NO305207B1 - Nye trans-syklopentanylpurinanaloger som er anvendbare som immunoundertrykkende midler - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår visse trans-syklo-pentanylpurinanaloger som er anvendbare som immunoundertrykkende midler.

Immunitet angår gjenkjennelse og ødeleggelse av fremmed antigenisk materiale som er til stede i kroppen. Typisk er antigenene i form av partikkelformig materiale

(dvs. celler, bakterier, etc.) eller større protein- eller polysakkaridmolekyler som gjenkjennes av immunsystemet som "ikke-egne", dvs. påvisbart forskjellige eller fremmede for dyrets egne bestanddeler. Potensielle antigener kan være et utall substanser, ofte proteiner, som mest typisk er lokal-isert på de ytre celleoverflatene. Eksempelvis kan potensielle antigener finnes på pollenkorn, vevtransplantater, animalske parasitter, virus og bakterier. Så snart det antigeniske materiale er gjenkjent som "ikke-egent" av immunsystemet, kan naturlige (ikke-spesifikke) og/eller adaptive immunresponser initieres og opprettholdes ved virkningen av spesifikke immunceller, antistoffer og komplementsystemet. Under visse betingelser, innbefattende visse sykdomstilstander, vil et dyrs immunsystem gjenkjenne dets egne bestanddeler som "ikke-egne" og initiere en immunrespons mot "eget" materiale .

En immunrespons kan utføres av immunsystemet ved hjelp av naturlige eller adaptive mekanismer som hver er sammensatt av både celleformidlede og humorale elementer. Naturlige mekanismer for immunrespons angir de mekanismer som er involvert i hovedsakelig ikke-spesifikke immunreaksjoner som innbefatter komplementsystemet og myeloidceller alene, slik som makrofager, mastceller og polymorfonukleære leuko-cytter (PMN) ved å reagere på visse bakterier, virus, vevskade og andre antigener. Disse naturlige mekanismer tilveiebringer hva som er angitt som en naturlig immunitet. Adaptive mekanismer for immunrespons angir de mekanismer som formidles av lymfocytter (T- og B-celler) og antistoffer som kan reagere selektivt på tusener forskjellige materialer gjenkjent som "ikke-egne". Disse adaptive mekanismer tilveiebringer hva som er angitt som adaptiv immunitet og fører til en spesifikk hukommelse og et permanent forandret mønster for respons til-passet dyrets eget miljø. Adaptiv immunitet kan tilveiebringes av lymfocyttene og antistoffene alene, eller kan vanligere tilveiebringes av interaksjonen av lymfocytter og antistoffer med komplementsystemet og myeloidceller av de naturlige immunitetsmekanismer. Antistoffene tilveiebringer det humorale element av den adaptive immunrespons, og T-cellene tilveiebringer det celleformidlede element av den adaptive immunrespons .

Naturlige mekanismer av immunrespons innbefatter fagocytose av makrofager og PMN hvorved fremmed materiale eller antigen oppslukes og ødelegges av disse celler. I tillegg kan makrofager drepe enkelte fremmede celler ved sine cytotoksiske effekter. Komplementsystemet som også er involvert i naturlig immunitet, utgjøres av forskjellige peptider og enzymer som kan angripe fremmed materiale eller antigen og derved aktivere fagocytose av makrofager og PMN, eller mulig-gjøre at cellelyse eller inflammatoriske effekter finner sted.

Adaptive mekanismer av immunrespons innbefatter virkningene mot spesifikke antigener av antistoff utskilt av B-lymfocytter (eller B-celler) så vel som virkningene av forskjellige T-lymfocytter (eller T-celler) på et spesifikt antigen, på B-celler, på andre T-celler og på makrofager.

Antistoffer som er ansvarlige for det humorale aspekt ved adaptiv immunitet, er serumglobuliner utskilt av B-celler med et vidt område av spesifisitet for forskjellige antigener. Antistoffer utskilles i respons på gjenkjennelsen av spesifikke antigener og tilveiebringer et utall beskytt-ende responser. Antistoffer kan binde til og nøytralisere bakterielle toksiner og kan binde til overflaten av virus, bakterier eller andre celler gjenkjent som "ikke-egne" og derved aktivere fagocytose med PMN og makrofager. I tillegg kan antistoffer aktivere komplementsystemet som øker immunresponsen mot det spesifikke antigen ytterligere.

Lymfocytter er små celler som finnes i blodet og som sirkulerer fra blodet gjennom vevet og tilbake til blodet via lymfesystemet. Det er to hovedsubpopulasjoner av lymfocytter kalt B-celler og T-celler. B-celler og T-celler er begge av-ledet fra den samme lymfoide stamcelle hvor B-cellene differensieres i benmargen og T-cellene differensieres i tymus. Lymfocyttene utviser visse begrensede reseptorer som tillater hver celle å svare på et spesifikt antigen. Dette tilveiebringer basis for spesifisiteten av den adaptive immunrespons. I tillegg har lymfocytter en relativt lang levetid og har evnen til å proliferere klonisk etter å ha mottatt det riktige signal. Denne egenskap tilveiebringer basisen for hukommelsesaspektet av den adaptive immunrespons.

B-celler er de lymfocytter som er ansvarlige for det humorale aspekt ved adaptiv immunitet. I respons på gjenkjennelse av et spesifikt, fremmed antigen vil en B-celle utskille et spesifikt antistoff som binder til dette spesifikke antigen. Antistoffet nøytraliserer antigenet i tilfelle av toksiner, eller aktiverer fagocytose i tilfelle av andre antigener. Antistoffene er også involvert i aktiveringen av komplementsystemet som ytterligere opptrapper immunresponsen mot det invaderende antigen.

T-celler er de lymfocytter som er ansvarlige for det celleformidlede aspekt ved adaptiv immunitet. Det er tre hovedtyper av T-celler, dvs. de cytotoksiske T-celler, hjelper-T-celler og suppressor-T-celler. De cytotoksiske T-celler påviser og ødelegger celler infisert med et spesifikt virusantigen. Hjelper-T-celler har et utall regulerende funksjoner. Etter identifisering av et spesifikt antigen kan hjelper-T-celler aktivere eller øke en antistoffrespons på antigenet med den egnede B-celle, og de kan aktivere eller øke fagocytose av antigenet av makrofager. Suppressor-T-celler har den effekt at de undertrykker en immunrespons rettet mot et bestemt antigen.

Den celleformidlede immunrespons reguleres og overvåkes av T-cellene gjennom et utall regulerende bud-bringerforbindelser utskilt av de myeloide celler og lymfo-cyttcellene. Gjennom sekresjon av disse regulerende bud-bringerforbindelser kan T-cellene regulere proliferering og aktivering av andre immunceller slik som B-celler, makrofager, PMN og andre T-celler. Etter binding av et fremmed antigen kan eksempelvis en makrofag eller annen antigenpresenterende celle, utskille interleukin-1 (IL-1) som aktiverer hjelper-T-cellene. T-celler i sin tur utskiller visse lymfokiner, innbefattende interleukin-2 (IL-2) og7-interferon, som hvert har et utall regulerende effekter i den celleformidlede immunrespons. Lymfokiner er en stor familie av molekyler produsert av T-celler (og enkelte ganger B-celler) innbefattende IL-2 som aktiverer den klonale proliferering av T-celler; MAF eller makrofagaktiveringsfaktor som øker mange makrofagfunksjoner innbefattende fagocytose, intra-cellulær dreping og sekresjon av forskjellige cytotoksiske faktorer; NAF eller nøytrofil aktiveringsfaktor som øker mange funksjoner av PMN innbefattende fagocytose, oksygen-radikalproduksjon, bakteriedreping, forøket kjemo-taksis og forøket cytokinproduksjon; MIF eller makrofag migreringsfaktor som ved begrens-ning av bevegelsen av makrofager konsentrerer disse i nærheten av T-cellen; •y-interferon som produseres av aktivert T-celle og som er i stand til å produsere et vidt område av effekter på mange celler innbefattende inhibering av virusreplikasjon, fremkallelse av ekspresjon av histoforenlighetsmolekyler av klasse II som tillater disse celler å bli aktive i antigenbinding og presentasjon, aktivering av makrofager, inhibering av cellevekst, fremkallelse av differensiering av et utall myeloide cellelinjer.

Aktiverte makrofager og PMN som tilveiebringer en forøket immunrespons som en del av den celleformidlede, adaptive immunitet, erkarakterisertsom å ha forøket produksjon av reaktive oksygenmellomprodukter. Denne forøkede produksjon av reaktive oksygenmellomprodukter, eller respiratoriske anfall, er kjent som "priming". Visse lymfokiner slik som7-interferon, utløser dette respiratoriske anfall av reaktive oksygenmellomprodukter i makrofager og PMN. Således tilveiebringer lymfokiner, slik som7-interferon, som utskilles av T-cellene, en aktivering av disse makrofager og PMN som resulterer i en forøket, celleformidlet immunrespons.

Immunresponsen kan tilveiebringe en umiddelbar eller forsinket type respons. Hypersensitivitet av forsinket type er en inflammatorisk reaksjon som oppstår i immunreaktive pasienter innen 24-48 timer etter utfordring med antigen og er primært resultatet av en celleformidlet immunrespons. Derimot er hypersensitivitet av umiddelbar type slik som den som ses i anafylaktiske eller Arthus-reaksjoner, en inflammatorisk reaksjon som oppstår i immunreaktive pasienter i løpet av minutter til noen få timer etter utfordring med antigen og er primært resultatet av humoral eller antistoff-formidlet immunrespons.

Immunsystemets evne, og i særdeleshet det celleformidlede immunsystem, til å skille mellom "egne" og "ikke-egne" antigener, er avgjørende for funksjoneringen av immunsystemet som et spesifikt forsvar mot invaderende mikro-organismer. "Ikke-egne" antigener er de antigener eller substanser i kroppen som påvisbart er forskjellige eller fremmede for dyrets egne bestanddeler. "Egne" antigener er de antigener som ikke er påvisbart forskjellige eller fremmede for dyrets egne bestanddeler. Selv om immunresponsen er et hovedforsvar mot fremmede substanser som kan forårsake sykdom, kan den ikke skjelne mellom nyttige og skadelige, fremmede substanser og ødelegger begge.

Det er visse situasjoner slik som med et allogenisk transplantat eller i "transplantat versus vert"-sykdommer hvor det vil være uhyre nyttig å undertrykke immunresponsen for å forhindre avstøtning av nyttig, fremmed vev eller organer. Allogenisk vev og organer er vev og organer fra et genetisk forskjellig medlem av den samme art. "Transplantat versus vert"-sykdommer oppstår hvor det transplanterte vev, f.eks. i en benmargstransplantasjon, inneholder allogeniske T-celler fra giveren som forårsaker en immunrespons mot mottagerens eget vev. Selv om både humorale og celleformidlede immunresponser spiller en rolle ved avstøtning av allogenisk vev og organer, er den involverte primærmekanisme den celleformidlede immunrespons.Undertrykkelse av immunresponsen, og i særdeleshet undertrykkelse av celleformidlet immunrespons, vil således være anvendbar til å forhindre en slik avstøtning av allotransplantatvev og -organer. Eksempelvis anvendes syklosporin A for tiden som et immunoundertrykkende middel ved behandling av pasienter som mottar allogeniske trans-plantater og i "transplantat versus vert"-sykdommer.

Det er tilfeller hvor individets immunologiske respons forårsaker mer skade eller ulempe enn de invaderende mikrober eller fremmed materiale, slik som i tilfelle med allergiske reaksjoner. Undertrykkelse av immunresponsen i disse tilfeller vil være ønskelig.

Leilighetsvis blir de immunologiske mekanismer sensi-bilisert i en viss grad av individets egen kropp som forårsaker interferens med eller til og med destruksjon av denne del. Evnen til å skjelne mellom "egen" og "ikke egen" svekkes og kroppen begynner åødelegge seg selv. Dette kan resul-tere i en autoimmun sykdom slik som reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus (som innbefatter autoimmun destruksjon av J5-cellene av Langerhans-øyene som er ansvarlige for sekresjon av insulin), visse hemolytiske anemier, giktfeber, tyroiditt, ulcerøs kolitt, myastenia gravis, glomerulonefritt, allergisk encefalomyelitt, kontinuerlig nerve- og leverødeleggelse som enkelte ganger følger viral hepatitt, multippel sklerose og systemisk lupus erytematosus. Enkelte former for autoimmunitet oppstår som et resultat av traume på et område som vanligvis ikke eksponeres overfor lymfocytter, slik som neuralt vev eller øyelinsen. Når vevet i disse områder eksponeres mot lymfocytter, kan deres over-flateproteiner virke som antigener og utløse produksjon av antistoffer og cellulære immunresponser som deretter begynner å ødelegge disse vev. Andre autoimmune sykdommer utvikles etter eksponering av individet mot antigener som er antigenisk like, dvs. kryssreagerer med, individets eget vev. Giktfeber er et eksempel på denne type sykdom hvori antigenet av den streptokokkale bakterie som forårsaker giktfeber, er kryss-reaktivt med deler av det humane hjerte. Antistoffene kan ikke differensiere mellom de bakterielle antigener og hjerte-muskelantigenene og celler med hvilke som helst av disse antigener kan ødelegges. Undertrykkelse av immunsystemet i disse autoimmune sykdommer vil være anvendbar til å minimere eller eliminere effektene av sykdommen. Visse av disse autoimmune sykdommer, f.eks. insulinavhengig diabetes mellitus, multippel sklerose og reumatoid artritt, erkarakterisertsom å være resultatet av en celleformidlet autoimmunrespons og synes å skyldes virkningen av T-celler [se Sinha et al., Science 248, 1380 (1990)]. Andre, slik som myastenia gravis og systemisk lupus erytematosus, erkarakterisertsom å være resultatet av en humoral autoimmunrespons [Id.].

Undertrykkelse av immunresponsen vil således være anvendbar ved behandling av pasienter som lider av autoimmune sykdommer. Nærmere bestemt vil undertrykkelse av celleformidlet immunrespons således være anvendbar ved behandling av pasienter som lider av autoimmune sykdommer som skyldes virkningen av T-celler, slik som insulinavhengig diabetes mellitus, multippel sklerose og reumatoid artritt. Undertrykkelse av humoral immunrespons vil være anvendbar ved behandling av pasienter som lider av T-celle-uavhengige auto-immunsykdommer slik som myastenia gravis og systemisk lupus erytematosus.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye forbindelser som erkarakterisert vedat de har formelen

hvori

substituenten i 3-stilling på syklopentanylringen er i trans-konfigurasjon i forhold til den bisykliske substituent,

Y3, Y5, Y7og Y9er hver nitrogen, og Y8er en CH-gruppe,

R er hydrogen,

Q er NH2, og

Z er hydrogen eller NH2;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I tillegg tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et farmasøytisk preparat omfattende en effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse av formel (1) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere farma-søytisk akseptable bærere eller eksipienser.

Som anvendt her, angir uttrykket "farmasøytisk akseptable salter" syreaddisjonssalter av forbindelsene av formel (1) hvori toksisiteten av forbindelsen ikke økes sammenlignet med ikke-saltet. Representative eksempler på farmasøytisk akseptable salter som fremstilles ved behandling av forbindelsene av formel (1) med de tilsvarende syrer, er: hydrobromid, hydroklorid, salter med svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, maursyre, eddiksyre, propionsyre, ravsyre, glykolsyre, melkesyre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, a-ketoglutarsyre, glutaminsyre, asparaginsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre, pyruvsyre, fenyleddiksyre, benzosyre, para-aminobenzosyre, antranilsyre, para-hydroksybenzosyre, salisylsyre, para-aminosalisylsyre, metansulfonsyre, etansul-fonsyre, hydroksyetansulfonsyre, etylensulfonsyre, halo-benzensulfonsyre, toluensulfonsyre, naftalensulfonsyre og sulfanilsyre. Hydrokloridet er foretrukket som et farmasøyt-isk akseptabelt salt av forbindelsene av formel (1).

Det skal forstås at substituentene på cyklopentanyl-ringen av forbindelsene av formel (1) har en transkonfigura-sjon i forhold til den bisykliske substituent. Det skal enn videre forstås at forbindelsene av formel (1) kan foreligge i stereoisomere konfigurasjoner. Forbindelsene av formel (1) omfatter og innbefatter både de individuelle stereoisomerer og racemiske blandinger.

En generell synteseprosedyre for fremstilling av forbindelser av formel (1) hvori Y9er nitrogen, er angitt i reaksjonsskjema A.

1-hydroksygruppen av cis-3-acetoksysyklopentan-l-ol

derivatiseres med en egnet, forlatende gruppe (L) i trinn a i reaksjonsskjerna A. Den bestemte forlatende gruppe kan være én av mange som er velkjente innen faget. Representative eksempler på egnede, forlatende grupper er brosyl, tosyl, mesylat.

Den foretrukne, forlatende gruppe for trinn a er mesylatet.

I trinn b fortrenges den forlatende gruppe av syklo-pentanderivatene dannet i trinn a, med denønskede nukleosid-base under dannelse av den trans-karbosykliske nukleosid-analog. Den foretrukne base for trinn b er adenin.

I trinn c kan acetoksygruppen hydrolyseres med en base slik som et kaliumkarbonat til en alkohol i henhold til prosedyrer som er velkjente innen faget. Når 3-hydroksyana-logen foretrekkes, kan produktet av denne reaksjon isoleres eller omdannes til det egnede salt under anvendelse av prosedyrer velkjente innen faget.

Det etterfølgende eksempel representerer en typisk syntese som beskrevet i reaksjonsskjerna A. Følgende uttrykk har de angitte betydninger: "g" angir gram; "mmol" angir millimol; ml angir milliliter; "DMF" angir dimetylformamid; "°C" angir grader Celsius; "mg" angir milligram; "N" angir normalitet; "pH" angir den negative log av hydroniumionet.

Eksempel 1

( IR, 3R)- trans- 1-( 9- adenyl) syklopentan- 3- ol- hydroklorid

Trinn a: ( IS, 3R)- cis- l- metansulfonyloksy- 3- acetoksysyklopentan

Tilsett 1,21 g (12,0 mmol) trietylamin dråpevis til en omrørt løsning av 1,44 g (10,0 mmol) (IS,3R)-cis-3-acetoksysyklopentan-l-ol og 1,29 g (11,0 mmol) metansulfonyl-klorid i 20 ml metylenklorid ved 0°C. Fjern isbadet etter at tilsetningen er fullført. Omrør løsningen i 20 minutter ved romtemperatur og ekstraher deretter løsningen med 30 ml vann og 30 ml saltvann. Tørk over natriumsulfat og konsentrer løsningen under dannelse av en gul olje; 2,1 g produkt (94%) utbytte. Anvend dette produkt umiddelbart i neste reaksjon uten ytterligere rensing.<X>H NMR (CDC13, TMS); 5,09 (m, 2H), 2,98 (s, 3H), 2,4, 1,9 (m, 9H).

Trinn b: ( IR, 3R)- trans- 1-( 9- adenyl)- 3- acetoksysyklopentan

Tilsett til en omrørt suspensjon av 4,1 g (30,0 mmol) adenin i 50 ml DMF1,0 g (30,0 mmol) 60% natriumhydrid. Oppvarm blandingen til 55°C i to timer. Tilsett en løsning av 2,0 g (9,1 mmol) (IS,3R)-cis-l-metansulfonyloksy-3-acetoksysyklopentan i 20 ml DMF til løsningen og tillat denne å om-røres i 24 til 48 timer ved 55°C. Filtrer løsningen og fordamp deretter DMF. Ta residuet opp i 100 ml metylenklorid. Ekstraher med 2 x 200 ml vann og 20 ml saltvann. Tørk løs-ningen med natriumsulfat og konsentrer til tørrhet. Ta opp residuet i metylenklorid og anbring deretter på 40 g silikagelkolonne. Eluer produktet med 9:1 metylenklorid/etanol. Oppsamle fraksjonen inneholdende produktet og konsentrer til tørrhet; 1,32 g produkt (56% utbytte). UV (MeOH; 261,5 nm); [a]365 = -29,40 (c 1,7 mg/ml, MeOH); ^H-NMR (CDC13, TMS) = 8,35 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,09 (m, 1H), 2,55-1,8 (m, 9H).

Trinn c: ( IR, 3R)- trans- 1-( 9- adenyl)- 3- hydroksysyklopentan Tilsett 600 mg (2,26 mmol) (IR,3R)-trans-1-(9- adenyl)-3-acetoksysyklopentan og 500 mg (3,6 mmol) kaliumkarbonat til en løsning av 25 ml metanol og 5 ml vann. Omrør blandingen ved romtemperatur i 20 minutter. Fjern det faste kaliumkarbonat ved filtrering og konsentrer filtratet til tørrhet. Ta residuet opp i etanol (med 10% metanol) og tillat blandingen å stå ved romtemperatur i 30 minutter og fjern det dannede bunnfall ved filtrering. Juster pH på filtratet til pH 3 med 6N HC1 og konsentrer til tørrhet. Oppløs materialet på nytt i vann og lyofiliser til et hvitt pulver; (.540 mg, 93% utbytte). UV (MeOH; 261 nm); [oc]365= -40,0° (c 0,6 mg/ml, MeOH);<X>H NMR (DMS0-d6, TMS) 8,20 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 5,11 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,0 (m, 1H), 1,7 (m, 1H).

Hvor det generelt er ønskelig å syntetisere den tilsvarende (IS,3S)-enantiomer av forbindelsene av formel (1), kan prosedyrer lik de ovenfor beskrevne, følges under anvendelse av egnede utgangsmaterialer. Det etterfølgende eksempel representerer en typisk syntese som beskrevet i reaksjonsskjema A.

Eksempel 2

( IS, 3S)- trans- 1-( 9- adenyl) syklopentan- 3- ol- hydroklorid

Trinn a: ( IR, 3S)- cis- l- metansulfonyloksy- 3- acetoksysyklopentan

Tilsett dråpevis 1,21 g (12,0 mmol) trietylamin til en omrørt løsning av 1,44 g (10,0 mmol) (IR,3S)-cis-3-acetoksysyklopentan- 1- ol og 1,29 g (11,0 mmol) metansulfonyl-klorid i 20 ml metylenklorid ved 0°C. Fjern isbadet etter at tilsetningen er fullført. Omrør løsningen i 20 minutter ved romtemperatur og ekstraher deretter løsningen med 30 ml vann og 30 ml saltvann. Tørk over natriumsulfat og konsentrer løsningen under dannelse av en gul olje; 2,1 g produkt (94% utbytte). Anvend dette produkt umiddelbart i neste reaksjon uten ytterligere rensing.<1>H NMR (CDC13, TMS); 5,09 (m, 2H), 2,98 (s, 3H), 2,4, 1,9 (m, 9H).

Trinn b: ( IS, 3S)- trans- 1-( 9- adenyl)- 3- acetoksysyklopentan

Tilsett til en omrørt suspensjon av 4,1 g (30,0 mmol) adenin i 50 ml DMF 1,0 g (30,0 mmol) 60% natriumhydrid. Oppvarm blandingen til 55°C i to timer. Tilsett en løsning av 2,0 g (9,1 mmol) (IR,3S)-cis-l-metansulfonyloksy-3-acetoksysyklopentan i 20 ml DMF til løsningen og tillat denne å omrøres i 24 til 48 timer ved 55°C. Filtrer løs-ningen og fordamp deretter DMF. Ta residuet opp i 100 ml metylenklorid. Ekstraher med 2 x 200 ml vann og 20 ml saltvann. Tørk løsningen med natriumsulfat og konsentrer til tørrhet. Ta residuet opp i metylenklorid og anbring deretter på en 40 g silikagelkolonne. Eluer produktet med 9:1 metylenklorid/etanol. Oppsamle fraksjonen inneholdende produktet og konsentrer til tørrhet; 1,2 g produkt (46% utbytte). UV

(MeOH; 261,5 nm); [a]365= +29,4 (c 1,7 mg/ml, MeOH); ^H-NMR (CDC13, TMS) = 8,34 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 5,41 (m, 1H), 5,09 (p, 1H), 2,5-1,8 (m, 9H).

Trinn c: ( IS, 3S)- trans- 1-( 9- adenyl)- 3- hydroksysyklopentan

Tilsett 1,2 g (4,6 mmol) (IS,3S)-trans-1-(9-adenyl)-3-acetoksysyklopentan og 1,0g (7,2 mmol) kaliumkarbonat til en løsning av 25 ml metanol og 5 ml vann. Omrør blandingen ved romtemperatur i 20 minutter. Fjern det faste kaliumkarbonat ved filtrering og konsentrer filtratet til tørrhet. Ta residuet opp i etanol (med 10% metanol) og tillat blandingen å stå ved romtemperatur i 30 minutter og fjern det dannede bunnfall ved filtrering og konsentrer til tørrhet. Ta residuet opp i metylenklorid, anbring på en 75 g silikagelkolonne. Eluer produktet med 9:1 metylenklorid/etanol. Oppsamle fraksjonen inneholdende produktet og konsentrer til tørrhet. Tilsett H20 og juster pH til 3 med 6 N HCl og konsentrer til tørrhet. Oppløs materialet på nytt i vann og lyofiliser til et hvitt pulver; (900 mg, 76% utbytte). UV (MeOH; 261 nm); [a]365 = +40,0° (c 0,6 mg/ml, MeOH);<X>H NMR (DMS0-d6, TMS) 8,20 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 5,11 (p, 1H), 4,44 (m, 1H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,0 (m, 1H), 1,7 (m, 1H).

Eksempel 3

( IR, 3R)- trans- 1- f 9-( 2, 6- diamino) purin1syklopentan- 3- ol

Trinn b: ( IR, 3R)- trans- 1-\ 9 -( 2 , 6- diamino) purin1- 3- acetoksysyklopentan

Tilsett til en omrørt suspensjon av 15,96 g (60,0 mmol) 2,6-diaminopurinsulfat i 150 ml DMF 5,79 g (180,0 mmol) 60% natriumhydrid og oppvarm den fuktige blanding til 55°C i to timer. Tilsett en løsning av 4,44 g (20,0 mmol) (1S,3R)-cis-l-metansulfonyloksy-3-acetoksysyklopentan i 50 ml DMF til løsningen og tillatt blandingen å omrøres i 48 timer ved 60°C. Fjern DMF og ta residuet opp i 100 ml metylenklorid og ekstraher med vann og saltvann. Tørk løsningen med natrium-sulf at, konsentrer deretter til tørrhet og ta residuet opp i metylenklorid og anbring på en silikagelkolonne og eluer produktet med 9:1 metylenklorid/etanol. Oppsamle fraksjonen inneholdende produktet og konsentrer til tørrhet under dannelse av 2,3 g produkt (42% utbytte). [a]589= +9,1° (c 0,002, MeOH); ^H-NMR (CDC13, TMS) 7,88 (s, 1H), 7,74 (s, 2H, exD20), 5,85 (s, 2H, exD20), 5,31 (m, 1H), 4,89 (p, 1H), 2,5-1,8 (m, 9H) .

Trinn c: ( IR, 3R)- trans- 1- f9-( 2, 6- diamino) purinlsyklopentan-3- ol

Tilsett 1,8 g (6,5 mmol) (IR,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)purin]-3-acetoksysyklopentan og 2,6 g (1,9 mmol) kaliumkarbonat til 250 ml metanol og 5 ml vann og fjern det faste kaliumkarbonat ved filtrering og konsentrer filtratet til tørrhet. Rens det faste materiale på silikagel under anvendelse av metylenklorid/metanol (4:1) under dannelse av 1,3 g produkt (86% utbytte). UV (EtOH; 257 nm og 283 nm); [a]365 = -16,7° (c 0,002, MeOH); ^H-NMR (DMS0-d6, TMS) 7,79 (s, 1H), 6,56 (s, 2H, exD20), 5,76 (s, 2H, exD20), 4,86 (p, 1H), 4,7 (br, s, 1H, exD20), 4,34 (m, 1H), 2,3-1,8 (m, 5H), 1,56 (m, 1H).

Utgangsmaterialene for det ovenfor beskrevne synteseskjerna innbefattende (IS,3R)-cis-3-acetoksysyklopentan-l-ol, adenin, 7-deazaadenin, purin, 8-azaadenin, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin og 2-amino-6-klorpurin, er lett tilgjengelige eller kan fremstilles i henhold til konvensjon-elle prosedyrer og teknikker som er velkjente innen faget.

Stereokjemien av sluttproduktet reguleres ved valg av et utgangsmateriale med den egnede konfigurasjon.

Som anvendt her, angir uttrykket "pasient" et varm-blodig dyr slik som et pattedyr som lider av en sykdom, slik som en autoimmun sykdom eller "transplantat versus vert"-sykdom, eller står i fare for avstøtelse av et transplan-tert allogenisk vev eller organ. Det skal forstås at mennesker, mus og rotter er innbefattet innen rammen av uttrykket "pasient".

Administrering av en forbindelse av formel (1) til en pasient resulterer i en immunoundertrykkende effekt hos pasienten. Nærmere bestemt resulterer administrering av en forbindelse av formel (1) til en pasient i undertrykkelse av adaptiv immunitet i pasienten. Ved behandling av en pasient med en forbindelse av formel (1) inhiberes med andre ord den adaptive immunrespons til pasienten eller undertrykkes i forhold til den som er til stede i fravær av behandling.

En pasient har behov for behandling med et immunoundertrykkende middel, slik som en forbindelse av formel (1), hvor pasienten lider av en autoimmun sykdom, "transplantat versus vert"-sykdom eller for å forhindre avstøtning av transplanterte, allogeniske vev eller organer. Uttrykket "autoimmun sykdom" angir de sykdomstilstander og tilstander hvori immunresponsen til pasienten er rettet mot pasientens egne bestanddeler, noe som resulterer i en uønsket og ofte svært svekkende tilstand.

Pasienter som lider av autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus, visse hemolytiske anemier, giktfeber, tyroiditt, septisk sjokk-syndrom, ulcerøs kolitt, myastenia gravis, glomerulonefritt, allergisk encefalomyelitt, kontinuerlig nerve- og lever-destruksjon som enkelte ganger følger viral hepatitt, multippel sklerose og systemisk lupus erytematosus, har behov for behandling med et immunoundertrykkende middel slik som en forbindelse av formel (1). Reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus og multippel sklerose erkarakterisertsom å være resultatet av en celleformidlet autoimmunrespons og synes å skyldes virkningen av T-celler. Myastenia gravis og systemisk lupus erytematosus erkarakterisertsom å være resultatet av en humoral autoimmunrespons. Som sådan vil behandling av pasienter som lider av disse sykdommer ved administrering av en forbindelse (1), være særlig effektiv til å forhindre ytterligere svekkelse eller forverring av pasientens tilstand. Behandling av en pasient på et tidlig stadium av en autoimmun sykdom, slik som reumatoid artritt, insulinavhengig diabetes mellitus, multippel sklerose, myastenia gravis eller systemisk lupus erytematosus, vil være særlig effektiv til å forhindre ytterligere svekkelse av sykdomstilstanden til en mer alvorlig tilstand. Eksempelvis er insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) en autoimmun sykdom som er antatt å være et resultat av autoimmunresponsen rettet mot 15-cellene til Langerhans-øyene som utskiller insulin. Behandling av en pasient som lider av et tidlig trinn av IDDM før fullstendig destruksjon av fi-cellene av Langerhans-øyer, vil være særlig anvendbar til å forhindre ytterligere progresjon av sykdommen da den vil forhindre eller inhibere ytterligere destruksjon av gjenværende insulinutskillende R-celler. Det skal forstås at behandling av en pasient som lider av et tidlig stadium av andre autoimmune sykdommer, også vil være særlig anvendbar for å forhindre eller inhibere ytterligere naturlig progresjon av sykdomstilstanden til mer alvorlige stadier.

Pasienter som har mottatt eller som skal motta et allogenisk vev eller organtransplantat, slik som en allogenisk nyre, lever, hjerte, hud, benmarg, er også pasienter som har behov for profylaktisk behandling med et immunoundertrykkende middel slik som en forbindelse av formel (1). Et immunoundertrykkende middel vil hindre den adaptive immunrespons til mottageren i å avstøte det allogeniske vev eller organ fra giveren. Likeledes er pasienter som lider av "transplantat versus vert"-sykdommer, pasienter som har behov for behandling med et immunoundertrykkende middel slik som en forbindelse av formel (1). Et immunoundertrykkende middel vil forhindre den adaptive immunrespons av det transplanterte vev eller organ fra avstøtning av det allogeniske vev eller organ til mottakeren.

Basert på standard kliniske og laboratorietester og prosedyrer, kan legen som fagmann lett identifisere de pasienter som har behov for behandling med et immunoundertrykkende middel slik som en forbindelse av formel (1).

En effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse av formel (1) er den mengde som er effektiv ved enkel eller multippel doseadministrering til en pasient, til å tilveiebringe en immunoundertrykkende effekt eller nærmere bestemt, en undertrykkelse av adaptiv immunrespons. En immunoundertrykkende effekt angir en nedsettelse, avbrytelse, inhibering eller forhindring av den ytterligere ekspresjon av den adaptive immunrespons. En effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse av formel (1) kan lett bestemmes av legen som fagmann, ved anvendelse av kjente teknikker og ved observering av resultater erholdt under analoge omstendigheter. Ved bestemmelse av den effektive mengde eller dose tas et utall faktorer i betraktning av legen, innbefattende arten av pattedyr, dets størrelse, alder og generelle helse; den spesifikke sykdom som er involvert; graden eller innbefatt-elsen eller strengheten av sykdommen; responsen av den individuelle pasient; den bestemte forbindelse som administreres; administreringsmåte; biotilgjengelighetskarakteristika for det administrerte preparat; det valgte doseregime; anvendelse av ledsagende medikamentering og andre relevante omstendigheter.

En effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse av formel (1) er forventet å variere fra ca. 0,1 milligram pr. kilo kroppsvekt pr. dag (mg/kg/dag) til ca. 500 mg/kg/dag. Foretrukne mengder er forventet å variere fra ca.

1 til 50 mg/kg/dag.

Ved utførelse av behandling av en pasient kan en forbindelse av formel (1) administreres i en hvilken som helst form eller måte som gjør forbindelsen biotilgjengelig i effektive mengder, innbefattende orale og parenterale ruter. F.eks. kan forbindelser av formel (1) administreres oralt, subkutant, intramuskulært, intravenøst, transdermalt, intra-nasalt, rektalt og lignende. Oral administrering foretrekkes generelt. Fagmannen vedrørende fremstilling av formuleringer kan lett velge den riktige administreringsform og -måte avhengig av de bestemte karakteristika for den valgte forbindelse, den sykdomstilstand som skal behandles, graden av sykdommen og andre relevante omstendigheter.

Forbindelsene kan administreres alene eller i form av et farmasøytisk preparat i kombinasjon med farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser hvis mengde og art bestemmes av løseligheten og de kjemiske egenskaper til den valgte forbindelse, den valgte administreringsrute og standard farmasøytisk praksis. Selv om forbindelsene ifølge oppfinnelsen er effektive i seg selv, kan de formuleres og administreres i form av sine farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter av stabilitetsformål, hensiktsmessig krystallisering, forøket løselighet og lignende.

Preparater omfattende en forbindelse av formel

(1) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere inerte bærere, er f.eks. anvendbare som prøvestandarder, som egnede midler for fremstilling av masseforsendelser, eller som farmasøytiske preparater.

En målbar mengde av en forbindelse av formel (1) er

en mengde som er lett målbar ved standard utprøvningsprose-dyrer og teknikker velkjente innen faget. Målbare mengder av en forbindelse av formel (1) vil generelt variere fra ca. 0,001% til ca. 75% av preparatet på vektbasis. Inerte bærere kan være et hvilket som helst materiale som ikke nedbryter eller på annen måte reagerer kovalent med en forbindelse av formel (1). Eksempler på egnede, inerte bærere er vann; vandige buffere, slik som de som generelt er anvendbare ved væskekromatografi med høy ytelse- (HPLC) analyse; organiske løsningsmidler slik som acetonitril, etylacetat, heksan og lignende; og farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

Spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater omfattende en effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse av formel (1) i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.

De farmasøytiske preparater fremstilles på en måte som er velkjent innen det farmasøytiske fag. Bæreren eller eksipiensen kan være et fast, halvfast eller væskeformig materiale som kan tjene som en bærer eller et medium for den aktive bestanddel. Egnede bærere eller eksipienser er velkjente innen faget. Det farmasøytiske preparat kan være til-passet for oral eller parenteral bruk, innbefattende topisk anvendelse, og kan administreres til pasienten i form av tabletter, kapsler, stikkpiller, løsninger, suspensjoner eller lignende.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt, f.eks. med et inert fortynningsmiddel eller med en spiselig bærer. De kan være innelukket i gelatinkapsler eller presset til tabletter. For oral terapeutisk administrering kan forbindelsene inkorporeres med eksipienser og anvendes i form av tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks, tyggegummi og lignende. Disse preparater skal inneholde minst 4% av forbindelsen ifølge oppfinnelsen, den aktive bestanddel, men kan varieres avhengig av den bestemte form og kan hensiktsmessig være mellom 4% og ca. 70% av vekten av enheten. Mengden av forbindelse som er til stede i preparatene, er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge oppfinnelsen fremstilles slik at en oral doseringsenhetsform inneholder mellom 5,0-300 milligram av en forbindelse ifølge oppfinnelsen.

Tablettene, pillene, kapslene, pastillene og lignende kan også inneholde ett eller flere av følgende adjuvanser: bindemidler slik som mikrokrystallinsk cellulose, gummitragant eller gelatin; eksipienser slik som stivelse eller laktose, oppbrytende midler slik som alginsyre, "Primogel", maisstivelse og lignende; smøremidler slik som magnesiumstearat eller "Sterotex"; glidemidler slik som kolloidalt silisiumdioksid; og søtningsmidler slik som sukrose eller sakkarin, kan tilsettes eller et smaksgivende middel slik som peppermynte, metylsalisylat eller appelsin- smak. Når enhetsdoseringsformen er en kapsel, kan den i tillegg til materialer av den ovenfor angitte type, inneholde en væskeformig bærer slik som polyetylenglykol eller en fett-olje. Andre doseringsenhetsformer kan inneholde andre forskjellige materialer som modifiserer den fysiske form av doseringsenheten, f.eks. som belegg. Således kan tabletter eller piller belegges med sukker, skjellakk eller andre enteriske belegningsmidler. En sirup kan i tillegg til foreliggende forbindelser inneholde sukrose som et søtnings-middel og visse konserveringsmidler, fargestoffer og smaksgivende midler. Materialer anvendt ved fremstilling av disse forskjellige preparater, skal være farmasøytisk rene og ikke-toksiske i de anvendte mengder.

For parenteral terapeutisk administrering innbefattende topisk administrering, kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen inkorporeres i en løsning eller suspensjon. Disse preparater skal inneholde minst 0,1% av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, men kan varieres til å være mellom 0,1 og 50% av vekten derav. Mengden av forbindelsen ifølge oppfinnelsen som er til stede i slike preparater, er slik at en egnet dose vil bli erholdt. Foretrukne preparater ifølge oppfinnelsen fremstilles slik at en parenteral doseringsenhet inneholder mellom 5,0 og 100 mg av forbindelsen ifølge oppfinnelsen.

Løsningene eller suspensjonene kan også innbefatte ett eller flere av følgende adjuvanser: sterile fortynnings-midler slik som vann for injeksjon, saltvannsløsning, blåste oljer, polyetylenglykoler, glyserol, propylenglykol eller andre syntetiske løsningsmidler; antibakterielle midler slik som benzylalkohol eller metylparaben; antioksidanter slik som askorbinsyre eller natriumbisulfitt; chelaterende midler slik som etylendiamintetraeddiksyre; buffere slik som acetater,

sitrater eller fosfater, og midler for å justere tonisiteten slik som natriumklorid eller dekstrose. Det parenterale preparat kan være innelukket i ampuller, engangssprøyter eller multiple doseampuller fremstilt av glass eller plast.

Følgende studier illustrerer anvendeligheten av forbindelsene av formel (1). Disse studier skal forstås å være illustrative. Som anvendt her, har følgende uttrykk de angitte betydninger: "uM" angir mikromolar konsentrasjon; "enheter" angir den internasjonalt aksepterte måling av protein; "S.D." angir standardavvik; "T|mol" angir nanomol; "T|g" angir nanogram.

Regulering av MHC klasse Il- ekspresjon

Under anvendelse av metoden ifølge Edwards (J. of Cell Biochemistry 5E, 155 (1991)) kan en forbindelse av formel (l)'s evne til å redusere hovedhistoforenlighets-kompleks (MHC) klasse II-antigennivåer på makrofager (M<j>) erholdt fra M. tuberculosis-behandlede rotter, måles. Celler erholdt fra behandlede rotter, ble anbrakt i vevkultur i en periode på 4 timer for å rense adhererende celler, ble deretter behandlet med økende nivåer av legemiddel i en periode på 18 timer. Etter denne inkuberingsperiode ble cellene skrapet fra skålene og beiset under anvendelse av strømningscytometrianalyse med forskjellige monoklonale antistoffer slik som OX-6, et monoklonalt antistoff som er spesifikt for MHC klasse II-antigener, og OX-42, et monoklonalt antistoff som er spesifikt for rottemakrofager. Data indikerer at (IR,3R)-trans-1-(9-adenyl)-syklopentan-3-ol-hydroklorid (10 jiM) reduserer ekspresjonen av MHC II-antigen-ekspresjon på rottemakrofager in vitro med tilnærmet 33% (39% 0X-6/0X-42 doble positive makrofager) sammenlignet med de positive kontroll-rottemakrofager erholdt fra tuberkulose-behandlede rotter (59% 0X-6/0X-42 doble positive makrofag-celler).

Regulering av antigenfremføring overfor rotte T- celle-hybridom

Under anvendelse av metoden ifølge Ku (Cellular Immunology 130, (1990)) og et Lewis (LEW/N) rotte T-celle-hybridom som er reaktivt med det proteinmetylerte kveg-serumalbumin (mBSA), kan en forbindelse av formel (l)'s evne til å regulere M<f>-antigenf remføring in vitro måles. Peri-toneale makrofager erholdt fra LEW/N-rotter, ble anbrakt i vevkultur og behandlet med 100 vq mBSA og legemiddel. En kontroll ble fremstilt på lignende måte. Etter en periode på 18 timer ble cellene vasket og inkubert med T-cellehybri-domet i ytterligere 12 timer. Supernatanter fra disse kul-turer ble erholdt og målt med hensyn til innhold av interleukin-2, et T-celleavledet lymfokin som produseres av aktiverte T-celler. Data indikerer at (IR,3R)-trans-1-(9-adenyl)-syklopentan-3-ol-hydroklorid inhiberer T-celle-aktivering. Rottemakrofag-antigenfremføring og den etterfølg-ende produksjon av interleukin-2 inhiberes når legemidlet administreres over et konsentrasjonsområde fra 0,1 til 100^M som illustrert i etterfølgende tabell.

Regulering av endotoksinletalitet

Under anvendelse av metoden ifølge Silverstein, (J. Exp. Med. 173, 357 (1991)) kan en museendotoksinletalitets-modell anvendes for å bestemme om en forbindelse av formel (1) har evnen til å inhibere endotoksinfremkalt septisk sjokk som er avhengig av produksjon av tumornekrosefaktor (a). CFl-mus forbehandlet ved tid (t) = -1 time med legemiddel ble utfordret med 18 mg D-galaktosamin og 50 ng LPS og ble deretter observert med hensyn til dødsfall i løpet av en 8-72-timers periode. Data indikerer at (IR,3R)-trans-1-(9-adenyl)-syklopentan-3-ol-hydroklorid (100 mg/kg i.p.) beskytter mot endotoksinletalitet.

Claims (5)

1. Forbindelser, karakterisert vedat de har formelen

hvori substituenten i 3-stilling på syklopentanylringen er i trans-konfigurasjon i forhold til den bisykliske substituent, Y3, Y5, Y7og Y9er hver nitrogen, og Y8er en CH-gruppe, R er hydrogen, Q er NH2, og Z er hydrogen eller NH2; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er (IR,3R)-trans-1-(9-adenyl)-3-hydroksysyklopentan.

3. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er (IS,3S)-trans-l-(9-adenyl)-3-hydroksysyklopentan.

4. Forbindelse ifølge krav 1,karakterisert vedat den er (IR,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)purin]-syklopentan-3-ol.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det omfatter en effektiv immunoundertrykkende mengde av en forbindelse ifølge krav 1 i blanding eller på annen måte i assosiasjon med én eller flere farmasøytisk akseptable bærere eller eksipienser.