JPH0482888A - テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素 - Google Patents
テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、6−(R)−エリスロー5,6,7゜8−テ
トラヒドロビオプテリン(以下、B H4ということが
ある)の製法に関する。
トラヒドロビオプテリン(以下、B H4ということが
ある)の製法に関する。
さらに詳しくは、酵素法によるBH4の製造の改良方法
に関する。
に関する。
(従来の技術))
]\3
テトラヒドロビオプテリンには、例えば、その6位の炭
素原子の側鎖の相対配置により、D−系列とL−系列が
あり、また、そのテトラヒドロ体には、6位の炭素原子
における絶対配置によって(R)−または(S)−とい
う二つのジアステレオマーが存在することが知られてい
る。すなわち−形式(■): で示されるテトラヒドロプテリン誘導体において、Rが
: −CH−CH−CI−13HOH であるものがB H4である。
素原子の側鎖の相対配置により、D−系列とL−系列が
あり、また、そのテトラヒドロ体には、6位の炭素原子
における絶対配置によって(R)−または(S)−とい
う二つのジアステレオマーが存在することが知られてい
る。すなわち−形式(■): で示されるテトラヒドロプテリン誘導体において、Rが
: −CH−CH−CI−13HOH であるものがB H4である。
B H4は生体内に存在し、モノアミン神経伝達物質合
成に関与するモノオキシゲナーゼの補酵素であり、その
調節因子の一つであると考えられている。従って、B
H/lの欠乏は、神経伝達物質であるセロトニン、ドー
パミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどの欠乏を
もたらし、重篤な神経症状をもたらす。例えば、悪性フ
ェニルケトン尿症などが知られており、事実、6−(R
,S)テトラヒドロビオプテリン投与による先駆的な治
療成果も報告されている(Niedcrwieser、
八、ら1、ancet、 L 550 (1979);
Curtius、 H−CIら、C目n。
成に関与するモノオキシゲナーゼの補酵素であり、その
調節因子の一つであると考えられている。従って、B
H/lの欠乏は、神経伝達物質であるセロトニン、ドー
パミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどの欠乏を
もたらし、重篤な神経症状をもたらす。例えば、悪性フ
ェニルケトン尿症などが知られており、事実、6−(R
,S)テトラヒドロビオプテリン投与による先駆的な治
療成果も報告されている(Niedcrwieser、
八、ら1、ancet、 L 550 (1979);
Curtius、 H−CIら、C目n。
Chim、 Acta、 98.251−262 (1
979))。
979))。
テトラヒドロビオプテリンを製造する方法としては、I
7−エリスロービオプテリンを化学的あるいは酵素的に
還元する方法が知られている。
7−エリスロービオプテリンを化学的あるいは酵素的に
還元する方法が知られている。
しかしながら、化学的方法によればビオプテリン自体の
合成に費用がかかり煩雑であり、また6R体と6S体の
混合物を生じ、これは分割しなければならないが、この
分割は極めて困難であり、現在その有利な分割法は知ら
れておらず、6R体の生成収率を高める研究がなされて
いる。一方、酵素法は6R体のみが得られるという利点
はあるが、装置および操作が煩雑であるという問題があ
る。
合成に費用がかかり煩雑であり、また6R体と6S体の
混合物を生じ、これは分割しなければならないが、この
分割は極めて困難であり、現在その有利な分割法は知ら
れておらず、6R体の生成収率を高める研究がなされて
いる。一方、酵素法は6R体のみが得られるという利点
はあるが、装置および操作が煩雑であるという問題があ
る。
マイルシュタインらは、各種動物組織や酵母中に存在す
るグアノシン5′−三リン酸(GTP)を出発原料とす
るB H4の酵素法による方法を報告シTイル((BI
OCIIEMICM1,AND BIOPIIYSIC
A1,RESEARCII COMMIINICAT
ION、 128. No、3. 1093−11
07(1985))。その方法は次に示すスキームから
なる。
るグアノシン5′−三リン酸(GTP)を出発原料とす
るB H4の酵素法による方法を報告シTイル((BI
OCIIEMICM1,AND BIOPIIYSIC
A1,RESEARCII COMMIINICAT
ION、 128. No、3. 1093−11
07(1985))。その方法は次に示すスキームから
なる。
1]0
H
エリスロ
I]
ジヒドロネオプテリントリフオスフエ
ビルボイル
テトラヒドロプテリン
ラクトイル
テトラヒドロプテリン
しかしながら、マイルシエタインらの方法は、」二記ス
キームから明らかな如く、複数の反応工程からなり煩雑
な操作が要求され、また中間生成物、特に6−ピルボイ
ル−テトラヒドロプテリンは非常に不安定であり、その
分離後最終反応工程に供しセピアプテリン還元酵素と反
応させるのは困難であり、とても実用的方法とは言いが
たい。また、すべての工程に単一精製標品の酵素を用い
ていないので、B H4と副産物(未同定を含む)の分
離が困難となっている可能性がある。
キームから明らかな如く、複数の反応工程からなり煩雑
な操作が要求され、また中間生成物、特に6−ピルボイ
ル−テトラヒドロプテリンは非常に不安定であり、その
分離後最終反応工程に供しセピアプテリン還元酵素と反
応させるのは困難であり、とても実用的方法とは言いが
たい。また、すべての工程に単一精製標品の酵素を用い
ていないので、B H4と副産物(未同定を含む)の分
離が困難となっている可能性がある。
(発明が解決しようとする課題)
そこで、本発明者らは、−ヒ記現状に鑑み鋭意研究を重
ねた結果、GTPを出発原料としてB H4をワンポッ
トで効率良く製造しうる酵素系を見出し、大発明を完成
するに至った。
ねた結果、GTPを出発原料としてB H4をワンポッ
トで効率良く製造しうる酵素系を見出し、大発明を完成
するに至った。
(課題を解決するだめの手段)
即ち、本発明は、GTPに大腸菌由来GTPシクロヒド
ロラーゼ1.6−ビルポイルテトラヒドロプテリン合成
酵素およびセピアプテリン還元酵素を作用させることを
特徴とする式(■):で示される6−(R)−L−エリ
スロー5,67.8−テトラヒドロビオプテリンの製法
を提供する。
ロラーゼ1.6−ビルポイルテトラヒドロプテリン合成
酵素およびセピアプテリン還元酵素を作用させることを
特徴とする式(■):で示される6−(R)−L−エリ
スロー5,67.8−テトラヒドロビオプテリンの製法
を提供する。
本発明は上記製法に用いる酵素、
(])アミノ末端から25番目までのアミノ酸配列が式
: %式% で示され、GTPを特異的にD−エリスロー78−ジヒ
ドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を有
する大腸菌由来GTPシクロヒドロラーゼ■、 (2)アミノ末端から15番目までのアミノ酸配列が式
: %式% で示され、■〕−エリスロー7.8−ジヒドロネオプテ
リントリホスフェートを特異的に6−ビルポイルー5.
6.7.8−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有
するラット肝由来6−ビルボイルテトラヒドロプテリン
合成酵素、および(3)部分アミノ酸配列が式: %式% ラヒドロブテリンを特異的に6−(R)−L−エリスロ
ー5,6,7.8−テトラヒドロビオプテリンに変換す
る能力を有するものであるラット赤血球由来セピアプテ
リン還元酵素も提供する。
: %式% で示され、GTPを特異的にD−エリスロー78−ジヒ
ドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を有
する大腸菌由来GTPシクロヒドロラーゼ■、 (2)アミノ末端から15番目までのアミノ酸配列が式
: %式% で示され、■〕−エリスロー7.8−ジヒドロネオプテ
リントリホスフェートを特異的に6−ビルポイルー5.
6.7.8−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有
するラット肝由来6−ビルボイルテトラヒドロプテリン
合成酵素、および(3)部分アミノ酸配列が式: %式% ラヒドロブテリンを特異的に6−(R)−L−エリスロ
ー5,6,7.8−テトラヒドロビオプテリンに変換す
る能力を有するものであるラット赤血球由来セピアプテ
リン還元酵素も提供する。
本発明において出発原料として用いるGTPは、各種動
物組織や酵母の酸抽出液から通常の方法に従って分離精
製して得ることができる。また、市販のGTPを用いて
もよい。
物組織や酵母の酸抽出液から通常の方法に従って分離精
製して得ることができる。また、市販のGTPを用いて
もよい。
本発明の酵素系は、大腸菌由来GTPシクロヒドロラー
ゼI (以下、G CHという)、例えばラット肝から
得られる6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素
(以下、PTPSという)および例えばラット赤血球か
ら得られるセピアプテリン還元酵素(以下、SPRとい
う)からなる。これらの酵素は、溶液状態で混合して用
いるのが好ましいが、単独でまたは一緒に、通常の方法
、例えば担体結合法や包括法により固定化されて用いら
れてもよい。
ゼI (以下、G CHという)、例えばラット肝から
得られる6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素
(以下、PTPSという)および例えばラット赤血球か
ら得られるセピアプテリン還元酵素(以下、SPRとい
う)からなる。これらの酵素は、溶液状態で混合して用
いるのが好ましいが、単独でまたは一緒に、通常の方法
、例えば担体結合法や包括法により固定化されて用いら
れてもよい。
本発明において上記3種の酵素は、B H4の生成に十
分な濃度で使用すればよいが、本発明によれば、これら
の酵素を全て、SDS電気泳動またはHP L Cの分
析でほぼ純粋な単一精製標品に精製する方法も提供され
る。全ての酵素を単一精製標品として用いれば、構造不
明な副産物の生成を最少にすることが期待され、B H
4の分離回収も容易である。
分な濃度で使用すればよいが、本発明によれば、これら
の酵素を全て、SDS電気泳動またはHP L Cの分
析でほぼ純粋な単一精製標品に精製する方法も提供され
る。全ての酵素を単一精製標品として用いれば、構造不
明な副産物の生成を最少にすることが期待され、B H
4の分離回収も容易である。
本発明の酵素系は、GTPシクロヒドロラーゼ1(GC
H)が大腸菌由来のものであることが重要である。G
CHを、大腸菌以外の由来、例えばラット由来のGCH
で代用した場合には、該酵素が最終生成物B H4で阻
害され(BH/lの10μHで30%阻害される)、さ
らにD−エリスロ7.8−ジヒドロネオプテリントリホ
スフェートの6−ビルポイルー5.6,7.8−テトラ
ヒドロプテリンへの変換反応に必要なMgC+2でも阻
害される(M g C+ 2の0.1mMで50%阻害
)ため、該ラット由来の酵素を含む酵素系は、本発明の
製造方法のごときワンポットでの反応に用いることはで
きない。
H)が大腸菌由来のものであることが重要である。G
CHを、大腸菌以外の由来、例えばラット由来のGCH
で代用した場合には、該酵素が最終生成物B H4で阻
害され(BH/lの10μHで30%阻害される)、さ
らにD−エリスロ7.8−ジヒドロネオプテリントリホ
スフェートの6−ビルポイルー5.6,7.8−テトラ
ヒドロプテリンへの変換反応に必要なMgC+2でも阻
害される(M g C+ 2の0.1mMで50%阻害
)ため、該ラット由来の酵素を含む酵素系は、本発明の
製造方法のごときワンポットでの反応に用いることはで
きない。
本発明の製法において、反応系中のGCH濃度は好まし
くは500〜5000μg/d、特に好ましくは500
0μg/威、PTPS濃度は好ましくは50〜500μ
g/ml、特に好ましくは500μg/pd、またSP
R濃度は好ましくは4〜401tg /rd、特に好ま
しくは40μg/IIlがよい。(I(L、ここに例示
した酵素量の」二限は主として酵素の精製標品における
最終濃度により決定されるもので、酵素活性が安定であ
るかぎり、酵素量に実質的上限は存在しない。
くは500〜5000μg/d、特に好ましくは500
0μg/威、PTPS濃度は好ましくは50〜500μ
g/ml、特に好ましくは500μg/pd、またSP
R濃度は好ましくは4〜401tg /rd、特に好ま
しくは40μg/IIlがよい。(I(L、ここに例示
した酵素量の」二限は主として酵素の精製標品における
最終濃度により決定されるもので、酵素活性が安定であ
るかぎり、酵素量に実質的上限は存在しない。
本発明の製法で使用するGCHは、大腸菌由来であり、
大腸菌例えばB株(野性株)の溶菌、硫安分画、AcA
34ゲル濾過、GTP−セファロース分画により得るこ
とができる。B株は、例えば、JE6034 (国立遺
伝研究所)とし゛ζ入手可能な大腸菌またはATCC2
3848として入手可能な大腸菌である。
大腸菌例えばB株(野性株)の溶菌、硫安分画、AcA
34ゲル濾過、GTP−セファロース分画により得るこ
とができる。B株は、例えば、JE6034 (国立遺
伝研究所)とし゛ζ入手可能な大腸菌またはATCC2
3848として入手可能な大腸菌である。
P T P Sは、哺乳類、例えばラットの肝より得ら
れた粗抽出物を硫安分画、熱処理、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー、ブチルトコバールクロマトグラ
フィー、セファデックスG100ゲル濾過、Mono
Qイオン交換クロマトグラフィーにより精製すること
により得ることができる。
れた粗抽出物を硫安分画、熱処理、ヒドロキシアパタイ
トクロマトグラフィー、ブチルトコバールクロマトグラ
フィー、セファデックスG100ゲル濾過、Mono
Qイオン交換クロマトグラフィーにより精製すること
により得ることができる。
また、SPRは、哺乳類例えばラットの赤血球の溶血、
硫安分画、ブチルトヨバールクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、レッドセファロ
ースCL−613により得ることができる。
硫安分画、ブチルトヨバールクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトクロマトグラフィー、レッドセファロ
ースCL−613により得ることができる。
ごのようにして得られた酵素標品は、SDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって、その精製程度あるいは
十分に精製単離されているかどうか知ることができ、ま
た、必要であればこれにより分子量を知ることができる
。さらに、得られた酵素標品はアミノ酸配列自動分析機
によってアミノ末端のアミノ酸配列が分析される。ある
いは、蛋白質分解酵素を用いて得られた酵素標品を分解
し、高速液体クロマトグラフィーを用いて、ペプチドを
分離し、同様にアミノ酸配列を決定することができる。
ルアミドゲル電気泳動によって、その精製程度あるいは
十分に精製単離されているかどうか知ることができ、ま
た、必要であればこれにより分子量を知ることができる
。さらに、得られた酵素標品はアミノ酸配列自動分析機
によってアミノ末端のアミノ酸配列が分析される。ある
いは、蛋白質分解酵素を用いて得られた酵素標品を分解
し、高速液体クロマトグラフィーを用いて、ペプチドを
分離し、同様にアミノ酸配列を決定することができる。
本発明においては前記のとおり本発明の製法に使用する
ために特に適する酵素も提供されたが、これらの各酵素
は、アミノ末端のアミノ酸配列および部分アミノ酸配列
により、新しい構造をもつ酵素であることがわかった。
ために特に適する酵素も提供されたが、これらの各酵素
は、アミノ末端のアミノ酸配列および部分アミノ酸配列
により、新しい構造をもつ酵素であることがわかった。
本発明は、新しいアミノ酸配列を見出したことにより、
これらをコードする本酵素の遺伝子の単離、さらには組
換えDNA技術による本発明の酵素の大量生産の材料を
提供する。
これらをコードする本酵素の遺伝子の単離、さらには組
換えDNA技術による本発明の酵素の大量生産の材料を
提供する。
1へ
本発明の製法においては、G CHがKCIで活性化さ
れ、PTPSはM g 2 ゛が活性発現に必須であり
、またSPRの活性発現にはN A D l) Hを要
することを考慮して、これら活性化因子および補酵素は
互いに他の酵素反応を阻害しない濃度範囲で設定されれ
ばよい。KCIの濃度は、好ましくは0.05〜0.5
0M、特に好ましくは、0゜10Mであり、Mg2′″
の供給源としてのMgC1□の濃度は、好ましくは5〜
50IIIM、特に好ましくは5〜20wM、およびN
A D P Hの濃度は、好ましくは4mM以」二、
特に好ましくは4mMがよい。
れ、PTPSはM g 2 ゛が活性発現に必須であり
、またSPRの活性発現にはN A D l) Hを要
することを考慮して、これら活性化因子および補酵素は
互いに他の酵素反応を阻害しない濃度範囲で設定されれ
ばよい。KCIの濃度は、好ましくは0.05〜0.5
0M、特に好ましくは、0゜10Mであり、Mg2′″
の供給源としてのMgC1□の濃度は、好ましくは5〜
50IIIM、特に好ましくは5〜20wM、およびN
A D P Hの濃度は、好ましくは4mM以」二、
特に好ましくは4mMがよい。
基質GTPの濃度は、特に限定されないが0.211I
M以下が好ましく、特に0.1〜0.2mMが好ましい
。GTPの濃度が0.2+wMを大幅に越えると、GT
Pのジヒドロネオプテリン1−リホスフエートへの変換
効率が低下するという不都合が生じる。
M以下が好ましく、特に0.1〜0.2mMが好ましい
。GTPの濃度が0.2+wMを大幅に越えると、GT
Pのジヒドロネオプテリン1−リホスフエートへの変換
効率が低下するという不都合が生じる。
各種反応条件は、本反応が阻害されない範囲で設定すれ
ばよいが、溶媒としては、適宜ジチオエリ1〜リトール
、ジチオスレイトールなどの還元剤やエチレンジアミン
四酢酸(EDTA)などの重金属キレイタ−を加えて、
リン酸緩衝液等の適当なpH調節剤を用いればよく、反
応pl+および温度は本酵素の特性により決定され、p
uは概ね6〜8、特に7付近が好ましく、温度は概ね2
5〜42°C2特に37℃付近が好ましい。反応時間は
概ね5分〜1時間である。こうして反応混合物中に生成
したB H4の回収は、HPLC等のクロマ1〜グラフ
イーによる分離法その他により行うことができる。
ばよいが、溶媒としては、適宜ジチオエリ1〜リトール
、ジチオスレイトールなどの還元剤やエチレンジアミン
四酢酸(EDTA)などの重金属キレイタ−を加えて、
リン酸緩衝液等の適当なpH調節剤を用いればよく、反
応pl+および温度は本酵素の特性により決定され、p
uは概ね6〜8、特に7付近が好ましく、温度は概ね2
5〜42°C2特に37℃付近が好ましい。反応時間は
概ね5分〜1時間である。こうして反応混合物中に生成
したB H4の回収は、HPLC等のクロマ1〜グラフ
イーによる分離法その他により行うことができる。
本発明の製法によるBI3の原料(GTP)に対する収
率は、約80%もしくはそれ以上であり、従来の方法に
比べて極めて収率が高い。
率は、約80%もしくはそれ以上であり、従来の方法に
比べて極めて収率が高い。
また、前記したごとく、ラット由来のGTPシクロヒド
ロラーゼ1は、B H4合成の律速酵素であり、また種
々の活性調節を受けることが知られている。そごで本発
明者らは、ラット肝よりGTPシクロヒドロラーゼIを
精製してその性質を明らかにした。本酵素のcDNAク
ローニングを行い、全−底構造を決定した。ラット肝ポ
リ(A)RNAからλZAPrlcl)NAライブラリ
ーを作成し、リジルエンドペプチダーゼ分解によって得
たペプチドの部分アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレ
オチドを合成し、それをプローブに用いてスクリーニン
グを行い、1.0kbの挿入断片を持つクローンを得た
。このクローンは241アミノ酸残基からなるポリペプ
チドをコードしており、上記リジルエンドペプチダーゼ
分解で分離した8個のペプチドのアミノ酸配列と完全に
一致する8領域を含んでいた。塩基配列から予想される
アミノ酸配列とNBRF蛋白質データベースを比較した
ところ、GTPシクロヒドロラーゼIのアミノ酸配列の
一部が、ジヒドロ葉酸還元酵素のジヒドロ葉酸結合部位
と同定されているアミノ酸配列とホモロジーを示すこと
が明らかになった。ジヒドロ葉酸の構造と類似している
BH4により、本酵素が活性阻害を受けることから、こ
の部分はプテリン結合部位ではないかと考えられる。
ロラーゼ1は、B H4合成の律速酵素であり、また種
々の活性調節を受けることが知られている。そごで本発
明者らは、ラット肝よりGTPシクロヒドロラーゼIを
精製してその性質を明らかにした。本酵素のcDNAク
ローニングを行い、全−底構造を決定した。ラット肝ポ
リ(A)RNAからλZAPrlcl)NAライブラリ
ーを作成し、リジルエンドペプチダーゼ分解によって得
たペプチドの部分アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレ
オチドを合成し、それをプローブに用いてスクリーニン
グを行い、1.0kbの挿入断片を持つクローンを得た
。このクローンは241アミノ酸残基からなるポリペプ
チドをコードしており、上記リジルエンドペプチダーゼ
分解で分離した8個のペプチドのアミノ酸配列と完全に
一致する8領域を含んでいた。塩基配列から予想される
アミノ酸配列とNBRF蛋白質データベースを比較した
ところ、GTPシクロヒドロラーゼIのアミノ酸配列の
一部が、ジヒドロ葉酸還元酵素のジヒドロ葉酸結合部位
と同定されているアミノ酸配列とホモロジーを示すこと
が明らかになった。ジヒドロ葉酸の構造と類似している
BH4により、本酵素が活性阻害を受けることから、こ
の部分はプテリン結合部位ではないかと考えられる。
以下本発明を実施例を用いてさらに詳しく説明するが、
もとより本発明は実施例のみに限定されるものではない
。
もとより本発明は実施例のみに限定されるものではない
。
実施例IGCHの抽出・精製
大腸菌としてはB株(野性株1国立遺伝研究所。
JE6034)を用いた。大腸菌B株を、以下のように
して溶菌、硫安分画、AcA34ゲル濾過、GTP−セ
ファロース分画して、約1400倍に精製した。各工程
の蛋白質量、活性収率および比活性は後記第1表に示す
。
して溶菌、硫安分画、AcA34ゲル濾過、GTP−セ
ファロース分画して、約1400倍に精製した。各工程
の蛋白質量、活性収率および比活性は後記第1表に示す
。
、MJIAM3 : −70°Cで保存しておいた大腸
菌245gを、pH8,0の0.3M)リス塩酸緩衝液
(緩衝液A)420−とブレングー中で混和し、各回5
分間の音波処理を5回行い、菌を破壊した。
菌245gを、pH8,0の0.3M)リス塩酸緩衝液
(緩衝液A)420−とブレングー中で混和し、各回5
分間の音波処理を5回行い、菌を破壊した。
この溶菌液を12000Xg、20分間遠心分離し、上
清を得た。沈渣は緩衝液A91dに懸濁し、音波処理を
5分間行い同様に遠心分離後、上滑を得、先の上清と混
和した。
清を得た。沈渣は緩衝液A91dに懸濁し、音波処理を
5分間行い同様に遠心分離後、上滑を得、先の上清と混
和した。
薄皮分画:溶菌液535dに100%飽和硫安229d
を加え、20分間攪拌後、12000xgで20分間遠
心分離し、」1清を得た。この上清722威に100%
飽和硫安149dを加え、20分間攪拌後、12000
Xgで20分間遠心分離し、沈渣を得た。この沈渣を0
.3M KC12、,1′。
を加え、20分間攪拌後、12000xgで20分間遠
心分離し、」1清を得た。この上清722威に100%
飽和硫安149dを加え、20分間攪拌後、12000
Xgで20分間遠心分離し、沈渣を得た。この沈渣を0
.3M KC12、,1′。
を含むpH8,0の5011IMトリス塩酸緩衝液(緩
衝液B)に溶かし、5℃の緩衝液Bに対して2回交換し
て透析した。
衝液B)に溶かし、5℃の緩衝液Bに対して2回交換し
て透析した。
ΔcA34ゲ四11−:透析した酵素液を12000×
gで20分間遠心分離後、上清を得た。このに清57d
を限外濾過膜(アミコン社製、l)Mlo)を用いて2
4dまで濃縮した。この濃縮した酵素液を緩衝液Bで平
衡化した5X83cmのAcA34ゲルカラムを用いて
流速60i/時間でゲル濾過を行い、活性分画を得た。
gで20分間遠心分離後、上清を得た。このに清57d
を限外濾過膜(アミコン社製、l)Mlo)を用いて2
4dまで濃縮した。この濃縮した酵素液を緩衝液Bで平
衡化した5X83cmのAcA34ゲルカラムを用いて
流速60i/時間でゲル濾過を行い、活性分画を得た。
GTP−セファロース ニゲル濾過の活性画分を、2
.5+oM EDTAを含むpH7,0の10mMカ
リウムリン酸緩衝液(緩衝液C)で平衡化したGTP−
セファロースカラムへ流速60d/時間で吸着させ、0
.3M KCIを含む緩衝液C40+tl!と緩衝液
C90mで連続して洗浄した。次にごのカラムに0.2
5■/dのGTPを含む緩衝液Cを流速10−7時間で
流し、G CHの活性分画を得た。
.5+oM EDTAを含むpH7,0の10mMカ
リウムリン酸緩衝液(緩衝液C)で平衡化したGTP−
セファロースカラムへ流速60d/時間で吸着させ、0
.3M KCIを含む緩衝液C40+tl!と緩衝液
C90mで連続して洗浄した。次にごのカラムに0.2
5■/dのGTPを含む緩衝液Cを流速10−7時間で
流し、G CHの活性分画を得た。
第1表
工程 蛋白質 活性
比活性(nmol/h
含量(+1g) 収率(%) /町蛋白質)溶菌
33.000 硫安分画 5,000 ΔcA34 2,500 GTP−セファロース 4.6100
0.25 67 1.1 55 1.9 なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。
33.000 硫安分画 5,000 ΔcA34 2,500 GTP−セファロース 4.6100
0.25 67 1.1 55 1.9 なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。
反応液である0、1mM GTPと2.5mM E
DTAを含むpl+8.5の0.IMFリス塩酸緩衝液
495μ+ に5μl (D酵素液を加え、37°Cテ
30分間保温し、50μmの0.9%I2と1.8%K
lを含むIN塩酸を加え、遮光して室温で1時間放置し
た。この液に2%アスコルビン酸50μm、IN水酸化
ナトリウム50μmと3ユニツトのアルカリフォスファ
ターゼ液100μmを加え、37°Cで1時間保温した
。この液にINの酢酸100μmを加え、遠心分離後上
清を得た。この」1清を1mM ED−1”Aを含む
pl+7.0の11011Iナトリウムリン酸緩衝液で
平衡化した4、6X250+wの5μmc18逆相カラ
ムに流速0.8d/分でインジェクトし、350nm励
起、440nm蛍光検出器を用いてG CH反応産生物
であるジヒドロネオプテリントリフオスフェート由来の
ネオプテリンを分離定量する。
DTAを含むpl+8.5の0.IMFリス塩酸緩衝液
495μ+ に5μl (D酵素液を加え、37°Cテ
30分間保温し、50μmの0.9%I2と1.8%K
lを含むIN塩酸を加え、遮光して室温で1時間放置し
た。この液に2%アスコルビン酸50μm、IN水酸化
ナトリウム50μmと3ユニツトのアルカリフォスファ
ターゼ液100μmを加え、37°Cで1時間保温した
。この液にINの酢酸100μmを加え、遠心分離後上
清を得た。この」1清を1mM ED−1”Aを含む
pl+7.0の11011Iナトリウムリン酸緩衝液で
平衡化した4、6X250+wの5μmc18逆相カラ
ムに流速0.8d/分でインジェクトし、350nm励
起、440nm蛍光検出器を用いてG CH反応産生物
であるジヒドロネオプテリントリフオスフェート由来の
ネオプテリンを分離定量する。
また、下記のようにして比活性を測定し、KmO,05
/μ門を決定した。Ifllら、GTPを0゜01、
0.02,0.04. 0.06,0.08゜0、 1
. 0. 2. 0. 4. 0.6. 0.8および
1.0μ門含む上記反応液を用いてG CHの初速度を
決定し、L i n e w e a v e r −
B u r kのプロットを作成し、Kmを決定した。
/μ門を決定した。Ifllら、GTPを0゜01、
0.02,0.04. 0.06,0.08゜0、 1
. 0. 2. 0. 4. 0.6. 0.8および
1.0μ門含む上記反応液を用いてG CHの初速度を
決定し、L i n e w e a v e r −
B u r kのプロットを作成し、Kmを決定した。
分子量の測定はF記のようにして行った。最終クロマト
グラフィー分画のSDSポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約26,000と推定され、またA
cA34ゲル漉過によれば約200,000であり、本
酵素はオリゴマー酵素と考えられる。
グラフィー分画のSDSポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約26,000と推定され、またA
cA34ゲル漉過によれば約200,000であり、本
酵素はオリゴマー酵素と考えられる。
SDSポリアクリルアミ」」じ彰永113:Laemm
liの方法に従い、12.5%アクリルアミドゲルを用
いて行った。標準蛋白質として、フォスフォリラーゼb
(94,000)、ウシ血清アルブミン(66,00
0)、オブアルブミン(43,000)、カーボニック
アンヒドラーゼ(30,000)およびソイビーントリ
プシンインヒビター(20,000)を電気泳動し、そ
の泳動位置との比較によりGCHの分子量を決定した。
liの方法に従い、12.5%アクリルアミドゲルを用
いて行った。標準蛋白質として、フォスフォリラーゼb
(94,000)、ウシ血清アルブミン(66,00
0)、オブアルブミン(43,000)、カーボニック
アンヒドラーゼ(30,000)およびソイビーントリ
プシンインヒビター(20,000)を電気泳動し、そ
の泳動位置との比較によりGCHの分子量を決定した。
△−zA↓4□ゲJ巧W過: 精製過程に用いたゲルを
用いて同じ条件下で標準蛋白質として、サイログロブリ
ン(669,000)、フェリチン(440,000)
、β−アミラーゼ(200,000)、アルコール脱水
素酵素(150,000)、ウシ血清アルブミン(66
,000)、カーボニックアンヒドラーゼ(29,00
0)およびチトクロームc (12,/+00)をゲル
濾過し、その溶出位置との比較よりGCHの分子量を決
定した。
用いて同じ条件下で標準蛋白質として、サイログロブリ
ン(669,000)、フェリチン(440,000)
、β−アミラーゼ(200,000)、アルコール脱水
素酵素(150,000)、ウシ血清アルブミン(66
,000)、カーボニックアンヒドラーゼ(29,00
0)およびチトクロームc (12,/+00)をゲル
濾過し、その溶出位置との比較よりGCHの分子量を決
定した。
最終クロマトグラフィー分画のG CHを下記の方法に
よって、アミノ末端25個のアミノ酸配列および内部の
部分アミノ酸配列を決定した。
よって、アミノ末端25個のアミノ酸配列および内部の
部分アミノ酸配列を決定した。
アー糺り酸配刀塑夫足: 精製したGCH54Q pi
oleを10%トリクロロ酢酸で沈澱させて、6Mグア
ニジンに溶解し、pH9,0のトリス塩酸緩衝液にて最
終濃度2Mグアニジンを含む50mMトリス塩酸緩衝液
溶液なるように希釈した。これに、C,CHの1/40
0モル即ち、1.35pm。
oleを10%トリクロロ酢酸で沈澱させて、6Mグア
ニジンに溶解し、pH9,0のトリス塩酸緩衝液にて最
終濃度2Mグアニジンを含む50mMトリス塩酸緩衝液
溶液なるように希釈した。これに、C,CHの1/40
0モル即ち、1.35pm。
1eのリジルエンドペプチダーゼを加え、30°Cで5
時間保温しGCI(を分解した。この液を5%アセトニ
トリルを含むO,1%トリフルオロ酢酸で平衡化した4
、6X250mmの5μ+mC18逆相カラムにインジ
ェクトし、つづいて5%から60%までのアセトニトリ
ルグラジェント溶出を、流速1.0d/分、勾配置%/
2m平衡化緩衝液にて30°Cにて行った。検出は22
0nwのUVで行い、吸収ピーク画分をエッペンドルフ
チューブに回収した。溶出の結果を第1図に示す。得ら
れたペプチドと分解していない蛋白質のアミノ酸配列を
モデル120A高速液体クロマトグラフィー装置に接続
したアブライドバイオシステムズ社の470A型自動ガ
ス相蛋白質配列決定装置を用いて決定し7た。
時間保温しGCI(を分解した。この液を5%アセトニ
トリルを含むO,1%トリフルオロ酢酸で平衡化した4
、6X250mmの5μ+mC18逆相カラムにインジ
ェクトし、つづいて5%から60%までのアセトニトリ
ルグラジェント溶出を、流速1.0d/分、勾配置%/
2m平衡化緩衝液にて30°Cにて行った。検出は22
0nwのUVで行い、吸収ピーク画分をエッペンドルフ
チューブに回収した。溶出の結果を第1図に示す。得ら
れたペプチドと分解していない蛋白質のアミノ酸配列を
モデル120A高速液体クロマトグラフィー装置に接続
したアブライドバイオシステムズ社の470A型自動ガ
ス相蛋白質配列決定装置を用いて決定し7た。
蛋白質のN末端
Pro−5er−Leu−3er−1,ys−Glu−
^1a−八Ia−Leu−ValII i s −G
l u−八Ia−Leu−Val−^1a−^rg−G
ly−Leu−GluThr−Pro−1,eu−^r
g−Pr。
^1a−八Ia−Leu−ValII i s −G
l u−八Ia−Leu−Val−^1a−^rg−G
ly−Leu−GluThr−Pro−1,eu−^r
g−Pr。
5μmc18逆相カラムから溶出したペプチド断片のア
ミノ酸配列決定の結果は次のとおりである。
ミノ酸配列決定の結果は次のとおりである。
ビークI
!1e−Thr−Leuile−Glu−へ5n−Ly
sピークll 5er−3er−Gln−Asn−Thr−^rg−H
is−Gin−Phe−Leu^rH−Ala−Val
−^rg−11is−11is−八snピーク■ 八Ia−()−Glydle−()−Asp−Ala−
Thr−5er−Alahr ピーク■ Glu−Ala−八Ia−1,eu−Val−11s−
Glu−^1a−1.eu−ValAla−Arg−G
ly−Leu−Gluピーク■ Met−Lys−Val−八sp−Glu−Met−V
al−Thr−Val−^rg^rg−11e−()−
Leu ビーク■ Met−Tyr−Val−Asp−Glu−11e−P
he−3er−Gly−Leu八5へ−Tyr−八Ia
−Asn−Phc−Pr。
sピークll 5er−3er−Gln−Asn−Thr−^rg−H
is−Gin−Phe−Leu^rH−Ala−Val
−^rg−11is−11is−八snピーク■ 八Ia−()−Glydle−()−Asp−Ala−
Thr−5er−Alahr ピーク■ Glu−Ala−八Ia−1,eu−Val−11s−
Glu−^1a−1.eu−ValAla−Arg−G
ly−Leu−Gluピーク■ Met−Lys−Val−八sp−Glu−Met−V
al−Thr−Val−^rg^rg−11e−()−
Leu ビーク■ Met−Tyr−Val−Asp−Glu−11e−P
he−3er−Gly−Leu八5へ−Tyr−八Ia
−Asn−Phc−Pr。
ピーク■
Ser−Leu−11e−Ala−Gly−H4S−M
et−Thr−Glu−11eMet−Gln−Leu
−Lea−^5n−()−Aspピーク■ Ice−八sn−Arg−11e−Val−Gln−P
he−Phe−八Ia−Gln^rg−Pr。
et−Thr−Glu−11eMet−Gln−Leu
−Lea−^5n−()−Aspピーク■ Ice−八sn−Arg−11e−Val−Gln−P
he−Phe−八Ia−Gln^rg−Pr。
実施例2 PTPSの抽出・精製
ラット肝650gを雄のK B L : W i s
t e r系ラット60匹より得た。この肝を、硫安分
画、熱処理、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、
ブチルトヨバールクロマトグラフィー、セファデックス
G100ゲル濾過、Mono Qイオン交換クロマト
グラフィーで以下のようにして、約32,000倍に精
製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を後
記第2表に示す。
t e r系ラット60匹より得た。この肝を、硫安分
画、熱処理、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、
ブチルトヨバールクロマトグラフィー、セファデックス
G100ゲル濾過、Mono Qイオン交換クロマト
グラフィーで以下のようにして、約32,000倍に精
製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を後
記第2表に示す。
硫−安−分−画−: −70°Cに保存しておいた肝
650gを、5mM2−メルカプトエタノールと0゜2
mMフェニルメチルサルフォニルフルオラドヲ含むpH
7,0の50mMカリウムリン酸緩衝液(緩衝液A)1
300d中でプレンダーを用いて破壊して、ホモジエネ
ートを得た。このホモジェネートを1300〆の緩衝液
Aと混和した後、ウルトラトラックス社製のブレンダー
を用いて更に組織を破壊した。このホモジェネートを1
2000Xgで20分遠心した後、上滑を得た。この上
清(2560atfりに100%飽和の硫安液1100
−を加え、20分撹拌後、12000Xg、20分間遠
心して上清を得た。この」−清に100%飽和の硫安液
1130mを加え、20分撹拌後、12000×g、2
0分間遠心し、沈渣をpH6,0の10mMカリウムリ
ン酸緩衝液に溶かした。この酵素液を5!の同緩衝液に
対して4回交換して透析し28\ た。
650gを、5mM2−メルカプトエタノールと0゜2
mMフェニルメチルサルフォニルフルオラドヲ含むpH
7,0の50mMカリウムリン酸緩衝液(緩衝液A)1
300d中でプレンダーを用いて破壊して、ホモジエネ
ートを得た。このホモジェネートを1300〆の緩衝液
Aと混和した後、ウルトラトラックス社製のブレンダー
を用いて更に組織を破壊した。このホモジェネートを1
2000Xgで20分遠心した後、上滑を得た。この上
清(2560atfりに100%飽和の硫安液1100
−を加え、20分撹拌後、12000Xg、20分間遠
心して上清を得た。この」−清に100%飽和の硫安液
1130mを加え、20分撹拌後、12000×g、2
0分間遠心し、沈渣をpH6,0の10mMカリウムリ
ン酸緩衝液に溶かした。この酵素液を5!の同緩衝液に
対して4回交換して透析し28\ た。
躾皿: 透析した酵素液を15000Xgで20分間
遠心し、上滑を得た。沈渣はpl+6.0の10+nM
カリウムリン酸緩衝液に溶かし、再び同条件にて遠心後
、上滑を得、先の上滑と混和した。
遠心し、上滑を得た。沈渣はpl+6.0の10+nM
カリウムリン酸緩衝液に溶かし、再び同条件にて遠心後
、上滑を得、先の上滑と混和した。
この酵素液を60dづつ80″Cの温浴中で撹拌しなが
ら熱処理して、12000Xgで20分間遠心して、上
清を得た。この上清347+dを限外濾過膜PM−10
を用いて79−になるまで濃縮後、p)16.Oの1m
Mカリウムリン酸緩衝液(緩衝液B)5!に対して透析
した。
ら熱処理して、12000Xgで20分間遠心して、上
清を得た。この上清347+dを限外濾過膜PM−10
を用いて79−になるまで濃縮後、p)16.Oの1m
Mカリウムリン酸緩衝液(緩衝液B)5!に対して透析
した。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー:透析した酵
素液を緩衝液Bで平衡化した2、8×430のヒドロキ
シアパタイトのカラムに流速60n/時間で吸着させた
。このカラムを260m1l!の緩衝液Bにて洗浄後、
700d(7)pH6、011+)IJン酸1mMから
20011IMのカリウムリン酸緩衝液のグラジェント
溶出を行うと、約50mMのリン酸濃度でPTPS活性
が溶出された。
素液を緩衝液Bで平衡化した2、8×430のヒドロキ
シアパタイトのカラムに流速60n/時間で吸着させた
。このカラムを260m1l!の緩衝液Bにて洗浄後、
700d(7)pH6、011+)IJン酸1mMから
20011IMのカリウムリン酸緩衝液のグラジェント
溶出を行うと、約50mMのリン酸濃度でPTPS活性
が溶出された。
ブチルトヨバールクロマトグラフィー: ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィーで得られた活性画分に、そ
の容量の半分量の90%飽和硫安を含むpl+6.0の
50mMカリウムリン酸緩衝液を加えた。この酵素液を
30%飽和硫安を含むpH6゜0の50mMカリウムリ
ン酸緩衝液(M樹液C)で平衡化した1×51のブチル
トヨバールカラムに流速40d/時間で吸着させた。こ
のカラムを40dの緩衝液Cで洗浄した後、40dの緩
衝液Cから硫安を含まない緩衝液Cまでのグラジェント
溶出を行うと、約20%飽和硫安にてPTPS活性が溶
出された。
パタイトクロマトグラフィーで得られた活性画分に、そ
の容量の半分量の90%飽和硫安を含むpl+6.0の
50mMカリウムリン酸緩衝液を加えた。この酵素液を
30%飽和硫安を含むpH6゜0の50mMカリウムリ
ン酸緩衝液(M樹液C)で平衡化した1×51のブチル
トヨバールカラムに流速40d/時間で吸着させた。こ
のカラムを40dの緩衝液Cで洗浄した後、40dの緩
衝液Cから硫安を含まない緩衝液Cまでのグラジェント
溶出を行うと、約20%飽和硫安にてPTPS活性が溶
出された。
セファデックスG100−ル : ブチルトヨバール
カラムクロマトグラフィーで得られた活性画分を限外濾
過膜アミコン社製セントリフローCF25を用いて1.
1dまで濃縮した。この酵素液を30mMのKCIを含
むpF17.0の20nMカリウムリン酸緩衝液(緩衝
液D)で平衡化した1゜5×89cmのセファデツクス
G100カラムを用いて流速5威/時間でゲル濾過を行
い、活性画分を得た。
カラムクロマトグラフィーで得られた活性画分を限外濾
過膜アミコン社製セントリフローCF25を用いて1.
1dまで濃縮した。この酵素液を30mMのKCIを含
むpF17.0の20nMカリウムリン酸緩衝液(緩衝
液D)で平衡化した1゜5×89cmのセファデツクス
G100カラムを用いて流速5威/時間でゲル濾過を行
い、活性画分を得た。
Mono Qイオン−りロマトグラフイー:ゲル濾過
で得られた活性画分を緩衝液りで平衡化した0、5X5
C11のMonoQイオン交換カラムに流速0.5d/
分で吸着させた。このカラムを3−の緩衝液りにて洗浄
後、]Odの緩衝液りから4001のKCIを含む緩衝
液りまでのグラジェント溶出を行うと、KCI 1B
(1+Mを含む溶出液の付近にPTPS活性が単一ピー
クで溶出された。
で得られた活性画分を緩衝液りで平衡化した0、5X5
C11のMonoQイオン交換カラムに流速0.5d/
分で吸着させた。このカラムを3−の緩衝液りにて洗浄
後、]Odの緩衝液りから4001のKCIを含む緩衝
液りまでのグラジェント溶出を行うと、KCI 1B
(1+Mを含む溶出液の付近にPTPS活性が単一ピー
クで溶出された。
第2表
粗抽出 112,000
硫安分画 41,400
熱処理 609
ヒFuキシアパタイト 47.6プチルトヨ
バール 4.77セフアダフクス G
100 O,60Monoロ 0.
57 100 0.68 95 1.8 18 2.900 17 22.000 16 22.000 なお、酵素活性の測定は、生成物である6−ビルボイル
テトラヒドロプテリンがアルカリ中でヨード酸化され、
プテリンとなることを利用して、反応生成物をプテリン
として定量した。
バール 4.77セフアダフクス G
100 O,60Monoロ 0.
57 100 0.68 95 1.8 18 2.900 17 22.000 16 22.000 なお、酵素活性の測定は、生成物である6−ビルボイル
テトラヒドロプテリンがアルカリ中でヨード酸化され、
プテリンとなることを利用して、反応生成物をプテリン
として定量した。
財流判塑肩淀: 反応液である50μHジヒドロネオプ
テリントリフオスフエート、8mMMgC1□および1
01ジチオスレイトールを含むp117.4の]、OO
mM)リス塩酸緩衝液18μmに、2μmの酵素液を加
え、37°Cで30分間保温後、0.9%I2と1.8
%Klを含むIN水酸化ナトリウム液200μmを加え
、遮光し、室温にて1時間放置した。この液に1N塩酸
200μmと5%アスコルビン酸50μmを加え、遠心
後上清を得た。この上清を0.1mM EDTAと5
%メタノールを含むpH5,0の50mMナトリウム酢
酸緩衝液で平衡化した4、6X250mmの5μ+nC
18逆相カラムに流速0.8d/分でインジェクトし、
350r+m励起、440nm蛍光検出器を用いて、P
TPS反応産生物である6−ビルボイルテトラヒドロプ
テリン由来のプテリンを分離定量し3ま た。
テリントリフオスフエート、8mMMgC1□および1
01ジチオスレイトールを含むp117.4の]、OO
mM)リス塩酸緩衝液18μmに、2μmの酵素液を加
え、37°Cで30分間保温後、0.9%I2と1.8
%Klを含むIN水酸化ナトリウム液200μmを加え
、遮光し、室温にて1時間放置した。この液に1N塩酸
200μmと5%アスコルビン酸50μmを加え、遠心
後上清を得た。この上清を0.1mM EDTAと5
%メタノールを含むpH5,0の50mMナトリウム酢
酸緩衝液で平衡化した4、6X250mmの5μ+nC
18逆相カラムに流速0.8d/分でインジェクトし、
350r+m励起、440nm蛍光検出器を用いて、P
TPS反応産生物である6−ビルボイルテトラヒドロプ
テリン由来のプテリンを分離定量し3ま た。
また、下記のようにして比活性を測定し、Km9.1p
台を決定した。即ち、ジヒドロネオプテリントリフオス
フェートを、1.2.5.10.20および50μh含
む上記反応液を用いてPTPSの初速度を決定し、Li
neweaver−Burkのプロットを作成し、Km
を決定した。
台を決定した。即ち、ジヒドロネオプテリントリフオス
フェートを、1.2.5.10.20および50μh含
む上記反応液を用いてPTPSの初速度を決定し、Li
neweaver−Burkのプロットを作成し、Km
を決定した。
分子量の測定は実施例1と同様に、SDSポリアクリル
アミド電気泳動分析およびHP L Cゲル濾過で行っ
た。ただし、ゲル濾過は平衡化緩衝液として0.1mM
EDTAを含むpl+7.5の50+mMカリウム
リン酸緩衝液を用い、カラムは1.5X47C11のも
のを用い、流速は5m/時間にて行った。最終クロマト
グラフィー分画のSDSポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約17000と推定され、またH
P L Cゲル濾過によれば、約93,000であった
。この結果から本酵素はオリゴマー酵素と考えられる。
アミド電気泳動分析およびHP L Cゲル濾過で行っ
た。ただし、ゲル濾過は平衡化緩衝液として0.1mM
EDTAを含むpl+7.5の50+mMカリウム
リン酸緩衝液を用い、カラムは1.5X47C11のも
のを用い、流速は5m/時間にて行った。最終クロマト
グラフィー分画のSDSポリアクリルアミド電気泳動分
析により、分子量は約17000と推定され、またH
P L Cゲル濾過によれば、約93,000であった
。この結果から本酵素はオリゴマー酵素と考えられる。
最終クロマトグラフィー分画のP T I)Sを下記の
方法によって、アミノ末端24個のアミノ酸配列および
内部の部分アミノ酸配列を決定した。
方法によって、アミノ末端24個のアミノ酸配列および
内部の部分アミノ酸配列を決定した。
7−1.ス1=刀勿迭淀−: 精製PTPS ln
molを用いて、実施例1のアミノ酸配列決定と同様の
方法でN末端のアミノ酸配列を決定した。精製PTPS
(In+mol)の分解、ペプチド分離およびアミノ酸
配列決定も実施例1と同様の方法で行った。
molを用いて、実施例1のアミノ酸配列決定と同様の
方法でN末端のアミノ酸配列を決定した。精製PTPS
(In+mol)の分解、ペプチド分離およびアミノ酸
配列決定も実施例1と同様の方法で行った。
ただし、酵素による分解はりジルエンドペプチダーゼの
他■8蛋白質分解酵素によっても行い、後者による分解
反応は、P T P S 1 nmolをトリクロロ
酢酸沈澱後、6μlの6Mグアニジンに溶解し、つづい
てpH7,7の0.5Mアンモニウム酢酸緩衝液10μ
lとH2O3,2μmを加え、■8蛋白質分解酵素を5
pmol加え、37°Cで12時間反応させた。この分
解物を実施例1と同様にしてペプチド分解してアミノ酸
配列の決定を行った。それぞれ、リジルエンドペプチダ
ーゼおよび■8蛋白質分解酵素で分解したペプチドを、
018逆相カラムで実施例1と同様に溶出した結果を第
2図および第3図に示す。
他■8蛋白質分解酵素によっても行い、後者による分解
反応は、P T P S 1 nmolをトリクロロ
酢酸沈澱後、6μlの6Mグアニジンに溶解し、つづい
てpH7,7の0.5Mアンモニウム酢酸緩衝液10μ
lとH2O3,2μmを加え、■8蛋白質分解酵素を5
pmol加え、37°Cで12時間反応させた。この分
解物を実施例1と同様にしてペプチド分解してアミノ酸
配列の決定を行った。それぞれ、リジルエンドペプチダ
ーゼおよび■8蛋白質分解酵素で分解したペプチドを、
018逆相カラムで実施例1と同様に溶出した結果を第
2図および第3図に示す。
蛋白質のN末端
NHz−Val−Gly−Leu−Arg−八rg−A
rg−^1a−Arg−Leu−3erArg−Leu
−Val−3er−Phe−()−Ala−()−11
is−ArHLeu−旧s−()−Pr。
rg−^1a−Arg−Leu−3erArg−Leu
−Val−3er−Phe−()−Ala−()−11
is−ArHLeu−旧s−()−Pr。
C18逆相カラムから溶出したペプチド断片のアミノ酸
配列決定の結果は次のとおりである。
配列決定の結果は次のとおりである。
Lys I Pro−Leu−^sn−旧s−()
−1,y、s■、ys VI Val−Val−Va
l−Thr41e41is−Gly−GIu41e−八
spPro−Val−Thr−Gly−Met−νal
−()−Asn−Leu■ Thr−Asp−へsn−へsn−11e−val−V
al−Tyr−Lys−Gly1u V8 It Asn−Leu−Gin−Arg
−Leu−Leu−Pro−Val−Gly−八1aL
eu−Tyr Lys II ()−Asn−Asn−Pro−
Asn−Gly−11is−Gly−()−Asn八5
へ V8 ■ Ala−11cmMet−Lys−P
ro−Leu−Δ5p−H4s−Lys−八sn1、e
u−八5p−(L()−Vat Lys m Val−Phe−Gly−LysV
8 IV 1ie−八5p−Pro−νal−
Thr−GlyLys IV Val−Tyr−G
lu−Thr−Asp−^5n−Asn−11e−Va
l−ValTyr−Lys−Gly−Glu なお、J二記各配列中、カッコは未同定のアミノ酸であ
る。
−1,y、s■、ys VI Val−Val−Va
l−Thr41e41is−Gly−GIu41e−八
spPro−Val−Thr−Gly−Met−νal
−()−Asn−Leu■ Thr−Asp−へsn−へsn−11e−val−V
al−Tyr−Lys−Gly1u V8 It Asn−Leu−Gin−Arg
−Leu−Leu−Pro−Val−Gly−八1aL
eu−Tyr Lys II ()−Asn−Asn−Pro−
Asn−Gly−11is−Gly−()−Asn八5
へ V8 ■ Ala−11cmMet−Lys−P
ro−Leu−Δ5p−H4s−Lys−八sn1、e
u−八5p−(L()−Vat Lys m Val−Phe−Gly−LysV
8 IV 1ie−八5p−Pro−νal−
Thr−GlyLys IV Val−Tyr−G
lu−Thr−Asp−^5n−Asn−11e−Va
l−ValTyr−Lys−Gly−Glu なお、J二記各配列中、カッコは未同定のアミノ酸であ
る。
しys V Glu−Tyr−Met−Glu−G
lu−ΔIa41e−Met−1.ys−Pr。
lu−ΔIa41e−Met−1.ys−Pr。
Leu−Asp
実施例3 SPRの抽出・精製
ラット赤血球を雄のKBL:Wister系のラット3
0匹より得た。得られた赤血球を、溶血、j・、5 硫安分画、ブチルトヨパールクロマトグラフィーヒドロ
キシアバタイトクロマトグラフィー、レッドセファロー
スCL−6Bゲル濾過で、以下のように約1100倍に
精製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を
後記第3表に示ず。
0匹より得た。得られた赤血球を、溶血、j・、5 硫安分画、ブチルトヨパールクロマトグラフィーヒドロ
キシアバタイトクロマトグラフィー、レッドセファロー
スCL−6Bゲル濾過で、以下のように約1100倍に
精製した。各工程の蛋白質量、活性収率および比活性を
後記第3表に示ず。
′fiiLニー70°Cに保存しておいたラット赤血球
的116gを、466dの0.2++Mフェニルメチル
ザルフォニルフルオリドを含むpl+7.0の51カリ
ウムリン酸緩衝液(緩衝液A)とブレングー中で混和し
、氷上で1時間撹拌後、9,500×gで30分間遠心
を行い、抽出液■を得た。沈渣は再び291dの緩衝液
A中で1時間撹拌後、同様に遠心し、抽出液■を得た。
的116gを、466dの0.2++Mフェニルメチル
ザルフォニルフルオリドを含むpl+7.0の51カリ
ウムリン酸緩衝液(緩衝液A)とブレングー中で混和し
、氷上で1時間撹拌後、9,500×gで30分間遠心
を行い、抽出液■を得た。沈渣は再び291dの緩衝液
A中で1時間撹拌後、同様に遠心し、抽出液■を得た。
抽出液■および■を混和した。
楡支分貞: 溶血により得た抽出液710dに163g
の硫安を加え、20分撹拌した後、13゜000Xgで
30分間遠心を行い、その上清780dに硫安69.5
gを加え、20分撹拌後、13 000Xgで30分遠
心を行い沈渣を得た。
の硫安を加え、20分撹拌した後、13゜000Xgで
30分間遠心を行い、その上清780dに硫安69.5
gを加え、20分撹拌後、13 000Xgで30分遠
心を行い沈渣を得た。
この沈渣を53dのpH6,0の10−門カリウムリン
酸緩衝液に溶解した。
酸緩衝液に溶解した。
ブチルトヨパールクロマトグーフィー: 硫安分画53
mと53dの60%飽和硫安を含むpH6゜0の50m
Mカリウムリン酸緩衝液を混和した。この酵素液を30
%飽和硫安を含むpH6,0の5011IMカリウムリ
ン酸緩衝液で平衡化した10dのブチルトヨバールカラ
ムへ流速40d/hで吸着させた。このカラムにIOd
の30%飽和硫安を含む同緩衝液および]、’OJdの
15%飽和硫安を含む同緩衝液を順に流した後、酵素を
15%飽和硫安から0%硫安までの10(ldの同緩衝
液のグラジエンl−にて溶出すると、約8%飽和硫安の
位置にセピアプテリン還元酵素活性が溶出された。
mと53dの60%飽和硫安を含むpH6゜0の50m
Mカリウムリン酸緩衝液を混和した。この酵素液を30
%飽和硫安を含むpH6,0の5011IMカリウムリ
ン酸緩衝液で平衡化した10dのブチルトヨバールカラ
ムへ流速40d/hで吸着させた。このカラムにIOd
の30%飽和硫安を含む同緩衝液および]、’OJdの
15%飽和硫安を含む同緩衝液を順に流した後、酵素を
15%飽和硫安から0%硫安までの10(ldの同緩衝
液のグラジエンl−にて溶出すると、約8%飽和硫安の
位置にセピアプテリン還元酵素活性が溶出された。
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー:ブチルトヨ
バール溶出の活性画分12−を、セファデックスG−2
5200j!i!を用いて、pH6゜0の10+Mカリ
ウムリン酸緩衝液に脱塩後、同緩衝液にて平衡化したi
、 old、のヒドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せた。このカラムを10dの同緩衝液で未吸着画分を洗
浄後、1(1+Mから200IIIMまでのカリウムリ
ン酸緩衝液50dのグラジェント溶出を行うと、リン酸
濃度約80+mMの位置に、セピアプテリン還元酵素活
性が溶出された。
バール溶出の活性画分12−を、セファデックスG−2
5200j!i!を用いて、pH6゜0の10+Mカリ
ウムリン酸緩衝液に脱塩後、同緩衝液にて平衡化したi
、 old、のヒドロキシアパタイトカラムに吸着さ
せた。このカラムを10dの同緩衝液で未吸着画分を洗
浄後、1(1+Mから200IIIMまでのカリウムリ
ン酸緩衝液50dのグラジェント溶出を行うと、リン酸
濃度約80+mMの位置に、セピアプテリン還元酵素活
性が溶出された。
レッドセファロースCL −6Bゲル −避: ヒド
ロキシアパタイト溶出の活性画分2.8dに2゜8dH
20を加え、pH6,8(7)20mMカリウムリン酸
緩衝液で平衡化した1dのレッドセファロースカラムに
吸着させた。このカラムを同緩衝液2dで未吸着骨を洗
浄後、更に0.1M KCIを含むpH6,8の50
mMカリウムリン酸緩衝液10I11を流し、つづいて
50mM NADPHを含む同緩衝液にてセピアプテ
リン還元酵素活性を溶出した。
ロキシアパタイト溶出の活性画分2.8dに2゜8dH
20を加え、pH6,8(7)20mMカリウムリン酸
緩衝液で平衡化した1dのレッドセファロースカラムに
吸着させた。このカラムを同緩衝液2dで未吸着骨を洗
浄後、更に0.1M KCIを含むpH6,8の50
mMカリウムリン酸緩衝液10I11を流し、つづいて
50mM NADPHを含む同緩衝液にてセピアプテ
リン還元酵素活性を溶出した。
第3表
工程
蛋白質量
(信g)
活性収率 比活性(口mol/h
(%) /■g蛋白質)
溶血 2500 100 460
硫安分画 160 94 6.600
ブチルトヨバール 8.8
48 66.000ヒト■キシア
パタイト 0.53 13
270 000レフトセファU−ス CL−6B O,2913520,000
なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。
硫安分画 160 94 6.600
ブチルトヨバール 8.8
48 66.000ヒト■キシア
パタイト 0.53 13
270 000レフトセファU−ス CL−6B O,2913520,000
なお、酵素活性の測定は下記のごとく行った。
反応液である50μHセピアプテリン、100μMNA
DPHおよび0.1mH/mのウシ血清アルブミンを含
むpl+6.4の100mMカリウムリン酸緩衝液47
.5μmに2.5μlの酵素液を加え、25°Cで10
分間保温後、200μmの酸性ヨウ素液を加え、室温に
て1時間遮光して放置した。
DPHおよび0.1mH/mのウシ血清アルブミンを含
むpl+6.4の100mMカリウムリン酸緩衝液47
.5μmに2.5μlの酵素液を加え、25°Cで10
分間保温後、200μmの酸性ヨウ素液を加え、室温に
て1時間遮光して放置した。
p
つづいて、250μmの1%アスコルビン酸を加えた後
、5μmc18カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィー(平衡化緩衝液は5%メタノールを含むpt+5.
0の50mMナトリウム酢酸緩衝液を用い、流速0.8
m/分、25°Cで分析した)にて酵素反応生成物ジヒ
ドロビオプテリンの酸化物であるビオプテリンを分離定
量した。
、5μmc18カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィー(平衡化緩衝液は5%メタノールを含むpt+5.
0の50mMナトリウム酢酸緩衝液を用い、流速0.8
m/分、25°Cで分析した)にて酵素反応生成物ジヒ
ドロビオプテリンの酸化物であるビオプテリンを分離定
量した。
また、下記のようにして、セピアプテリンに対するKm
9.4μ門を決定した。即ち、セピアプテリンL 2.
5.10.15.20.25.30.40.50゜75
および100μ台を含む上記反応液を用いてセピアプテ
リン還元酵素の初速度を決定し、L i n ewea
ver−Burkのプayトを作成し、Kmを決定した
。
9.4μ門を決定した。即ち、セピアプテリンL 2.
5.10.15.20.25.30.40.50゜75
および100μ台を含む上記反応液を用いてセピアプテ
リン還元酵素の初速度を決定し、L i n ewea
ver−Burkのプayトを作成し、Kmを決定した
。
分子量の測定は実施例1と同様のSDSポリアクリルア
ミド電気泳動で行った。最終ゲル濾過で得られたSPR
のSDSポリアクリルアミド電気泳動分析により、分子
量は約28,800と推定された。またH P L C
ゲル濾過によれば、分子量は約56,000であった。
ミド電気泳動で行った。最終ゲル濾過で得られたSPR
のSDSポリアクリルアミド電気泳動分析により、分子
量は約28,800と推定された。またH P L C
ゲル濾過によれば、分子量は約56,000であった。
これらの結果から本酵素はダイマー酵素と考えられる。
最終クロマトグラフィー分画のSPRの部分アミノ酸配
列を、2μmoleのSPR精製標品を用いて実施例1
と同様の方法によって決定した。リジルエンドペプチダ
ーゼで分解したSPRをC18逆相カラムで実施例1と
同様に溶出した結果を第4図に示す。カラムから分離溶
出されたペプチドのアミノ酸配列決定の結果は次の通り
であった。
列を、2μmoleのSPR精製標品を用いて実施例1
と同様の方法によって決定した。リジルエンドペプチダ
ーゼで分解したSPRをC18逆相カラムで実施例1と
同様に溶出した結果を第4図に示す。カラムから分離溶
出されたペプチドのアミノ酸配列決定の結果は次の通り
であった。
ビーク■
Leu−Leu−3er−1,eu−Leu−G ln
−Arg−Asp−Thr−Phe−G In5er−
Gly−八Ia−tlis−VaI−Asp−1’he
−Tyr−^5p−He実施例4 安定・至適pHの測
定 下記のようにして、p Hと酵素活性の関係を調べた。
−Arg−Asp−Thr−Phe−G In5er−
Gly−八Ia−tlis−VaI−Asp−1’he
−Tyr−^5p−He実施例4 安定・至適pHの測
定 下記のようにして、p Hと酵素活性の関係を調べた。
(1) G CHについては実施例1に示した反応液
組成を用いて緩衝剤のみを50ffiMナトリウム酢酸
、MES、カリウムリン酸、Hepes、Trisまた
はすトリウJ、グリシン緩衝液に代えて、がっKCl0
.IMの存在もしくは非存在下で調べた。
組成を用いて緩衝剤のみを50ffiMナトリウム酢酸
、MES、カリウムリン酸、Hepes、Trisまた
はすトリウJ、グリシン緩衝液に代えて、がっKCl0
.IMの存在もしくは非存在下で調べた。
(2)PTPSについては(1)のごと(、緩衝液のみ
を代えて、実施例2に示した反応条件で行った。
を代えて、実施例2に示した反応条件で行った。
この酵素に対しては、0.1M KCIの効果は認め
られなかった。
られなかった。
(3)SPHについては、751IIMにて(1)のご
とく緩衝液のみを代えて、実施例3に示した反応条件で
0.1M KCIの存在もしくは不存在下で調べた。
とく緩衝液のみを代えて、実施例3に示した反応条件で
0.1M KCIの存在もしくは不存在下で調べた。
結果を第5図に示す。この第5図より明らかなごとく、
C,CH,PTPSおよびSPRは、7付近に至適pH
を有することが分かる。なお、第5図中のプロットの意
味は次の表に示すとおりである。
C,CH,PTPSおよびSPRは、7付近に至適pH
を有することが分かる。なお、第5図中のプロットの意
味は次の表に示すとおりである。
MCI 0.1Mの有無
(+)
緩衝液
・
酢酸ナトリウム
■
口
MES (2−(N−モルホリノ)
エタンスルホン酸)
ム
Δ
リン酸カリウJ、
スルホン酸)
〈
ris
◆
◇
グリシンナトリウム
緩衝液濃度は、G CI(およびPTPSについては5
0mM、SPRについては75mMで試験した。
0mM、SPRについては75mMで試験した。
実施例5 ワンポット法によるB H4の製造下記組成
によりBH4の合成を行った。
によりBH4の合成を行った。
50IIIMリン酸カリウム緩衝液(pH7,0)0.
2mM GTP OoI M 塩化カリウム 43ゝ、− ジチオエリトリトール ADPH MgC+□ DTA 乙1大腸菌由来G CHシクロヒド ロラーゼI ラット肝由来6−ビルボイル テトラヒドロプテリン合成酢 素 ラット赤血球由来セピアプテ リン還元酵素 (″ 反応液中での最終濃度) 0mM 4111M 4111M mM 770μg 96μg/d” 8μg/−− 」1記組成の反応液を作成し、三酵素の混合液を最後に
加え、37°Cにて20分間反応を行い、5mMジチオ
スレイトール(DTT)を含む0.2Nトリクロロ酢酸
を加え遠心後上清を得た。反応生成物は強力カチオンイ
オン交換相FN(ワットマン5CX)4.6X250m
+oカラムを5%メタノールを含むpn3.sのO,1
Mアンモニウム酢酸緩衝液で平衡化し、流速1d/分で
分析した。検出は電気化学検出器を用い300mV電圧
で測定した。その結果を第6図に示す。この分離系に、
1nM DTTを添加することにより、BH4を安定
に分離回収した。
2mM GTP OoI M 塩化カリウム 43ゝ、− ジチオエリトリトール ADPH MgC+□ DTA 乙1大腸菌由来G CHシクロヒド ロラーゼI ラット肝由来6−ビルボイル テトラヒドロプテリン合成酢 素 ラット赤血球由来セピアプテ リン還元酵素 (″ 反応液中での最終濃度) 0mM 4111M 4111M mM 770μg 96μg/d” 8μg/−− 」1記組成の反応液を作成し、三酵素の混合液を最後に
加え、37°Cにて20分間反応を行い、5mMジチオ
スレイトール(DTT)を含む0.2Nトリクロロ酢酸
を加え遠心後上清を得た。反応生成物は強力カチオンイ
オン交換相FN(ワットマン5CX)4.6X250m
+oカラムを5%メタノールを含むpn3.sのO,1
Mアンモニウム酢酸緩衝液で平衡化し、流速1d/分で
分析した。検出は電気化学検出器を用い300mV電圧
で測定した。その結果を第6図に示す。この分離系に、
1nM DTTを添加することにより、BH4を安定
に分離回収した。
上記反応の経時的追跡結果を第7図に示す。出発GTP
からのB H4の収率は、約75%であった。
からのB H4の収率は、約75%であった。
実施例6 ラットGTPシクロヒドロラーゼIの部分配
列の解析 ハタヶヤマら(Hatakeyama、に、。
列の解析 ハタヶヤマら(Hatakeyama、に、。
Ha rada、T、、5uzuk i、s、、Wat
anabe、Y、 、およびKagamiyama、H
,(1989)J、Biol、Chem。
anabe、Y、 、およびKagamiyama、H
,(1989)J、Biol、Chem。
(l↓、21660−21664)の方法で、ラットG
TPシクロヒドロラーゼIを精製し、リジルエンドペプ
チダーゼで分解した(GTPシクロヒドロラーゼI/リ
ジルエンドペプチダーゼ−400/1(モル比)、30
℃、7時間)。分解物は、0.1%トリフルオロ酢酸−
5%アセトニトリルで平衡化した5μm C18カラム
(ナカライテスク社製)を用いた5−40%アセトニト
リルの直線濃度勾配(25°C2流速1.0〆/分、6
0分)の逆相クロマトグラフィーにより分画した(第8
図)。分画されたペプチドの配列は、自動気相蛋白質配
列分析機(アプライド・ハイオシステムズ社製、モデル
470A)を用いて分析した。
TPシクロヒドロラーゼIを精製し、リジルエンドペプ
チダーゼで分解した(GTPシクロヒドロラーゼI/リ
ジルエンドペプチダーゼ−400/1(モル比)、30
℃、7時間)。分解物は、0.1%トリフルオロ酢酸−
5%アセトニトリルで平衡化した5μm C18カラム
(ナカライテスク社製)を用いた5−40%アセトニト
リルの直線濃度勾配(25°C2流速1.0〆/分、6
0分)の逆相クロマトグラフィーにより分画した(第8
図)。分画されたペプチドの配列は、自動気相蛋白質配
列分析機(アプライド・ハイオシステムズ社製、モデル
470A)を用いて分析した。
オリゴデオキシリボヌクレオチドの合
オリゴデオキシリボヌクレオチドをDNA合成機(アプ
ライド・バイオシステムズ社製、モデル381A)を用
い自動ホスホルアミダイト法により製造した。これらオ
リゴヌクレオチドを′F4ポリヌクレオチドキナーゼお
よび〔γ−”PEATPでラベルした。
ライド・バイオシステムズ社製、モデル381A)を用
い自動ホスホルアミダイト法により製造した。これらオ
リゴヌクレオチドを′F4ポリヌクレオチドキナーゼお
よび〔γ−”PEATPでラベルした。
全RNAをラット肝から抽出した(Ch i r gw
in、J、M、、PrzyByla、A、E、。
in、J、M、、PrzyByla、A、E、。
MacDona Id、R,J、’、およびRutte
r、W、J、(1979)Biochemistry
18,5294−5299)。ポリ(八)RNAは抽
出した全RNAをオリゴ(dT)−セルロースクロマト
グラフィーに供して単離した(Δviv、H,,および
Leder、P、(1972)l’roc、Na L
1.AcacL、Sc 1USA、 6−9. 14
08−1412) 、二本鎖CI) N Aは、c D
NA合成キット(ファルマシア・エルゲービー・バイオ
テクノロジ社製)を用いてグブラーおよびホフマンの方
法に従って合成した(Gub I c r、 V、 、
およびI−(offman。
r、W、J、(1979)Biochemistry
18,5294−5299)。ポリ(八)RNAは抽
出した全RNAをオリゴ(dT)−セルロースクロマト
グラフィーに供して単離した(Δviv、H,,および
Leder、P、(1972)l’roc、Na L
1.AcacL、Sc 1USA、 6−9. 14
08−1412) 、二本鎖CI) N Aは、c D
NA合成キット(ファルマシア・エルゲービー・バイオ
テクノロジ社製)を用いてグブラーおよびホフマンの方
法に従って合成した(Gub I c r、 V、 、
およびI−(offman。
B、、J、 (1983)Gene (Amst、)
25.263−269)、平滑末端二本鎖cDNAをR
Na s eTl (0,1ug /■)を追加して用
いた他は、クリックシュタインらの方法に従って生成さ
せた(Klickstein、L、B。
25.263−269)、平滑末端二本鎖cDNAをR
Na s eTl (0,1ug /■)を追加して用
いた他は、クリックシュタインらの方法に従って生成さ
せた(Klickstein、L、B。
およびNeve、R,L (1987)in Cur
rent Protocols in Mo1e
cular Biology(Ausubel。
rent Protocols in Mo1e
cular Biology(Ausubel。
F、M、、Brent、R,、Kingston。
R,E、、Moorc、D、D、、Sc idma4、
不。
不。
n、 J、 G、、 Smi Lh、 J、 A、
、および5truhl、 K、、 eds)、
pp 5. 5. 15、 5. 10. Cr
ccne Publishing As5oc
iates and Wiley −Tnte
rsc:n Cce N Cw Y。
、および5truhl、 K、、 eds)、
pp 5. 5. 15、 5. 10. Cr
ccne Publishing As5oc
iates and Wiley −Tnte
rsc:n Cce N Cw Y。
rk)。cDNAの各平滑末端にE c o RI /
Nowlアダプター(cDNADNA合成フットルマ
シア製)を連結したのち、該cDNAをλZAPrlベ
クターDNA (ストラタジーン社製)のr3coR1
部位に挿入した。得られたライブラリーDNAをGig
apack Gold (ストラタジーン社製)を用
いてin vitroでパッケージングし、大腸菌X
LI−Blueに導入した。
Nowlアダプター(cDNADNA合成フットルマ
シア製)を連結したのち、該cDNAをλZAPrlベ
クターDNA (ストラタジーン社製)のr3coR1
部位に挿入した。得られたライブラリーDNAをGig
apack Gold (ストラタジーン社製)を用
いてin vitroでパッケージングし、大腸菌X
LI−Blueに導入した。
レプリカナイロンフィルター(デュポン−ニューイング
ランド ニュクレアー社製のGeneScreen
Plus)を用い、約3.0XIO5プラークを、5z
p−ラベル化合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングした(Bent。
ランド ニュクレアー社製のGeneScreen
Plus)を用い、約3.0XIO5プラークを、5z
p−ラベル化合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリ
ーニングした(Bent。
n、 W、D、 、およびDavis、 R,W、
(1977)Sc i ence ユ96−.180
−182)。3つのプローブの塩基配列は、後に述べる
ように、GTPシクロヒドロラーゼIのリジルエンドペ
プチダーゼ処理ペプチドのアミノ酸配列から推論される
。1つのタイプのプローブとして、コドン利用分析(L
athe、R,(1985)J、Mol、Biol、1
影3,1−12)に基づき作成された単一の長鎖オリゴ
ヌクレオチドと、他のタイプのプローブとして、全ての
コドンコンビネーションを有する短鎖オリゴヌクレオチ
ドの混合物の2つのタイプのプローブを用いた。レプリ
カナイロンフィルターは、5容量の0.1%ドデシル硫
酸ナトリウム(SDS)を含むSSC(SSC?8液:
0,15M塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウ
ムを含む)、10容量のDenhardt溶液(Den
hardt溶液:0.2%(W/V)のフィコール、ポ
リビニルピロリドン、ウシ胎児血清アルブミンを含む)
および0゜11mg/dの仔牛胸腺DNA (シグマ社
製)の溶液で65°Cで少なくとも3時間前処理をして
用いた。
(1977)Sc i ence ユ96−.180
−182)。3つのプローブの塩基配列は、後に述べる
ように、GTPシクロヒドロラーゼIのリジルエンドペ
プチダーゼ処理ペプチドのアミノ酸配列から推論される
。1つのタイプのプローブとして、コドン利用分析(L
athe、R,(1985)J、Mol、Biol、1
影3,1−12)に基づき作成された単一の長鎖オリゴ
ヌクレオチドと、他のタイプのプローブとして、全ての
コドンコンビネーションを有する短鎖オリゴヌクレオチ
ドの混合物の2つのタイプのプローブを用いた。レプリ
カナイロンフィルターは、5容量の0.1%ドデシル硫
酸ナトリウム(SDS)を含むSSC(SSC?8液:
0,15M塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウ
ムを含む)、10容量のDenhardt溶液(Den
hardt溶液:0.2%(W/V)のフィコール、ポ
リビニルピロリドン、ウシ胎児血清アルブミンを含む)
および0゜11mg/dの仔牛胸腺DNA (シグマ社
製)の溶液で65°Cで少なくとも3時間前処理をして
用いた。
放射線ラベル化オリゴヌクレオチドプローブを前記溶液
に加え、42°Cで一部フイルターをハイブリダイゼー
ションさせた(Maniatis、T、、Fr1tsc
h、E、F、、およびSambrook、J、 (1
982)MolecularCloning:A L
aboratoryManual、Gold Spr
ing [(arbar Laboratory、
Co1d Spring Harbor、NY)。
に加え、42°Cで一部フイルターをハイブリダイゼー
ションさせた(Maniatis、T、、Fr1tsc
h、E、F、、およびSambrook、J、 (1
982)MolecularCloning:A L
aboratoryManual、Gold Spr
ing [(arbar Laboratory、
Co1d Spring Harbor、NY)。
フィルターを長鎖オリゴヌクレオチドを除くために0.
1%SDSを含む0.2容量のSSCで40″Cで洗浄
し、一方、短鎖オリゴヌクレオチドを除くために0゜1
%SDSを含む4容量のSSCで洗浄したのち、オート
ラジオグラフィーに供した。ハイブリダイゼーション−
陽性クローンをプラーク精製し、ファージをストラタジ
ーン・オートマチック・エクシジョン・プロトコール(
SLratageneautomatic exci
sion pr。
1%SDSを含む0.2容量のSSCで40″Cで洗浄
し、一方、短鎖オリゴヌクレオチドを除くために0゜1
%SDSを含む4容量のSSCで洗浄したのち、オート
ラジオグラフィーに供した。ハイブリダイゼーション−
陽性クローンをプラーク精製し、ファージをストラタジ
ーン・オートマチック・エクシジョン・プロトコール(
SLratageneautomatic exci
sion pr。
tocol)に従い、BIuescripL pla
smidに変換した。
smidに変換した。
メン仁緊i−f)Me吐列−q肛折
cDNAインサートをM13ベクターのEc。
R1部位にサブクローニングした(VieiraJ、、
およびMessing、J、(1987)Me t h
、 En z ymo 1. 1−δ↓、 3−1
1)。
およびMessing、J、(1987)Me t h
、 En z ymo 1. 1−δ↓、 3−1
1)。
インサートのヌクレオチド配列を3equence
kit Ver、2.0 (7−der+zadGT
P−edition、United 5tales
Biochcmical)と合成プライマーを用いて
、ジデオキシチェーンターミネーション法によって決定
した(Sanger、F。
kit Ver、2.0 (7−der+zadGT
P−edition、United 5tales
Biochcmical)と合成プライマーを用いて
、ジデオキシチェーンターミネーション法によって決定
した(Sanger、F。
N1cklen、S、、およびCoulson。
A、R,(1977) Proc、Nat 1,Aca
d、Sci、USA 74.5463−5.’167
)。
d、Sci、USA 74.5463−5.’167
)。
コンピューターによる配
cDNA配列から推測されたアミノ酸配列は、クハラら
によって開発されたデータベースシステム(GENAS
) (Kuhara、 S、 、 Matsuo、F、
、Futamura、S、、FugiLa、 A、、
5hinohara、 T、、 ”Fakag
i、T、、および5akaki、Y、(1984)Nu
cleic Ac1ds Res。
によって開発されたデータベースシステム(GENAS
) (Kuhara、 S、 、 Matsuo、F、
、Futamura、S、、FugiLa、 A、、
5hinohara、 T、、 ”Fakag
i、T、、および5akaki、Y、(1984)Nu
cleic Ac1ds Res。
12.89−99Lで、ウィルバーとリップマンのプロ
グラム(Wi I bu r、 W、 、J、、およ
びLipman、D、J、(1983)Proc。
グラム(Wi I bu r、 W、 、J、、およ
びLipman、D、J、(1983)Proc。
Natl、Acad、Sci、USA、80,726−
730)によって修正した。
730)によって修正した。
(結果)
グー2−トーq−TPシクロヒドロラーゼIQ一部分−
η冬−スー酸噂超す 8つのペプチドを単離しく第8図のI〜■)、それらの
完全なまたは部分的なアミノ酸配列を決定した(第10
図に下線で示す)。精製酵素のN末端配列を30残基ま
で決定した: Gly−Phe−Pro−Glu−八rg−Glu−L
eu−Pro−Arg−Pr。
η冬−スー酸噂超す 8つのペプチドを単離しく第8図のI〜■)、それらの
完全なまたは部分的なアミノ酸配列を決定した(第10
図に下線で示す)。精製酵素のN末端配列を30残基ま
で決定した: Gly−Phe−Pro−Glu−八rg−Glu−L
eu−Pro−Arg−Pr。
cry−へ1a−5er−^rg−Pro−八1a−G
lu−Lys−5er−()Pro−Pro−Gln−
Ala−Lys−Gly−八Ia−Gln−Pro−A
la 。
lu−Lys−5er−()Pro−Pro−Gln−
Ala−Lys−Gly−八Ia−Gln−Pro−A
la 。
なお、上記配列の第20番目のアミノ酸はcDNAから
Argであることが決定された(第10図参照)。
Argであることが決定された(第10図参照)。
夏力NA湾」
蛋白質性ペプチドのアミノ酸配列から、ユニクな配列を
持つ3つの単一の長鎖オリゴヌクレオチ ド (5’
−TTCCAGGCATCAGCAGGCTGGGC
ACCTTTGGCTTCAGG (第10図のペプ
チドIと蛋白質N末端配列の一部よりニブローフ゛1
”) ; 5’ −TTGGTGAAGA八CTGC
ATGGへTGTGGCAGCTCTCCATGGGG
T (ペプチド■ニブローフ゛2);5’−八CGCC
AGCAGGCTGCAGGGCCTCTGTGATG
GCCACAGCAATCTG (ペプチド■ニブロ
ーフ゛3)〕および全てのあり得るコドンコンビネーシ
ョンをカバーする2つの短鎖オリゴヌクレオチド混合物
(5’ −TTCCA(G/A/T/C)GC(G/A
)TC(G/A/T/C)GC(ペプチドIニブローフ
゛4 ) ; 5’ −GT(G/A)It八(G/
A)八A (I/C) TGCAT (G/八へT/C
)GC(ペプチド■:)。
持つ3つの単一の長鎖オリゴヌクレオチ ド (5’
−TTCCAGGCATCAGCAGGCTGGGC
ACCTTTGGCTTCAGG (第10図のペプ
チドIと蛋白質N末端配列の一部よりニブローフ゛1
”) ; 5’ −TTGGTGAAGA八CTGC
ATGGへTGTGGCAGCTCTCCATGGGG
T (ペプチド■ニブローフ゛2);5’−八CGCC
AGCAGGCTGCAGGGCCTCTGTGATG
GCCACAGCAATCTG (ペプチド■ニブロ
ーフ゛3)〕および全てのあり得るコドンコンビネーシ
ョンをカバーする2つの短鎖オリゴヌクレオチド混合物
(5’ −TTCCA(G/A/T/C)GC(G/A
)TC(G/A/T/C)GC(ペプチドIニブローフ
゛4 ) ; 5’ −GT(G/A)It八(G/
A)八A (I/C) TGCAT (G/八へT/C
)GC(ペプチド■:)。
ローブ5))を作成した。これらのクローンをラット肝
ポリ(A)“RNA由来のλZAPIlcDNΔライブ
ラリーの約3X105クローンのスクリーニングのため
に用いた。4つのクローンがプローブ2.3および5で
ハイブリダイゼーションされた。短鎖プローブの1つで
あるプローブ4は、λZAPプラークのシグナルが非常
に弱いため検出されず、これらりtl−ンとハイブリダ
イゼーションしなかったと考えられる。また、長鎖オリ
ゴヌクレオチドプローブの1つであるプローブエは、本
プローブの8塩基(21%)が誤って推定され、これら
クローンとハイブリダイゼーションしなかったと考えら
れる。これらクローンを部分的に配列決定し、5′−お
よび3′−非翻訳領域の長さの他は一致することを見出
した。これらクローンのうち最も長鎖のものはポリ(d
A) トラクトを含み、従って本クローンをさらに分
析に供した。
ポリ(A)“RNA由来のλZAPIlcDNΔライブ
ラリーの約3X105クローンのスクリーニングのため
に用いた。4つのクローンがプローブ2.3および5で
ハイブリダイゼーションされた。短鎖プローブの1つで
あるプローブ4は、λZAPプラークのシグナルが非常
に弱いため検出されず、これらりtl−ンとハイブリダ
イゼーションしなかったと考えられる。また、長鎖オリ
ゴヌクレオチドプローブの1つであるプローブエは、本
プローブの8塩基(21%)が誤って推定され、これら
クローンとハイブリダイゼーションしなかったと考えら
れる。これらクローンを部分的に配列決定し、5′−お
よび3′−非翻訳領域の長さの他は一致することを見出
した。これらクローンのうち最も長鎖のものはポリ(d
A) トラクトを含み、従って本クローンをさらに分
析に供した。
浣へなヌクレオチド配J
ラットGTPシクロヒドロラーゼ■のcDNAの一次配
列を第9図に示すストラテジーに従って両鎖について決
定した。その結果を第10図に示す。挿入断片はポリ(
A)゛テイルの8アデニン残基を含む、1024ヌクレ
オチドであった。オープンリーディングフレームは、7
23ヌクレオチドであり、それにつづく3′−非翻訳領
域にば終止コドン’T’ G Aからポリ(八)テイル
まで163ヌクレオチドであった。3′−非翻訳領域の
ポリ(A)テイルから13ヌクレオチド上流にポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルAATAAAがあった。
列を第9図に示すストラテジーに従って両鎖について決
定した。その結果を第10図に示す。挿入断片はポリ(
A)゛テイルの8アデニン残基を含む、1024ヌクレ
オチドであった。オープンリーディングフレームは、7
23ヌクレオチドであり、それにつづく3′−非翻訳領
域にば終止コドン’T’ G Aからポリ(八)テイル
まで163ヌクレオチドであった。3′−非翻訳領域の
ポリ(A)テイルから13ヌクレオチド上流にポリアゾ
ニレ−ジョンシグナルAATAAAがあった。
オープンリーディングフレームは、クローンの配列にお
いて最初のΔTGから開始し、241アミノ酸からなる
ポリペプチドをコードしていた。開始コドン周辺の配列
は、真核生物の開始部位として好ましいとされている配
列(KOZ a k、 M。
いて最初のΔTGから開始し、241アミノ酸からなる
ポリペプチドをコードしていた。開始コドン周辺の配列
は、真核生物の開始部位として好ましいとされている配
列(KOZ a k、 M。
(1984)Nucleic、Ac1ds ReS、
且、857−872)と整合した。ヌクレオチド配列か
ら推定されるアミノ酸配列を第10図に示す。8つの蛋
白質性ペプチドのアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列か
ら推定される配列と一致した。上に示した生成蛋白質の
N末端は、推定されたアミノ酸配列の12〜41番目の
残基と完全に一致した。さらに、精製酵素のアミノ酸組
成は、12〜241番目の残基から推定される配列の組
成とよく一致した(第4表)。
且、857−872)と整合した。ヌクレオチド配列か
ら推定されるアミノ酸配列を第10図に示す。8つの蛋
白質性ペプチドのアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列か
ら推定される配列と一致した。上に示した生成蛋白質の
N末端は、推定されたアミノ酸配列の12〜41番目の
残基と完全に一致した。さらに、精製酵素のアミノ酸組
成は、12〜241番目の残基から推定される配列の組
成とよく一致した(第4表)。
第4表
分析値3)
推定値
アルギニン
リジン
ヒスチジン
アスパラギン酸
アスパラギン
トレオニン
セリン
グルタミン酸
グルタミン
プロリン
グリシン
アラニン
1B、21
11.85
5.25
16.58
11.74
17.00
29.82
1.1.33
18.02
20.98
システィン
バリン
メチオニン
イソロイシン
ロイシン
チロシン
フェニルアラニン
トリプトファン
16.00 17
7.33 9
11.12 12
1.9.62 20
4.11 4
7.96 8
1)アミノ酸分析は蛋白質を110 ”C,24時間の
酸加水分解後、日立L−8500型アミノ酸分析機を用
いて、0−フタルアルデヒドのポストカラムラベル法に
より行った。
酸加水分解後、日立L−8500型アミノ酸分析機を用
いて、0−フタルアルデヒドのポストカラムラベル法に
より行った。
い測定せず。
したがって、ラットGTPシクロヒドロラーゼIば、2
30のアミノ酸残基を有し、計算値として分子量25,
815を有すべきものである;この値は、ハタケヤマら
(前述)によって報告された精製蛋白質の分子量より1
4%小さい。これは、ASn++ GIy+□結合で
の後翻訳による切断が、推定された一次ポリペプチドを
酵素の成熟体に変換するためであろう。この前配列は、
3つの塩基性および1つの酸性残基を有し、ネットで正
荷電しているが、分泌蛋白質のシグナルペプチドに共通
してみられる長い疎水性領域を欠いている。よってこの
前配列の機能は推定できない。他の3つのハイブリダイ
ゼーション−陽性クローンも同様の結果を与えた。
30のアミノ酸残基を有し、計算値として分子量25,
815を有すべきものである;この値は、ハタケヤマら
(前述)によって報告された精製蛋白質の分子量より1
4%小さい。これは、ASn++ GIy+□結合で
の後翻訳による切断が、推定された一次ポリペプチドを
酵素の成熟体に変換するためであろう。この前配列は、
3つの塩基性および1つの酸性残基を有し、ネットで正
荷電しているが、分泌蛋白質のシグナルペプチドに共通
してみられる長い疎水性領域を欠いている。よってこの
前配列の機能は推定できない。他の3つのハイブリダイ
ゼーション−陽性クローンも同様の結果を与えた。
推定された蛋白質配列をナショナル バイオケミカル
リサーチ ファウンデーテヨン(NaLional
Biochemical Re5earch Fo
undation)の蛋白質配列データベースと比較し
たことろ、77〜96のアミノ酸残基がジヒドロホレー
ト還元酵素の高変換領域の残基(Bever ] ey
、S、M、、 EIIenberger、T、E、、お
よびCordingley、J、S−(1986)Pr
oc。
リサーチ ファウンデーテヨン(NaLional
Biochemical Re5earch Fo
undation)の蛋白質配列データベースと比較し
たことろ、77〜96のアミノ酸残基がジヒドロホレー
ト還元酵素の高変換領域の残基(Bever ] ey
、S、M、、 EIIenberger、T、E、、お
よびCordingley、J、S−(1986)Pr
oc。
Na t 1,Acad、Sc i、U、S、A、83
゜2584−2588 ;Grumont、R,、Wa
sht icn、W、L、、CapuL、D、。
゜2584−2588 ;Grumont、R,、Wa
sht icn、W、L、、CapuL、D、。
および5anti、D、V、(1986)Pr。
c、Na L ]、Aca d、Sc i、U、S、A
。
。
8−雄、5387−5391)と有意なホモロジーを有
することを見出した(第11図)。これらの残基は、ジ
ヒドロホレート還元酵素に対するメトトレキセートまた
はジヒドロホレートの結合を引き起ごずことがボリンら
及びマシュースらにより、結晶構造的に同定されている
(Bolin、J。
することを見出した(第11図)。これらの残基は、ジ
ヒドロホレート還元酵素に対するメトトレキセートまた
はジヒドロホレートの結合を引き起ごずことがボリンら
及びマシュースらにより、結晶構造的に同定されている
(Bolin、J。
T 、 、 Fi Iman、 D、
J、 、 Matthews、 D、 A
、 、 I−l−1a i n、 R,C0およびKr
aut、J、(1982)J、Biol、Chem、λ
5−7.13650−13662; Matthew
s、D、A、、Bo I in、J、T、。
J、 、 Matthews、 D、 A
、 、 I−l−1a i n、 R,C0およびKr
aut、J、(1982)J、Biol、Chem、λ
5−7.13650−13662; Matthew
s、D、A、、Bo I in、J、T、。
Burridge、、J、M、、Fi Iman D
。
。
J、、VOIZ、に、W、、Kaufman、B。
T、、Bede I 1,C,R,、Champnes
s、J、N、、Stammers、D、に、。
s、J、N、、Stammers、D、に、。
およびKrauL、J、(1985)J、Bi。
1、Chem、260,381−391)、特に、第1
1図に円で囲って示されるトリプトファンおよびフェニ
ルアラニンは、これらの化合物のプテリン環と相互に作
用する(上記ボリンら及びマシュースらの文献参照)。
1図に円で囲って示されるトリプトファンおよびフェニ
ルアラニンは、これらの化合物のプテリン環と相互に作
用する(上記ボリンら及びマシュースらの文献参照)。
対応トリプトファンおよびフェニルアラニン残基が、G
TPシクロヒドロラーゼIの配列に見出される。GTP
シクロヒドロラーゼ■の活性は、ジヒドロホレート還元
酵素のジヒドロホレートに対するKm値と比較して、そ
れぞれ、12μHおよび170μhのKi値を有するテ
トラヒドロビオプテリンおよびジヒドロホレートのよう
なプテリン類によって阻害され(Shen、 R,、A
I am、 A、 、およびZhang、Y、 (1
988)Biochim、Bi。
TPシクロヒドロラーゼIの配列に見出される。GTP
シクロヒドロラーゼ■の活性は、ジヒドロホレート還元
酵素のジヒドロホレートに対するKm値と比較して、そ
れぞれ、12μHおよび170μhのKi値を有するテ
トラヒドロビオプテリンおよびジヒドロホレートのよう
なプテリン類によって阻害され(Shen、 R,、A
I am、 A、 、およびZhang、Y、 (1
988)Biochim、Bi。
phys、Acta 965.9−15)、ジヒドロ
ホレート還元酵素は、7.8−ジヒドロビオプテリンを
テトラヒドロプテリンに還元する(Kaufman、S
、 (1967)J、Biol。
ホレート還元酵素は、7.8−ジヒドロビオプテリンを
テトラヒドロプテリンに還元する(Kaufman、S
、 (1967)J、Biol。
Chem、242.3934−3943)、ビオプテリ
ンと葉酸塩は、共通のプテリン部分を持つので、これら
の結果は、GTPシクロヒドロラーゼIがジヒドロホレ
ート還元酵素のプテリン結合部位に類似したプテリン結
合部位を有することおよび推定されたアミノ酸配列の7
7〜96番の残基からなる領域がプテリンの結合に応答
可能な部位であることを示唆する。
ンと葉酸塩は、共通のプテリン部分を持つので、これら
の結果は、GTPシクロヒドロラーゼIがジヒドロホレ
ート還元酵素のプテリン結合部位に類似したプテリン結
合部位を有することおよび推定されたアミノ酸配列の7
7〜96番の残基からなる領域がプテリンの結合に応答
可能な部位であることを示唆する。
この結果より推定されたこのプテリン結合部位に部位特
異的変異を行えば、BI3により阻害のかからないラッ
トGTPシクロヒドロラーゼIを遺伝子工学法により作
成できる可能性がある。
異的変異を行えば、BI3により阻害のかからないラッ
トGTPシクロヒドロラーゼIを遺伝子工学法により作
成できる可能性がある。
(発明の効果)
本発明によれば、モノアミン神経伝達物質の欠乏障害に
よる疾患の治療に有用な6−(R)−Lエリスロー5,
6,7,8.−テトラヒドロビオプテリン(BI3)を
簡単な繰作で効率よく製造できる。
よる疾患の治療に有用な6−(R)−Lエリスロー5,
6,7,8.−テトラヒドロビオプテリン(BI3)を
簡単な繰作で効率よく製造できる。
また本発明はBI3の生理機能を理解するうえで有用な
10−ブとしての14Cラベル化B I−T 4の製造
にも有利に利用されうる。
10−ブとしての14Cラベル化B I−T 4の製造
にも有利に利用されうる。
さらに、本発明は、新しい構造(アミノ酸配列)を持つ
酵素を開示したことにより、これらをコードするDNA
をプローブとする本酵素の遺伝子の単離、さらには組換
えDNA技術による本発明の酵素の大量生産の材料もし
くは菌体内で本来菌が生産できないBI3を合成させる
ためのDNAを提供するものである。
酵素を開示したことにより、これらをコードするDNA
をプローブとする本酵素の遺伝子の単離、さらには組換
えDNA技術による本発明の酵素の大量生産の材料もし
くは菌体内で本来菌が生産できないBI3を合成させる
ためのDNAを提供するものである。
第1図は実施例1においてG CHをリジルエンドペプ
チダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマトグラ
フィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図
である。 第2図は実施例2においてP T P Sをリジルエン
ドペプチダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマ
トグラフィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を
示す図である。 第3図は実施例2においてPTPSを■8蛋自分解酵素
で分解した後、C18逆相カラムクロマトグラフィーで
、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図である。 第4図は実施例3においてSPRをリジルエンドペプチ
ダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマトグラフ
ィーで、アセ1−二トリルにより溶出した様子を示す図
である。 第5図AはG CHの至適pi+を示すグラフであり、
第5図BはPTPSの至適piを示すグラフであり、第
5図CはSPRの至適ρ]1を示ずグラフである。 第6図は実施例5におけるワンポット法で合成したB
H4をワットマンSCXカラムで単離した様子を示す図
である。 第7図は実施例5におけるワンポット法でB H4を合
成した際の、原料、中間生成物およびBI3の消長を示
すグラフである。 第8図は実施例6で精製したラッ)GTPシクロヒドロ
ラーゼIをリジルエンドペプチダーゼで分解した後、C
18逆相カラムクロマトグラフィーで、アセトニトリル
により溶出した様子を示す図である。 第9図はラットGTPシクロヒドロラーゼIのcDNA
の一次配列を決定するために用いたストラテジーを示す
図である。 第10図はラットGTPシクロヒドロラーゼ[のcDN
Aの一次配列、および該配列から推定したアミノ酸配列
を示す配列図である。 第11図はラットGTPシクロヒドロラーゼIが、ジヒ
ドロホレート還元酵素のプテリン結合領域の残基と容易
なホモロジーを有することを示す図である。
チダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマトグラ
フィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図
である。 第2図は実施例2においてP T P Sをリジルエン
ドペプチダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマ
トグラフィーで、アセトニトリルにより溶出した様子を
示す図である。 第3図は実施例2においてPTPSを■8蛋自分解酵素
で分解した後、C18逆相カラムクロマトグラフィーで
、アセトニトリルにより溶出した様子を示す図である。 第4図は実施例3においてSPRをリジルエンドペプチ
ダーゼで分解した後、C18逆相カラムクロマトグラフ
ィーで、アセ1−二トリルにより溶出した様子を示す図
である。 第5図AはG CHの至適pi+を示すグラフであり、
第5図BはPTPSの至適piを示すグラフであり、第
5図CはSPRの至適ρ]1を示ずグラフである。 第6図は実施例5におけるワンポット法で合成したB
H4をワットマンSCXカラムで単離した様子を示す図
である。 第7図は実施例5におけるワンポット法でB H4を合
成した際の、原料、中間生成物およびBI3の消長を示
すグラフである。 第8図は実施例6で精製したラッ)GTPシクロヒドロ
ラーゼIをリジルエンドペプチダーゼで分解した後、C
18逆相カラムクロマトグラフィーで、アセトニトリル
により溶出した様子を示す図である。 第9図はラットGTPシクロヒドロラーゼIのcDNA
の一次配列を決定するために用いたストラテジーを示す
図である。 第10図はラットGTPシクロヒドロラーゼ[のcDN
Aの一次配列、および該配列から推定したアミノ酸配列
を示す配列図である。 第11図はラットGTPシクロヒドロラーゼIが、ジヒ
ドロホレート還元酵素のプテリン結合領域の残基と容易
なホモロジーを有することを示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、グアノシン5′−三リン酸(GTP)に、大腸菌由
来GTPシクロヒドロラーゼ1,6−ピルボイルテトラ
ヒドロプテリン合成酵素およびセピアプテリン還元酵素
を作用させることを特徴とする式( I ): ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で示される6−(R)−L−エリスロ−5,6,7,8
−テトラヒドロビオプテリンの製法。 2、大腸菌由来GTPシクロヒドロラーゼIが、アミノ
末端から25番目までのアミノ酸配列が式:【遺伝子配
列があります】 で示され、GTPを特異的にD−エリスロ−7,8−ジ
ヒドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を
有するものである請求項1記載の製法。 3、6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素がラ
ット肝由来であり、アミノ末端から15番目までのアミ
ノ酸配列が式: 【遺伝子配列があります】 で示され、D−エリスロ−7,8−ジヒドロネオプテリ
ントリホスフェートを特異的に6−ピルボイル−5,6
,7,8−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有す
るものである請求項1記載の製法。 4、セピアプテリン還元酵素がラット赤血球由来であり
、部分アミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を有し、6−ピルボイル−5,6,7,8−テトラヒド
ロプテリンを特異的に6−(R)−L−エリスロ−5,
6,7,8−テトラヒドロビオプテリンに変換する能力
を有するものである請求項1記載の製法。 5、アミノ末端から25番目までのアミノ酸配列が式: 【遺伝子配列があります】 で示され、GTPを特異的にD−エリスロ−7,8−ジ
ヒドロネオプテリントリホスフェートに変換する能力を
有する大腸菌由来GTPシクロヒドロラーゼI。 6、アミノ末端から15番目までのアミノ酸配列が式: 【遺伝子配列があります】 で示され、D−エリスロ−7,8−ジヒドロネオプテリ
ントリホスフェートを特異的に6−ピルボイル−5,6
,7,8−テトラヒドロプテリンに変換する能力を有す
るラット肝由来6−ピルボイルテトラヒドロプテリン合
成酵素。 7、部分アミノ酸配列: 【遺伝子配列があります】 を有し、6−ピルボイル−5,6,7,8−テトラヒド
ロプテリンを特異的に6−(R)−L−エリスロ−5,
6,7,8−テトラヒドロビオプテリンに変換する能力
を有するものであるラット赤血球由来セピアプテリン還
元酵素。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP02193359A JP3137333B2 (ja) | 1990-07-21 | 1990-07-21 | テトラヒドロビオプテリンの製法およびそれに用いる酵素 |
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---|---|---|---|
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JP2000035587A Division JP3124967B2 (ja) | 2000-02-14 | 2000-02-14 | テトラヒドロビオプテリンの製造に用いる酵素 |
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---|---|
JPH0482888A true JPH0482888A (ja) | 1992-03-16 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002018587A1 (fr) * | 2000-08-31 | 2002-03-07 | Suntory Limited | Procede de production de biopterines |
KR100456062B1 (ko) * | 2001-06-18 | 2004-11-08 | 박영식 | 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법 |
EP2436379A1 (en) | 2004-11-17 | 2012-04-04 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Stable tablet formulation |
EP2545939A2 (en) | 2007-04-11 | 2013-01-16 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Methods of administering tetrahydrobiopterin, associated compositions, and methods of measuring |
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---|---|---|---|---|
JP6041064B1 (ja) * | 2016-03-14 | 2016-12-07 | 健剛 小山田 | 下駄箱 |
-
1990
- 1990-07-21 JP JP02193359A patent/JP3137333B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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JPWO2002018587A1 (ja) * | 2000-08-31 | 2004-01-15 | 第一サントリーファーマ株式会社 | ビオプテリン類の製造方法 |
US7807421B2 (en) | 2000-08-31 | 2010-10-05 | Asubio Pharma Co., Ltd. | Process for production of biopterin compound |
JP4817590B2 (ja) * | 2000-08-31 | 2011-11-16 | 第一三共株式会社 | ビオプテリン類の製造方法 |
KR100456062B1 (ko) * | 2001-06-18 | 2004-11-08 | 박영식 | 재조합 대장균에 의한 테리딘 화합물의 제조방법 |
EP2436379A1 (en) | 2004-11-17 | 2012-04-04 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Stable tablet formulation |
EP2545939A2 (en) | 2007-04-11 | 2013-01-16 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Methods of administering tetrahydrobiopterin, associated compositions, and methods of measuring |
EP3461503A1 (en) | 2007-04-11 | 2019-04-03 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Methods of administering tetrahydrobiopterin, associated compositions, and methods of measuring |
EP4029519A1 (en) | 2007-04-11 | 2022-07-20 | BioMarin Pharmaceutical Inc. | Tetrahydrobiopterin for treating conditions associated with elevated phenylalanine levels |
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