가피 줄기, 뿌리, 열매를 혼합한 후 혼합비율별로 유효성분 함량을 비교하였다.

(1) 가시오가피 줄기와 열매의 혼합

가시오가피 줄기와 열매의 혼합 비율(줄기:열매)을 각각 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 비율로 혼합한 후 정제수를 10배수(무게) 가하여 80℃에서 3시간 추출한 다음 유효성분(엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E의 합) 함량을 측정한 결과, 줄기:열매의 비율이 8:2 (50.62 μg/g)> 7:3 (40.25 μg/g)> 6:4 (36.45 μg/g)> 5:5 (35.25 μg/g) 순으로 확인되어 줄기 8: 열매 2의 비율로 혼합하였을 때 유효성분의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다(표 5).

(2) 가시오가피 줄기와 뿌리의 혼합

가시오가피 줄기와 뿌리의 혼합 비율(줄기:뿌리)을 각각 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 비율로 혼합한 후 정제수를 10배수(무게) 가하여 80℃에서 3시간 추출한 다음 유효성분 함량을 측정한 결과, 가시오가피 줄기와 뿌리 혼합 추출물에서는 엘레우테로사이드 E만 검되었다. 가시오가피 줄기와 뿌리 혼합 추출물의 유효성분 함량은 줄기:뿌리의 비율이 6:4 (61.31 μg/g)> 7:3 (57.36 μg/g)> 5:5 (45.24 μg/g)> 8:2 (39.10 μg/g) 순으로 확인되어 줄기 6: 뿌리 4의 비율로 혼합하였을 때 지표성분(유효성분)의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다(표 6).

(3) 가시오가피 뿌리와 열매의 혼합

가시오가피 뿌리와 열매의 혼합 비율(뿌리:열매)을 각각 5:5, 6:4, 7:3, 8:2의 비율로 혼합한 후 정제수를 10배수(무게) 가하여 80℃에서 3시간 추출한 다음 유효성분 함량을 측정한 결과, 가시오가피 뿌리와 열매 혼합 추출물에서는 엘레우테로사이드 E만 검출되었고, 뿌리와 열매 혼합 추출물의 유효성분 함량은 뿌리:열매의 비율이 8:2 (54.02 μg/g)> 6:4 (45.28 μg/g)> 7:3 (35.92 μg/g)> 5:5 (28.61 μg/g) 순으로 확인되어, 뿌리 8: 열매 2의 비율로 혼합하였을 때 유효성분의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다(표 7).

<1-8> 가시오가피 줄기와 열매 혼합 농축액의 유효성분 함량 및 수율 비교

상기 <1-7>의 가시오가피 줄기, 뿌리, 열매의 혼합 비율별 유효성분 함량 실험 결과 줄기와 열매 혼합물에서만 엘레우테로사이드 B와 엘레우테로사이드 E가 모두 검출되었으므로 가시오가피 줄기와 열매를 혼합하여 농축액을 제조하고, 그 유효성분 함량 및 수율을 비교하였다. 농축액은 가시오가피 줄기와 열매를 8:2의 비율로 혼합한 후 60% 에탄올을 10배수 가하여 80℃에서 3시간 추출을 2회 반복한 다음 정제수를 10배수(무게) 가하여 80℃에서 3시간 추출을 2회 반복한 후 여과하여 20 brix까지 감압 농축시켜 제조하였다.

분석 결과, 가시오가피 줄기 농축액의 유효성분 함량이 가시오가피 줄기와 열매 혼합 농축액의 유효성분 함량보다 1.5배 높았으며, 가시오가피 줄기와 열매 혼합 농축액의 수율이 가시오가피 줄기 농축액의 수율보다 4.5배 높았다(표 8).

< 실시예 2>

항산화 활성 측정

상기 실시예 1에 따라 제조된 본 발명의 가시오가피 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여 ORAC 어세이(assay)를 실시하였다. Oxygen Radical Absorbance Capacity (ORAC)은 항산화 활성을 측정하는 표준화된 방법으로, 자유 라디칼(free radical)의 한 종류인 AAPH [2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride]의 제거능을 형광으로 측정하는 방법이다. 시료 또는 양성대조군인 trolox [(±)-6-Hydroxy- 2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid, 238813, Sigma] 20 μL를 96-well black plate (3603, Corning Inc., Corning, NY, USA)에 넣고 200 nM fluorescein (F2456, Sigma)를 160 μL 첨가한 후 37℃에서 10분간 방치한 이후, 20 mM AAPH [2,2'-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride, 440914, Sigma]를 20 μL를 plate에 첨가하고 분광광도계 (Wallac Victor3 PerkinElmer, MA, USA)를 이용하여 490 nm excitation 파장 및 535 nm emission 파장 조건에서 5분 간격으로 70분 동안 측정하였다(도 3). 여기서 ROOT-1는 용매로 1번 추출한 것을 표시한 것이고 ROOT-2는 용매로 2번 추출한 것을 표시한 것이다.

항산화능을 수치상으로 비교하기 위해 AUC (the area under the curve) 및 ORAC value를 계산한다(농도는 10 /ml의 값을 기준으로 나타냄).

AUC = (0.5 + f5/f0 + f10/f0 + ... + fn+5/f0) × 5

ORAC value = (AUC_sample - AUC_blank) / (AUC_trolox AUC_blank)

도 3의 그래프에서, 항산화 활성을 비교하기 위해 그래프의 AUC (area under the curve)값을 구하고, 양성 대조군인 Trolox의 표준곡선을 통해 동일한 질량대비 가시오갈피의 항산화활성 정도를 측정하였다(표 9). 그 결과, 특히 줄기의 40% 에탄올 추출물과, 뿌리의 60% 에탄올 추출물 처리 샘플에서 약 50% 이상에 해당하는 항산화활성이 측정되었고, 이는 양성대조군으로 이용한 Trolox가 단일 화합물(single compound)인 것을 감안하였을 때 상당히 높은 수준의 항산화 활성을 가지는 것으로 판단된다.

< 실시예 3>

세포독성 및 피로회복 활성 평가

<3-1> 세포 독성 실험

L6 및 3T3-L1 세포를 이용하여 가시오가피 추출물에 대한 세포 생존율을 MTT 시약을 이용하여 확인하였다. 추출물을 농도별로 배양 중인 세포에 처리하여 24시간 후 남아있는 세포의 생존율을 확인하였으며, 생존율은 media 교체 후, 1시간 동안 CO₂ incubator에서 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

실험 결과, 모든 줄기 및 뿌리 시료에서 200 /mL 이하의 농도는 세포 생존률이 90% 이상으로 독성을 거의 나타내지 않아, 200 /mL 이하의 농도로 실험을 진행하였다(도 4).

<3-2> GSH 측정

세포의 주된 항산화제 기능을 하는 GSH는 세포내에서 활성산소와 다른 자유라디칼들을 흡수하여 세포를 보호하는 역할을 한다. 본 실험에서는 지방세포인 3T3-L1 세포와 근육 세포인 L6 세포를 이용하여 시료 처리 후 GSH 활성을 측정하였다. 세포에 가시오가피 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 후 세포를 얻어 5% SAA (sulfosapicylic acid)을 넣고 10분 동안 8,000g로 냉장 원심분리 한 후 얻은 상등액을 새 튜브에 옮겨 준비하였다. Reaction mix (NADPH generating mix : glutathione reductase : glutathione reaction buffer = 1 : 1 : 6)를 넣어 혼합한 후, 10 분 동안 실온에서 반응 시킨 준비함. 상등액에 반응 혼합물(reaction mix)을 혼합하여 실온에서 10분간 반응 후 기질 용액(substrate solution) 20 ㎕을 넣고 실온에서 10분간 반응 후 405 nm에서 측정하였다. 이때 혈장 대신 GSH 표준품의 농도별 값을 구하여 검량곡선을 그린 후 시료의 GSH 함량(/L)을 측정하였다. 그 결과 지방세포인 3T3-L1 세포와 근육 세포인 L6 세포 모두 GSH 함량 변화는 일으키지 않았다(도 5).

<3-3> 크레아틴 키나아제 ( creatine kinase ) 측정

근육이 피로해지면 혈액 내로 크레아틴 키나아제 방출이 증가해 쉽게 피로해지고 병증이 나타나므로, 본 발명의 추출물의 피로회복 활성을 평가하기 위해, 지방세포인 3T3-L1 세포와 근육 세포인 L6 세포를 이용하여 시료 처리 후 크레아틴 키나아제 활성을 다음과 같이 측정하였다.

세포에 가시오가피 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양 후 CK 어세이 버퍼를 이용해 세포 상등액을 얻었다. 세포 상등액과 반응 혼합물(reaction mix) (CK assay buffer : CK enzyme mix : CK developer: ATP : CK substrate = 17 : 1 : 1 : 1 : 5)을 넣어 혼합한 후, 40 분 동안 37 ℃에서 반응 시키고 450 nm에서 측정하였다. 이때 혈장 대신 NADH 표준품의 농도별 값을 구하여 검량곡선을 그린 후 시료의 크레아틴 함량(nmol/L)을 측정하였다.

그 결과 3T3-L1 세포에서는 효소 활성에 변화를 일으키지 않는 것으로 관찰되었지만, L6 세포에서는 줄기 40% 에탄올 추출물과 뿌리 60% 에탄올 추출물이 효소 활성을 감소시키는 것으로 관찰되었다(도 6).

< 실시예 4>

트레드밀(Treadmill)을 이용한 체력 강화 효과 측정

<4-1> 실험동물의 준비 및 시료 투여

실험에 이용된 동물은 6주령 ICR 마우스로, 10마리씩을 랜덤 블록 설계(randomized block design)에 따라 음성대조군, 양성대조군(홍삼), 가시오가피 줄기추출물[주정 60%-1;용매로 1번 추출한 것, 주정 60%-2; 용매로 2번 추출한 것]군으로 체중이 균등하도록 나누었다. 모든 시험물질 및 대조물질은 매일 동일 시간에 1회, 4주간 경구 투여를 실시하였으며, 음성대조군은 생리식염수를 샘플과 동일한 양을 투여하였고, 양성대조군은 홍삼 200 mg/kg으로 투여하였고, 가시오가피 줄기 추출물(주정 60%-1) 50, 100, 200 mg/kg 과 가시오가피 줄기 추출물(주정 60%-2) 50, 100, 200 mg/kg 의 농도로 투여 하였으며, 식이는 일반 사료를 자유롭게 섭취하도록 하였다.

<4-2> 트레드밀 시험

지구성 운동수행 능력의 변화를 측정하기 위하여 트레드밀(Treadmill)을 이용하였다(도 7). 동물실험의 조건은 시험물질 및 대조물질을 하루 1회 4주간 투여한 후 트레드밀 실험 전날 트레드밀 달리기에 적응시키기 위해 경사도 5°에서 27 ㎝/초 속도로 10분간 운동을 수행하였다. 운동수행 능력의 변화를 측정하기 위하여 동물들에게 트레드밀 운동을 시켰고, 그 프로토콜은 다음과 같다.

1) 경사도 5°에서 25 ㎝/초의 속도로 20분간 운동을 시작함

2) 경사도 5°에서 30 ㎝/초의 속도로 20분간 운동을 수행함

3) 경사도 5°에서 33 ㎝/초의 속도로 20분간 운동을 수행함

4) 경사도 5°에서 36 ㎝/초의 속도로 20분간 운동을 수행함

5) 경사도 5°에서 36 ㎝/초의 속도로 15분간 운동울 수행함

6) 경사도 10°에서 38 ㎝/초의 속도로 15분간 운동을 수행함

7) 경사도 10°에서 41 ㎝/초의 속도로 지칠 때까지 달리도록 구성됨

실험 당일 트레드밀 달리기를 시작하기 2시간 전 금식을 시킨 후, 음성대조군 및 시험물질 실험동물들의 최대운동수행능력을 측정하였다. 실험과정에서 쥐가 지쳤다고 사료되는 시점은 5분이라는 시간동안 100번의 전기충격을 받는 시점이며, 트레드밀로 운동수행능력을 평가해 본 결과 운동거리(A)와 시간(B)이 증가되는 것을 확인하였다(Resveratrol improves mitochondrial function and protects against metabolic disease by activating SIRT1 and PGC-1alpha. CELL, VOL. 127, NO. 6, 1109-1122, 2006).

생리식염수(음성대조군)군(샘플과 동일한 양), 홍삼 200 mg/kg(양성대조군), 가시오가피 줄기 추출물 50, 100, 200 mg/kg의 농도로 4주간 투여한 후, 각 그룹에 대해 트레드밀 테스트를 실시한 결과는 도 8에 기재하였으며, 주정 60%-1 대신에 주정 60%-2를 사용한 가시오가피 줄기 추출물 50, 100, 200 mg/kg을 4주간 투여한 후, 트레드밀 테스트를 실시한 결과는 도 9에 기재하였다. 가시오가피 줄기시료를 투여한 마우스 군에서 농도 의존적으로 운동 수행한 거리와 시간 모두 생리식염수만을 섭취한 대조군에 비해 최대 35% 정도 증가하는 것을 확인하였으며, 국내에서 가장 효과가 좋다고 밝혀진 홍삼과 비교 시 가시오가피 줄기에서 더 나은 효과를 보였다(도 8). 가시오가피 줄기시료를 투여한 마우스 군에서는 농도 의존적이지는 않지만 운동수행한 거리와 시간 모두 생리식염수만을 섭취한 대조군에 비해 증가하였으며, 특히 가시오가피 줄기 50 mg/kg군은 음성대조군에 비해 약 31% 정도 증가하는 것을 확인하였으며, 홍삼을 투여한 쥐보다 가시오가피 줄기에서 더 나은 효과를 보였다(도 9).

<4-3> 마우스 혈청 생화학 분석

가시오가피 줄기 시료를 투여한 마우스의 혈청을 다음과 같이 분석하였다. 혈액생화학분석장비 BS-390(Mindray, India)를 이용하여 제조사의 생화학 시약을 사용하여 2종류의 컨트롤(control) 시약으로 QC검사 진행 후 반응 농도값에 대한 표준(standard) 설정 후 각 항목별로 분석을 진행하였다. CRP (C-reactive protein)는 항체를 이용한 immunocomplex photometric 측정, LDH(Lactate dehydrogenase)는 IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine)에 따른 UV-Assay측정, Glucose, HDL(high density lipoprotein)-cholesterol, LDL(lowdensity lipoprotein)-cholestetol, Total-cholesterol, TG(Triglycerides)는 enzymatic colormetric 방법, 요산(uric acid)은 uricrase-peroxidase를 이용한 방법에 의하여 측정하였다(도 10).

운동직후 일반적으로 LDH의 축적은 증가하는 것으로 보고되어 있다. 가시오가피 추출물의 경우, 양성대조군인 홍삼군보다 더 많은 운동을 수행하였음에도 불구하고, LDH의 축적이 낮은 것으로 보아 가시오가피 추출물이 피로를 예방하고 회복을 촉진시키는 효능이 홍삼보다 높을 것으로 기대할 수 있다. 또한 피로수준을 보여주는 요산(Uric acid)의 경우에도 LDH와 비슷한 경향을 보였다. 혈중 지질성분 중 HDL, LDL의 변화에는 큰 차이를 보이지 않았지만 총 콜레스테롤(Total cholesterol)의 경우 가시오가피 줄기 시료를 투여한 마우스군에서 줄어드는 경향을 보였다. 염증반응의 지표 중 하나인 CRP의 경우 홍삼군에 비해 줄어드는 경향을 보였다.

< 실시예 7>

본 발명의 가시오가피 추출물을 함유한 음료의 제조

본 발명의 가시오가피 추출물을 함유한 액상 파우치 제품을 다음과 같은 순서에 따라 제조하였다.

① 원료칭량 : 품질검사 결과 적합한 각각의 원료를 제조배합비율에 따라 칭량한다.

② 추출 : 추출탱크에 가시오가피 줄기 무게 대비 10배수의 정제수를 투입한 후 부직포에 세척이 완료된 가시오가피 줄기를 포장하여 추출탱크에 넣고 80℃, 3시간 이상 추출한다(Circulation). 추출이 완료되면 원물을 건져낸 후 최초 투입 정제수양 만큼 보정한다. 보정이 완료되면 Brix를 측정한다(20Brix이상, 고형분 함량 20% 이상).

③ 원료 투입 : 추출이 완료된 가시오가피 줄기농축액과 나머지 원료를 투입한다. 투입이 완료된 후 정제수로 부피를 맞춘 후 교반 용해한다.

④ 여과 : 기준검사 측정이 완료된 액을 여과한다.

⑤ 파우치 충전 : 비중 적용하여 60 mL씩 충전한다.

⑥ 후살균 : 90~100℃로 30분 이상 후살균한다.

⑦ 포장 : 포장단위에 맞추어 포장한다.

⑧ 품질검사 : 품질표준을 기준으로 품질 검사를 실시한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

가시오가피 원재료를 준비하는 단계;
20% 내지 60% 에탄올을 용매로 사용하여 추출을 2~5회 반복하는 단계; 및
정제수 또는 20% 내지 60% 에탄올을 용매로 사용하여 추출을 2~5회 더 반복하는 단계를 포함하는 항산화, 피로회복 및 운동능력 향상 효과를 갖는 가시오가피 추출물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 에탄올은 가시오가피 원재료 무게의 8~10배의 양을 사용하며, 추출은 70~90℃에서 2~4시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 가시오가피 원재료는 가시오가피 줄기, 뿌리 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 가시오가피 원재료는 가시오가피 줄기 및 뿌리가 6(줄기):4(뿌리)~6(줄기):6(뿌리)의 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 피로회복 또는 운동능력 향상 효과를 갖는 기능성 식품 조성물.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 엘레우테로사이드(Eleutheroside) B 및 엘레우테로사이드(Eleutheroside) E로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 체내의 크레아틴 키나아제(creatine kinase) 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 체내 LDH 및 요산(uric acid) 수치를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.