KR100456062B1 - 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법 - Google Patents

재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 벡터에 생리화합물을 생성하는 생체효소유전자를 삽입하여 재조합벡터를 제조하고, 상기 재조합벡터를 포함하는 형질전환체에서 생체효소를 동시에 발현시켜 재조합 생리화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 생리화합물 생산방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 세피아테린, BH4 및 BH4-α-글루코사이드를 다량으로 생산하는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP), pET-BH4 형질전환체, 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 제조하여 테린딘 화합물을 대장균에서 쉽게 대량 생산할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법{PRODUCING METHOD OF PTERIDINE COMPOUNDS USING RECOMBINANT BACTERIA}
본 발명은 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 GTPCH(GTP cyclohydrolase I), PTPS(6-pyruvoyltetrahydropterin synthase), SR(sepiapterin reductase) 또는 BGluT(BH4:UDP-glucose-α-glucosyltransferase) 유전자를 대장균에서 발현시켜, 세피아테린, 바이오테린(biopterin) 및 바이오테린-α-글리코사이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
테리딘(pteridine) 화합물이란 2-아미노-4-옥소-피리미딘을 기본구조로 가지는 고리화합물로서 다양한 종류의 유도체들이 있다. 테리딘은 생체 내에서 주로 테트라하이드로의 완전히 환원된 형태로 활성을 가지며 공기에 노출되었을 경우 쉽게 디하이드로(dihydro) 또는 완전히 산화된 형태로 전환된다(Nichol, C.A., G. K. Smith, and D. S. Duch. 1985. Ann. Rev. Biochem. 54, 729-764). 또한 테리딘은 산화된 상태에서 형광을 가지는 특성이 있다.
테리딘 화합물들 중 가장 잘 알려진 것은 테트라하이드로 바이오테린(biopterin의 완전한 환원형으로 (6R)-5,6,7,8-tetrahydro-L-biopterin; 이하 'BH4'라 함)이다. BH4의 기능, 생합성, 관련된 효소와 유전자들에 대한 내용은 알려져 있다(Thony B, Auerbach, G, Blau N (2000) Biochem. J. 347, 1-16). BH4는 방향성 아미노산 하이드로실레이즈들의 조효소로 작용한다. 상기 조효소가 결핍되면 신생아의 간 내에 페닐알라닌 하이드로실레이즈의 활성이 저하되어 혈액내 페닐알라닌의 농도가 증가되고, 그 결과 중추신경계의 발달이 저하되어 정박아가 되는 부정형의 페닐케톤요증(atypical phenylketonuria; PKU) 질환이 발생될수 있다(Duch DS, Smith GK (1991) J. Nutr. Biochem. 2, 411-423). 타이로신 하이드로실레이즈와 트립토판 하이드로실레이즈는 뇌에서 도파민, 세로토닌과 같은 신경전달물질들의 생합성에 작용하므로, BH4의 결핍은 여러 가지 신경질환을 유발할 수 있다. 또한 BH4의 결핍은 유전성 신경질환인 도파-민감성 발육이상(Dopa-responsive dystonia)을 야기한다(Ichinose H, Ohye T, Takahashi E, Seki N, Hori T, Segawa M, Nomura Y, Endo K, Tanaka H, Tsuji S, Fujita K, Nagatsu T (1994) Nat. Genet. 8, 236-242). 이외에도 파킨슨 질환, 알쯔하이머 질환, 우울증 등의 환자에서 체액 내의 BH4 농도가 정상인보다 낮은 것으로 알려져 연구가 진행되고 있다.
BH4 결핍과 관련된 또다른 질환으로는 상피세포에서 멜라닌색소가 결핍되는 백색증이 있으며(Schallreuter KU, Wood JM, Pittelkow MR, Gulich M, Lemke KR, Rodl W, Swanson NN, Hitzemann K, Ziegler I (1994) Science 263, 1444-1446), BH4는 심혈관계에서 중요한 역할을 하는 산화질소합성효소(nitric oxide synthase; NOS)의 조효소로서도 작용하므로(Kaufman S (1993) Annu. Rev. Nutr. 13, 261-286) 다른 질환을 유발할 것으로 추정된다.
생체 내에서 테리딘 화합물의 신생합성은 구아노신 트리포스페이트 (guanosine triphosphate; 이하 'GTP'라 함)로부터 출발한다.(도 1) GTP는 GTP 사이크로하이드로레이즈 I(GTP cyclohydrolase I; 이하 'GTPCH'라 함)에 의해 디하이드로네오테린 트리포스페이트(dihydroneopterin triphosphate; 이하 'H2-NTP라 함)로 전환되고, 이것은 다시 6-피루브일테트라하이드로테린 합성효소(6-pyruvoyltetrahydropterin synthase; 이하 'PTPS'라 함)에 의해 6-피루브일테트라하이드로테린(6-pyruvoyltetrahydropterin; 이하 'PPH4'라 함)로 전환된다. PPH4는 알도스 환원효소(aldose reductase; AR, 또는 PPH4 reductase라 함)와 세피아테린 환원효소(sepiapterin reductase; 이하 'SR'라 함)의 협동작용이나 SR 효소 단독에 의해 BH4로 전환된다. SR이 없이 AR만 존재할 때는 PPH4의 곁사슬에 존재하는 C2'만이 환원된 6-락토일테트라하이드로테린(6-lactoyltetrahydropterin; 이하 'LPH4'라 함)로 전환되고, LPH4는 용존산소에 의해 쉽게 디하이드로(dihydro) 상태의 세피아테린으로 산화된다. BH4는 재생경로에 의해 세피아테린으로부터도 생성된다. 세피아테린은 생체 내에서 SR에 의해 7,8-디하이드로바이로테린으로 환원된 후 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase; 이하 'DHFR'라 함)에 의해 BH4로 전환될 수 있다. 때문에 동물조직배양에서 BH4 대신에 첨가되었을 경우 BH4를 투여한 것과 동일한 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
또한 BH4에 당이 결합되는 반응을 통해 BH4-글리코사이드(당화합물)들이 합성된다. BH4-당화합물들은 일부 혐기성 광합성 세균과 남세균(cyanobacteria)에서 발견되었다(Forrest HS, Van Baalen C (1970) Ann. Rev. Microbiol. 24, 91-108;Cha KW, Pfleiderer W, Yim J (1995). Helv. Chim. Acta 78, 600-614; Cho SH, Na JU, Youn H, Hwang CS, Lee CH, Kang SO. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1379, 53-60; Chung HJ, Kim Y, Kim YJ, Choi YK, Hwang YK, Park YS (2000) Biochim. Biophys. Acta 1524, 183-18). BH4에 UDP-글루코스의 당을 전달하는 BH4:UDP-글루코스 α-글루코실트랜스퍼레이즈(BH4:UDP-glucose-α-glucosyltransferase; 이하 'BGluT'라 함)는 남세균의 일종인 시네코코커스 속(Synechococcussp.) PCC 7942에서 정제되었으며, 유전자도 클로닝되었다(Choi YK (2001) 시아노박테리아Synechococcussp. PCC 7942에서 테리딘 당전이효소 유전자의 클로닝. MS thesis, Inje University ; Choi YK, Hwang YK, Park YS (2001) FEBS Lett. in submission). BH4-당화합물 (glycoside)들의 생리활성은 밝혀지지 않았으며, BH4와 동일한 활성을 가지는 지의 여부도 확인되지 않았으나 당이 결합하였을 경우 수용성과 안정성의 증가와 같은 약리적인 장점이 있을 것으로 추정되고 있다.
BH4는 부정형 PKU 질환의 치료약으로 사용되고 있으며(Blau N, Barnes I, Dhondt JL (1996) J. Inherit. Metab. Dis. 19, 8-14), 파킨슨씨병, 자폐증, 우울증, 알쯔하이머 질환과 같은 몇가지 정신질환(Thony B, Auerbach, G, Blau N (2000) Biochem. J. 347, 1-16)과 동맥경화, 고혈압, 고콜레스테롤증, 당뇨병과 같은 다양한 질환에서 비롯되는 혈관장애 질환에 대한 치료약으로서의 가능성이 연구되고 있고(Tiefenbacher CP (2001) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, H2484-H2488), BH4는 상기 질환들의 연구용 시약으로 판매되고 있다.
세피아테린도 생체 내에서 BH4로 전환될 수 있어 혈관장애와 관련된 조직배양이나 동물실험 수준에서의 연구결과는 BH4와 동일한 효과를 발휘하는 것으로 보고되었다(Tiefenbacher CP (2001) Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, H2484-H2488). 아직까지 세피아테린이 혈관장애 질환이나 부정형 PKU 질환에 대한 임상목적으로 사용되었다는 보고는 없다. 그렇지만 세피아테린은 BH4보다 안정성이 탁월하다는 장점을 가지고 있어 BH4보다 저렴한 생산이 가능해진다면 BH4를 대체할 수 있는 가능성을 가지고 있다. BH4와 세피아테린은 유기합성에 의해 생산되고 있으며, 미생물을 이용한 대량생산은 보고된 바 없다. BH4 당화합물이 존재하는 일부 시아노박테리아를 비롯한 세균을 제외하고는 대장균과 같은 대부분의 세균에서는 BH4의 생합성은 일어나지 않는다.
또한 테리딘 화합물은 의약품과 시약용으로 사용되는 화합물로서 유기합성에 의해 생산된다. 그렇지만 입체이성질체들로 존재하는 테리딘 화합물을 유기합성으로 제조하여 유용한 한가지 형태만을 정제하기가 쉽지 않아 고가에 판매되고 있으며, 당화합물의 경우는 유기합성으로 제조하기도 쉽지 않은 실정이다.
따라서, 상기한 문제를 생물공학적으로 해결하고자 테리딘 생합성에 관여하는 유전자들을 삽입한 재조합벡터를 제조하고 그 대장균 형질전환체도 제조하였다.
본 발명은 테리딘 화합물을 대장균에서 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 테리딘 화합물을 생성하는 생리효소를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 테리딘 화합물을 생산할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 대장균에서 발현시켜 제조한 재조합 테리딘 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 BH4와 BH4-α-글루코시드의 생합성경로이고,
도 2는 pET-GTPCH/PTPS 벡터의 제조과정을 도시한 것이고,
도 3은 pET-BH4 벡터의 제조과정을 도시한 것이고,
도 4는 pET-BH4/BGluT 벡터의 제조과정을 도시한 것이고,
도 5는 BL21(DE3)(A), pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(B), pET-BH4 형질전환체(C), 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체(D)의 고체배양물 사진이고,
도 6은 BL21(DE3)(A), pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(B), pET-BH4 형질전환체(C), 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체(D)의 액체배양물 사진이고,
도 7은 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 액체배지를 HPLC하여 분석한 그래프이고,
도 8은 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 액체배지상의 세피아테린을 분석한 HPLC그래프이고,
도 9는 pET-BH4 형질전환체의 액체배지를 HPLC하여 분석한 그래프이고,
도 10은 pET-BH4/BGluT 형질전환체의 액체배지를 HPLC하여 분석한 그래프이고,
도 11은 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 생장에 따른 세피아테린의 생산율을 흡광도로 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 테리딘 화합물을 생성하는 생리효소 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제공한다. 바람직하게는 pET-GTPCH/PTPS, pET-BH4, 및 pET-BH4/BGluT를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체, pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP), pET-BH4 형질전환체, 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 형질전환체에서 생산되는 테리딘 화합물 또는 재조합 효소를 제공한다.
또한 본 발명은 벡터에 테리딘 화합물을 생성하는 생체효소유전자를 삽입하여 재조합벡터를 제조하고, 상기 재조합벡터를 포함하는 형질전환체에서 생체효소를 동시에 발현시켜 재조합 생리화합물을 생산하는 것을 특징으로 하는 대장균을 이용한 테리딘 화합물 생산방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 테리딘 화합물을 대장균에서 생산하기 위하여 재조합벡터를 제조하였다. 본 발명의 재조합 벡터는 pET-GTPCH/PTPS, pET-BH4, 및 pET-BH4/BGluT 이다.
상기 pET-GTPCH/PTPS는 GTP를 H2-NTP로 전환시키는 GTPCH 효소 유전자와 H2-NTP를 PPH4로 전환시키는 PTPS 효소 유전자를 포함하고 있으며, pMal-hPTPS의 PTPS cDNA(서열번호 1)와 pET15b-GTPCH의 프로모터 및 GTPCH(서열번호 2)를 pET-28a 벡터에 삽입하여 pET-GTPCH/PTPS를 제조하였다. pET-GTPCH/PTPS의 구조는 도 2에 나타난 바와 같이 GTPCH 및 PTPS가 각각의 프로모터에 발현되도록 되어있다.
상기 pET-BH4는 GTP를 H2-NTP로 전환시키는 GTPCH 효소 유전자, H2-NTP를 PPH4로 전환시키는 PTPS 효소 유전자 및 PPH4를 BH4로 전환시키는 SR 유전자를 포함하고 있으며, 상기 pET-GTPCH/PTPS 벡터에 pET15b-mSR의 SR유전자(서열번호 3)를 더욱 삽입하여 pET-BH4를 제조하였다. pET-BH4의 구조는 도 3에 나타난 바와 같이 GTPCH, PTPS 및 SR가 각각의 프로모터에 발현되도록 되어있다.
상기 pET-BH4/BGluT는 GTP를 H2-NTP로 전환시키는 GTPCH 효소 유전자, H2-NTP를 PPH4로 전환시키는 PTPS 효소 유전자, PPH4를 BH4로 전환시키는 SR 유전자 및 BH4를 BH4-α-글루코시드로 전환시키는 BGluT를 포함하고 있으며, 상기 pET-BH4에 pET28a-BGluT의 BGluT 유전자(서열번호 4)를 삽입하여 pET-BH4/BGluT를 제조하였다. pET-BH4/BGluT의 구조는 도 4에 나타난 바와 같이 GTPCH, PTPS, SR 및 BGluT가 각각의 프로모터에 발현되도록 되어있다.
상기 재조합 벡터는 대장균에 형질도입하여 형질전환체를 제조하였다. 상기 대장균은 XL-1 blue, JM101, DH5F', TG1, M5219, G1724, BL21(DE3), B834(DE3), BLR(DE3), HMS174(DE3), AD494(DE3), NovaBlue(DE3), Origami(DE3), OrigamiB(DE3), Rosetta(DE3) 및 Tuner(DE3)로 이루어진 군으로부터 선택하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 (DE3)를 포함하는 것들이고, 가장 바람직하게는 BL21(DE3)이다.
본 발명에서는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP), pET-BH4 형질전환체, 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 제조하였다.
상기 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP)는 GTPCH와 PTPS를 생성한다. GTPCH는 GTP를 H2-NTP로 전환시키고, PTPS는 H2-NTP를 PPH4로 전환시킨다. 따라서 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP)는 PPH4를 생산하는 것이 바람직하나, pET-GTPCH/PTPS 형질전환체는 세피아테린을 생산하였다. 세피아테린은 PPH4가 AR의 효소반응에 의해 변형된 형태이므로, pET-GTPCH/PTPS 형질전환체내의 기작에 의해 LPH4가 생성되고 이것이 산화되면서 세피아테린이 생성되는 것으로 추정되고 있다.
또한 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체는 배지 1 리터당 32.66 mg의 세피아테린을 생산하는 유용한 균주일 뿐만 아니라 테리딘 유도체를 생산하는 발현시스템으로 최적화되어 있다. 즉, 상기 pET-GTPCH/PTPS 벡터에 테리딘 유도체 생성에 관여하는 다수의 효소들을 동시에 발현시키므로써 발현된 효소들의 기작에 의해 최종 테리딘 유도체를 생산할 수 있게 된 것이다.
또한 본 발명의 pET-BH4 형질전환체는 GTPCH, PTPS 및 SR을 각각 발현시킨다. 따라서, 상기 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체가 세피아테린을 생산하는것에 그친 반면 pET-BH4 형질전환체는 발현된 SR을 이용하여 세피아테린을 BH4로 전환시킬 수있다. 실험결과 pET-BH4 형질전환체는 세피아테린과 더불어 BH4를 생산하였다.
또한 본 발명의 pET-BH4/BGluT 형질전환체는 GTPCH, PTPS, SR 및 BGluT을 각각 발현시킨다. 따라서 pET-BH4/BGluT 형질전환체는 대장균의 GTP를 GTPCH, PTPS, SR 및 BGluT 효소작용으로 최종산물 BH4-α-글루코시드를 생산하고, 중간산물인 세피아테린도 생산하였다.
또한 본 발명은 벡터에 다수의 생리효소를 동시발현시켜 재조합 화합물을 대장균에서 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하기로는 pET 벡터에 생체내에서 화합물을 생성하는데 관여하는 생리효소들의 유전자를 삽입하여 재조합벡터를 제조하고, 상기 재조합벡터를 포함하는 형질전환체를 선별한 다음 상기 형질전환체에서 각각 효소들을 발현시키고, 발현된 효소들에 의해 재조합 화합물이 생성되도록 하는 것이다. 즉, 재조합 화합물의 초기물질은 대장균의 생체물질을 사용하고, 효소는 재조합벡터로 삽입한 유전자들을 발현시켜 사용하여 원하는 화합물을 생산하는 것이다. 바람직하게는 테리딘 화합물, BH4, 세피아테린, BH4-α-글루코시드, 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum) SR 유전자, L-threo-BH4, 및 BH4 당화합물(BH4-(α또는 β)-당)들을 생산하기 위하여 GTPCH, PTPS, SR, 및 BGluT(BH4:UDP-glucose-α-glucosyltransferase)를 비롯한 기타 테리딘 당전이 효소로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되어지는 효소유전자를 재조합벡터로 발현시켜 형질전환체에서 생산하는 것이다.
또한 본 발명은 재조합 테리딘 화합물 및 재조합 생리효소를 제공한다. 상기 재조합 테리딘 화합물은 BH4, 세피아테린 및 BH4-α-글루코시드가 바람직하고,재조합 생리효소는 GTPCH, PTPS, SR, 및 BGluT이다. 상기 BH4, 세피아테린 및 BH4-α-글루코시드는 질병치료 등의 의약적인 용도 또는 건강식품등에 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) 벡터와 균주
PCR 산물의 클로닝에는 pGEM-T Easy 벡터(Promega)를 사용하였고, 과발현벡터로는 pET-28a(Novagen)을 사용하였다. 플라스미드 증폭을 위한 클로닝 균주로는 XL-1 Blue를 사용하였으며, 숙주로는 BL21(DE3) 균주를 사용하였다.
XL-1 Blue와 BL21 균주는 LB 배지에서 배양하였으며, XL-1 Blue의 형질전환체는 암피실린(ampicillin; Am)이 50 ㎍/ml의 농도로 첨가된 배지에서, BL21의 형질전환체는 카나마이신(kanamycin; Km)이 50 ㎍/ml의 농도로 첨가된 배지에서 배양하였다.
(2) 유전자와 cDNA 클론들
GTPCH, PTPS, SR, BGluT 효소들의 유전자와 cDNA 클론들은 이미 그 염기서열이 보고된 것들로 대장균 과발현 벡터인 pET(Novagen) 또는 pMal-c2(New England Biolabs)에 클로닝되어 그 재조합 단백질의 활성도 확인된 것으로, 하기 표 1에 각 효소 유전자를 포함하는 벡터를 나타내었다.
효소 과발현벡터 클론 기원 참고문헌 비고
GTPCH pET15b-cGTPCH Synechocystissp. PCC6803(ORF slr0426) Lee SW, Lee HW, Chung HJ, Kim YA, Kim YJ, Chung JH, Park YS (1999) FEMS Microbiol. Lett.176(1), 169-176.
PTPS pMal-hPTPS 사람섬유아세포 cDNA Burgisser DM, Thony B, Redweik U, Hunziker P, Heizmann, Blau N (1994) Eur. J. Biochem. 219, 497-502. 스위스 쥬리히대학 Nenad Blau 박사
SR pET15b-mSR 마우스 간 cDNA Seong C, Kim YA, Chung HJ, Park D, Yim J, Baek K, Park YS, Han K, Yoon J (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1443, 239-244; Kim, YA, Chung HJ, Kim YJ, Choi YK, Hwang YK, Lee SW, Park YS (2000) Mol. Cells 10, 405-410
BGluT pET28a-BGluT Synechococcussp. PCC 7942 Choi YK (2001) 시아노박테리아 Synechococcus sp. PCC 7942에서 테리딘 당전이효소 유전자의 클로닝. MS thesis, Inje University; Choi YK, Hwang YK, Park YS (2001) FEBS Lett. in submission. GenBank Accession No. AF331846
실시예 1-1. pET-GTPCH/PTPS 제조
세피아테린 단백질을 생산하는 벡터는 GTP를 H2-NTP로 전환시키는 GTPCH 효소 유전자와 H2-NTP를 PPH4로 전환시키는 PTPS 효소 유전자를 포함하도록 제조하였다.
도 2에 pET-GTPCH/PTPS 벡터의 제조과정을 나타내었다.
pMal-hPTPS의 PTPS cDNA는 서열번호 5의 프라이머(Forward primer)와 서열번호 6의 프라이머(Reverse primer)로 PCR하였다. PCR 반응은 10X 반응 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 25 ℃, 500 mM KCl, 1.0 % Triton X-100), 1.5 mM MgCl2,0.2 mM dNTP, 각각 0.5 pmol의 프라이머, pMal-hPTPS DNA, 및 2.5 unit의 DNA 중합효소로 최종 부피 50 ㎕으로 하였다. PCR 조건은 전처리변성단계(Pre-denaturation: 95 ℃, 4분), 변성(Denaturation: 95 ℃, 1분), 어닐링(Annealing:55-57 ℃, 1분), 증폭(Extension: 72 ℃, 1분)으로 25-30회를 수행하였으며, 마지막으로 72 ℃에서 10분간 최종연장을 하여 PCR 반응을 종결하였다. 반응물은 1-2 %의 아가로즈젤에서 전기영동하여 확인하였다. 증폭된 PTPS 유전자는 pGEM-T Easy 벡터 (Promega)에 클로닝한 다음 NdeI/BamHI으로 잘라 pET-28a 벡터에 클로닝하여 pET28a-hPTPS를 제조하였다.
pET15b-GTPCH를 BglII/HindIII로 잘라 프로모터 부위를 포함한 cGTPCH 절편을 회수한 후 BamHI/HindIII로 자른 pET28a-PTPS 플라스미드에 삽입하여 pET-GTPCH/PTPS를 제조하였다.
실시예 1-2. pET-BH4의 제조
상기의 pET-GTPCH/PTPS 벡터에 pET15b-mSR의 SR유전자를 더욱 삽입하여 pET-BH4를 제조하였다. pET-BH4 제조과정은 도 3과 같다.
pET15b-mSR를 BglII/HindIII로 잘라 프로모터 부위를 포함한 mSR 절편을 회수한 후 BamHI/HindIII로 자른 pET-GTPCH/PTPS에 삽입하여 pET-BH4를 제조하였다. 상기 pET-BH4는 XL-1 Blue에서 확인하고, BL21(DE3)에 형질전환하여 pET-BH4 형질전환체를 수득하였다.
실시예 1-3. pET-BH4/BGluT의 제조
상기 pET-BH4 벡터에 pET28a-BGluT의 BGluT 유전자를 삽입하여 pET-BH4/BGluT를 제조하였다. 그 제조 과정은 도 4와 같다.
pET28a-BGluT를 BglII/HindIII로 잘라 프로모터 부위를 포함한 BGluT 절편을 회수한 후 BamHI/HindIII로 자른 pET-BH4에 삽입하여 pET-BH4/BGluT를 제조하였다.
[실시예 2]
(1) pET-GTPCH/PTPS 형질전환체 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 pET-GTPCH/PTPS를 XL-1 Blue에 형질전환(Sambrook et al., 2001)하고 37 ℃에서 16시간동안 배양한 후 IPTG와 X-Gal이 도말된 LB-Amp+(50 ㎍/ml) 고체 배지에서 흰색 콜로니들을 선별하였다. 선별된 세포는 정제키트(QIAprep spin miniprep kit, QIAGEN)로 벡터 DNA를 정제한 후 염기서열을 확인하고, BL21(DE3) 균주에 형질도입하여 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체를 제조하였다.
(2) pET-BH4 형질전환체 제조
상기 실시예 1-2에서 제조한 pET-BH4를 XL-1 Blue에 형질전환하고, 37 ℃에서 16시간동안 배양한 후 IPTG와 X-Gal이 도말된 LB-Amp+(50 ㎍/ml) 고체 배지에서 흰색 콜로니들을 선별하였다. 선별된 세포는 정제키트(QIAprep spin miniprep kit, QIAGEN)로 벡터 DNA를 정제한 후 염기서열을 확인하고, BL21(DE3) 균주에 형질도입하여 pET-BH4 형질전환체를 제조하였다.
(3) pET-BH4/BGluT 형질전환체 제조
상기 실시예 1-3에서 제조한 pET-BH4/BGluT를 XL-1 Blue에 형질전환하고, 37 ℃에서 16시간동안 배양한 후 IPTG와 X-Gal이 도말된 LB-Amp+(50 ㎍/ml) 고체 배지에서 흰색 콜로니들을 선별하였다. 선별된 세포는 정제키트(QIAprep spin miniprep kit, QIAGEN)로 벡터 DNA를 정제한 후 염기서열을 확인하고, BL21(DE3)균주에 형질도입하여 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 제조하였다.
[실험예 1]
pET-GTPCH/PTPS 형질전환체, pET-BH4 형질전환체 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 각각 배양하여 재조합 단백질 생성여부를 확인하였다.
pET-GTPCH/PTPS 형질전환체, pET-BH4 형질전환체 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체를 LB-Km+고체배지에서 각각 키운 결과 IPTG의 첨가가 없이도 24시간 이내에서는 콜로니 색깔이 노란색을 띠었다가 나중에는 배지의 색깔이 노랗게 변하는 것을 관찰하였다. 이것은 노란색의 화합물이 배지로 방출되는 것을 가리키는 것으로 액체배양 시에도 동일한 결과가 나타났다. 반면 형질전환되지 않은 BL21 균주의 배양에서는 아무런 색깔도 관찰되지 않았고, pET-BH4 형질전환체와 pET-BH4/BGluT 형질전환체는 약한 노란색을 나타내었다. 세피아테린은 노란색의 화합물로 상기 형질전환체 콜로니가 노란색을 나타내는 것은 세피아테린을 생성하기 때문인 것으로 추정된다.
도 5는 고체배양한 BL21 균주(a), pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(b), pET-BH4 형질전환체(c) 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체(d)를 나타낸 것으로, BL21 균주를 제외한 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(b), pET-BH4 형질전환체(c) 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체가 노랑색을 나타냄을 나타낸 것이다.
도 6은 액체배양한 BL21 균주(a), pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(b), pET-BH4 형질전환체(c) 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체(d)를 나타낸 것으로, BL21 균주를 제외한 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(b), pET-BH4 형질전환체(c) 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체가 노랑색을 나타냄을 나타낸 것이다.
[실험예 2] 형질전환체의 테리딘 화합물 발현여부 확인
(1) pET-GTPCH/PTPS 형질전환체
형질전환체 배양액에 존재하는 테리딘 화합물들은 HPLC와 분광광도계를 사용하여 분석하였다. 테리딘 화합물은 산성요오드에 의해 형광을 나타내지만, 세피아테린은 산성요오드에 의해 형광을 나타내지 않는다. 형질전환체 배양액내의 테리딘화합물을 확인하기 위하여 산성요오드를 처리하여 형광파장내에서 HPLC를 실시하였고, 형광을 내지 않는 세피아테린은 SR과 반응시켜 수득되는 바이오테린을 다시 산성요오드를 처리한 다음 HPLC 분석하여 확인하였다.
pET-GTPCH/PTPS 형질전환체을 액체배지에 접종하고 24시간 경과 후에 배양액을 원심분리하고 상등액을 동일 부피의 산성 요오드 용액 (2 % KI/1 % I2in 1 N HCl)과 혼합한 후 1 시간 동안 암소에서 실온에 방치하였다. 이것을 원심분리하여 비타민 C 용액을 최종농도 0.5 %가 되도록 상등액에 첨가한 후 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 분석에는 C18 컬럼(Inertsil ODS-3, 5 ㎛, 150 x 2.3 mm, GL Sci., Japan)이 사용되었으며, 10 mM 포타슘 포스페이트(pH 6.0) 용매를 분당 1.2 ml의 속도로 흘려주었다. 용출되는 테리딘 화합물들은 형광분석기(HP Model 1046A fluorescence detector) 350 nm/450 nm (Ex/Em)의 파장에서 측정하였다. 세피아테린 및 BH4의 농도는 구입한 표준 시료 (Schircks Lab., Switzerland)로 결정하였고, 바이오테린-α-글루코사이드는 연구실에서 정제된 것(Chung et al., 2000)을 사용하였다.
또한 배지에 존재하는 세피아테린의 확인은 김(Kim, YA, Chung HJ, Kim YJ, Choi YK, Hwang YK, Lee SW, Park YS (2000) Mol. Cells 10, 405-410)에 기술된 방법에 따라 정제된 생쥐의 재조합 SR과 반응시킨 후 산성요오드 용액으로 산화시켜 HPLC를 사용하여 바이오프테린의 존재로서 분석하였다. 산성요오드는 테리딘 화합물을 산화시켜 테리딘 화합물을 산화상태에서 형광을 발하게 한다. 정량분석은 배지를 직접 420 nm에서의 흡광도로서 분석하거나, HPLC로 분석하였다. HPLC에는 상기와 동일한 컬럼을 사용하였으며 12 % 메탄올 용매를 분당 1.2 ml의 속도로 흘려주고 420 nm에서 분석하였다.
도 7은 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 배양액을 HPLC 한 그래프로, A는 표준 테리딘 화합물의 HPLC 그래프이고, B는 산성요오드 용액을 처리한 배양액 HPLC 그래프이고, C는 SR 효소와 반응시킨 후 산성 요오드 용액을 처리한 배양액의 HPLC 그래프이다. 또한 a는 네오테린(neopterin)이고, b는 테린(pterin)이고, c는 바이오테린(biopterin)이고, d는 6-하이드로시메틸테린이고(6-hydroxymethylpterin), e는 딕티오테린(dictyopterin)이고, 화살표는 바이로테린 위치를 가리킨다.
도 7에서 나타난 바와 같이, pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 배지를 산성요오드 용액으로 처리한 후 HPLC로 분석한 결과, 별다른 테리딘 화합물의 피크는 관찰되지 않았으나 배지에 직접 생쥐의 SR 효소와 NADPH를 첨가하여 반응시킨 결과 배양액의 노란색이 없어지고, 바이오테린에 해당하는 피크가 높게 나타났다. 이는배양액에 세피아테린이 존재하는 것을 의미하는 것이다.
재확인하기 위하여 배양액을 산성요오드 용액으로 처리하지 않고 직접 HPLC로 분석하였다. 도 8은 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 액체배지에 존재하는 세피아테린을 분석한 HPLC 그래프로, A는 표준 세피아테린을 분석한 그래프이고, B는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 액체배지를 분석한 그래프이다. 그 결과 420 nm에서 흡광도를 가지는 화합물이 많이 검출되었으며, 그 용출위치는 표준 세피아테린과 동일한 위치임이 확인되어 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체가 재조합 세피아테린을 생산함을 확인할 수 있었다.
(2) pET-BH4 형질전환체
상기 테리딘 화합물을 확인하기 위한 실험을 동일하게 pET-BH4 형질전환체에 대하여 실시하였다.
도 9는 pET-BH4 형질전환체 배양액을 HPLC한 그래프로, A는 표준 테리딘 화합물의 HPLC 그래프이고, B는 산성요오드 용액을 처리한 배양액 HPLC 그래프이고, C는 SR 효소와 반응시킨 후 산성 요오드 용액을 처리한 배양액의 HPLC 그래프이다. 또한 a는 네오테린(neopterin)이고, b는 테린(pterin)이고, c는 바이오테린(biopterin)이고, d는 6-하이드로시메틸테린이고(6-hydroxymethylpterin), e는 딕티오테린(dictyopterin)이고, 화살표는 바이로테린 위치를 가리킨다. 그 결과, pET-BH4 형질전환체 배양액은 산성요오드 용액을 처리하였을 때 바이오테린 피크를 보여주었다.(도 9B) 이는 pET-BH4 형질전환체가 GTPCH, PTPS 및 SR을 모두 발현하여 BH4가 생성되었음을 의미하는 것이다.
또한 pET-BH4 형질전환체 배양액을 SR 효소와 반응시켜 HPLC로 분석한 결과 바이오테린의 피크가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.(도 9C) 이는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체가 대부분 세피아테린을 분비하기 때문에 분비된 세피아테린이 첨가한 SR과 반응하여 바이오테린을 형성한 것이다. 따라서 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체 배지의 노란색은 세피아테린에 기인하는 것임을 확인하였다.
(3) pET-BH4/BGluT 형질전환체
BGluT는 BH4의 6번 곁사슬의 C2'-OH 기에 글루코스를 α-배위로 붙여주는 효소로서, BGluT 유전자의 발현에 의해 BH4-α-글루코스가 생성될 수 있는지 알아보았다. 실험은 상기 테리딘 화합물을 확인하기 위한 실험과 동일하게 실시하였다.
도 10은 pET-BH4/BGluT 형질전환체의 배양액을 HPLC한 그래프로, A는 표준 테리딘 화합물의 HPLC 그래프이고, B는 산성요오드 용액을 처리한 배양액 HPLC 그래프이고, C는 바이오테린-α-글루코시드를 산성요오드 용액을 처리한 배양액과 혼합한 시료의 HPLC 그래프이고, D는 SR 효소와 반응시킨 후 산성 요오드 용액으로 산화시킨 배양액의 HPLC 그래프이다. 또한 a는 네오테린(neopterin)이고, b는 테린(pterin)이고, c는 바이오테린(biopterin)이고, d는 6-하이드로시메틸테린이고(6-hydroxymethylpterin), e는 딕티오테린(dictyopterin)이고, 화살표 a는 바이오테린을, 화살표 b는 바이오테린-α-글루코시드의 위치를 가리킨다.
도 10에서 나타난 보와 같이, pET-BH4/BGluT 형질전환체의 배양액을 산성요오드 용액으로 처리한 후 HPLC로 분석한 결과 바이오테린 피크는 거의 없고, 18분정도의 용출위치에 적은 양의 새로운 화합물(화살표 b)이 나타났다.(도 10B) pET-BH4/BGluT 형질전환체의 배양액을 산성요오드 용액처리하고, 바이오테린-α-글루코시드를 혼합하였을 때 도 10C로 나타났다. 이는 화살표 b가 바이오테린-α-글루코시드임을 입증하는 것이다. 또한 배양액에 SR을 처리한 경우 바이오테린이 용출되는 것으로 보아(도 10D), pET-BH4/BGluT 형질전환체 역시 pET-BH4 형질전환체와 같이 세피아테린을 발현함을 알 수 있었다. 따라서, pET-BH4/BGluT 형질전환체 콜로니의 노란색은 세피아테린에 의한 것이다.
[실시예 3]
상기 실시예 2에서 제조된 각 형질전환체는 LB-Km+액체배지에 접종하여 섭씨 37도에서 200rpm의 속도로 진탕배양하여 재조합단백질을 과발현시키고, 이를 정제하였다. pET-GTPCH/PTPS 형질전환체, pET-BH4 형질전환체 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체의 재조합 단백질의 발현방법은 동일하다.
형질전환체를 LB-Km+(50 ㎍/ml) 액체배지에 접종하여 O.D600의 값이 0.6에서 1 사이가 될 때까지 배양한 뒤 최종농도가 50 uM이 되도록 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다. 재조합 단백질들의 과발현 여부는 SDS-PAGE로 분석되었다. 그 결과 His-tag을 포함하는 분자량 이 GTPCH는 27.5 kD, PTPS는 18.6 kD, SR는 30 kD, BGluT는 40.2 kD였으며, SDS-PAGE로 재조합단백질들의 발현량을 분석하였을 때 IPTG를 첨가하지 않았을 때 발현율이 좋은 것으로 나타났다.
또한 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체의 생장에 따른 세피아테린의 생성량을 600nm와 420 nm의 흡광도로 분석하였다. 대조군으로 BL21(DE3) 균주와 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체 각각을 LB-Km+액체 배지에서 접종하여 37도에서 진탕배양하면서 매 30-60분 마다 600 nm와 420 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체가 OD6000.6일 때 50 uM IPTG를 첨가한 실험군도 동일하게 실험하였다. 그 결과는 도 11에 그래프로 나타내었다. ●는 BL21 균주이고, ○는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체이고, ▼는 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체+ 50 uM IPTG이고, 점선은 600 nm에서 측정한 흡광도이고, 실선은 420 nm에서 세피아테린의 노란색 흡광도를 측정한 것이다.
도 11에 따르면, pET-GTPCH/PTPS 형질전환체 생장에 따른 세피아테린의 생성량은 IPTG의 첨가없이도 생성되어 24시간 이내에 포화상태에 도달하여 2.0에 가까운 흡광도 값을 보여주었다.(도 11-실선○) IPTG를 첨가하였을 경우는 오히려 낮은 값을 보여주었다.(도 11-실선▼) 또한 23시간에서의 흡광도 값은 BL21 대조군의 흡광도 값을 제하였을 때 1.84이었고, 1.84는 420 nm에서 세피아테린의 흡광계수값 10400을 적용하였을 때 177 uM 농도에 해당하는 값이다. HPLC로 분석하였을 때 177 uM의 77 % 수준에 해당하는 농도의 세피아테린 피크가 나타났었다. 따라서 보정된 값을 적용하더라도 배지에 존재하는 세피아테린의 농도는 137.7 uM에 해당하는 높은 농도로 계산되었다. 137.7 uM은 세피아테린의 분자량 237.2를 적용하였을 때 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체 배지 1 리터당 32.66 mg의 수율로 계산되었다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 테리딘 화합물을 대장균을 이용하여 생산하는 방법을 확립하여 대량의 세피아테린을 대장균에서 쉽게 수득할 수 있다. 또한 본 발명의 pET-GTPCH/PTPS 형질전환체(KCTC 1020BP), pET-BH4 형질전환체 및 pET-BH4/BGluT 형질전환체로 세피아테린, BH4 및 BH4-α-글루코시드를 대량으로 제조하여 의약적의 용도로 사용할 수 있다.
<110> PARK, Young Shik <120> Producing method of pteridine compounds using recombinant bacteria <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 438 <212> DNA <213> hPTPS gene <400> 1 atgagcacgg aaggtggtgg ccgtcgctgc caggcacaag tgtcccgccg catctccttc 60 agcgcgagcc accgattgta cagtaaattt ctaagtgatg aagaaaactt gaaactgttt 120 gggaaatgca acaatccaaa tggccatggg cacaattata aagttgtggt gacagtacat 180 ggagagattg accctgctac gggaatggtt atgaatctgg ctgatctcaa aaaatatatg 240 gaggaggcga ttatgcagcc ccttgatcat aagaatctgg atatggatgt gccatacttt 300 gcagatgtgg tgagcacgac tgaaaatgta gctgtttata tctgggacaa cctccagaaa 360 gttcttcctg taggagttct ttataaagta aaagtatacg aaactgacaa taatattgtg 420 gtttataaag gagaatag 438 <210> 2 <211> 669 <212> DNA <213> cGTPCH gene <400> 2 atgaacaccg gtaaattagt gaatcagctt tcctccctac ctgaccgtaa tacccacaat 60 gggcaagagg tgaaatatca tcccgaaaat gttgagttga ataaagaaaa aatgatggac 120 gcggtgcgcg tcatgttgga gtcagtaggg gaagatccgg aaagggaagg cttgctaaaa 180 acccccaaac gggtagcaga agcaatgcaa tttttgaccc agggttatga ccaatccttg 240 gaaaaattag tcaatggcgc catttttgac gaaggtcata acgaaatggt attggtgcgg 300 gacattgatt ttttcagttt gtgtgaacat cacatgttgc cctttatggg taaggcccat 360 ttggcttata ttcccaacca aaaagtagtg ggactgagca aactggcccg catcgtggaa 420 atgttttccc gccgtctcca ggtacaggag cgtctcacca ggcagatcgc cgaagcagta 480 caggaaatcc tcgatcccca aggtgtggca gtggtgatgg aagccaccca catgtgcatg 540 gtaatgcgtg gtgtacaaaa accaggttcc tggacagtga ccagtgccat gattggttct 600 ttccaaaatg aacaaaaaac cagagaagag tttttgaacc tgattcgcca tcaacctaat 660 ttctattaa 669 <210> 3 <211> 786 <212> DNA <213> mSR gene <400> 3 atggaggcag acgggctggg ctgcgctgtg tgcgtgttga ccggggcctc ccggggcttt 60 ggtcgcgccc tggccccgca gctggcccgg ttgctgtctc ccggttccgt gatgctcgta 120 agcgcacgca gtgagtcgat gctgcggcaa ctgaaggagg agctgggcgc tcagcagcct 180 gacctgaaag tggtgctggc agccgccgat ctgggcaccg aggctggcgt gcagcggttg 240 ctgagcgcag tacgcgagct cccgaggccc gaggggctgc agcgcctgct gctcatcaac 300 aacgcagcca ctcttgggga tgtttccaaa ggcttcctca acgtgaatga cctagctgag 360 gtgaacaact actgggctct gaacctgacc tccatgctct gtttgacttc cggcaccttg 420 aatgccttcc aggatagccc tggcctgagc aagactgtgg ttaacatctc atctctgtgt 480 gccctgcagc cctacaaggg ctggggtctg tactgtgcgg ggaaggctgc ccgagacatg 540 ctctaccagg tcctggctgc tgaggaaccg agtgtgcggg tgctgagcta tgctccaggt 600 cccctggaca atgacatgca gcagttggct cgggaaacct ccaaggaccc agagttaagg 660 agcaaactgc agaagttgaa gtcggatggg gcgctggtgg actgtgggac ttcagcccag 720 aaactgctgg gcttgctgca aaaggacacc ttccagtctg gagcccatgt ggacttctat 780 gactga 786 <210> 4 <211> 786 <212> DNA <213> BGluT gene <400> 4 atggaggcag acgggctggg ctgcgctgtg tgcgtgttga ccggggcctc ccggggcttt 60 ggtcgcgccc tggccccgca gctggcccgg ttgctgtctc ccggttccgt gatgctcgta 120 agcgcacgca gtgagtcgat gctgcggcaa ctgaaggagg agctgggcgc tcagcagcct 180 gacctgaaag tggtgctggc agccgccgat ctgggcaccg aggctggcgt gcagcggttg 240 ctgagcgcag tacgcgagct cccgaggccc gaggggctgc agcgcctgct gctcatcaac 300 aacgcagcca ctcttgggga tgtttccaaa ggcttcctca acgtgaatga cctagctgag 360 gtgaacaact actgggctct gaacctgacc tccatgctct gtttgacttc cggcaccttg 420 aatgccttcc aggatagccc tggcctgagc aagactgtgg ttaacatctc atctctgtgt 480 gccctgcagc cctacaaggg ctggggtctg tactgtgcgg ggaaggctgc ccgagacatg 540 ctctaccagg tcctggctgc tgaggaaccg agtgtgcggg tgctgagcta tgctccaggt 600 cccctggaca atgacatgca gcagttggct cgggaaacct ccaaggaccc agagttaagg 660 agcaaactgc agaagttgaa gtcggatggg gcgctggtgg actgtgggac ttcagcccag 720 aaactgctgg gcttgctgca aaaggacacc ttccagtctg gagcccatgt ggacttctat 780 gactga 786 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400> 5 ggaattccat atgagcacgg aaggtggt 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 6 cgggatccta ttctccttta taaacca 27

Claims (8)

  1. pET-GTPCH/PTPS, pET-BH4 및 pET-BH4/BGluT로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 벡터를 포함하는 테리딘 화합물 생합성용 재조합벡터:
    상기 pET-GTPCH/PTPS은 GTPCH(GTP cyclohydrolase I) 및 PTPS(6-pyruvoyltetrahydropterin synthase) 유전자를 포함하며;
    상기 pET-BH4는 GTPCH, PTPS 및 SR(sepiapterin reductase) 유전자를 포함하며;
    상기 pET-BH4/BGluTpET-GTPCH/PTPS는 GTPCH, PTPS, SR 및 BGluT(BH4:UDP-glucose-α-glucosyltransferase) 유전자를 포함하며; 및
    상기 테리딘 화합물은 세피아테린(sepiapterin), BH4((6R)-5,6,7,8-tetrahydro-L-biopterin) 및 BH4-α-글루코시드(BH4-α-glucoside)로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 화합물인 재조합벡터.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 따른 재조합벡터로 형질전환된 E.coli 균주.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 균주는 E.coli BL21(D3)/pET-GTPCH/PTPS(KCTC 1020BP)인 균주.
  5. 삭제
  6. GTPCH 유전자 및 PTPS 유전자를 포함하는 재조합벡터를 제조하고, 상기 재조합벡터를 대장균에 형질전환시켜 대장균으로부터 테리딘 화합물을 생합성하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 재조합벡터는 SR 유전자 또는 BGluT 유전자를 더욱 포함하는 것인 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 테리딘 화합물은 세피아테린, BH4 및 BH4-α-글루코시드로 이루어지는 군으로부터 1종이상 선택된 화합물인 방법.
KR10-2001-0034466A 2001-06-18 2001-06-18 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법 KR100456062B1 (ko)

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