KR100439928B1 - 면역억제제로서의아스피로클로라인또는그의유도체의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역억제 약제를 제조하기 위한 화학식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
<화학식 I>
상기 식 중에서, R은 수소 또는 염소를 나타낸다.

Description

면역억제제로서의 아스피로클로라인 또는 그의 유도체의 용도{Use of Aspirochlorine or Derivatives Thereof as Immunosuppressive Agents}
본 발명은 화학식 I의 화합물의 면역억제제로서의 신규의 치료 용도에 관한 것이다.
상기 식 중에서, R은 수소 또는 염소이다.
알려진 바와 같이, 면역성은 체내에 존재하는 외래 항원성 물질의 인식과 처리에 관련되어 있다. 통상적으로 항원은 면역계가 "자신이 아님"을, 즉 동물 자신의 성분과 감지가능하게 다르거나 그의 외래 물질임을 인식하는 미립자 물질 (즉, 세포, 박테리아 등) 또는 큰 단백질 또는 다당류 분자의 형태를 하고 있다. 잠재적인 항원은, 세포의 외부 표면에 가장 빈번하게 위치하는 각종 물질, 흔히 단백질일 수 있다. 예를 들면, 잠재적인 항원은 꽃가루 입자, 조직 이식편, 동물 기생충, 바이러스 및 박테리아에서 발견될 수 있다. 일단 항원성 물질이 면역계에 의해 "자신이 아님"으로 인식되면, 자연 (비-특이적) 면역 반응 및(또는) 적응 면역 반응이 개시되고, 특이적 면역 세포, 항체 및 보체계의 작용에 의해 유지된다. 특정 조건 또는 질병 상태 하에서, 동물의 면역계는 자기 자신의 성분을 "자신이 아님"으로 인식하여 "자신"의 물질에 대해 면역 반응을 개시할 수도 있다.
면역 반응은 면역계에 의해 자연 또는 적응 메카니즘을 통해 수행될 수 있고, 이들 각각은 세포-매개 요소 및 체액성 요소 둘 다로 구성되어 있다. 면역 반응에 대한 자연 메카니즘은, 특정 박테리아, 바이러스, 조직 손상 및 다른 항원에 대한 반응에 있어 주로 보체계 및, 대식 세포, 마스트 세포 및 다형핵성 백혈구 (PMN)과 같은 골수 세포가 관여하는 비-특이성 면역 반응에 수반되는 메카니즘을 말한다. 이러한 자연 메카니즘은 자연 면역으로 불리는 메카니즘을 제공한다. 면역 반응에 대한 적응 메카니즘은 "자신이 아님"으로 인식되는 수천개의 상이한 물질에 대해 선택적으로 반응할 수 있는 림프세포 (T 세포 및 B 세포) 및 항체에 의해 매개되는 메카니즘에 관한 것이다. 이러한 적응 메카니즘은 적응 면역으로 불리며 특이적 기억 및 동물 자신의 환경에 적응하여 영구적으로 변경된 반응 패턴을 유발하는 메카니즘을 제공한다. 적응 면역은 림프 세포 및 항체에 의해 따로따로 제공되거나, 보다 통상적으로는, 자연 면역 메카니즘 및 보체계의 골수 세포와 함께 림프세포 및 항체의 상호작용에 의해 제공될 수 있다. 항체는 적응 면역 반응의 체액성 요소를 제공하고 T-세포는 적응 면역 반응의 세포-매개 요소를 제공한다.
더욱 상세하게는, 적응 면역 반응 메카니즘은 B-림프세포 (또는 B-세포)에 의해 분비되는 항체의 특이적 항원에 대한 작용 뿐만 아니라 특이적 항원, B-세포, 다른 T-세포 또는 대식세포에 대한 각종 T-림프세포 (또는 T-세포)의 작용을 수반한다.
세포-매개 면역 반응은 골수 세포 및 림프세포에 의해 분비되는 각종 조절성 전령 화합물을 통하여 T-세포에 의해 조절되고 모니터된다. 이러한 조절성 전령 화합물의 분비를 통해, T-세포는 B-세포, 대식세포, PMN 및 다른 T-세포와 같은 다른 면역 세포의 증식과 활성화를 조절할 수 있다. 예를 들면, 외래 항원과 결합하자마자, 대식세포 또는 다른 항원 제공 세포는 헬퍼 T-세포를 활성화하는 인터루킨-1 (IL-1)을 분비할 수 있다. T-세포는 인터루킨-2 (IL-2)를 비롯한 특정 림포카인, 및 γ-인터페론을 차례로 분비하고, 이들 각각은 세포-매개 면역 반응에 있어서 각종 조절 효과를 나타낸다.
면역계, 특히 세포-매개 면역계의 "자신" 및 "자신이 아닌" 항원을 식별하는 능력은 침입 미생물에 대한 특이적 방어로서의 면역계의 기능을 하는데 중요하다. "자신이 아닌" 항원은 동물 자신의 성분과 감지가능하게 상이한 (또는 그에 대해 외래 물질인), 체내 물질에 대한 항원이고, "자신" 항원은 동물 자신의 성분과 감지가능할 정도로 상이하지 않은 (또는 그에 대해 외래 물질이 아닌) 항원이다. 면역 반응이 질병을 유발할 수 있는 외래 물질에 대한 주요 방어 수단일지라도, 이는 유익한 외래 물질과 유해한 외래 물질을 구별할 수 없어, 이들 모두를 파괴한다.
동종 이식에서나 또는 "이식편 대 숙주" 질환에 있어서와 같이, 유용한 외래조직 또는 장기의 거부 반응을 방지하기 위해 면역 반응을 억제하는 것이 극히 유용한 특정 상황이 있다. 동종 조직 및 장기는 동일한 종의 유전적으로 상이한 성원으로부터의 조직 및 기관이다. "이식편 대 숙주" 질환은 이식된 조직이, 예를 들어 골수 이식에서, 피이식자 자신의 조직에 대해 면역 반응을 일으키는 기증자의 동종 T-세포를 함유하는 경우에 일어난다. 체액성 및 세포-매개 면역 반응 모두가 동종 조직 및 장기의 거부 반응에 중요하다 하더라도, 관여하는 주된 메카니즘은 세포-매개 면역 반응이다. 따라서, 면역 반응의 억제, 보다 상세하게는, 세포-매개 면역 반응의 억제는 동종 조직 및 장기의 이러한 거부 반응을 예방하는 데에 유용할 것이다. 예를 들면, 시클로스포린 A는 동종 이식을 받는 환자의 치료 및 "이식편 대 숙주" 질환에 있어서의 면역억제제로서 현재 사용되고 있다.
알러지 반응의 경우에 있어서와 같이, 개체의 면역학적 반응이 침입 미생물 또는 외래 물질로 인한것 보다 더한 손상이나 고통을 야기하는 시기가 있다. 이러한 경우에는 면역 반응의 억제가 바람직할 것이다.
때때로, 면역학적 메카니즘은 개체 자신의 신체의 특정 부분에 대해 민감해져서 그 부분을 장애하거나 또는 심지어는 파괴를 야기하게 된다. "자신" 및 "자신이 아님"을 구별하는 능력이 손상되면 신체는 그 자신을 파괴하기 시작한다. 이는 류마티즘성 관절염, (인슐린의 분비를 책임지는 랑게르한스섬의 β-세포의 자가면역 파괴를 유발하는) 인슐린-의존성 당뇨병, 특정 용혈성 빈혈, 류마티스열, 갑상선염, 궤양성 대장염, 위근무력증, 사구체신염, 알러지성 뇌척수염, 이따금 바이러스성 감염에 의해 발생하는 계속되는 신경 및 간 파괴, 다발성 경화증 및 전신성홍반성루푸스와 같은 자가면역 질환을 초래할 수도 있다. 몇몇 형태의 자가면역은 눈의 수정체의 신경 조직과 같이 림프세포에 보통은 노출되지 않는 영역의 외상의 결과로서 발생한다. 이러한 영역의 조직이 림프세포에 노출되면, 그의 표면 단백질이 항원으로서 작용하여 항체의 생성 및 세포 면역 반응을 개시하므로 이러한 조직들을 파괴하기 시작할 수 있다. 다른 자가면역 질병은 개체 자신의 조직과 항원으로서 유사한 항원에 노출되어, 그 항원이 개체 자신의 조직과 교차반응한 후 발병된다. 류마티스열은 류마티스열을 야기하는 연쇄상구균성 세균의 항원이 인간의 심장과 교차반응하는 상기 유형 질병의 일례이다. 항체는 세균의 항원과 심장 근육의 항원 및 세포를 구별하지 못하여 이러한 항원 중의 어느 것이라도 그의 작용에 의해 파괴될 수 있다. 이러한 자가면역 질환에 있어서 면역계의 억제는 이 질환의 영향을 최소화하거나 제거하는 데에 있어서 유용할 것이다. 이러한 자가면역 질환 중 몇몇은, 예를 들면, 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증 및 류마티즘성 관절염은 세포-매개 자가면역 반응을 특징으로 하며, T-세포의 작용에 의한 것인 듯하다 (문헌 [Sinha 등, Science248, 1380 (1990)] 참조).
따라서, 면역 반응의 억제는 자가면역 질환으로 고통받는 환자의 치료에 유용할 것이다. 보다 구체적으로, 세포-매개 면역 반응의 억제는 인슐린-의존성 당뇨병, 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염과 같은 T-세포의 작용으로 인한 자가면역 질환으로 고통받는 환자의 치료에 유용할 것이다.
상기 화학식 I로 나타낸, R이 염소인 화합물은 아스피로클로라인으로 알려져 있다.
이 화합물은 미국 특허 제3991052호에 항생제 A-30641로서 기재되어 있고, 그에 기재된 바로는, 상기 화합물은 침지된 호기성 조건하에서, 미생물 균주 아스퍼질러스 타마리 (Aspergillus tamarii) NRRL 8101의 발효로 얻은 복합체의 주성분이다. 미국 특허 제3991052호는 이 화합물의 항진균성 활성을 기재하고 있다.
아스피로클로라인 (문헌 [K. Sakata 등., Agric. Biol. Chem., 47(8), 1983, 2673-2674쪽] 참조)는 가또 (A. Kato) 등의 문헌 [Jour. Antib., 1969, 22, 322-326 쪽]에 기재되어 있는 관용명이 "오리자클로라인"인 항진균성 항생제의 진정한 항균성 성분임이 밝혀졌다. 상기 물질은 아스퍼질러스 오리재 (Aspergillus oryzae) IAM-2613의 발효 브로쓰로부터 단리되었고, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)의 증식을 억제하는 그의 활성이 보고되었으며, 또한 상기 문헌에는 그의 항바이러스성 및 항종양성 활성에 관한 지적도 기재되어 있다.
(A30641로 보고된) 아스피로클로라인의 항진균성 특성은 문헌 [D. H. Berg 등., Jour. Antib., 1976, 29, 394-397 쪽]에 의해 확증되었고, 상기 문헌에서, 또한 저자는 A30641이 주변 항바이러스성 활성을 나타낸다고만 기재하고 있다.
상기 언급된 모든 문헌은 아스피로클로라인의 잘못된 구조를 기재하고 있다. (화학식 I에 나타낸 바와 같이) 올바른 구조는 후에 문헌 [K. Sakata 외., Tetr. Lett., 28, 46 (1987), 5607-5610 쪽]에 지정되었다.
상기 언급된 미생물 발효 과정 이외에도, 아스피로클로라인의 합성을 위한 화학적인 방법은 최근 문헌 [G. F. Miknis 등., J. Am. Soc., 1993, 115, 536-547 쪽]에 개시되었다.
R이 수소인 화학식 I의 화합물 (탈-염소 아스피로클로라인)은 문헌 [K. Sakata 등., Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu (1987), 29, 684-691]에 설명되어 있다 (문헌 [Chem. Abstract, 108, 128151] 참조). 이 화합물은 에이. 오리재의 발효 배지의 할로겐원을 개질함으로써 제조되며, 이는 또한 아스피로클로라인과 유사한 항진균성 활성을 나타낸다.
화학식 I의 화합물이 면역억제 활성을 갖는다는 것이 이제 발견되었다.
본 발명의 화합물의 면역억제 활성은, 일차적인 인간의 T-세포에 있어서 IL-2 수용체 (IL-2R)의 발현을 콘카나발린 A (Con A)에 의해 유도하여 IL-2 수용체 발현 억제 퍼센트로서 면역억제 활성을 나타내는 표준 면역학적 시험으로 증명할 수 있다.
탈-염소 아스피로클로라인에 대한 IC50값은 0.1 ㎍/㎖ 보다 약간 높은 반면, 아스피로클로라인의 경우는 0.1 ㎍/㎖ 보다 낮은 IC50값이 결정되었다.
상기 활성의 관점에서 볼 때, 화학식 I의 화합물은, 특히 세포-매개 면역을 억제하는, 면역억제 약제의 제조에 사용할 수 있다.
따라서, 화학식 I의 화합물을 함유하는 면역억제 약제 조성물은, 상기 언급된 바와 같은 자가면역 질환, 알러지 반응 및 "이식편 대 숙주" 질병과 같이 변경된 면역학적 적응 반응과 관련된 질환의 치료에 특히 유용하다. 이러한 제형은 이러한 질환으로 고통받는 환자의 증상의 더 이상의 열화 또는 악화를 예방 또는 억제하는데 특히 효과적일 것이다. 또한, 상기 면역억제 약제 조성물은, 원치않는면역학적 반응을 예방하기 위해, 동종 조직 또는 장기를 이식받았거나 받을 예정인 환자의 예방 치료에 있어서도 유용할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "환자"는, 자가 면역 질환 또는 "이식편 대 숙주" 질환과 같은 질환으로 고통받거나, 조직이식된 동종 조직 또는 장기의 거부반응의 위험에 처해있는 포유류와 같은 온혈 동물을 의미한다. 인간, 애완용 동물, 마우스 및 래트가 상기 용어 "환자"의 범위에 포함됨은 물론이다.
표준 임상 또는 실험실 시험 및 방법을 기준으로 하여, 당 업계의 숙련자로서의 담당 진단 전문 의사는 화학식 I의 화합물과 같은 면역억제제로의 치료를 필요로 하는 환자들을 쉽게 구별할 수 있을 것이다.
화학식 I의 화합물의 유효량은, 환자에게 1회 또는 다회 투여량 투여 후에 면역억제 효과, 보다 상세하게는 세포-매개 면역억제 효과를 제공하는데 유효한 양이다. 면역억제 효과는 면역 반응 또는 세포-매개 면역 반응의 더 이상의 발현을 지체, 차단, 억제 또는 예방하는 것을 의미한다.
화학식 I의 화합물의 유효 면역억제량은, 당 업계의 숙련자로서의 담당 진단 전문 의사가, 공지된 기술 및 유사 환경하에서 얻은 관찰 결과를 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 유효량 또는 1회 투여량의 결정에는, 담당 진단 의사가, 포유류의 종; 그의 크기, 나이 및 일반적인 건강; 연관된 특별한 질병; 질병의 연관도 또는 심각한 정도; 각 환자의 반응; 투여하는 특정 화합물; 투여 방식; 투여한 제제의 생체내 이용능 특성; 선택된 투여 계획; 수반된 약물 처리의 사용 여부; 및 다른 관련된 환경을 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 여러 요소들을 고려한다.
화학식 I의 화합물의 면역억제 유효량은 1일당 체중 1㎏당 약 0.1 ㎎ (0.1 ㎎/㎏/일) 내지 약 100 ㎎/㎏/일로 변할 것이다. 바람직한 양은 약 0.5 내지 약 10 ㎎/㎏/일일 것이다.
화학식 I의 화합물을 포함하는 약제 조성물은 상기 화합물을 유효량으로 생체내에서 이용가능하게 하는, 경구적 또는 비경구 경로를 비롯한 어떠한 형태 또는 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구로, 피하로, 근육 내로, 정맥 내로, 경피적으로, 비강내로, 직장내로 등으로 투여할 수 있다. 경구적 투여가 통상적으로 바람직하다. 제형을 제조하는 당 업계의 숙련자는 선택된 화합물의 특성, 치료해야 할 질병의 상태, 질병의 단계 및 다른 관련 환경에 따라 적당한 형태 및 투여 방식을 쉽게 선택할 수 있다.
상기 화합물은 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 조합된 약제 조성물의 형태로 투여할 수 있고, 상기 담체 또는 부형제의 비율 및 성질은 선택된 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 및 표준 제약학적 관례에 의해 결정된다.
상기 약제 조성물은 제약 기술 분야에 잘 알려진 방법으로 제조한다. 담체 또는 부형제는 고형, 반-고형, 또는 액체형 물질일 수 있고, 이는 유효 성분에 대한 부형약 또는 매질로서 기능한다. 적당한 담체 또는 부형제는 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이 약제 조성물은 경구적 또는 비경구적 사용에 맞출 수 있고, 환자에게 정제, 캡슐제, 좌약, 용액제, 현탁액제 등의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물은, 예를 들면, 불활성 희석제 또는 식용 담체와 함께, 경구로 투여할 수 있다. 이 화합물은 젤라틴 캡슐 중에 담거나 정제로 압축시킬 수도 있다. 경구 치료 투여를 위해, 상기 화합물은 부형제와 함께, 정제, 트로키, 캡슐제, 엘릭시르제, 현탁액제, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 형태로 사용할 수 있다. 이러한 제제들은 본 발명의 화합물, 즉 유효 성분을 최소 4 % 함유해야하나, 구체적인 형태에 따라 변할 수 있고 편리하게는 단위 제제 중량의 4 % 내지 약 70 %일 수 있다. 조성물 내에 존재하는 화합물의 양은 적정 투여량이 얻어지는 정도이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 및 제제는 경구 투약 단위 형태가 본 발명의 화합물을 5.0 내지 300 ㎎ 함유하도록 제조한다.
정제, 환약, 캡슐제, 트로키 등은 또한 하기 보조약을 1 종 이상 함유할 수 있다: 미정질 셀룰로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토오스와 같은 부형제; 알긴산, 프리모겔 (Primogel) (등록 상표), 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스 (Sterotex) (등록 상표)와 같은 윤활제; 콜로이드질 이산화 규소와 같은 활택제; 및 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제를 첨가할 수도 있거나 박하, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미료와 같은 향미제를 첨가할 수도 있다. 단위 제형이 캡슐일 경우, 상기 유형의 물질 이외에도, 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방 오일과 같은 액상 담체를 함유할 수도 있다. 또 다른 단위 제형은, 예를 들면 코팅과 같이 단위 제형의 물리적인 형태를 개질하는 상이한 각종 물질을 함유할 수 있다. 따라서, 정제 또는 환약은 설탕, 셸락 또는 다른 장용피제로 코팅할 수 있다. 시럽은, 본 발명의 화합물에 추가하여, 감미제로서의 설탕 및 특정 보존제, 염료 및 착색제 및 향미료를 함유할 수 있다. 이러한 각종 조성물의 제조에 사용되는 물질은 제약학적으로 순수하고사용량에서 비독성이어야 한다.
비경구적 치료 투여를 위해서는, 화학식 I의 화합물은 용액 또는 현탁액으로 만들 수도 있다. 이러한 제제는 본 발명의 화합물을 최소 0.1 % 이상 함유하여야 하나, 제제의 중량의 0.1 내지 약 50 %로 변할 수도 있다. 이러한 조성물 중에 존재하는 본 발명의 화합물의 양은 적당한 투여량이 얻어지는 정도여야 한다. 바람직한 조성물 및 제제는 단위 비경구 제형이 화학식 I의 화합물을 5.0 내지 100 ㎎ 함유하도록 제조한다.
또한, 상기 용액 및 현탁액은 하기 보조약을 1종 이상 포함할 수 있다: 주사용수, 염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 무균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산 나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌 디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화 나트륨 또는 데스트로스와 같은 장성 (tonicity) 조절제. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사 또는 유리 또는 플라스틱제 다회 투여 바이알 내에 밀봉할 수 있다.
화학식 I의 화합물의 면역억제 활성을 결정하기 위해, 하기 프로토콜을 사용할 수 있으며, 여기서, IL-2 수용체 (IL-2R)의 발현은 일차적인 인간 T-세포 중에서 콘카나발린 A (Con A)로 유도된다. 그 다음, 화학식 I의 화합물의 면역억제 활성은 T-세포에서 IL-2R 발현의 억제 퍼센트로서 주어진다.
1) T-세포 제조 방법:
인간의 말초 혈액 림프세포 (PBLs)를 히스토-파크-1077 (시그마) [Histo-Paque-1077 (Sigma)]를 사용하여 (0.01 % M 시트르산 나트륨 중의) 혈액 샘플 200 ㎖로부터 단리하였다. 이 혈액을 행크스 평형 염수 (시그마) [Hanks' Balanced Salt Solution (Sigma)]로 1:1로 희석하고, 희석한 혈액 10 ㎖를 50 ㎖ 튜브 (팔콘사 제품, 폴리프로필렌) 중의 히스토-파크-1077 10 ㎖ 위에 깔았다. 행크스 용액 및 히스토-파크는 실온에 있어야 한다. 튜브를 실온에서 30 분간 1400 RPM에서 원심분리하였다. 혈청을 제거하고 경계면에서 회수한 세포를 둘베코 인산 완충 염수 [Dulbecco's Phosphate Buffered Saline; 깁코 (Gibco) BRL사 제품, DPBS]로 세척하고, 1400 RPM에서 5 분 동안 원심 분리하고 DPBS로 다시 세척하였다. 세포들을 계수하고 RPMI 1640 (깁코 BRL사 제품) 중에 2×106세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포 용액 2㎖를 6개의 웰 플레이트 [팔콘사 (Falcon) 제품, 조직 배양 등급]의 각각의 웰에 배치하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 상청액을 제거하고 저장하였다. 점착성 대식세포 층을 DPBS로 2회 세척하고, 플레이트를 가볍게 두드려 이 층 위에 침강된 비점착성 세포를 제거하였다. 상청액 및 세척액을 모아서, 원심분리하고, 계수하고, 10 % 우태아 혈청 [히클론사 (Hyclone) 제품, FCS]을 포함한 RPMI 1640, 5×10-5M 2-메르캅토에탄올 (시그마, 2-ME), 2 mM L-글루타민 (깁코 BRL 사 제품), 100 U/㎖ 페니실린 (깁코 BRL사 제품), 100 U/㎖ 스트렙토마이신 (깁코 BRL사 제품) 및 1 mM HEPES 완충액 [리서치 오가닉스사 제품 (Research Organics)] 중에 2.0×106세포/㎖로 재현탁시켰다.
2) 세포 배양
인간의 T-세포를 2 ㎖/웰 부피의 24개의 웰 플레이트 (팔콘사 제품, 조직 배양 등급) 중에서 배양하였다. 대조군에는 Con A가 없는 것 (0 % IL-2R 발현)과, Con A (시그마) 2.5 ㎍/㎖가 포함된 것 (100 % IL-2R 발현)이 있다. 본 발명의 화합물을 각각의 웰에 해당 농도 (1, 10, 100 및 1000 ㎍/㎖)의 DMSO 용액 20 ㎕를 첨가하여, 0.01, 0.1, 1.0 및 10.0 ㎍/㎖의 농도로 시험하였다; 본 발명의 시험 화합물이 없는 군에도 DMSO 20 ㎕를 첨가하여, 모든 군이 DMSO를 동일한 양으로 함유하도록 한다.
상기 플레이트를 5 % CO2중에서 37 ℃에서 96 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포들을 거두고 강한 피펫팅을 이용하여 웰을 RPMI로 2회 세척하였다. 세포들을 1400 RPM에서 5 분 동안 원심분리하였다.
3) IL-2 수용체 (IL-2R)에 대한 염색:
상청액을 제거하고, 펠렛을 DPBS 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 대조군의 샘플을 2개의 샘플로 나누어, 하나는 플루오레세인-표지된 마우스 IgGl (중복기준 대조군) 10 ㎕로 염색하였다. 나머지 세포들은 플루오레세인-표지된 항-IL-2R (쿠울터사 제품) 10 ㎕로 염색하였다. 4 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. DPBS 1 ㎖를 첨가하고 1400 RPM에서 5 분 동안 원심분리하여 과잉의 항체를 세척하여 제거하였다. DPBS 0.5 ㎖ 중에 재현탁시키고, 유동세포광도측정 분석법을 할 때까지 4℃에서 보관하였다.
4) 유동세포광도측정 분석법 (flow cytometry analysis):
분석은 488 ㎚ 레이저를 사용하여 쿠울터 ELITE 유동세포광도측정기로 수행하였다. 양성 셀 커서는 중복기준 대조군에 맞추었다. 각각의 샘플에 대해 최소 104개의 세포를 분석하였다. 쿠울터 멀티그래프 소프트웨어를 사용하여 히스토그램 자료를 분석하였다.
그 결과는, 하기 표 1에 기재된 바와 같이, Con A 활성제 (발현 100 %)만을 갖는 T-세포의 발현에 대하여, 면역억제 활성의 양을 증가시키면서 그의 존재하의 T-세포로부터 발현된 IL-2의 퍼센트로 기재하였다.
IL-2R 발현의 억제
화합물 농도 (㎍/㎖) IL-2R 발현 %
아스피로클로라인 0.010.11.0 93.534.823.6
탈-염소 아스피로클로라인 0.010.11.0 90.555.828.8

Claims (7)

  1. 화학식 I의 화합물을 함유하는 면역억제용 약제.
    <화학식 I>
    상기 식 중에서, R은 수소 또는 염소를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 세포-매개 면역성 억제에 유용한 약제.
  3. 제1항에 있어서, 동종이식편의 거부 반응 치료에 유용한 약제.
  4. 제1항에 있어서, 자가면역 질병의 치료에 유용한 약제.
  5. 제1항에 있어서, 인슐린-의존성 당뇨병의 치료에 유용한 약제.
  6. 제1항에 있어서, 다발성 경화증의 치료에 유용한 약제.
  7. 제1항에 있어서, 류마티즘성 관절염의 치료에 유용한 약제.
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