KR100429752B1 - 염증반응억제를위한인슐린유사성장인자(i)및(ii)의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IGF를 염증 반응, 허혈성 상해, 및 장기 거부의 억제제로서 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

염증 반응 억제를 위한 인슐린 유사 성장 인자 (I) 및 (II)의 용도
본 발명은, 염증성 장 질환 뿐만 아니라, 루머티즘성 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군(Reiter's syndrom), 및 공지된 다른 염증성 관절염등과 같은 염증 반응 억제를 위한, IGF-I과 IGF-II를 포함하는 인슐린 유사 성장 인자 (IGF, insulin-like growth hormone)의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 허혈성 상해의 억제 및 이식 수술에서의 장기 거부의 억제에 관한 것이다.
인슐린 유사 성장 인자인 IGF-I과 IGF-II은 각각 약 7,500 달톤의 분자량을 가진다. IGF-I과 IGF-II에는 프로인슐린의 대응하는 도메인과 상당히 유사한, A 및 B 도메인이 각각 있다. A 도메인과 B 도메인은 C 도메인에 의하여 서로 연결되어 있다. IGF에는 카르복실 말단의 연장인 D 도메인이 나타나 있으나, 프로인슐린에는 없다. IGF-I과 IGF-II 모두는 각각 3개의 디설파이드 브리지가 있는 단일쇄 폴리펩티드이며, 인간 인슐린 A 쇄와 B 쇄에 대하여 각각 49% 및 47%의 서열 동일성을 갖는다. 인슐린처럼, IGF는 이들이 결합하는 수용체의 세포질 도메인내의 특정 타이로신 잔기의 포스포릴화를 촉진시킨다. "인슐린 유사 성장 인자"라는 명칭은, 다수의 세포에 대하여 유사 분열 물질로 작용하는 이 폴리펩티드의 인슐린 유사 효과와 인슐린 유사 구조를 나타내기 위해 선택된 것이다. IGF-I은 70개의 아미노산 펩티드이고, IGF-II는, 67개의 아미노산 펩타이드이다. 문헌[Rinderknecht,J. Biol Chem.(1978)253:2769; 및 Rinderknecht,FEBS Letters,(1978) 89:283]에서 설명하는 대로, IGF-I 및 IGF-II는 서로 62%의 구조적 상동성을 가진다. 둘다 사람의 혈청에서 분리한 것이다.
인슐린 유사 성장 인자는 또한 조마토메딘(somatomedins)이라는 군(class)에 속하며, 다양한 동물 종(species)의 다양한 조직과 세포의 종류에서 특히 발육 과정 동안의 세포의 성장을 촉진시키는 작용을 하는 폴리펩티드로서 확인되었다. 조마토메딘의 성장 촉진 효과에는 세포 증대의 촉진 및 연골조직 증식의 촉진, 아미노산 운반 촉진, RNA, DNA 및 단백질 합성의 촉진, 및 황산염의 프로테오글리칸 중으로의 혼합과 프롤린의 콜라겐중으로의 혼입의 촉진이 포함된다. 대부분의 포유류의 출생후 성장은 조마토메딘에 의한 연골조직 성장의 촉진에 기인하며, 자궁내에서의 성장도 또한 조마토메딘에 의존적일 수 있다.
IGF의 흥분 및 성장 촉진제로서의 공지된 용도에는 뼈의 복구 및 교체 치료에서의 용도; 암제거 약물의 특정의 유해적인 부작용을 막는 수단으로서의 용도; 및 소나 다른 가축 동물의 젖 분비와 고기의 생산을 증가시키는 방법으로서의 용도가 포함된다.
피층 뼈의 광물질 농도가 줄어든 포유류, 및 뼈 밀도의 감소 및 잠재적으로 골다공증 증세를 야기하는 약물이나 환경 조건에 노출된 이들의 골다공증을 치료하는데에 IGF-I이 유용함이 밝혀졌다.
연골 조직에 있는 활성있는 중성의 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)의 수준을 낮춤으로서 병의 심각성을 줄이는 효과를 위하여, IGF-I은 소듐 펜토산 폴리설페이트(PPS)와 함께 골관절염을 앓는 개에게 투여되어왔다. 온화하게 골관절염을 앓는 개 모델에 있어서, 문헌[Rogachefsky,Osteoarthritis and Cartilage, (1993) 1:105-114]에서 기술하는 바와 같이, IGF 단독으로는 효능이 없으나, IGF-I과 PPS가 치료적으로 간섭하면 연골조직 구조 및 생화학이 성공적으로 유지되었다. IGF의 다른 용도를 발견하는 것은 유익할 것이다.
발명의 요약
IGF의 부가적인 용도를 발견하고 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 류마티즘성의 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 그리고 다른 알려진 염증성 관절염 같은 염증 반응 및 염증성 장 질환을 억제하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
허혈성 상해, 예를 들면, 급성 신장 관상 괴사(acute renal tubular necrosis, ATN)나 심장, 뇌, 또는 간에의 허혈성 상해를 막기 위한 방법을 제공하는 것도 또한 본 발명의 목적이다.
신장, 심장, 허파, 간 및 췌장 기관등의 이식을 포함하는, 장기의 이식 거부를 억제하는 방법을 제공하는 것도 본 발명의 또 다른 목적이다.
류마티즘성의 관절염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 및 염증성 장 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하는 것도 본 발명의 또 다른 목적이다.
따라서, 본 발명의 목적중 하나에 따라, 염증 반응 억제 용량의 IGF를 투여하는 염증 반응의 억제 방법이 제공된다. 본 발명의 다른 하나의 목적에 따라, 허혈성 상해 억제 용량의 IGF를 투여하는 허혈성 상해의 억제 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 장기 거부 억제 용량의 IGF를 투여하는 이식후의 장기 거부의 억제방법도 제공한다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 장점은 다음의 상세한 설명에 의하여 분명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 실시양태를 나타내지만, 본 발명의 취지와 범위 내에서의 다양한 변화와 변형이 이 상세한 설명으로 인해 본 분야의 숙련가들에게는 명백해질 것이기 때문에 상세한 설명은 예시를 위해 주어진 것이다.
도 1은 ATN 유도 군의 4일째에, 재조합 사람 IGF-I(rhIGF)의 MHC I군과 II군 발현에 미치는 영향을 RIA를 통하여 나타낸 것이다.
도 2는 ATN 유도 군의 5일째에, 재조합 사람 IGF-I(rhIGF)의 MHC I군과 II군 발현에 미치는 영향을 RIA를 통하여 나타낸 것이다.
본 발명은 IGF-I 또는 IGF-II를 사용하는, 염증반응, 허혈성 상해, 및 장기의 이식거부의 억제 방법에 관한 것이다. 전부터, IGF-I과 IGF-II는 주로 이들의 흥분과 성장 촉진 효과에 대해 알려져있다. 예기치 않게도, 본 발명자들은 IGF가 염증 반응, 허혈성 상해, 및 장기 이식 거부의 억제와 같은 억제 반응을 또한 할 수 있음을 발견하였다. 본 명세서에서 "인슐린 유사 성장 인자"라는 용어는 실질적으로 정제되거나, 원형 상태이거나, 재조합적으로 생산되거나 화학적으로 합성된 형태의 IGF-I 및 IGF-II를 포함하는 것이고, 생물학적 활성을 가진 단편, 유사체, 변이체( C-말단이 제거된 변이체 포함), 및 예를 들어, EP 135 094, WO85/00831,미국 특허 4,738,921, WO 92/04363, 미국 특허 5,158,875, EP 123 228, 및 EP 128 733에 기술되어 있는, IGF 활성 및/또는 IGF 수용체와의 결합 능력을 가진 그의 유도체를 포함한다. IGF 유사체 또는 단편의 유사체는, 실질적으로 이것의 성질에 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산의 첨가, 삭제, 또는 치환에 의해 변형된 원형 IGF를 포함한다. 바람직하게는, 이 유사체는 원형 IGF보다 더 증가된 활성을 가진다. 더 바람직하게는, 적어도 2 배가 증가하고, 가장 바람직하게는 적어도 7-10배의 증가이다. 예를 들면, 유사체는 보존성 아미노산 대체물을 포함할 수 있다. IGF 유사체는 WO 91/04282에 기술되어 있는 것들과 같은, 하나 이상의 펩타이드 모조물("펩토이드")이 있는 펩티드를 또한 포함한다.
IGF 변이체는, 시스테인 잔기가 디술피드 결합을 형성하지 않는 아미노산으로 치환되는 것과 같은, 하나 이상의 아미노산이 변형되어 바람직한 특성을 나타내는 폴리펩타이드 변형체이다. 변이체, 유사체 및 유도체는 통상의 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들면, PCR 변이유도(mutagenesis)가 사용될 수 있다. 아래의 논의는 DNA에 관한 것이지만, 이 기술은 RNA에도 또한 적용되는 것으로 이해된다. PCR 기술의 한 예는 WO92/22653에 기술되어 있다. 유사체, 변이체, 그리고 유도체를 만드는 또 다른 방법은 문헌[Wells,Gene, (1985) 34:315]에 설명되어 있는 기술에 근거한 카세트 변이유도(cassette mutagenesis)이다.
"염증 반응"은 일반적으로 혈류 및 백혈구의 조직내로의 침투가 증가하여, 붓고, 붉게되며, 높은 온도 및 통증을 나타내는 것을 특징으로 한다. 염증 반응의 한 징후는 주요 조직적합 복합체("MHC")의 I군 또는 II군의 발현이다. I군 MHC 는모든 유핵 세포, 특히, 림포이드 세포의 표면에서 발현된다. II군 MHC는 포유류에서의 염증 반응의 일부로서 대식세포(macrophage)에서 발현된다. g-인터페론과 같은 약제로 활성화 되었을 때, 모세관 내피세포 및 많은 상피 세포는 표면 II군의 발현 및 I군의 증가된 발현을 나타낼 것이다. 여기서 발명자들은 생체에 IGF를 투여하는 것이 염증을 억제하는 데에 효과가 있음을 발견하였다. 이러한 억제는 예를 들어, 문헌[ Geraught,Curr.Opin.Immunol., (1993) 5:3; Kara C. & Glimcher,Curr. Opin. Immunol., (1991) 3:16; 및 Kurlander, Science, (1992) 257;678]에 기술되어 있는 바와 같이, I군 또는 II군 MHC 발현의 감소에 의하여, 또는 I군 또는 II군 MHC와 결합하는 항체의 양에 의하여 모니터될 수 있다.
장기로의 혈류가 감소함으로 인해 초래된 허혈성 상해에는, 예를 들면 동맥 협착 또는 혈액 공급의 기계적 차단이 포함된다. 포유류에 있어서, 허혈성 상해는 IL-6(interleukin-6), IL-8(interleukin-8) 및 IFN-γ(interferron-γ) 같은 사이토카인의 생산을 동반한다. 허혈성 상해에 의하여 유도될 수 있는 다른 사이토카인으로는 IL-1(interleukin-1), IL-2(interleukin-2) 및 IL-10(interleukin-10) 같은 인터루킨, 콜로니 자극 인자 (CSF; colony stimulating factor), 및 종양 괴사 인자(TNF; tumor necrosis factor) 및 형질전환 성장인자-베타 (TGF-β transforming growth factor-beta)와 같은 치료 또는 보수에 관여하는 것들이 포함된다. 사이토카인은, 생체내(In vivo) 및 생체 밖(in vitro)에서, 보수 및 치료 뿐만 아니라, 주위 조직의 손상을 포함하는 다양한 효과를 낸다고 보고 되어왔다.
여기서 "염증 반응 억제량"은, 추가의 염증 반응을 감소 또는 방지하는데 충분한 치료학적 유효량이다. 염증 반응의 억제는 통상적인 방법에 의해 모니터할 수 있다. 한 방법으로, 예를 들면 MHCs에 결합하는 항체를 검출하여 I군 MHC 및 II군 MHC의 발현의 감소를 모니터하는 것이 있다. 만약 이들의 반응이 적어도 5% 감소, 바람직하게는 10% 이상 감소, 더 바람직하게는 15% 이상 감소, 및 가장 바람직하게는 20% 이상이 감소하면, 염증 반응이 억제된 것으로 간주한다.
여기서 "허혈성 상해 억제량"은 허혈성 상해로 인한 반응을 감소 또는 방지하는데 충분한, 치료학적 유효량이다. 이러한 반응도 또한 통상적인 방법에 의하여 모니터할 수 있다. 한 방법으로, 예를 들면 위에서 언급한 사이토카인 같은 사이토카인의 생산 유도가 감소하는 것을 모니터하는 것이 있다. 만약 사이토카인 생산이 5% 이상 감소, 바람직하게는 10% 이상 감소, 더 바람직하게는 15% 이상 감소, 및 가장 바람직하게는 20% 이상이 감소하면 허혈성 상해가 억제된 것으로 간주한다.
여기서 "장기 거부 억제량"은 이식 이후의 장기 거부를 방지하거나, 또는 이식된 장기의 수용을 지속시키기에 충분한 치료학적 유효량이다.
"관절염 증세"는 관련된 세포 유형이 퇴화되지 않는다면 억제된 것으로 간주한다. 전형적으로, 관절염 억제량은 세포 유형의 재생에 더욱 영향을 주어서, 세포 유형이 2% 이상 증가, 바람직하게는 5% 이상 증가, 더 바람직하게는 10% 이상 증가, 및 가장 바람직하게는 15% 이상이 증가하는 결과를 나타낼 것이다.
"약제학상 허용되는 담체"는 인간에게 치료 조성물을 투여하기 위해 당업자들이 통상적으로 사용하는 담체이다. 이러한 담체는 전형적으로, 예를 들면, 항체 생산의 유도, 열의 유도 등과 같은 원하지 않는 부작용을 최소화한다. 적당한 담체는 전형적으로, 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트 산, 폴리글리콜 산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체, 또는 비활성 바이러스 입자등과 같은 분자를 포함하는 크고, 서서히 대사되는 거대분자이다. 이러한 담체는 당업자들에게 잘 알려져 있다.
여기서, "치료 조성물"은 활성 성분으로 IGF-I 또는 IGF-II 또는 이들 둘 다를 함유하며, 1 종 이상의 약제학상 허용되는 담체, 및(또는) 물, 염수, 글리세롤, 또는 에탄올 같은 1 종 이상의 성분을 조성물에 포함할 수 있다. 또한, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질등과 같은 보조 물질들은 임의적으로 조성물에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 경구 투여 또는 비경구 투여에 쓰이는 담체로는 링거 용액, 행크 용액, 및 포도당, 설탕, 젖당, 만노스, 덱스토로즈, 덱스트란, 만니톨, 솔비톨, 알부민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 인산염, 초산염, 젤라틴, 콜라겐, 카보폴(Cabopol), 식물성 기름 같은 것들이 포함된다. 이러한 조성물들은 임의적으로 안정화제, 항산화제, 항균제, 방부제, 완충제, 계면활성제, 및 기타 부수적인 첨가제들을 포함한다. 제제에 유용한 크림 또는 연고 개재는 라놀린, 실바덴(SilvadeneR; Marion), 아쿠아퍼(AquaphorR; Duke Lavoratories)을 포함한다. 기타 국소제제는 에어로솔, 붕대, 서방성 패치등을 포함한다.
"치료 유효량"이란 목적하는 결과를 생성시키기에 효과적인 양이다. 이 양은 치료 대상이 되는 환자의 건강과 신체적 상태, 항체를 생산할 수 있는 개인 면역계의 능력, 원하는 보호의 정도, 처방, 의학적 상태에 대한 담당 의사의 평가, 나이,신장, 상태, 치료 되어야할 질환의 본질과 심도, 및 다른 관련된 요소에 따라 변화될 수 있다. 이 양은 자격있는 의사 또는 수의사의 일상적인 시도를 통해 결정되어 질 수 있는 비교적 넓은 범위이다. 따라서 예를 들면 염증 반응 억제를 위한 치료 유효량은 약 50-500 mg/kg, 바람직하게는 약 100-500 mg/kg, 더 바람직하게는 약 150-450 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 200 mg/kg의 범위가 될 수 있다. 일반적으로 말하자면, IGF-I 및 IGF-II의 유효량은, 약 5-10 mg/kg 내지 50 mg/kg까지의 범위에서 100 mg/kg 내지 500 mg/kg까지의 범위이다. 또한, IGF-I 및 IGF-II의 유효량은 10-50 mg/kg, 10-500 mg/kg, 50-100 mg/kg, 100-150 mg/kg, 150-200 mg/kg, 200-400 mg/kg, 250-350 mg/kg, 및 400-500 mg/kg의 범위일 수 있다. 이러한 처방은 단일 투여량 또는 다회 투여량으로의 투여로 가능하다. 여기서의 목적으로 IGF가 다회 투여량으로 주어지면, 다회 투여량은 하루에 주어질 수 있고, 바람직하게는 일주일 내에 주어지고, 더 바람직하게는 2 주 내에 주어지고, 더욱 바람직하게는 한 달 내에 주어질 수 있다. 필요에 따라, 여기서 목적하는 반응이 나타날 때까지 IGF를 투여할 수 있다.
또한, IGF를 적당한 중합체 매트릭스 또는 막에 혼입 또는 캡슐화 시켜, 국소적으로 치료할 부위 또는 그 근처에 주입하기 적당한 서방성 전달 장치를 제공할 수 있다. 기타 장치들은 내재 카테테르 및 알제트(AlzetR) 소형 펌프 같은 장치를 포함한다. 또한, 화합물을 고형, 특히 동결 건조 분말형으로 제공할 수 있다. 동결 건조된 제제는 전형적으로 안정화제 및 팽창제, 예를 들면 인간 혈청 알부민, 설탕, 만니톨등 같은 것들을 포함한다. 약제학상 허용되는 부형제에 대한 충분한 설명은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, 1990(Mack Pub. Co., Easton, PA)]에 기재되어 있다.
발명한 화합물은, 예를 들면 피하, 국소, 정맥내, 경구, 근육내, 복막내, 구강내, 관절내등을 포함하는 목적하는 결과를 얻기에 적당한 이 분야에서 일반적으로 알려진 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 제제의 본질과 치료되어야 할 상태에 따라 다를 것이다. 치료 기간으로는, 예를 들면 25-100 mg/kg/투여의 단일 투여량을 하루에 한 번, 또는 두 번, 또는 세 번 투여할 수 있다. 투여일 수는 1일 또는 2일이 될 것이다. 류마티스성 관절염인 상태에서는, 예를 들어 100-500 mg/kg/투여의 많은 투여을 관절내로 투여할 때, 일주일에 세 번 3개월간 투여하는 것이 적당할 것이다. 만성 염증성 장 질환 및 다른 염증성 질환 또는 상태에서는, 예를 들면 내강으로 내지 GI 관을 포함하는 국소 투여로 1 내지 6 주 동안 매일 투여가 필요하다. 전신 염증 반응 상태에서는, 상태의 심도나 치료에 대한 개인의 반응에 따라, 예를 들면, 25-100 mg/kg/dose을 포함하는 소량으로 장기간 피하 투여가 요구된다. 급성 신부전 및 급성 뇌 또는 급성 간 이상의 경우, 치료기간은, 예를 들면, 4 내지 14 일간의 매일 투여, 또는 4 내지 21 일간의 매일 투여, 또는 4 내지 28일간의 매일 투여가 요구된다. 뇌에 투여하기 위해서는 뇌내 투여가 요구될 수 있다.
본 발명에 사용된 IGF는 공지된 다양한 기술로 제조할 수 있다. 따라서, IGF는 혈청 또는 혈장에서 단리 또는 정제 되거나, 세균 또는 효모와 같은 미생물 숙주, 또는 곤충 세포 또는 동물 세포 배양물과 같은 세포 배양물에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산되거나, 통상의 기술에 따라 화학적으로 합성되어질 수 있다. 예를 들면, IGF는 문헌[Philips,New Engl. J. Med.,(1980) 302:371-380]에 기재된 바와 같이 많은 양의 혈장 또는 혈청으로부터 적은 양으로 단리될 수 있다.
IGF는 문헌[Li,PROC.NATL. ACAD.SCI.USA, (1983) 80:2216-2220]에 기술되어 있는 바와 같은 고체상 방법에 의하여서도 또한 합성될 수 있다. 이 방법에서는 아미노산 잔기들을 커플링시킴으로써 IGF-I의 폴리펩타이드 서열을 합성할 수 있다.
IGF는 문헌[Biochem. and Biophys. Res. Comm.,(1990) 169:832-839 (IGF II) 및Cell Regulation,(1990) 1:197-213, (IGF II), 및Biotechnology News, (1993) 3:1-3 (IGF-I 및 II)]에 기술되어 있는 통상적인 재조합 DNA 기술로 제조될 수 있다. 예를 들면, IGF는 미국 특허 제 4,738,921호에서 설명되어 있는 바와 같이, 변형된 트립토판 오페론의 조절하에 trpE 유전자를 사용하여 융합된 단백질로 대장균에서 생산할 수 있다. 또한, EP 478 333에 설명되어 있는 바와 같이, IGF는 베시큘러 조마티티스 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV) 프로모터 및 프로텍터 서열의 조절하에 대장균에서 합성될 수 있다. 여기서 발현을 위해 사용되는 대장균 발현계는, IGF 단백질의 적당한 폴딩을 가능케하는, 변형된 양으로 하전된 리더(leader) 서열을 포함하도록 미국 특허 제 5,158,875호에 설명된 바와 같이 변형될 수 있다.
더욱이, IGF-I은 분비 및 단백질 생성물의 단백질 분해 과정을 지시하는 시그날 펩티드에 연결되어 있는, IGF 코딩(coding) 서열로 형질 전환된 메틸로트로픽 효모 형질전환체에서 생산될 수 있다. 여기서 적당한 시그날 펩티드는 WO 92/04363에 설명되어 있는 바와 같이, 단백질 분해 효소가 없는 피. 파스토리스(P. pastoris)균주에서 에스. 세레비지아에 (S. cerevisiae) 알파 메이팅 인자 pre-pro 서열을 포함한다.
IGF-II를 생산하기 위한 DNA 구조체는 WO 89/03423에서 설명되어 있는 바와 같이 대장균에서 생산 및 발현될 수 있다. 재조합 IGF-II의 합성은 공유 결합된 외래 잔기를 가지며 N 말단에 메티오닌이 없는 재조합 IGF-II의 생산에 관한 EP 434 605에 설명되어 있는 프로토콜에 따라 실시할 수 있다.
IGF는 또한 EP 123 228 및 미국 특허 출원 제 06/922,199호에 설명되어 있는 바와 같이 효모에서 제조될 수 있다. 여기서 적당한 재조합 DNA 기술을 사용하여 IGF를 생산하는 또 다른 방법은 문헌[Biotechnology News, (1983) 10:1-3]에 설명되어 있다. IGF-I 또는 IGF-II의 코딩 서열을 바이러스 또는 환상 플라스미드 DNA 벡터에 삽입하여 하이브리드 벡터를 형성하고 생성된 하이브리드 벡터를 세균이나 효모 세포와 같은 숙주 미생물을 형질 전환시키는데 사용 할 수 있다. 형질 전환된 미생물은 EP 135 733에서 설명되어 있는 바와 같이 IGF를 발현할 수 있는 적당한 영양 조건에서 성장되어질 수 있다.
다른 보고에 의하면, EP 128 733에 설명되어 있는 바와 같이 인간 IGF-I 및 IGF-II는 효모 에이 팩터 시그날 서열 (a-factor signal sequence)의 일부분을 함유하는 리더 서열을 사용하여 발현 및 분비할 수 있다.
IGF-I은 예를 들면 효모 세포, 세균, 곤충 및 포유류 세포등을 포함하는, 단세포 생물에서 발현될 수 있다. 예를 들면, IGF-I가 발현될 수 있는 효모 세포에는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)(Hinnen,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA,(1978) 75:1929 ; Ito,J Bacteriol.,(1983) 153:163) ;사카로마이세스 칼스베르제네이스(Saccharomyces carlsbergeneis) ; 캔디다 알비칸스(Candida albicans),(Kurtz,Mol.Cell. Biol.,(1986) 6:142); 캔디다 말토사(Candida maltosa),( Kunze,J. Basic Microbiol.,(1985) 25:141); 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) (Glesson,J. Gen. Microbiol, (1986) 32:3459 ; Roggenkamp,Mol. Gen. Genet.,(1986) 202:302) ;클루예로미세스 프라질리스(Kluyeromyces fragilis), (Das,J. Bacteriol.,(1984) 158:1165) ; 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactix),(De Louvencourt,J. Bacteriol.,(1983) 154:737 ; Van den Berg,Bio/Technology,(1990) 8:135) ; 피치아 귈레니몬디이(Pichia guilerimondii), (Kunze,J. Basic Microbiol., (1985) 25:141); 피치아파스토리스(Pichia pastoris), (Cregg,Mol. Cell. Biol, (1985) 5:3376 ; 미국 특허 제 4,837,148호 및 4,929,555호) ; 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe,Beach),(Nature, (1981) 300:706) ; 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica),(Davidow,Curr. Genet.,(1985) 10:38047 ; Gailardin,Curr. Genet.,(1985) 10:49) ; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), (Case,PROC. NSTL. ACAD. SCI. USA(USA), (1979) 76:5259) ; 및 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움(Penicilium), 톨리포클라디움(Tolypociadium), (WO91/00357)과 같은 섬유상 진균 에이. 니둘란스 (A. nidulans), 발란스 (Ballance),(Biochem. Biophys. Res. Comm.,(1983) 112:284 ; Tiburn,Gene, (1983) 26:205, Yelton,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(USA),(1984) 1981:1470, 및A. Niger,Kelly,EMBO J.,(1985) 4:475-479)와 같은 아스페리질루스(Aspergillus) 숙주 등이 있다.
여기서 IGF-I은, 예를 들면, 스트렙토코쿠스(Streptococcus spp.), 및 스트렙토마이세스(treptomyces spp.), 예를 들면, 이. 콜리(E. coli), 비, 서브틸리스(B. subtilits) 같은 바실리(Bacili), 피. 에루기노사(P.aeruginosa), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세트칸스(Serratia marcescans)등의 슈도모나스(Pseudomonas)종과 그람-양성 또는 그람-음성 유기체인 진핵 세균에서도 발현될 수 있다.
또한, IGF-I은 바큘로바이러스 발현계가 있는 곤충 세포, 예를 들면, 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변체, 및 이에 상응하는 임의의 숙주, 예를 들면 문헌 [Luckow,Bio/Technology, (1988) 6:47 ; Miller,Genetic Engineering, Plenum Publishing (1986) 8: 277 ; 및 Maeda,Nature, (1985) 315:592]에 설명되어 있는 스포오프테라 프루기페르다 {Spodoptera frugiperda) (catepilar), 에이데스 아에집티(Aedes aegypti)(mosquito), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(mosquito), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (fruitfly), 및 봄빅스 모리(bombyx mori) 숙주로 부터의 곤충 숙주 세포에서도 발현될 수 있다. 벡터는 예를 들면 문헌[Smith,Virol.,(1978) 89:517]에 설명되어있는, 오토그라포 칼시포미카(Autographo califomica) MNPV, 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV, 리초플루시아 니 (rrichoplusia ni) MNPV, 라킬프루시아 오우(Rachlplusia ou) MNPV, 또는 갈레리아 멜로넬라 (Galleria mellonella) MNPV, 트리초플루시아니(Trichoplusia ni). 라키프루시아 오우(Rachiplusiaou), 및 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella)를 포함하는 예를 들어, 레피도프데라(Lepidoptera), 디프테라(Diptera), 오르토프테라(Orthoptera), 콜레오프테라(Coleoptera) 및 히멘토프테라(Hymenoptera)목과 같은, 일반적으로 곤충을 감염시키는 500 이상의 바큘로바이러스로부터 유래한 바큘로바이러스의 전사 프로모터 영역일 수 있다.
IGF-I은 또한 예를 들어, 문헌[Reyes.,Nature,(1982) 279:598]에 설명되어 있는 원숭이 세포, 배양된 생쥐 및 토끼 세포, 생쥐 NIH-3T3 세포, 예를 들면, 문헌[Urlaub, PROC. NSTL. ACAD. SCI. USA(USA), (1980) 77:4216]에 설명되어 있는 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO), 헬라(HeLa) 세포, 어린 햄스터 신장 세포(BHK), 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간실 세포의 암 세포(e.g., Hep G2), 문헌[Grisham,J. Gen, Virol.,(1977) 36:59]에 설명되어 있는 사람 배 세포주, 문헌[Mather,Biol. Reprod.,(1980) 23:243]에 설명되어 있는 생쥐의 세르톨리 세포, 아프리카의 초록 원숭이 세포, 개의 신장 세포, 버팔로 쥐의 간 세포, 인간 폐 세포, 인간 간 세포, 및 쥐의 유방암 세포등을 포함하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American type culture collection, ATCC)에서 입수할 수 있는 많은 죽지 않는 세포주를 포함하는 포유류 숙주 세포에서도 발현될 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위한 설명이며, 어떤 면에서도 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
<실시예 1> IGF-I 제조
rhIGF-I 단백질은 플라스미드 pYLUIGF1-24로 형질 전환된 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 균주 JSC417에 의하여 합성하였다. 형질 전환된 효모 균주로는 12301 파크론 드라이브, 록크바일, 메릴랜드 20852에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1994년 8월 2일일자로 ATCC 수탁 번호 제 74295호로 기탁되었다. 균주 JSC417은 균주 AB110으로부터 유도된 것이다. JSC417은 다음과 같은 유전형질을 갖는다: Mata,ura3-52,leu2,pep4-3,his4-580, [cir. ].
에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 균주 JSC417에서의 rhIGF-I의 발현은 발명을 구성하는 것은 아니며, 문헌[Beier, Nature, (1982) 300:724]에 설명되어 있는 효모의 알코올 데하이드로나제 및 EP 120 551에 설명되어 있는 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제의 프로모터 서열로 부터 유래한 하이브리드 ADH2-GAP의 프로모터의 조절을 받는다. 또한, rhIGF-I서열은 분비를 가능케하는 효모 a 인자 리더, 및 효모 a 인자 터미네이터에 융합되어 있다[Brake, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, (1984)]. rhIGF-I 발현 유도는 발효 동안의 성장 배지의 포도당 농도를 낮게 유지함으로써 달성된다.
플라스미드 pYLUIGF1-24는, 암피실린 내성(ampR) 유전자, 2-미크론(2m) 서열, 및 효모 LEU 2와 URA 3유전자를 포함하는 pBR322 뿐만 아니라, 문헌[Barr.Bio/Technology,(1987) 5:486]에 설명되어 있는 벡터 pAB24의BamHI 부위에 클로닝 되어 있는 rhIGF-I을 코딩하는 서열을 함유하는 효모 발현 벡타이다. rhIGF-I의 발현 카세트는 EP 123 228에서 설명되어 있는 바와 같이, (5'에서 3') ADH2 조절 서열, GAP 프로모터, a 요소 리더, rhIGF-I 합성 유전자 및 α 인자 터미네이터로 구성되어 있다.
발현 카세트에 클로닝되어 있는 rhIGF-I 유전자는 문헌[Urdea,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA,(1983) 80:7461]에 설명되어 있는 바와 같이 포스포라미다이트 방법을 사용하여 다이호프(Dayhoff) 아미노산 서열에 따라 화학적으로 합성된다.
에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 세포를, 문헌[Hinnen,PROC. NATL. ACAD. ACI. USA,(1983) 80:7461n]에 설명되어있는, 표준 실험 방법에 따라 플라스미드 pYLUIGF 1-24에 의하여 형질 전환시켰다. 간단히 설명하자면, 2% 포도당을 함유한 아미노산으로 효모 질소의 기초가 되는 우라실 결핍 선택 접시에 형질전환 혼합물을 도말한 후, 30℃에서 4일간 배양하였다. 형질전환된 콜로니를 8% 포도당을 함유한 루신 결핍 선택 배지로 옮겨서, 30℃에서 성장시켰다. 효모 형질 전환체를 0.4% 포도당이 있는 우라실 결핍 배지에서 30℃에서 40시간동안 배양시켜 rhIGF-I 의 발현을 달성하였다.
48시간째에 IGF-I의 배지에서의 발현을 RP-HPLC, SDS-PAGE, RIA, 또는 라디오리셉터 분석를 포함하는 몇 가지의 표준 방법에 의하여 분석하였다.
rhIGF-I의 생산은, 종자 배양액 분액 내에 함유된 효모 세포의 연속적인 증식을 포함한다. 제 1 증식 단계는, 30℃의 조절 온도로 회전 진탕 배양기내의 진탕 플라스크내에서 이루어진다. 위에서 언급된, 5-8%의 포도당을 함유하는 우라실- 및 루신 결핍 배지 500 ml에 약 107개의 세포를 넣었다. 25 내지 45 시간, 바람직하게는 35±2 시간 이후에, 세포 증식의 제 2 단계를 위하여 플라스크의 내용물을 작은 발효 용기에 옮겼다. 이 배양액을 제 1 단계에 사용된 것과 동일한 배지 10 ℓ에서, 조절된 온도(30 ℃), 통기(1 vvm), 및 교반(400-600 rpm) 하에서 24±4 시간동안 성장시켰다. 제 2 단계의 배양액 10-30ℓ를, 최종 증식 및 rhIGF-I의 발현 성장 단계를 위한 큰 생산 규모 발효조로 옮겼다. 제 3 단계에서는 카제인 가수 분해물, 염기성 염, 비타민, 미량 원소(trace elements), 및 소포제를 함유하는 세미 한정 성장 배지를 사용하였다. 사용된 카제인 가수 분해물은 적어도 5% 아미노-질소, 적어도 10% 전체 질소, 20% 이하의 애쉬(ash)로 구성되어 있는 어떠한 회사의 제품일 수도 있으나, N-Z-Amine HD(Quest)의 성분과 비슷한 성분을 가지는 것이 바람직하다. 사용되는 소포제는 시판하는 폴리알코올 또는 실리콘 기재 화합물일 수 있다. 발효는 일정한 진탕으로, 30℃, pH 6(50% 수산화 나트륨 또는 95% 인산을 첨가함으로써), 통기(0.8 vvm), 압력 (5-12 psig), 및 포도당 주입 속도가 일정하게 유지되는 가운데 수행하였다. 이 발효는 발효조가 처음에는 용량보다-적게 채워져 있다가 25-50%w/v의 농도로 적당량의 포도당 주입 용액을 넣어주기 때문에 페드-베치방식이라 불리는 당업자에게 공지된 방법이다. 전형적으로, 800-900 kg의 포도당은 작업 동안 효모 세포 밀도 및 잔류 포도당 농도에 따라 달라지는 첨가 속도로 발효조에 첨가하였다. 전형적으로, 포도당을 처음 26 시간 동안에는 500 g/min의 속도로, 다음 24 시간동안에는 1000 g/min의 속도로, 마지막에는 완결시까지 500g/min의 속도로 첨가하였다. 생성물 발현에 수반되는 세포의 성장은 배지에 많은 포도당이 고갈되면 일어나게 되고 배양이 약 35 g DCW/ℓ 정도의 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 지속될 수 있다.
rhIGF-I를 일반적인 방법으로 세포 배양액으로부터 회수하였다. 발효가 끝나게 되면, 발효조 배양물 pH를 적어도 30분 동안에 pH 9-10, pH 10.1-10.3, pH 10.4-10.6, pH 10.6-10.8, pH 10.9-10.11, 또는 pH 11-12의 범위까지 상승시킨다. 세포를 제거하기 전에, 0.5 시간 내지 4 시간 동안, 발효조의 전체 배양액의 pH를 pH 9-10, pH 10.1-10.3, pH 10.4-10.6, pH 10.6-10.8, pH 10.9-10.11, 또는 pH 11-12 까지 (바람직하게는 적어도 0.5시간 동안 pH 10.2) 높이기 위하여 50% 수산화 나트륨을 첨가하였다. 다음에는, 전체 효모를 계속적인 원심분리에 의하여 생산물을 포함한 나머지 배지로부터 분리하였다. 상등액을 모아서 75% 인산으로 pH 3-4, pH 5-6 또는 pH 6-7 (바람직하게는 pH 4)의 범위가 되도록 맞춘후, 양이온 교환 수지에 흡착시키기 전에 미공성 탠젠셜 유동 여과기를 사용하여 여과하였다. 이 컬럼을 20 mM 아세트산 및 100 mM 붕산 칼륨/ 0.1mM EDTA 완충용액으로 세척한 후, pH 8.7에서 100 mM 붕산 칼륨/ 0.1mM EDTA/ 300 mM 염화 칼륨 클로라이드 용액으로 용출시켰다.
표준 소수 상호 작용 크로마토그라피(HIC)를 rhIGF-I의 첫 단계 정제를 위하여 사용하였다. 황산 암모늄 침전 및 미공성 텐젠셜 유동 여과기를 효모 오염물을제거하기 위하여 사용하였다. 침전물을, 황산 암모늄, 아세트산 나트륨 및 pH 4의 EDTA 완충 용액으로 세척한 다음, HIC 매트릭스에 부하시키고, 0.9 M 내지 0.5 M로 선형 감소 경사의 황산 암모늄으로 용출시켰다.. pH 4에서 용출된 단백질을 20 배 농축하고, 5000 MWCO 탄젠셜 유동 한외 여과막을 사용하여 완충 용액을 교환하였다. 사용된 여과제는 고순도의 물 및 이어서 20 mM 아세트산이 사용되었다.
표준 역상 고성능 액체 크로마토그라피(RP-HPLC)를 순수한 rhIGF-I으로부터 부산물들을 제거하기 위하여 사용하였다. 5 K 농축액을 적당한 C8 매트릭스에 부하한 후, pH 6.8 암모늄 아세테이트 완충 용액 중에서, 10% 내지 50%의 선형 증가 구배 아세토니트릴을 사용하여 용출시켰다.
<실시예 2>
허혈성 상해와 관련된 염증 반응 감소시키기 위한 IGF-I의 용도
허혈성 급성 관상 괴사(ATN)가 염증, MHC 및 사이토카인 발현을 유발한다는 것이 공지되어 있다. 여기서 본 발명자는 IGF-I이 ATN 유도 이후에 사이토카인과 MHC의 유도를 감소키는 것을 나타낸다. 인간 IGF-I(huIGF-I)을 ATN 유도 후에 생쥐에게 투여하였다. 염증의 정도는 주요 조직적합 복합체(MHC complex)의 발현 및 사이토카인의 발현의 정도에 의하여 평가하였다. ATN은 생쥐의 왼쪽 신장경을 60분 동안 크램프함으로써 생성되었다. MHC의 발현은 방사성으로 표지된 단클론 항체(mABs)와의 결합됨을 통하여 정량하였다(RIA). IL-2(interleukin-2), IL-10(interleukin-10), GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor) 및 IFN-γ(interferron-γ)의 정지상, mRNA의 양은 RT-PCR에 의하여 측정하고,TGF-β-1(transformina gro조 factor-beta-1), TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), 및 ppEGF(preproepidermal growth factor)은 노던(Northerns)에 의하여 측정하였다. IGF-I이 없으면, MHC I군 과 II군 mRNA 및 그 산물은 I군의 경우 2 주동안, II군의 경우 5 주동안 증가하였다. 허혈성 신장의 경우에, IL-2, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, TGF-β-1 mRNA는 유도되는 반면에, ppEGF mRNA는 상당히 감소되었다. 재관류 이후 1시간이 지난 때 부터 시작하여 rhIGF-I 25 μg 을 피하로 매일 투여하고 5 일째에 평가하였더니 허혈성 상해 이후의 MHC 발현 및 사이토카인 mRNA의 유도가 감소되었다. 결과는 표 I-VI에 나타내었다.
잭슨 실험실(Bar Harbor, ME)로부터 얻은 6-15 주 령의 수컷 BALB/c 및 CBA 생쥐를 실험에 사용하였다. 이들을 tert-부틸 알콜중의 2,2,2-크리브로모에탄올(Avertin)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 왼쪽 신장경을 중심선 절개에 의해 찾아 내고, 60 분 동안 미크로-불독형의 크램프로 막았다. 봉하기 전에 개관류를 확인하기 위하여 신장을 조사하고, 복강 안은 따뜻한 식염수로 채웠다. 대조용 생쥐도 동일한 조건에서 간단한 개복 수술을 하였다. 개복 수술후 4 내지 5일째에 생쥐들을 수납하였다. 수납시에 각 군을 4 내지 8 마리씩 포함되도록 하였다. 헤파린화나 신장 플러싱을 하지 않음에도 혈전증은 관찰되지 않았다. ATN은 각 군에서 임의적으로 선택한 두 동물의 HE 및 PAS를 사용한 조직 염색 실험에서 확인하였다. 처음의 두 실험에서, rhIGF-I은 하기의 실험 방법에 따라 투여하였으며, n은 각 군의 생쥐의 수이다.
Figure pct00001
0.9% NaCl로 희석된 인간의 IGF-I을 수술후 2, 24, 48, 72 및 96 시간 후에 25 μg씩 피하 주사로 투여하였다. 이러한 투여량은, 문헌[Miller,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(USA), (1992) 89:11876 및 Ding,J Clin Invest, (1993) 91:2281]에 설명되어 있는 바와 같이, rhIGF-I이 신장의 회복을 촉진시키는 것이 발견된 쥐의 연구에서 사용되었던 투여량을 기초로 선택된 것이다.
단클론 항체는, 복수종 종양으로서 또는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (Rockvile, MD)으로 부터 제공된 하이브리도마 세포의 상등액으로서 제조하였다. 이것들을 단백질 A 컬럼으로 정제하고, 1 mg/mℓ의 단백질 농도가 되도록 조정하였다. 안티-I군, 안티-H-2K(k)는 Ig 군 IgG(2a)이고, 안티-II군, 안티-I-A(k)는 IgG(2b)이다. 쥐의 안티-생쥐 H-2 하플로타입(M1) 및 안티-I-A(b, d, q 하플로타입) 및 I-E(dK)(M5)는 각각 IgG(2a)와 IgG(2b)이다. 염소의 항-쥐 및 염소의 항-생쥐 퍼옥시다제는 IgG의 중쇄 및 경쇄의 폴리클로날 F(ab')2 단편이다. 문헌[Salacinski,Anal Biochem, (1981) 117:136]에서 설명되어 있는 로도겐(lodogen) 방법에 의하여125I를 사용하는 방사성요오드화를 행하였다.
여기서 사용된 RIA 기술은 문헌[Cockfield,J immunol, (1989) 142:1120]에이미 보고된 바있다. 이 보고에 따라, 조직의 균질화물을 제조하고 5 mg 시료로 나누어 담은 후, 원심분리 시켰다. 조직 펠렛을125I-표지 안티-MHC mAB와 1시간 동안 반응시켰다. 펠렛을 세척한후, 펠렛을 감마계수기로 계수하여 펠렛 조직에 결합되어 있는 항체의 갯수를 얻었다. 모든 시료를 3 번씩 시험하였다. 실험 조직에서 얻은 수치에서 관계 없는 균주의 조직 5 mg과 결합한 수를 뺌으로써 비특이적 결합을 고려하여 수정하였다. 직접적으로 또는 경쟁적 억제에 의하여 증명되는 특이적 결합은 오직 특별한 MHC 하플로타입을 발현하는 생쥐에서만 관찰되고 FcR 결합으로는 설명될 수 없다. 왼쪽(클램프된)과 오른쪽(대조구) 신장을 변화의 한 방향 조사로 비교하였다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표시하였다.
전체 RNA를 문헌[Chirgwin,Biochemistry(1979) 18::5294]에서 설명된 방법을 변형한 방법에 따라 모아진 시료로부터 추출하였다. 4 M 구아니디늄 이소티오시아네이트 중의 폴리트론으로 조직을 균질화 한후, 문헌[Glisin,Biochemistry, (1974) 13:2633]에서 설명되어 있는 바와 같이, 5.7 M 세슘 클로라이드 쿠션를 통해 펠렛화 하였다. RNA의 농도는 260 nm에서의 흡광도를 통하여 측정하였다. 노던 블랏은 2.2 M의 포름알데하이드의 존재하에 1.5%의 아가로즈 겔에서 25 내지 35 μg의 전체 RNA를 전기영동하여 준비하고 니트로셀룰로스 필터로 이동시켰다. 블랏을, HLA-A3 유전자(Class I), I-A (Class II)의 a-chain, ppEGF, TNF-α 및 TGF-β-1을 위한32P로 표지된 cDNA 탐침으로 하이브리드화 시켰다. 조밀 스크린으로 -70℃에서 각각의 블랏에 Kodak X-Omat AR 필름을 노출시켰다.
구아니디늄-세슘 클로라이드 방법으로 준비된 전체 RNA를, 5 ng/μℓ IFN-γ에 특이적인 하류 프라이머, 5 U/μℓ 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스의 역전사효소(Superscript;BRL), 표준 반응 완충 용액, 및 뉴클레오타이드를 포함하는 10μℓ의 반응액 중에서 역전사시켰다. cDNA 산물을 표준 PCR 반응 완충용액, BSA, 적당한 프라이머 및 0.01 U/μℓ의 Taq 폴리머라제(BRL)를 포함하는 50 μℓ의 반응액 중에서 써모사이클러(thermocycler)를 사용하여 증폭시켰다. MgCl2의 적정 곡선은 이 프라이머 쌍에는 2.5 mM MgCl2이 최적 농도임을 나타내었다. 사이클러 프로그램은, 초기의 변성, 어닐링 및 연장의 시간 및 온도로 이루어진 많은 표준 PCR 기술 중의 하나이다. 이 RT-PCR 산물을 1.5 % 아가로즈 겔에서 전개시킨 후, 나일론 막으로 옮겨,32P로 표지된 IFN-γ cDNA 탐침으로 하이브리드화시켰다. 사용된 프라이머는, 문헌[Gray,PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(USA) (1983) 80 : 5842]에서 설명하는 공지된 서열 정보에 기초한 것이며, 증폭된 산물이 오염된 게놈 DNA로부터가 아닌, mRNA로부터 나온 것임을 확실히 하기 위하여 인트론의 양쪽에 위치한다. RNA 역전사, 및 IL-2, IL-10 및 GM-CSF의 DNA 증폭 방법은 IFN-γ에 사용되는 방법과 동일하다.
쥐의 IFN-γ에 사용된 cDNA 탐침은 I-A의 a 쇄의 전사체를 검출하기 위해 pBR322의PstI의 부위에 삽입된 Aad cDNA 단편이며; pEMBL8에 삽입되어 있는 HLA-A3 유전자의 1.5 kB cDNA 단편이 I군 전사체를 검출하기 위해 사용되며; pBR322의PstI 부위에 삽입되어 있는 쥐의 ppEGF의 0.96 kB cDNA 단편이 ppEGF를 위한 탐침으로 사용되며; 인간 TGF-β-1 mRNA의 2.13 kb 단편; GM-CSF 탐침은 유전자의 cDNA 단편이며; 유전자의 IL-10 탐침은 +213 내지 +253의 올리고머이다. 모든 탐침은 문헌[Feinberg and Volgelstein,Anal Biochem, (1983) 132:6]의 랜덤 프라이밍 방법으로32P로 표지된다.
생쥐의 경우에, 일측 허혈증은 잘 극복이 되고, 문헌[Shoskes,Transplantation, (1990) 49:201]에서 설명되어 있는 바와 같이, 유조직이 완전히 회복되었다. 여기서, 급성 관상 괴사(ATN)의 조직학적인 증거는 허혈성 신장에서 12 시간 이전에 관찰되며, 3-5 일 동안 심한 상태로 지속된다. 약 7 일째에 왼쪽 신장의 간질 세포충실성의 과도함이 명확히 나타났으며, 14 내지 15 까지 간질성 단핵 세포 침윤으로 진전되었다. 오른쪽(대조구) 신장은 조직학적으로 정상이었다. 대조구 및 시험 군에서 선택된 동물을 수거할 때의 혈청 크레아티닌 및 혈중 우레아의 농도는 검출할 수 있을 정도의 상승을 나타내지 않았다.
rhIGF-I으로 처리하는 것은 ATN 유도 이후에 MHC의 유도를 감소시켰다. ATN 또는 정상적인 신장으로 세 개의 신장의 풀으로부터 추출한 전체 RNA를 사용하여 노던 블랏 분석한 결과 ATN 신장에서의 I군 및 II군 mRNA의 발현이 증가되었음을 나타내었다. rhIGF-I 처리 이후에 MHC 유전자 유도의 감소가 발견되었다(표 1). MHC I군 및 II군 유전자의 유도를 I군 및 II군에 대한 방사성 표지된 단클론 항체(RIA)를 사용하여 단백질 수준에서도 연구하였다(표 2 및 표 3, 및 도 1 및 2에 나타나 있는 그래프 1및 2). rhIGF-I의 투여는 I군 및 II군의 산물의 발현을 약60-70%정도 감소시켰다. I군은 주로 외부 골수의 외면에 있는 관상 세포의 바소레터럴(basolateral)한 곳에 집중적으로 및 여러 군데로 나뉘어져서 발견되며, rhIGF-I의 처리로 인하여 감소되었다(표 4 및 5). II군의 발현은 이전에 설명된 바와 같이 4일째와 5일째의 염색에 의하여 검출되지 않았다.
rhIGF-I은 ATN 유도 이후에 사이토카인 유전자 유도를 또한 감소시켰다. IL-2, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α 및 TGF-β-1의 ppEGF 유전자의 현저한 감소도 ATN 신장에서 발견되었다. rhIGF-I의 투여는 모든 사이토카인 유전자의 유도를 감소시키고, ATN에 의하여 유도된 ppEGF mRNA의 감소 정도를 줄인다(표 6). 사이토카인 및 염증 반응을 감소시키는 IGF의 능력은 (a) 상해 정도의 감소; (b) 상해 회복의 증가된 속도; (c) 사이토카인 및 염증 반응에 대한 직접적인 억제; 및 (d) 이러한 기작들의 조합등에 영향을 미칠 수 있다.
[표 1]
허혈성 상해 후의 MHC 유전자의 유도 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00002
표 1의 결과는 노던 블랏 분석을 사용한 왼쪽(허혈성)과 오른쪽 신장(+ 에서 +++까지)의 차이로 나타낸다.
[표 2]
허혈증에 의해 유도되는 MHC의 발현 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00003
표 2의 결과는 MHC I군 및 II군의 산물에 대한 방사성으로 표지된 mAB(RIA)를 사용하여 왼쪽(허혈성) 및 오른쪽 신장의 차이로 나타낸다(평균 cpm ± SEM).
[표 3]
허혈증에 의해 유도되는 MHC의 발현 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00004
표 3의 결과는 MHC I군과 II군의 산물에 대한 방사성으로 표지된 mAB(RIA)를 사용하여 왼쪽(허혈성)및 오른쪽 신장의 차이로 나타낸다(평균 cpm ± SEM).
[표 4]
허혈증에 의해 유도되는 신장 MHC 발현 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00005
표 4의 결과는 항 - I군 및 II군 mABs를 사용하여 면역 퍼옥시다제 염색 강도(-에서 ++++까지)로 나타낸다.
[표 5]
허혈증에 의해 유도되는 신장의 MHC 발현 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00006
표 5의 결과는 항 - I군 및 II 군 mABs를 사용하여 면역 퍼옥시다제 염색강도(-에서 ++++까지)로 나타낸다.
[표 6]
허혈성 상해 이후의 사이토카인 유전자의 유도 - rhIGF-I의 효과
Figure pct00007
표 6의 결과는 IL-10, GM-CAF 및 IFN-γ의 경우 RT-PCR를 사용하고, TNF-α, TNF-β-1 및 ppEGF의 경우 노던 블랏 분석을 사용하여, 왼쪽(허혈성)및 오른쪽(정상) 신장의 차이( + 에서 +++까지)로 나타낸다.
여기서 언급된 특허, 특허 출원 및 공고는 참고로 인용되었다.
미생물 기탁
플라스미드 pYLUIGF1-24로 형질전환된 효모 균주 JSC417은 12301 파크론 파크론 드라이브, 록크바일, 메릴랜드 20852에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 ATCC 수탁번호 제 74295호로 1994년 8 월 2일에 기탁되었다.

Claims (9)

  1. MHC의 I군 또는 II군 항원의 발현을 5% 이상 감소시키는 양의 IGF-I(인슐린 유사 성장 인자-I; insulin-like growth factor-I)을 포함하는, 포유류의 염증 반응을 억제하기 위한 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, IGF-I의 양이 간 세포, 췌장 세포, 뇌 세포, 및 위장 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 한 기관의 퇴화를 억제하기에 충분한 양인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, IGF-I의 양이 추가로 간 세포, 췌장 세포, 또는 위장 세포의 재생을 자극하기에 충분한 양인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, IGF-I이 하나의 투여량으로 투여되는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, IGF-I이 두 개 이상의 투여량으로 투여되는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, IGF-I의 양이 10-50 mg/kg, 10-500 mg/kg, 25-50 mg/kg, 25-100 mg/kg, 50-100 mg/kg, 60-75 mg/kg, 100-150 mg/kg, 150-200 mg/kg, 175-200 mg/kg, 250-350 mg/kg, 200-300 mg/kg, 300-400 mg/kg, 및 400-500 mg/kg으로 이루어진 군으로부터 선택된 범위인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, IGF-I이 정맥내, 피하, 근육내, 내강내, 관절내 및 뇌실내 투여되는 조성물.
  8. 제1항에 있어서, IGF-I이 다수의 약제로 1년 동안 투여되는 것인 조성물.
  9. MHC의 I군 또는 II군 항원의 발현을 5% 이상 감소시키는 양의 IGF-I으로 이루어진 포유류의 염증 반응을 억제하기 위한 약제.
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