JPH0482888A - テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、６−（Ｒ）−エリスロー５，６，７゜８−テ
トラヒドロビオプテリン（以下、Ｂ　Ｈ４ということが
ある）の製法に関する。

さらに詳しくは、酵素法によるＢＨ４の製造の改良方法
に関する。

（従来の技術）） ］＼３ テトラヒドロビオプテリンには、例えば、その６位の炭
素原子の側鎖の相対配置により、Ｄ−系列とＬ−系列が
あり、また、そのテトラヒドロ体には、６位の炭素原子
における絶対配置によって（Ｒ）−または（Ｓ）−とい
う二つのジアステレオマーが存在することが知られてい
る。すなわち−形式（■）： で示されるテトラヒドロプテリン誘導体において、Ｒが
：　　　　−ＣＨ−ＣＨ−ＣＩ−１３ＨＯＨ であるものがＢ　Ｈ４である。

Ｂ　Ｈ４は生体内に存在し、モノアミン神経伝達物質合
成に関与するモノオキシゲナーゼの補酵素であり、その
調節因子の一つであると考えられている。従って、Ｂ　
Ｈ／ｌの欠乏は、神経伝達物質であるセロトニン、ドー
パミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどの欠乏を
もたらし、重篤な神経症状をもたらす。例えば、悪性フ
ェニルケトン尿症などが知られており、事実、６−（Ｒ
，Ｓ）テトラヒドロビオプテリン投与による先駆的な治
療成果も報告されている（Ｎｉｅｄｃｒｗｉｅｓｅｒ、
八、ら１、ａｎｃｅｔ、　Ｌ　５５０　（１９７９）；
　Ｃｕｒｔｉｕｓ、　Ｈ−ＣＩら、Ｃ目ｎ。

Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、　９８．２５１−２６２　（１
９７９））。

テトラヒドロビオプテリンを製造する方法としては、Ｉ
７−エリスロービオプテリンを化学的あるいは酵素的に
還元する方法が知られている。

しかしながら、化学的方法によればビオプテリン自体の
合成に費用がかかり煩雑であり、また６Ｒ体と６Ｓ体の
混合物を生じ、これは分割しなければならないが、この
分割は極めて困難であり、現在その有利な分割法は知ら
れておらず、６Ｒ体の生成収率を高める研究がなされて
いる。一方、酵素法は６Ｒ体のみが得られるという利点
はあるが、装置および操作が煩雑であるという問題があ
る。

マイルシュタインらは、各種動物組織や酵母中に存在す
るグアノシン５′−三リン酸（ＧＴＰ）を出発原料とす
るＢ　Ｈ４の酵素法による方法を報告シＴイル（（ＢＩ
ＯＣＩＩＥＭＩＣＭ１，ＡＮＤ　ＢＩＯＰＩＩＹＳＩＣ
Ａ１，ＲＥＳＥＡＲＣＩＩ　　ＣＯＭＭＩＩＮＩＣＡＴ
ＩＯＮ、　　１２８．　　Ｎｏ、３．　１０９３−１１
０７（１９８５））。その方法は次に示すスキームから
なる。

１］０ Ｈ エリスロ Ｉ］ ジヒドロネオプテリントリフオスフエ ビルボイル テトラヒドロプテリン ラクトイル テトラヒドロプテリン しかしながら、マイルシエタインらの方法は、」二記ス
キームから明らかな如く、複数の反応工程からなり煩雑
な操作が要求され、また中間生成物、特に６−ピルボイ
ル−テトラヒドロプテリンは非常に不安定であり、その
分離後最終反応工程に供しセピアプテリン還元酵素と反
応させるのは困難であり、とても実用的方法とは言いが
たい。また、すべての工程に単一精製標品の酵素を用い
ていないので、Ｂ　Ｈ４と副産物（未同定を含む）の分
離が困難となっている可能性がある。

（発明が解決しようとする課題） そこで、本発明者らは、−ヒ記現状に鑑み鋭意研究を重
ねた結果、ＧＴＰを出発原料としてＢ　Ｈ４をワンポッ
トで効率良く製造しうる酵素系を見出し、大発明を完成
するに至った。

（課題を解決するだめの手段） 即ち、本発明は、ＧＴＰに大腸菌由来ＧＴＰシクロヒド
ロラーゼ１．６−ビルポイルテトラヒドロプテリン合成
酵素およびセピアプテリン還元酵素を作用させることを
特徴とする式（■）：で示される６−（Ｒ）−Ｌ−エリ
スロー５，６７．８−テトラヒドロビオプテリンの製法
を提供する。

本発明は上記製法に用いる酵素、 （］）アミノ末端から２５番目までのアミノ酸配列が式
： ％式％ で示され、ＧＴＰを特異的にＤ−エリスロー７８−ジヒ
ドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を有
する大腸菌由来ＧＴＰシクロヒドロラーゼ■、 （２）アミノ末端から１５番目までのアミノ酸配列が式
： ％式％ で示され、■〕−エリスロー７．８−ジヒドロネオプテ
リントリホスフェートを特異的に６−ビルポイルー５．
６．７．８−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有
するラット肝由来６−ビルボイルテトラヒドロプテリン
合成酵素、および（３）部分アミノ酸配列が式： ％式％ ラヒドロブテリンを特異的に６−（Ｒ）−Ｌ−エリスロ
ー５，６，７．８−テトラヒドロビオプテリンに変換す
る能力を有するものであるラット赤血球由来セピアプテ
リン還元酵素も提供する。

本発明において出発原料として用いるＧＴＰは、各種動
物組織や酵母の酸抽出液から通常の方法に従って分離精
製して得ることができる。また、市販のＧＴＰを用いて
もよい。

本発明の酵素系は、大腸菌由来ＧＴＰシクロヒドロラー
ゼＩ　（以下、Ｇ　ＣＨという）、例えばラット肝から
得られる６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素
（以下、ＰＴＰＳという）および例えばラット赤血球か
ら得られるセピアプテリン還元酵素（以下、ＳＰＲとい
う）からなる。これらの酵素は、溶液状態で混合して用
いるのが好ましいが、単独でまたは一緒に、通常の方法
、例えば担体結合法や包括法により固定化されて用いら
れてもよい。

本発明において上記３種の酵素は、Ｂ　Ｈ４の生成に十
分な濃度で使用すればよいが、本発明によれば、これら
の酵素を全て、ＳＤＳ電気泳動またはＨＰ　Ｌ　Ｃの分
析でほぼ純粋な単一精製標品に精製する方法も提供され
る。全ての酵素を単一精製標品として用いれば、構造不
明な副産物の生成を最少にすることが期待され、Ｂ　Ｈ
４の分離回収も容易である。

本発明の酵素系は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１（ＧＣ
Ｈ）が大腸菌由来のものであることが重要である。Ｇ　
ＣＨを、大腸菌以外の由来、例えばラット由来のＧＣＨ
で代用した場合には、該酵素が最終生成物Ｂ　Ｈ４で阻
害され（ＢＨ／ｌの１０μＨで３０％阻害される）、さ
らにＤ−エリスロ７．８−ジヒドロネオプテリントリホ
スフェートの６−ビルポイルー５．６，７．８−テトラ
ヒドロプテリンへの変換反応に必要なＭｇＣ＋２でも阻
害される（Ｍ　ｇ　Ｃ＋　２の０．１ｍＭで５０％阻害
）ため、該ラット由来の酵素を含む酵素系は、本発明の
製造方法のごときワンポットでの反応に用いることはで
きない。

本発明の製法において、反応系中のＧＣＨ濃度は好まし
くは５００〜５０００μｇ／ｄ、特に好ましくは５００
０μｇ／威、ＰＴＰＳ濃度は好ましくは５０〜５００μ
ｇ／ｍｌ、特に好ましくは５００μｇ／ｐｄ、またＳＰ
Ｒ濃度は好ましくは４〜４０１ｔｇ　／ｒｄ、特に好ま
しくは４０μｇ／ＩＩｌがよい。（Ｉ（Ｌ、ここに例示
した酵素量の」二限は主として酵素の精製標品における
最終濃度により決定されるもので、酵素活性が安定であ
るかぎり、酵素量に実質的上限は存在しない。

本発明の製法で使用するＧＣＨは、大腸菌由来であり、
大腸菌例えばＢ株（野性株）の溶菌、硫安分画、ＡｃＡ
３４ゲル濾過、ＧＴＰ−セファロース分画により得るこ
とができる。Ｂ株は、例えば、ＪＥ６０３４　（国立遺
伝研究所）とし゛ζ入手可能な大腸菌またはＡＴＣＣ２
３８４８として入手可能な大腸菌である。

Ｐ　Ｔ　Ｐ　Ｓは、哺乳類、例えばラットの肝より得ら
れた粗抽出物を硫安分画、熱処理、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー、ブチルトコバールクロマトグラ
フィー、セファデックスＧ１００ゲル濾過、Ｍｏｎｏ　
　Ｑイオン交換クロマトグラフィーにより精製すること
により得ることができる。

また、ＳＰＲは、哺乳類例えばラットの赤血球の溶血、
硫安分画、ブチルトヨバールクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、レッドセファロ
ースＣＬ−６１３により得ることができる。

ごのようにして得られた酵素標品は、ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって、その精製程度あるいは
十分に精製単離されているかどうか知ることができ、ま
た、必要であればこれにより分子量を知ることができる
。さらに、得られた酵素標品はアミノ酸配列自動分析機
によってアミノ末端のアミノ酸配列が分析される。ある
いは、蛋白質分解酵素を用いて得られた酵素標品を分解
し、高速液体クロマトグラフィーを用いて、ペプチドを
分離し、同様にアミノ酸配列を決定することができる。

本発明においては前記のとおり本発明の製法に使用する
ために特に適する酵素も提供されたが、これらの各酵素
は、アミノ末端のアミノ酸配列および部分アミノ酸配列
により、新しい構造をもつ酵素であることがわかった。

本発明は、新しいアミノ酸配列を見出したことにより、
これらをコードする本酵素の遺伝子の単離、さらには組
換えＤＮＡ技術による本発明の酵素の大量生産の材料を
提供する。

１へ 本発明の製法においては、Ｇ　ＣＨがＫＣＩで活性化さ
れ、ＰＴＰＳはＭ　ｇ　２　゛が活性発現に必須であり
、またＳＰＲの活性発現にはＮ　Ａ　Ｄ　ｌ）　Ｈを要
することを考慮して、これら活性化因子および補酵素は
互いに他の酵素反応を阻害しない濃度範囲で設定されれ
ばよい。ＫＣＩの濃度は、好ましくは０．０５〜０．５
０Ｍ、特に好ましくは、０゜１０Ｍであり、Ｍｇ２′″
の供給源としてのＭｇＣ１□の濃度は、好ましくは５〜
５０ＩＩＩＭ、特に好ましくは５〜２０ｗＭ、およびＮ
　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの濃度は、好ましくは４ｍＭ以」二、
特に好ましくは４ｍＭがよい。

基質ＧＴＰの濃度は、特に限定されないが０．２１１Ｉ
Ｍ以下が好ましく、特に０．１〜０．２ｍＭが好ましい
。ＧＴＰの濃度が０．２＋ｗＭを大幅に越えると、ＧＴ
Ｐのジヒドロネオプテリン１−リホスフエートへの変換
効率が低下するという不都合が生じる。

各種反応条件は、本反応が阻害されない範囲で設定すれ
ばよいが、溶媒としては、適宜ジチオエリ１〜リトール
、ジチオスレイトールなどの還元剤やエチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）などの重金属キレイタ−を加えて、
リン酸緩衝液等の適当なｐＨ調節剤を用いればよく、反
応ｐｌ＋および温度は本酵素の特性により決定され、ｐ
ｕは概ね６〜８、特に７付近が好ましく、温度は概ね２
５〜４２°Ｃ２特に３７℃付近が好ましい。反応時間は
概ね５分〜１時間である。こうして反応混合物中に生成
したＢ　Ｈ４の回収は、ＨＰＬＣ等のクロマ１〜グラフ
イーによる分離法その他により行うことができる。

本発明の製法によるＢＩ３の原料（ＧＴＰ）に対する収
率は、約８０％もしくはそれ以上であり、従来の方法に
比べて極めて収率が高い。

また、前記したごとく、ラット由来のＧＴＰシクロヒド
ロラーゼ１は、Ｂ　Ｈ４合成の律速酵素であり、また種
々の活性調節を受けることが知られている。そごで本発
明者らは、ラット肝よりＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを
精製してその性質を明らかにした。本酵素のｃＤＮＡク
ローニングを行い、全−底構造を決定した。ラット肝ポ
リ（Ａ）ＲＮＡからλＺＡＰｒｌｃｌ）ＮＡライブラリ
ーを作成し、リジルエンドペプチダーゼ分解によって得
たペプチドの部分アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレ
オチドを合成し、それをプローブに用いてスクリーニン
グを行い、１．０ｋｂの挿入断片を持つクローンを得た
。このクローンは２４１アミノ酸残基からなるポリペプ
チドをコードしており、上記リジルエンドペプチダーゼ
分解で分離した８個のペプチドのアミノ酸配列と完全に
一致する８領域を含んでいた。塩基配列から予想される
アミノ酸配列とＮＢＲＦ蛋白質データベースを比較した
ところ、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩのアミノ酸配列の
一部が、ジヒドロ葉酸還元酵素のジヒドロ葉酸結合部位
と同定されているアミノ酸配列とホモロジーを示すこと
が明らかになった。ジヒドロ葉酸の構造と類似している
ＢＨ４により、本酵素が活性阻害を受けることから、こ
の部分はプテリン結合部位ではないかと考えられる。

以下本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、
もとより本発明は実施例のみに限定されるものではない
。

実施例ＩＧＣＨの抽出・精製 大腸菌としてはＢ株（野性株１国立遺伝研究所。

ＪＥ６０３４）を用いた。大腸菌Ｂ株を、以下のように
して溶菌、硫安分画、ＡｃＡ３４ゲル濾過、ＧＴＰ−セ
ファロース分画して、約１４００倍に精製した。各工程
の蛋白質量、活性収率および比活性は後記第１表に示す
。

、ＭＪＩＡＭ３　：　−７０°Ｃで保存しておいた大腸
菌２４５ｇを、ｐＨ８，０の０．３Ｍ）リス塩酸緩衝液
（緩衝液Ａ）４２０−とブレングー中で混和し、各回５
分間の音波処理を５回行い、菌を破壊した。

この溶菌液を１２０００Ｘｇ、２０分間遠心分離し、上
清を得た。沈渣は緩衝液Ａ９１ｄに懸濁し、音波処理を
５分間行い同様に遠心分離後、上滑を得、先の上清と混
和した。

薄皮分画：溶菌液５３５ｄに１００％飽和硫安２２９ｄ
を加え、２０分間攪拌後、１２０００ｘｇで２０分間遠
心分離し、」１清を得た。この上清７２２威に１００％
飽和硫安１４９ｄを加え、２０分間攪拌後、１２０００
Ｘｇで２０分間遠心分離し、沈渣を得た。この沈渣を０
．３Ｍ　　ＫＣ１２、，１′。

を含むｐＨ８，０の５０１１ＩＭトリス塩酸緩衝液（緩
衝液Ｂ）に溶かし、５℃の緩衝液Ｂに対して２回交換し
て透析した。

ΔｃＡ３４ゲ四１１−：透析した酵素液を１２０００×
ｇで２０分間遠心分離後、上清を得た。このに清５７ｄ
を限外濾過膜（アミコン社製、ｌ）Ｍｌｏ）を用いて２
４ｄまで濃縮した。この濃縮した酵素液を緩衝液Ｂで平
衡化した５Ｘ８３ｃｍのＡｃＡ３４ゲルカラムを用いて
流速６０ｉ／時間でゲル濾過を行い、活性分画を得た。

ＧＴＰ−セファロース　　ニゲル濾過の活性画分を、２
．５＋ｏＭ　　ＥＤＴＡを含むｐＨ７，０の１０ｍＭカ
リウムリン酸緩衝液（緩衝液Ｃ）で平衡化したＧＴＰ−
セファロースカラムへ流速６０ｄ／時間で吸着させ、０
．３Ｍ　　ＫＣＩを含む緩衝液Ｃ４０＋ｔｌ！と緩衝液
Ｃ９０ｍで連続して洗浄した。次にごのカラムに０．２
５■／ｄのＧＴＰを含む緩衝液Ｃを流速１０−７時間で
流し、Ｇ　ＣＨの活性分画を得た。

第１表 工程　　蛋白質　　　活性 比活性（ｎｍｏｌ／ｈ 含量（＋１ｇ）　　収率（％）　／町蛋白質）溶菌　　
　　３３．０００ 硫安分画　　５，０００ ΔｃＡ３４　　　　２，５００ ＧＴＰ−セファロース　　　　　　　４．６１００　　
　　　　　　０．２５ ６７　　　　　　　　１．１ ５５　　　　　　　　１．９ なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。

反応液である０、１ｍＭ　　ＧＴＰと２．５ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡを含むｐｌ＋８．５の０．ＩＭＦリス塩酸緩衝液
４９５μ＋　に５μｌ　（Ｄ酵素液を加え、３７°Ｃテ
３０分間保温し、５０μｍの０．９％Ｉ２と１．８％Ｋ
ｌを含むＩＮ塩酸を加え、遮光して室温で１時間放置し
た。この液に２％アスコルビン酸５０μｍ、ＩＮ水酸化
ナトリウム５０μｍと３ユニツトのアルカリフォスファ
ターゼ液１００μｍを加え、３７°Ｃで１時間保温した
。この液にＩＮの酢酸１００μｍを加え、遠心分離後上
清を得た。この」１清を１ｍＭ　　ＥＤ−１”Ａを含む
ｐｌ＋７．０の１１０１１Ｉナトリウムリン酸緩衝液で
平衡化した４、６Ｘ２５０＋ｗの５μｍｃ１８逆相カラ
ムに流速０．８ｄ／分でインジェクトし、３５０ｎｍ励
起、４４０ｎｍ蛍光検出器を用いてＧ　ＣＨ反応産生物
であるジヒドロネオプテリントリフオスフェート由来の
ネオプテリンを分離定量する。

また、下記のようにして比活性を測定し、ＫｍＯ，０５
／μ門を決定した。Ｉｆｌｌら、ＧＴＰを０゜０１、　
０．０２，０．０４．　０．０６，０．０８゜０、　１
．　０．　２．　０．　４．　０．６．　０．８および
１．０μ門含む上記反応液を用いてＧ　ＣＨの初速度を
決定し、Ｌ　ｉ　ｎ　ｅ　ｗ　ｅ　ａ　ｖ　ｅ　ｒ　−
Ｂ　ｕ　ｒ　ｋのプロットを作成し、Ｋｍを決定した。

分子量の測定はＦ記のようにして行った。最終クロマト
グラフィー分画のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約２６，０００と推定され、またＡ
ｃＡ３４ゲル漉過によれば約２００，０００であり、本
酵素はオリゴマー酵素と考えられる。

ＳＤＳポリアクリルアミ」」じ彰永１１３：Ｌａｅｍｍ
ｌｉの方法に従い、１２．５％アクリルアミドゲルを用
いて行った。標準蛋白質として、フォスフォリラーゼｂ
　（９４，０００）、ウシ血清アルブミン（６６，００
０）、オブアルブミン（４３，０００）、カーボニック
アンヒドラーゼ（３０，０００）およびソイビーントリ
プシンインヒビター（２０，０００）を電気泳動し、そ
の泳動位置との比較によりＧＣＨの分子量を決定した。

△−ｚＡ↓４□ゲＪ巧Ｗ過：　精製過程に用いたゲルを
用いて同じ条件下で標準蛋白質として、サイログロブリ
ン（６６９，０００）、フェリチン（４４０，０００）
、β−アミラーゼ（２００，０００）、アルコール脱水
素酵素（１５０，０００）、ウシ血清アルブミン（６６
，０００）、カーボニックアンヒドラーゼ（２９，００
０）およびチトクロームｃ　（１２，／＋００）をゲル
濾過し、その溶出位置との比較よりＧＣＨの分子量を決
定した。

最終クロマトグラフィー分画のＧ　ＣＨを下記の方法に
よって、アミノ末端２５個のアミノ酸配列および内部の
部分アミノ酸配列を決定した。

アー糺り酸配刀塑夫足：　精製したＧＣＨ５４Ｑ　ｐｉ
ｏｌｅを１０％トリクロロ酢酸で沈澱させて、６Ｍグア
ニジンに溶解し、ｐＨ９，０のトリス塩酸緩衝液にて最
終濃度２Ｍグアニジンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
溶液なるように希釈した。これに、Ｃ，ＣＨの１／４０
０モル即ち、１．３５ｐｍ。

１ｅのリジルエンドペプチダーゼを加え、３０°Ｃで５
時間保温しＧＣＩ（を分解した。この液を５％アセトニ
トリルを含むＯ，１％トリフルオロ酢酸で平衡化した４
、６Ｘ２５０ｍｍの５μ＋ｍＣ１８逆相カラムにインジ
ェクトし、つづいて５％から６０％までのアセトニトリ
ルグラジェント溶出を、流速１．０ｄ／分、勾配置％／
２ｍ平衡化緩衝液にて３０°Ｃにて行った。検出は２２
０ｎｗのＵＶで行い、吸収ピーク画分をエッペンドルフ
チューブに回収した。溶出の結果を第１図に示す。得ら
れたペプチドと分解していない蛋白質のアミノ酸配列を
モデル１２０Ａ高速液体クロマトグラフィー装置に接続
したアブライドバイオシステムズ社の４７０Ａ型自動ガ
ス相蛋白質配列決定装置を用いて決定し７た。

蛋白質のＮ末端 Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−１，ｙｓ−Ｇｌｕ−
＾１ａ−八Ｉａ−Ｌｅｕ−ＶａｌＩＩ　ｉ　ｓ　−Ｇ　
ｌ　ｕ−八Ｉａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−＾１ａ−＾ｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−ＧｌｕＴｈｒ−Ｐｒｏ−１，ｅｕ−＾ｒ
ｇ−Ｐｒ。

５μｍｃ１８逆相カラムから溶出したペプチド断片のア
ミノ酸配列決定の結果は次のとおりである。

ビークＩ ！１ｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕｉｌｅ−Ｇｌｕ−へ５ｎ−Ｌｙ
ｓピークｌｌ ５ｅｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−＾ｒｇ−Ｈ
ｉｓ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ＾ｒＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−＾ｒｇ−１１ｉｓ−１１ｉｓ−八ｓｎピーク■ 八Ｉａ−（）−Ｇｌｙｄｌｅ−（）−Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ｔｈｒ−５ｅｒ−Ａｌａｈｒ ピーク■ Ｇｌｕ−Ａｌａ−八Ｉａ−１，ｅｕ−Ｖａｌ−１１ｓ−
Ｇｌｕ−＾１ａ−１．ｅｕ−ＶａｌＡｌａ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕピーク■ Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−八ｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｖ
ａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ＾ｒｇ−１１ｅ−（）−
Ｌｅｕ ビーク■ Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ八５へ−Ｔｙｒ−八Ｉａ
−Ａｓｎ−Ｐｈｃ−Ｐｒ。

ピーク■ Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈ４Ｓ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−１１ｅＭｅｔ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅａ−＾５ｎ−（）−Ａｓｐピーク■ Ｉｃｅ−八ｓｎ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ−八Ｉａ−Ｇｌｎ＾ｒｇ−Ｐｒ。

実施例２　　ＰＴＰＳの抽出・精製 ラット肝６５０ｇを雄のＫ　Ｂ　Ｌ　：　Ｗ　ｉ　ｓ　
ｔ　ｅ　ｒ系ラット６０匹より得た。この肝を、硫安分
画、熱処理、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、
ブチルトヨバールクロマトグラフィー、セファデックス
Ｇ１００ゲル濾過、Ｍｏｎｏ　　Ｑイオン交換クロマト
グラフィーで以下のようにして、約３２，０００倍に精
製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を後
記第２表に示す。

硫−安−分−画−：　　−７０°Ｃに保存しておいた肝
６５０ｇを、５ｍＭ２−メルカプトエタノールと０゜２
ｍＭフェニルメチルサルフォニルフルオラドヲ含むｐＨ
７，０の５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）１
３００ｄ中でプレンダーを用いて破壊して、ホモジエネ
ートを得た。このホモジェネートを１３００〆の緩衝液
Ａと混和した後、ウルトラトラックス社製のブレンダー
を用いて更に組織を破壊した。このホモジェネートを１
２０００Ｘｇで２０分遠心した後、上滑を得た。この上
清（２５６０ａｔｆりに１００％飽和の硫安液１１００
−を加え、２０分撹拌後、１２０００Ｘｇ、２０分間遠
心して上清を得た。この」−清に１００％飽和の硫安液
１１３０ｍを加え、２０分撹拌後、１２０００×ｇ、２
０分間遠心し、沈渣をｐＨ６，０の１０ｍＭカリウムリ
ン酸緩衝液に溶かした。この酵素液を５！の同緩衝液に
対して４回交換して透析し２８＼ た。

躾皿：　　透析した酵素液を１５０００Ｘｇで２０分間
遠心し、上滑を得た。沈渣はｐｌ＋６．０の１０＋ｎＭ
カリウムリン酸緩衝液に溶かし、再び同条件にて遠心後
、上滑を得、先の上滑と混和した。

この酵素液を６０ｄづつ８０″Ｃの温浴中で撹拌しなが
ら熱処理して、１２０００Ｘｇで２０分間遠心して、上
清を得た。この上清３４７＋ｄを限外濾過膜ＰＭ−１０
を用いて７９−になるまで濃縮後、ｐ）１６．Ｏの１ｍ
Ｍカリウムリン酸緩衝液（緩衝液Ｂ）５！に対して透析
した。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー：透析した酵
素液を緩衝液Ｂで平衡化した２、８×４３０のヒドロキ
シアパタイトのカラムに流速６０ｎ／時間で吸着させた
。このカラムを２６０ｍ１ｌ！の緩衝液Ｂにて洗浄後、
７００ｄ（７）ｐＨ６、０１１＋）ＩＪン酸１ｍＭから
２００１１ＩＭのカリウムリン酸緩衝液のグラジェント
溶出を行うと、約５０ｍＭのリン酸濃度でＰＴＰＳ活性
が溶出された。

ブチルトヨバールクロマトグラフィー：　ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィーで得られた活性画分に、そ
の容量の半分量の９０％飽和硫安を含むｐｌ＋６．０の
５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液を加えた。この酵素液を
３０％飽和硫安を含むｐＨ６゜０の５０ｍＭカリウムリ
ン酸緩衝液（Ｍ樹液Ｃ）で平衡化した１×５１のブチル
トヨバールカラムに流速４０ｄ／時間で吸着させた。こ
のカラムを４０ｄの緩衝液Ｃで洗浄した後、４０ｄの緩
衝液Ｃから硫安を含まない緩衝液Ｃまでのグラジェント
溶出を行うと、約２０％飽和硫安にてＰＴＰＳ活性が溶
出された。

セファデックスＧ１００−ル　　：　ブチルトヨバール
カラムクロマトグラフィーで得られた活性画分を限外濾
過膜アミコン社製セントリフローＣＦ２５を用いて１．
１ｄまで濃縮した。この酵素液を３０ｍＭのＫＣＩを含
むｐＦ１７．０の２０ｎＭカリウムリン酸緩衝液（緩衝
液Ｄ）で平衡化した１゜５×８９ｃｍのセファデツクス
Ｇ１００カラムを用いて流速５威／時間でゲル濾過を行
い、活性画分を得た。

Ｍｏｎｏ　　Ｑイオン−りロマトグラフイー：ゲル濾過
で得られた活性画分を緩衝液りで平衡化した０、５Ｘ５
Ｃ１１のＭｏｎｏＱイオン交換カラムに流速０．５ｄ／
分で吸着させた。このカラムを３−の緩衝液りにて洗浄
後、］Ｏｄの緩衝液りから４００１のＫＣＩを含む緩衝
液りまでのグラジェント溶出を行うと、ＫＣＩ　　１Ｂ
（１＋Ｍを含む溶出液の付近にＰＴＰＳ活性が単一ピー
クで溶出された。

第２表 粗抽出　　１１２，０００ 硫安分画　　４１，４００ 熱処理　　　　６０９ ヒＦｕキシアパタイト　　　　　　４７．６プチルトヨ
バール　　　　　　　　　４．７７セフアダフクス　Ｇ
１００　　　　　　Ｏ，６０Ｍｏｎｏロ　　　　　０．
５７ １００　　　　　　　０．６８ ９５　　　　　　　１．８ １８　　　　２．９００ １７　　　　２２．０００ １６　　　　２２．０００ なお、酵素活性の測定は、生成物である６−ビルボイル
テトラヒドロプテリンがアルカリ中でヨード酸化され、
プテリンとなることを利用して、反応生成物をプテリン
として定量した。

財流判塑肩淀：　反応液である５０μＨジヒドロネオプ
テリントリフオスフエート、８ｍＭＭｇＣ１□および１
０１ジチオスレイトールを含むｐ１１７．４の］、ＯＯ
ｍＭ）リス塩酸緩衝液１８μｍに、２μｍの酵素液を加
え、３７°Ｃで３０分間保温後、０．９％Ｉ２と１．８
％Ｋｌを含むＩＮ水酸化ナトリウム液２００μｍを加え
、遮光し、室温にて１時間放置した。この液に１Ｎ塩酸
２００μｍと５％アスコルビン酸５０μｍを加え、遠心
後上清を得た。この上清を０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡと５
％メタノールを含むｐＨ５，０の５０ｍＭナトリウム酢
酸緩衝液で平衡化した４、６Ｘ２５０ｍｍの５μ＋ｎＣ
１８逆相カラムに流速０．８ｄ／分でインジェクトし、
３５０ｒ＋ｍ励起、４４０ｎｍ蛍光検出器を用いて、Ｐ
ＴＰＳ反応産生物である６−ビルボイルテトラヒドロプ
テリン由来のプテリンを分離定量し３ま た。

また、下記のようにして比活性を測定し、Ｋｍ９．１ｐ
台を決定した。即ち、ジヒドロネオプテリントリフオス
フェートを、１．２．５．１０．２０および５０μｈ含
む上記反応液を用いてＰＴＰＳの初速度を決定し、Ｌｉ
ｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋのプロットを作成し、Ｋｍ
を決定した。

分子量の測定は実施例１と同様に、ＳＤＳポリアクリル
アミド電気泳動分析およびＨＰ　Ｌ　Ｃゲル濾過で行っ
た。ただし、ゲル濾過は平衡化緩衝液として０．１ｍＭ
　　ＥＤＴＡを含むｐｌ＋７．５の５０＋ｍＭカリウム
リン酸緩衝液を用い、カラムは１．５Ｘ４７Ｃ１１のも
のを用い、流速は５ｍ／時間にて行った。最終クロマト
グラフィー分画のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約１７０００と推定され、またＨ　
Ｐ　Ｌ　Ｃゲル濾過によれば、約９３，０００であった
。この結果から本酵素はオリゴマー酵素と考えられる。

最終クロマトグラフィー分画のＰ　Ｔ　Ｉ）Ｓを下記の
方法によって、アミノ末端２４個のアミノ酸配列および
内部の部分アミノ酸配列を決定した。

７−１．ス１＝刀勿迭淀−：　　精製ＰＴＰＳ　　ｌｎ
ｍｏｌを用いて、実施例１のアミノ酸配列決定と同様の
方法でＮ末端のアミノ酸配列を決定した。精製ＰＴＰＳ
（Ｉｎ＋ｍｏｌ）の分解、ペプチド分離およびアミノ酸
配列決定も実施例１と同様の方法で行った。

ただし、酵素による分解はりジルエンドペプチダーゼの
他■８蛋白質分解酵素によっても行い、後者による分解
反応は、Ｐ　Ｔ　Ｐ　Ｓ　　１　ｎｍｏｌをトリクロロ
酢酸沈澱後、６μｌの６Ｍグアニジンに溶解し、つづい
てｐＨ７，７の０．５Ｍアンモニウム酢酸緩衝液１０μ
ｌとＨ２Ｏ３，２μｍを加え、■８蛋白質分解酵素を５
ｐｍｏｌ加え、３７°Ｃで１２時間反応させた。この分
解物を実施例１と同様にしてペプチド分解してアミノ酸
配列の決定を行った。それぞれ、リジルエンドペプチダ
ーゼおよび■８蛋白質分解酵素で分解したペプチドを、
０１８逆相カラムで実施例１と同様に溶出した結果を第
２図および第３図に示す。

蛋白質のＮ末端 ＮＨｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−八ｒｇ−Ａ
ｒｇ−＾１ａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−３ｅｒＡｒｇ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−（）−Ａｌａ−（）−１１
ｉｓ−ＡｒＨＬｅｕ−旧ｓ−（）−Ｐｒ。

Ｃ１８逆相カラムから溶出したペプチド断片のアミノ酸
配列決定の結果は次のとおりである。

Ｌｙｓ　　Ｉ　　Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−＾ｓｎ−旧ｓ−（）
−１，ｙ、ｓ■、ｙｓ　ＶＩ　　Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｔｈｒ４１ｅ４１ｉｓ−Ｇｌｙ−ＧＩｕ４１ｅ−八
ｓｐＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−νａｌ
−（）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ■ Ｔｈｒ−Ａｓｐ−へｓｎ−へｓｎ−１１ｅ−ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ１ｕ Ｖ８　　　Ｉｔ　　　Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−八１ａＬ
ｅｕ−Ｔｙｒ Ｌｙｓ　　ＩＩ　　　（）−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−１１ｉｓ−Ｇｌｙ−（）−Ａｓｎ八５
へ Ｖ８　　　■　　Ａｌａ−１１ｃｍＭｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ−Δ５ｐ−Ｈ４ｓ−Ｌｙｓ−八ｓｎ１、ｅ
ｕ−八５ｐ−（Ｌ（）−Ｖａｔ Ｌｙｓ　　ｍ　　　Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＬｙｓＶ
８　　　ＩＶ　　　１ｉｅ−八５ｐ−Ｐｒｏ−νａｌ−
Ｔｈｒ−ＧｌｙＬｙｓ　　ＩＶ　　Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−＾５ｎ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｖａ
ｌ−ＶａｌＴｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ なお、Ｊ二記各配列中、カッコは未同定のアミノ酸であ
る。

しｙｓ　　Ｖ　　Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｕ−ΔＩａ４１ｅ−Ｍｅｔ−１．ｙｓ−Ｐｒ。

Ｌｅｕ−Ａｓｐ 実施例３　　ＳＰＲの抽出・精製 ラット赤血球を雄のＫＢＬ：Ｗｉｓｔｅｒ系のラット３
０匹より得た。得られた赤血球を、溶血、ｊ・、５ 硫安分画、ブチルトヨパールクロマトグラフィーヒドロ
キシアバタイトクロマトグラフィー、レッドセファロー
スＣＬ−６Ｂゲル濾過で、以下のように約１１００倍に
精製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を
後記第３表に示ず。

′ｆｉｉＬニー７０°Ｃに保存しておいたラット赤血球
的１１６ｇを、４６６ｄの０．２＋＋Ｍフェニルメチル
ザルフォニルフルオリドを含むｐｌ＋７．０の５１カリ
ウムリン酸緩衝液（緩衝液Ａ）とブレングー中で混和し
、氷上で１時間撹拌後、９，５００×ｇで３０分間遠心
を行い、抽出液■を得た。沈渣は再び２９１ｄの緩衝液
Ａ中で１時間撹拌後、同様に遠心し、抽出液■を得た。

抽出液■および■を混和した。

楡支分貞：　溶血により得た抽出液７１０ｄに１６３ｇ
の硫安を加え、２０分撹拌した後、１３゜０００Ｘｇで
３０分間遠心を行い、その上清７８０ｄに硫安６９．５
ｇを加え、２０分撹拌後、１３　０００Ｘｇで３０分遠
心を行い沈渣を得た。

この沈渣を５３ｄのｐＨ６，０の１０−門カリウムリン
酸緩衝液に溶解した。

ブチルトヨパールクロマトグーフィー：　硫安分画５３
ｍと５３ｄの６０％飽和硫安を含むｐＨ６゜０の５０ｍ
Ｍカリウムリン酸緩衝液を混和した。この酵素液を３０
％飽和硫安を含むｐＨ６，０の５０１１ＩＭカリウムリ
ン酸緩衝液で平衡化した１０ｄのブチルトヨバールカラ
ムへ流速４０ｄ／ｈで吸着させた。このカラムにＩＯｄ
の３０％飽和硫安を含む同緩衝液および］、’ＯＪｄの
１５％飽和硫安を含む同緩衝液を順に流した後、酵素を
１５％飽和硫安から０％硫安までの１０（ｌｄの同緩衝
液のグラジエンｌ−にて溶出すると、約８％飽和硫安の
位置にセピアプテリン還元酵素活性が溶出された。

ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー：ブチルトヨ
バール溶出の活性画分１２−を、セファデックスＧ−２
５２００ｊ！ｉ！を用いて、ｐＨ６゜０の１０＋Ｍカリ
ウムリン酸緩衝液に脱塩後、同緩衝液にて平衡化したｉ
、　　ｏｌｄ、のヒドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せた。このカラムを１０ｄの同緩衝液で未吸着画分を洗
浄後、１（１＋Ｍから２００ＩＩＩＭまでのカリウムリ
ン酸緩衝液５０ｄのグラジェント溶出を行うと、リン酸
濃度約８０＋ｍＭの位置に、セピアプテリン還元酵素活
性が溶出された。

レッドセファロースＣＬ　−６Ｂゲル　−避：　　ヒド
ロキシアパタイト溶出の活性画分２．８ｄに２゜８ｄＨ
２０を加え、ｐＨ６，８（７）２０ｍＭカリウムリン酸
緩衝液で平衡化した１ｄのレッドセファロースカラムに
吸着させた。このカラムを同緩衝液２ｄで未吸着骨を洗
浄後、更に０．１Ｍ　　ＫＣＩを含むｐＨ６，８の５０
ｍＭカリウムリン酸緩衝液１０Ｉ１１を流し、つづいて
５０ｍＭ　　ＮＡＤＰＨを含む同緩衝液にてセピアプテ
リン還元酵素活性を溶出した。

第３表 工程 蛋白質量 （信ｇ） 活性収率　比活性（口ｍｏｌ／ｈ （％）　　／■ｇ蛋白質） 溶血　　　　２５００　　　　１００　　　　　４６０
硫安分画　　１６０　　　　　９４　　　　６．６００
ブチルトヨバール　　　　　　　　８．８　　　　　　
　　　４８　　　　　　　　６６．０００ヒト■キシア
パタイト　　　　　０．５３　　　　　　　１３　　　
　　　２７０　０００レフトセファＵ−ス ＣＬ−６Ｂ　　　　　　　Ｏ，２９１３５２０，０００
なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。

反応液である５０μＨセピアプテリン、１００μＭＮＡ
ＤＰＨおよび０．１ｍＨ／ｍのウシ血清アルブミンを含
むｐｌ＋６．４の１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液４７
．５μｍに２．５μｌの酵素液を加え、２５°Ｃで１０
分間保温後、２００μｍの酸性ヨウ素液を加え、室温に
て１時間遮光して放置した。

ｐ つづいて、２５０μｍの１％アスコルビン酸を加えた後
、５μｍｃ１８カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィー（平衡化緩衝液は５％メタノールを含むｐｔ＋５．
０の５０ｍＭナトリウム酢酸緩衝液を用い、流速０．８
ｍ／分、２５°Ｃで分析した）にて酵素反応生成物ジヒ
ドロビオプテリンの酸化物であるビオプテリンを分離定
量した。

また、下記のようにして、セピアプテリンに対するＫｍ
９．４μ門を決定した。即ち、セピアプテリンＬ　２．
５．１０．１５．２０．２５．３０．４０．５０゜７５
および１００μ台を含む上記反応液を用いてセピアプテ
リン還元酵素の初速度を決定し、Ｌ　ｉ　ｎ　ｅｗｅａ
ｖｅｒ−Ｂｕｒｋのプａｙトを作成し、Ｋｍを決定した
。

分子量の測定は実施例１と同様のＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動で行った。最終ゲル濾過で得られたＳＰＲ
のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動分析により、分子
量は約２８，８００と推定された。またＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ
ゲル濾過によれば、分子量は約５６，０００であった。

これらの結果から本酵素はダイマー酵素と考えられる。

最終クロマトグラフィー分画のＳＰＲの部分アミノ酸配
列を、２μｍｏｌｅのＳＰＲ精製標品を用いて実施例１
と同様の方法によって決定した。リジルエンドペプチダ
ーゼで分解したＳＰＲをＣ１８逆相カラムで実施例１と
同様に溶出した結果を第４図に示す。カラムから分離溶
出されたペプチドのアミノ酸配列決定の結果は次の通り
であった。

ビーク■ Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−１，ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｎ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ５ｅｒ−
Ｇｌｙ−八Ｉａ−ｔｌｉｓ−ＶａＩ−Ａｓｐ−１’ｈｅ
−Ｔｙｒ−＾５ｐ−Ｈｅ実施例４　安定・至適ｐＨの測
定 下記のようにして、ｐ　Ｈと酵素活性の関係を調べた。

（１）　　Ｇ　ＣＨについては実施例１に示した反応液
組成を用いて緩衝剤のみを５０ｆｆｉＭナトリウム酢酸
、ＭＥＳ、カリウムリン酸、Ｈｅｐｅｓ、Ｔｒｉｓまた
はすトリウＪ、グリシン緩衝液に代えて、がっＫＣｌ０
．ＩＭの存在もしくは非存在下で調べた。

（２）ＰＴＰＳについては（１）のごと（、緩衝液のみ
を代えて、実施例２に示した反応条件で行った。

この酵素に対しては、０．１Ｍ　　ＫＣＩの効果は認め
られなかった。

（３）ＳＰＨについては、７５１ＩＩＭにて（１）のご
とく緩衝液のみを代えて、実施例３に示した反応条件で
０．１Ｍ　　ＫＣＩの存在もしくは不存在下で調べた。

結果を第５図に示す。この第５図より明らかなごとく、
Ｃ，ＣＨ，ＰＴＰＳおよびＳＰＲは、７付近に至適ｐＨ
を有することが分かる。なお、第５図中のプロットの意
味は次の表に示すとおりである。

ＭＣＩ　０．１Ｍの有無 （＋） 緩衝液 ・ 酢酸ナトリウム ■ 口 ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モルホリノ） エタンスルホン酸） ム Δ リン酸カリウＪ、 スルホン酸） 〈 ｒｉｓ ◆ ◇ グリシンナトリウム 緩衝液濃度は、Ｇ　ＣＩ（およびＰＴＰＳについては５
０ｍＭ、ＳＰＲについては７５ｍＭで試験した。

実施例５　ワンポット法によるＢ　Ｈ４の製造下記組成
によりＢＨ４の合成を行った。

５０ＩＩＩＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）０．
２ｍＭ　　　　ＧＴＰ ＯｏＩ　Ｍ　　塩化カリウム ４３ゝ、− ジチオエリトリトール ＡＤＰＨ ＭｇＣ＋□ ＤＴＡ 乙１大腸菌由来Ｇ　ＣＨシクロヒド ロラーゼＩ ラット肝由来６−ビルボイル テトラヒドロプテリン合成酢 素 ラット赤血球由来セピアプテ リン還元酵素 （″　　反応液中での最終濃度） ０ｍＭ ４１１１Ｍ ４１１１Ｍ 　　ｍＭ ７７０μｇ ９６μｇ／ｄ” ８μｇ／−− 」１記組成の反応液を作成し、三酵素の混合液を最後に
加え、３７°Ｃにて２０分間反応を行い、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＴＴ）を含む０．２Ｎトリクロロ酢酸
を加え遠心後上清を得た。反応生成物は強力カチオンイ
オン交換相ＦＮ（ワットマン５ＣＸ）４．６Ｘ２５０ｍ
＋ｏカラムを５％メタノールを含むｐｎ３．ｓのＯ，１
Ｍアンモニウム酢酸緩衝液で平衡化し、流速１ｄ／分で
分析した。検出は電気化学検出器を用い３００ｍＶ電圧
で測定した。その結果を第６図に示す。この分離系に、
１ｎＭ　　ＤＴＴを添加することにより、ＢＨ４を安定
に分離回収した。

上記反応の経時的追跡結果を第７図に示す。出発ＧＴＰ
からのＢ　Ｈ４の収率は、約７５％であった。

実施例６　ラットＧＴＰシクロヒドロラーゼＩの部分配
列の解析 ハタヶヤマら（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ、に、。

Ｈａ　ｒａｄａ、Ｔ、、５ｕｚｕｋ　ｉ、ｓ、、Ｗａｔ
ａｎａｂｅ、Ｙ、　、およびＫａｇａｍｉｙａｍａ、Ｈ
，（１９８９）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（ｌ↓、２１６６０−２１６６４）の方法で、ラットＧ
ＴＰシクロヒドロラーゼＩを精製し、リジルエンドペプ
チダーゼで分解した（ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ／リ
ジルエンドペプチダーゼ−４００／１（モル比）、３０
℃、７時間）。分解物は、０．１％トリフルオロ酢酸−
５％アセトニトリルで平衡化した５μｍ　Ｃ１８カラム
（ナカライテスク社製）を用いた５−４０％アセトニト
リルの直線濃度勾配（２５°Ｃ２流速１．０〆／分、６
０分）の逆相クロマトグラフィーにより分画した（第８
図）。分画されたペプチドの配列は、自動気相蛋白質配
列分析機（アプライド・ハイオシステムズ社製、モデル
４７０Ａ）を用いて分析した。

オリゴデオキシリボヌクレオチドの合 オリゴデオキシリボヌクレオチドをＤＮＡ合成機（アプ
ライド・バイオシステムズ社製、モデル３８１Ａ）を用
い自動ホスホルアミダイト法により製造した。これらオ
リゴヌクレオチドを′Ｆ４ポリヌクレオチドキナーゼお
よび〔γ−”ＰＥＡＴＰでラベルした。

全ＲＮＡをラット肝から抽出した（Ｃｈ　ｉ　ｒ　ｇｗ
ｉｎ、Ｊ、Ｍ、、ＰｒｚｙＢｙｌａ、Ａ、Ｅ、。

ＭａｃＤｏｎａ　Ｉｄ、Ｒ，Ｊ、’、およびＲｕｔｔｅ
ｒ、Ｗ、Ｊ、（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
　１８，５２９４−５２９９）。ポリ（八）ＲＮＡは抽
出した全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマト
グラフィーに供して単離した（Δｖｉｖ、Ｈ，，および
Ｌｅｄｅｒ、Ｐ、（１９７２）ｌ’ｒｏｃ、Ｎａ　Ｌ　
１．ＡｃａｃＬ、Ｓｃ　１ＵＳＡ、　　６−９．　１４
０８−１４１２）　、二本鎖ＣＩ）　Ｎ　Ａは、ｃ　Ｄ
ＮＡ合成キット（ファルマシア・エルゲービー・バイオ
テクノロジ社製）を用いてグブラーおよびホフマンの方
法に従って合成した（Ｇｕｂ　Ｉ　ｃ　ｒ、　Ｖ、　、
およびＩ−（ｏｆｆｍａｎ。

Ｂ、、Ｊ、　　（１９８３）Ｇｅｎｅ　（Ａｍｓｔ、）
２５．２６３−２６９）、平滑末端二本鎖ｃＤＮＡをＲ
Ｎａ　ｓ　ｅＴｌ　（０，１ｕｇ　／■）を追加して用
いた他は、クリックシュタインらの方法に従って生成さ
せた（Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、Ｌ、Ｂ。

およびＮｅｖｅ、Ｒ，Ｌ　（１９８７）ｉｎ　　Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ　　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　　ｉｎ　　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ。

Ｆ、Ｍ、、Ｂｒｅｎｔ、Ｒ，、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ。

Ｒ，Ｅ、、Ｍｏｏｒｃ、Ｄ、Ｄ、、Ｓｃ　ｉｄｍａ４、
不。

ｎ、　Ｊ、　Ｇ、、　Ｓｍｉ　Ｌｈ、　　Ｊ、　Ａ、　
、および５ｔｒｕｈｌ、　　Ｋ、、　　ｅｄｓ）、　　
ｐｐ　　　５．　５．　１５、　５．　１０．　　Ｃｒ
ｃｃｎｅ　　　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　　Ａｓ５ｏｃ
ｉａｔｅｓ　　　ａｎｄ　　　Ｗｉｌｅｙ　−Ｔｎｔｅ
ｒｓｃ：ｎ　Ｃｃｅ　　　Ｎ　Ｃｗ　　　Ｙ。

ｒｋ）。ｃＤＮＡの各平滑末端にＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／
　Ｎｏｗｌアダプター（ｃＤＮＡＤＮＡ合成フットルマ
シア製）を連結したのち、該ｃＤＮＡをλＺＡＰｒｌベ
クターＤＮＡ　（ストラタジーン社製）のｒ３ｃｏＲ１
部位に挿入した。得られたライブラリーＤＮＡをＧｉｇ
ａｐａｃｋ　　Ｇｏｌｄ　（ストラタジーン社製）を用
いてｉｎ　　ｖｉｔｒｏでパッケージングし、大腸菌Ｘ
ＬＩ−Ｂｌｕｅに導入した。

レプリカナイロンフィルター（デュポン−ニューイング
ランド　ニュクレアー社製のＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　　
Ｐｌｕｓ）を用い、約３．０ＸＩＯ５プラークを、５ｚ
ｐ−ラベル化合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングした（Ｂｅｎｔ。

ｎ、　Ｗ、Ｄ、　、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　　
（１９７７）Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ　　ユ９６−．１８０
−１８２）。３つのプローブの塩基配列は、後に述べる
ように、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩのリジルエンドペ
プチダーゼ処理ペプチドのアミノ酸配列から推論される
。１つのタイプのプローブとして、コドン利用分析（Ｌ
ａｔｈｅ、Ｒ，（１９８５）Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、１
影３，１−１２）に基づき作成された単一の長鎖オリゴ
ヌクレオチドと、他のタイプのプローブとして、全ての
コドンコンビネーションを有する短鎖オリゴヌクレオチ
ドの混合物の２つのタイプのプローブを用いた。レプリ
カナイロンフィルターは、５容量の０．１％ドデシル硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＳＳＣ（ＳＳＣ？８液：
０，１５Ｍ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウ
ムを含む）、１０容量のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ溶液：０．２％（Ｗ／Ｖ）のフィコール、ポ
リビニルピロリドン、ウシ胎児血清アルブミンを含む）
および０゜１１ｍｇ／ｄの仔牛胸腺ＤＮＡ　（シグマ社
製）の溶液で６５°Ｃで少なくとも３時間前処理をして
用いた。

放射線ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液
に加え、４２°Ｃで一部フイルターをハイブリダイゼー
ションさせた（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃ
ｈ、Ｅ、Ｆ、、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、　　（１
９８２）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｇｏｌｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　　［（ａｒｂａｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。

フィルターを長鎖オリゴヌクレオチドを除くために０．
１％ＳＤＳを含む０．２容量のＳＳＣで４０″Ｃで洗浄
し、一方、短鎖オリゴヌクレオチドを除くために０゜１
％ＳＤＳを含む４容量のＳＳＣで洗浄したのち、オート
ラジオグラフィーに供した。ハイブリダイゼーション−
陽性クローンをプラーク精製し、ファージをストラタジ
ーン・オートマチック・エクシジョン・プロトコール（
ＳＬｒａｔａｇｅｎｅａｕｔｏｍａｔｉｃ　　ｅｘｃｉ
ｓｉｏｎ　　ｐｒ。

ｔｏｃｏｌ）に従い、ＢＩｕｅｓｃｒｉｐＬ　　ｐｌａ
ｓｍｉｄに変換した。

メン仁緊ｉ−ｆ）Ｍｅ吐列−ｑ肛折 ｃＤＮＡインサートをＭ１３ベクターのＥｃ。

Ｒ１部位にサブクローニングした（ＶｉｅｉｒａＪ、、
およびＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１９８７）Ｍｅ　ｔ　ｈ
、　　Ｅｎ　ｚ　ｙｍｏ　１．　１−δ↓、　　３−１
１）。

インサートのヌクレオチド配列を３ｅｑｕｅｎｃｅ　　
ｋｉｔ　　Ｖｅｒ、２．０　（７−ｄｅｒ＋ｚａｄＧＴ
Ｐ−ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｌｅｓ　
　Ｂｉｏｃｈｃｍｉｃａｌ）と合成プライマーを用いて
、ジデオキシチェーンターミネーション法によって決定
した（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ。

Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、、およびＣｏｕｌｓｏｎ。

Ａ、Ｒ，（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１，Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７４．５４６３−５．’１６７
）。

コンピューターによる配 ｃＤＮＡ配列から推測されたアミノ酸配列は、クハラら
によって開発されたデータベースシステム（ＧＥＮＡＳ
）　（Ｋｕｈａｒａ、　Ｓ、　、　Ｍａｔｓｕｏ、Ｆ、
、Ｆｕｔａｍｕｒａ、Ｓ、、ＦｕｇｉＬａ、　　Ａ、、
　　５ｈｉｎｏｈａｒａ、　　Ｔ、、　　”Ｆａｋａｇ
ｉ、Ｔ、、および５ａｋａｋｉ、Ｙ、（１９８４）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄｓ　　　Ｒｅｓ。

１２．８９−９９Ｌで、ウィルバーとリップマンのプロ
グラム（Ｗｉ　Ｉ　ｂｕ　ｒ、　Ｗ、　　、Ｊ、、およ
びＬｉｐｍａｎ、Ｄ、Ｊ、（１９８３）Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０，７２６−
７３０）によって修正した。

（結果） グー２−トーｑ−ＴＰシクロヒドロラーゼＩＱ一部分−
η冬−スー酸噂超す ８つのペプチドを単離しく第８図のＩ〜■）、それらの
完全なまたは部分的なアミノ酸配列を決定した（第１０
図に下線で示す）。精製酵素のＮ末端配列を３０残基ま
で決定した： Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−八ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒ。

ｃｒｙ−へ１ａ−５ｅｒ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−八１ａ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−（）Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−八Ｉａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ　　。

なお、上記配列の第２０番目のアミノ酸はｃＤＮＡから
Ａｒｇであることが決定された（第１０図参照）。

夏力ＮＡ湾」 蛋白質性ペプチドのアミノ酸配列から、ユニクな配列を
持つ３つの単一の長鎖オリゴヌクレオチ　ド　（５’　
　−ＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣ
ＡＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＣＡＧＧ　　（第１０図のペプ
チドＩと蛋白質Ｎ末端配列の一部よりニブローフ゛１　
”）　　；　５’　−ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡ八ＣＴＧＣ
ＡＴＧＧへＴＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧ
Ｔ　（ペプチド■ニブローフ゛２）；５’−八ＣＧＣＣ
ＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＴＧ
ＧＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＣＴＧ　　（ペプチド■ニブロ
ーフ゛３）〕および全てのあり得るコドンコンビネーシ
ョンをカバーする２つの短鎖オリゴヌクレオチド混合物
（５’　−ＴＴＣＣＡ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＣ（Ｇ／Ａ
）ＴＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ）ＧＣ（ペプチドＩニブローフ
゛４　）　　；　５’　−ＧＴ（Ｇ／Ａ）Ｉｔ八（Ｇ／
Ａ）八Ａ　（Ｉ／Ｃ）　ＴＧＣＡＴ　（Ｇ／八へＴ／Ｃ
）ＧＣ（ペプチド■：）。

ローブ５））を作成した。これらのクローンをラット肝
ポリ（Ａ）“ＲＮＡ由来のλＺＡＰＩｌｃＤＮΔライブ
ラリーの約３Ｘ１０５クローンのスクリーニングのため
に用いた。４つのクローンがプローブ２．３および５で
ハイブリダイゼーションされた。短鎖プローブの１つで
あるプローブ４は、λＺＡＰプラークのシグナルが非常
に弱いため検出されず、これらりｔｌ−ンとハイブリダ
イゼーションしなかったと考えられる。また、長鎖オリ
ゴヌクレオチドプローブの１つであるプローブエは、本
プローブの８塩基（２１％）が誤って推定され、これら
クローンとハイブリダイゼーションしなかったと考えら
れる。これらクローンを部分的に配列決定し、５′−お
よび３′−非翻訳領域の長さの他は一致することを見出
した。これらクローンのうち最も長鎖のものはポリ（ｄ
Ａ）　　トラクトを含み、従って本クローンをさらに分
析に供した。

浣へなヌクレオチド配Ｊ ラットＧＴＰシクロヒドロラーゼ■のｃＤＮＡの一次配
列を第９図に示すストラテジーに従って両鎖について決
定した。その結果を第１０図に示す。挿入断片はポリ（
Ａ）゛テイルの８アデニン残基を含む、１０２４ヌクレ
オチドであった。オープンリーディングフレームは、７
２３ヌクレオチドであり、それにつづく３′−非翻訳領
域にば終止コドン’Ｔ’　Ｇ　Ａからポリ（八）テイル
まで１６３ヌクレオチドであった。３′−非翻訳領域の
ポリ（Ａ）テイルから１３ヌクレオチド上流にポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルＡＡＴＡＡＡがあった。

オープンリーディングフレームは、クローンの配列にお
いて最初のΔＴＧから開始し、２４１アミノ酸からなる
ポリペプチドをコードしていた。開始コドン周辺の配列
は、真核生物の開始部位として好ましいとされている配
列（ＫＯＺ　ａ　ｋ、　Ｍ。

（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄｓ　　ＲｅＳ、
且、８５７−８７２）と整合した。ヌクレオチド配列か
ら推定されるアミノ酸配列を第１０図に示す。８つの蛋
白質性ペプチドのアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列か
ら推定される配列と一致した。上に示した生成蛋白質の
Ｎ末端は、推定されたアミノ酸配列の１２〜４１番目の
残基と完全に一致した。さらに、精製酵素のアミノ酸組
成は、１２〜２４１番目の残基から推定される配列の組
成とよく一致した（第４表）。

第４表 分析値３） 推定値 アルギニン リジン ヒスチジン アスパラギン酸 アスパラギン トレオニン セリン グルタミン酸 グルタミン プロリン グリシン アラニン １Ｂ、２１ １１．８５ ５．２５ １６．５８ １１．７４ １７．００ ２９．８２ １．１．３３ １８．０２ ２０．９８ システィン バリン メチオニン イソロイシン ロイシン チロシン フェニルアラニン トリプトファン １６．００　　　　　　１７ ７．３３　　　　　　　９ １１．１２　　　　　　１２ １．９．６２　　　　　　２０ ４．１１　　　　　　　４ ７．９６　　　　　　　８ １）アミノ酸分析は蛋白質を１１０　”Ｃ，２４時間の
酸加水分解後、日立Ｌ−８５００型アミノ酸分析機を用
いて、０−フタルアルデヒドのポストカラムラベル法に
より行った。

い測定せず。

したがって、ラットＧＴＰシクロヒドロラーゼＩば、２
３０のアミノ酸残基を有し、計算値として分子量２５，
８１５を有すべきものである；この値は、ハタケヤマら
（前述）によって報告された精製蛋白質の分子量より１
４％小さい。これは、ＡＳｎ＋＋　　ＧＩｙ＋□結合で
の後翻訳による切断が、推定された一次ポリペプチドを
酵素の成熟体に変換するためであろう。この前配列は、
３つの塩基性および１つの酸性残基を有し、ネットで正
荷電しているが、分泌蛋白質のシグナルペプチドに共通
してみられる長い疎水性領域を欠いている。よってこの
前配列の機能は推定できない。他の３つのハイブリダイ
ゼーション−陽性クローンも同様の結果を与えた。

推定された蛋白質配列をナショナル　バイオケミカル　
リサーチ　ファウンデーテヨン（ＮａＬｉｏｎａｌ　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉｏｎ）の蛋白質配列データベースと比較し
たことろ、７７〜９６のアミノ酸残基がジヒドロホレー
ト還元酵素の高変換領域の残基（Ｂｅｖｅｒ　］　ｅｙ
、Ｓ、Ｍ、、　ＥＩＩｅｎｂｅｒｇｅｒ、Ｔ、Ｅ、、お
よびＣｏｒｄｉｎｇｌｅｙ、Ｊ、Ｓ−（１９８６）Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａ　ｔ　１，Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３
゜２５８４−２５８８　；Ｇｒｕｍｏｎｔ、Ｒ，、Ｗａ
ｓｈｔ　ｉｃｎ、Ｗ、Ｌ、、ＣａｐｕＬ、Ｄ、。

および５ａｎｔｉ、Ｄ、Ｖ、（１９８６）Ｐｒ。

ｃ、Ｎａ　Ｌ　］、Ａｃａ　ｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ
。

８−雄、５３８７−５３９１）と有意なホモロジーを有
することを見出した（第１１図）。これらの残基は、ジ
ヒドロホレート還元酵素に対するメトトレキセートまた
はジヒドロホレートの結合を引き起ごずことがボリンら
及びマシュースらにより、結晶構造的に同定されている
（Ｂｏｌｉｎ、Ｊ。

Ｔ　、　　、　　　Ｆｉ　　　Ｉｍａｎ、　　　Ｄ、　
　　Ｊ、　　　、　　　Ｍａｔｔｈｅｗｓ、　Ｄ、　Ａ
、　、　Ｉ−ｌ−１ａ　ｉ　ｎ、　Ｒ，Ｃ０およびＫｒ
ａｕｔ、Ｊ、（１９８２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ
５−７．１３６５０−１３６６２；　　Ｍａｔｔｈｅｗ
ｓ、Ｄ、Ａ、、Ｂｏ　Ｉ　ｉｎ、Ｊ、Ｔ、。

Ｂｕｒｒｉｄｇｅ、、Ｊ、Ｍ、、Ｆｉ　Ｉｍａｎ　　Ｄ
。

Ｊ、、ＶＯＩＺ、に、Ｗ、、Ｋａｕｆｍａｎ、Ｂ。

Ｔ、、Ｂｅｄｅ　Ｉ　１，Ｃ，Ｒ，、Ｃｈａｍｐｎｅｓ
ｓ、Ｊ、Ｎ、、Ｓｔａｍｍｅｒｓ、Ｄ、に、。

およびＫｒａｕＬ、Ｊ、（１９８５）Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、２６０，３８１−３９１）、特に、第１
１図に円で囲って示されるトリプトファンおよびフェニ
ルアラニンは、これらの化合物のプテリン環と相互に作
用する（上記ボリンら及びマシュースらの文献参照）。

対応トリプトファンおよびフェニルアラニン残基が、Ｇ
ＴＰシクロヒドロラーゼＩの配列に見出される。ＧＴＰ
シクロヒドロラーゼ■の活性は、ジヒドロホレート還元
酵素のジヒドロホレートに対するＫｍ値と比較して、そ
れぞれ、１２μＨおよび１７０μｈのＫｉ値を有するテ
トラヒドロビオプテリンおよびジヒドロホレートのよう
なプテリン類によって阻害され（Ｓｈｅｎ、　Ｒ，、Ａ
Ｉ　ａｍ、　Ａ、　、およびＺｈａｎｇ、Ｙ、　　（１
９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　　９６５．９−１５）、ジヒドロ
ホレート還元酵素は、７．８−ジヒドロビオプテリンを
テトラヒドロプテリンに還元する（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｓ
、　　（１９６７）Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４２．３９３４−３９４３）、ビオプテリ
ンと葉酸塩は、共通のプテリン部分を持つので、これら
の結果は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩがジヒドロホレ
ート還元酵素のプテリン結合部位に類似したプテリン結
合部位を有することおよび推定されたアミノ酸配列の７
７〜９６番の残基からなる領域がプテリンの結合に応答
可能な部位であることを示唆する。

この結果より推定されたこのプテリン結合部位に部位特
異的変異を行えば、ＢＩ３により阻害のかからないラッ
トＧＴＰシクロヒドロラーゼＩを遺伝子工学法により作
成できる可能性がある。

（発明の効果） 本発明によれば、モノアミン神経伝達物質の欠乏障害に
よる疾患の治療に有用な６−（Ｒ）−Ｌエリスロー５，
６，７，８．−テトラヒドロビオプテリン（ＢＩ３）を
簡単な繰作で効率よく製造できる。

また本発明はＢＩ３の生理機能を理解するうえで有用な
１０−ブとしての１４Ｃラベル化Ｂ　Ｉ−Ｔ　４の製造
にも有利に利用されうる。

さらに、本発明は、新しい構造（アミノ酸配列）を持つ
酵素を開示したことにより、これらをコードするＤＮＡ
をプローブとする本酵素の遺伝子の単離、さらには組換
えＤＮＡ技術による本発明の酵素の大量生産の材料もし
くは菌体内で本来菌が生産できないＢＩ３を合成させる
ためのＤＮＡを提供するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１においてＧ　ＣＨをリジルエンドペプ
チダーゼで分解した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラ
フィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図
である。 第２図は実施例２においてＰ　Ｔ　Ｐ　Ｓをリジルエン
ドペプチダーゼで分解した後、Ｃ１８逆相カラムクロマ
トグラフィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を
示す図である。 第３図は実施例２においてＰＴＰＳを■８蛋自分解酵素
で分解した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーで
、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図である。 第４図は実施例３においてＳＰＲをリジルエンドペプチ
ダーゼで分解した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフ
ィーで、アセ１−二トリルにより溶出した様子を示す図
である。 第５図ＡはＧ　ＣＨの至適ｐｉ＋を示すグラフであり、
第５図ＢはＰＴＰＳの至適ｐｉを示すグラフであり、第
５図ＣはＳＰＲの至適ρ］１を示ずグラフである。 第６図は実施例５におけるワンポット法で合成したＢ　
Ｈ４をワットマンＳＣＸカラムで単離した様子を示す図
である。 第７図は実施例５におけるワンポット法でＢ　Ｈ４を合
成した際の、原料、中間生成物およびＢＩ３の消長を示
すグラフである。 第８図は実施例６で精製したラッ）ＧＴＰシクロヒドロ
ラーゼＩをリジルエンドペプチダーゼで分解した後、Ｃ
１８逆相カラムクロマトグラフィーで、アセトニトリル
により溶出した様子を示す図である。 第９図はラットＧＴＰシクロヒドロラーゼＩのｃＤＮＡ
の一次配列を決定するために用いたストラテジーを示す
図である。 第１０図はラットＧＴＰシクロヒドロラーゼ［のｃＤＮ
Ａの一次配列、および該配列から推定したアミノ酸配列
を示す配列図である。 第１１図はラットＧＴＰシクロヒドロラーゼＩが、ジヒ
ドロホレート還元酵素のプテリン結合領域の残基と容易
なホモロジーを有することを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グアノシン５′−三リン酸（ＧＴＰ）に、大腸菌由
   来ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１，６−ピルボイルテトラ
   ヒドロプテリン合成酵素およびセピアプテリン還元酵素
   を作用させることを特徴とする式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示される６−（Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，６，７，８
   −テトラヒドロビオプテリンの製法。 ２、大腸菌由来ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩが、アミノ
   末端から２５番目までのアミノ酸配列が式：【遺伝子配
   列があります】 で示され、ＧＴＰを特異的にＤ−エリスロ−７，８−ジ
   ヒドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を
   有するものである請求項１記載の製法。 ３、６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素がラ
   ット肝由来であり、アミノ末端から１５番目までのアミ
   ノ酸配列が式： 【遺伝子配列があります】 で示され、Ｄ−エリスロ−７，８−ジヒドロネオプテリ
   ントリホスフェートを特異的に６−ピルボイル−５，６
   ，７，８−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有す
   るものである請求項１記載の製法。 ４、セピアプテリン還元酵素がラット赤血球由来であり
   、部分アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有し、６−ピルボイル−５，６，７，８−テトラヒド
   ロプテリンを特異的に６−（Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，
   ６，７，８−テトラヒドロビオプテリンに変換する能力
   を有するものである請求項１記載の製法。 ５、アミノ末端から２５番目までのアミノ酸配列が式： 【遺伝子配列があります】 で示され、ＧＴＰを特異的にＤ−エリスロ−７，８−ジ
   ヒドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を
   有する大腸菌由来ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ。 ６、アミノ末端から１５番目までのアミノ酸配列が式： 【遺伝子配列があります】 で示され、Ｄ−エリスロ−７，８−ジヒドロネオプテリ
   ントリホスフェートを特異的に６−ピルボイル−５，６
   ，７，８−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有す
   るラット肝由来６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合
   成酵素。 ７、部分アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有し、６−ピルボイル−５，６，７，８−テトラヒド
   ロプテリンを特異的に６−（Ｒ）−Ｌ−エリスロ−５，
   ６，７，８−テトラヒドロビオプテリンに変換する能力
   を有するものであるラット赤血球由来セピアプテリン還
   元酵素。