KR100425018B1

KR100425018B1 - 면역증강, 혈관생성억제 및 종양억제 활성을 갖는 ｐ43단백질

Info

Publication number: KR100425018B1
Application number: KR10-2001-0033399A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 고영규; 김영수; 조영준
Original assignee: 주식회사 이매진
Priority date: 2000-06-14
Filing date: 2001-06-14
Publication date: 2004-03-27
Also published as: AU5114000A; KR20010112108A; WO2001095927A1

Abstract

본 발명은 면역증강 효과, 종양억제 효과 및 혈관생성억제 효과를 갖는 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우수한 사이토카인 활성 및 종양억제, 혈관생성 억제 활성을 나타내는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 p43 단백질은 사이토카인을 유도하여 면역반응을 증가시키고, 혈관생성을 억제하므로, 이를 유효성분으로 하는 면역증강제, 종양 억제제 또는 혈관생성 억제제에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

면역증강, 혈관생성억제 및 종양억제 활성을 갖는 ｐ43 단백질{p43 protein having the activity of immunological enhancement, angiogenesis suppression and tumor suppression}

본 발명은 면역증강 효과, 종양억제 효과 및 혈관생성억제 효과를 갖는 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 우수한 사이토카인 활성, 종양억제 활성 및 혈관생성억제 활성을 나타내는, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질에 관한 것이다.

내피 단핵구 활성화 폴리펩티드 II(endotherial monocyte activating polypeptide II; EMAP II)는 메틸콜라트렌 A로 형질전환된 섬유육종 세포(mathylcholathrene A-transformed fibrosarcoma cells)로부터 분리된 폴리펩티드이며(Kaoet al.,J. Biol. Chem. 267:20239-20247, 1992), 원발성 및 전이성 종양의 성장을 억제하고, 증식하는 내피 세포에서 세포고사(apoptosis)를 유발한다고 알려져 있다(Schwarzet al.,J. Exp. Med. 190:341-353, 1999).

EMAP II는 세포고사가 진행되면서 전구체인 p43 단백질로부터 방출된다. 전구체인 p43(pro-EMAP II) 단백질은 312개의 아미노산으로 이루어져 있고, 진핵세포에서는 멀티-tRNA 합성효소 복합체(multi-tRNA synthetase complex)와 결합되어 있다(Parket al.,J. Biol. Chem. 274:16673-166776, 1999). 그러나, 세포고사가 진행되는 동안 활성화된 케스페이즈-7(caspase-7)에 의하여 C-말단 부위가 분리되어 EMAP II가 생성된다(Behrensdorfet al.,FEBS Lett. 466:143-147, 2000).

EMAP II 단백질의 서열은 여러가지 다른 아미노아실-tRNA 합성효소(aminoacyl-tRNA synthetase)상에 존재하는 도메인과 유사성을 보이며(Quevillonet al.,J. Biol. Chem. 272;32573-32579, 1997), tRNA와 결합할 수 있다고 알려져 있다. 또한, N-말단의 15개 펩티드가 EMAP II의 사이토카인 활성에 관여한다고 알려져 있다(Kaoet al.J. Biol. Chem.269:9774-9782, 1994).

EMAP II의 구조와 성숙과정은 면역반응에 관여하는 14.5kDa의 IL-1b와 유사하다. IL-1b 사이토카인은 ICE(케스페이즈-1)에 의해 33kDa 분자량을 갖는 비활성 전구체(pre-IL-1b)로부터 분리된다. 비록 상기 두 사이토카인의 성숙 과정은 유사하지만, EMAP II의 전구체인 p43 단백질은 멀티-tRNA 합성효소와 결합되어 작용한다는 점에서 IL-1b의 전구체(pre-IL-1b)와는 다르다.

이와 같이, EMAP II 도메인의 사이토카인 활성에 대해서는 많은 연구가 되어 있으며, 또한, 본 발명자들은 이미 p43 단백질의 N-말단 도메인이 인간 아르기닐-tRNA 합성효소(human arginyl-tRNA synthetase)의 N-말단 비촉매 부위와의 상호작용에 관여하며, p43 단백질의 양 말단 도메인이 p43과 아르기닐-tRNA 합성효소와의 반응에서 자극제 역할을 한다고 밝힌 바 있다(Parket al.,J. Biol. Chem.274:16673-16676, 1999).

또한, 미국특허 제 5,641,867호는 EMAP II의 종양 억제 기능에 대해 개시한 바 있다.

본 발명자들은 p43 단백질과 EMAP II간의 다양한 사이토카인 활성도 및 종양억제도와 내피세포의 혈관생성 억제 효과를 비교하여, p43 단백질 자체가 p43의 분해물질인 EMAP II에 비해 사이토카인 활성 및 종양억제 활성이 크다는 것과 혈관생성을 억제한다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 p43 단백질을 유효 성분으로 하는 면역증강제를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 p43 단백질을 유효 성분으로 하는 혈관생성 억제제 및 종양 억제제를 제공하는 데 있다.

도 1은 p43의 전장, N-말단 및 C-말단 단백질을 분리한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 p43 및 EMAP II에 의한 TNF-a, IL-6 및 IL-8의 발현 유도 정도를 나타낸 것이다.

도 3은 p43 및 EMAP II에 의한 MMP-9(matrix matalloprotease-9)의 분비 정도를 나타낸 것이다.

도 4는 인간 흑색종 세포에 대한 p43 및 EMAP II의 시험관내 운동성 어세이(in vitro motility assay) 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5a는 소 동맥혈관내피세포에 p43 단백질 100nM을 처리한 후 혈관생성억제 여부를 현미경으로 관찰한 것이다.

도 5b는 소 동맥혈관내피세포에 각각 p43 전장 단백질(F), p43 N-말단 펩티드(N) 및 p43 C-말단 펩티드(C) 100nM을 처리한 후 세포고사 정도를 그래프로 비교한 것이다.

도 5c는 소 동맥혈관내피세포에 p43 단백질 100nM을 처리한 후 세포고사 유도 여부를 DNA fragmentation assay 결과로 나타낸 것이다.

도 5d는 소 동맥혈관내피세포에 p43 단백질 100nM을 처리한 후 세포고사 유도 정도를 케스페이즈-3 활성도로 나타낸 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강제를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 혈관생성 억제제를 제공하며, 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 유효성분으로 하는 종양 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 면역증강제, 혈관생성 억제제 또는 종양 억제제는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 p43 단백질 자체가 우수한 면역증강 활성을 가지며, 또한 종양억제 및 혈관생성억제 활성을 나타내는 것을 확인하기 위하여, p43 단백질과 이의 C-말단, N-말단 펩티드간의 사이토카인 활성도, 종양 억제도 및 혈관생성 억제도 등을 조사하였다.

이를 위하여, 우선 본 발명에서는 상기 세 단백질들을 공지의 방법(Parket al.,J. Biol. Chem. 274:166673-166676, 1999)에 따라 발현시키고 분리, 정제하였다. 상기 유전자 삽입에 사용될 수 있는 벡터는 특별한 제한은 없으나, pET28a(Novagen)가 사용되는 것이 바람직하다. 상기 벡터의 내부에는 히스티딘을 암호화하는 서열이 다수 존재하고 있기 때문에 단백질 발현시 히스티딘이 같이 발현되어 쉽게 정제할 수 있다는 잇점이 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 p43 단백질과 C-말단 부위인 EMAP II의 면역활성도를 측정하였다. 면역활성도는 p43 및 EMAP II에 의해 유도될 수 있는 다양한 종류의 사이토카인의 양을 조사함으로써 측정될 수 있으며, 본 발명에서는 구체적으로 TNF-α, IL-8 및 IL-6의 양을 측정함으로써 확인하였다. 상기 세 사이토카인은 주로 대식세포(macrophage)로부터 생산되는 단백질로서 다른 세포의 특성을 변화시켜 면역작용에 관여한다고 알려져 있다. 본 발명에서는 p43 단백질과 EMAP II를 같은 농도로 처리하였을때, 도 2에 도시된 바와 같이, p43 단백질이 EMAP II 보다 상기 세 사이토카인의 유도를 촉진시킴을 확인할 수 있었으며, p43 단백질 자체가 보다 효과적인 면역증강제 기능을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 사이토카인 외에 p43 단백질에 의한 MMP-9(matrix matalloprotease-9)의 유도 효과를 측정하였다. p43 단백질 및 EMAP II에 의한 MMP-9의 유도 효과 측정은 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의하여 측정될 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)를 수행함으로써 측정되었다. MMP-9는 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 단백질로서, 종양의 전이 과정에 작용하며 TNF-α를 유도한다고 알려져 있다. 또한, MMP-9의 분비는 혈관생성을 억제하는 물질로 알려진 안지오스타틴(angiostatin)의 분비를 촉진한다. 도 3에 도시된 바와 같이, p43 단백질을 처리하였을 때, EMAP II처리시 보다 MMP-9의 양이 증가된 것을 확인할 수 있어, 역시 p43 단백질 자체가 보다 효과적인 면역증강제 기능을 하며, 혈관생성을 억제하는 기능을 할 수 있다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 흑색종 세포(melanoma cell)에 각각 p43 단백질 및 EMAP II를 처리하고 화학주성(chemotaxis) 효과를 측정하였다. 상기 단백질들의 화학주성 효과는 당업계의 공지된 방법에 의하여 측정될 수 있으며,본 발명에서는 구체적으로 시험관내 운동성 테스트(in vitro motility test)방법을 이용하여 측정하였다. 일반적으로 화학주성이 크면, 암세포에 특이적인 림포사이트나 비특이적인 중성구(neutrophil) 또는 대식세포(macrophage) 등을 암세포로 유도하여 항암 작용을 촉진하게 된다. 도 4에 도시된 바와 같이, p43 단백질을 처리하였을때 화학주성 정도가 크게 나타났으며, 이는 p43 단백질이 EMAP II보다 우수한 화학주성 물질이라는 것을 나타내며, 우수한 종양 억제제 역할을 할 수 있다는 것을 보여준다.

한편, 본 발명에 따른 p43 단백질이 혈관생성을 억제할 수 있는가를 확인하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 혈관내피세포, 구체적으로 소의 동맥혈관 내피세포(bovine aorta endothelial cell)에서 p43 단백질에 의한 세포고사가 유도되는지를 측정하였다. 세포고사 유도 정도를 측정하기 위해서는 당업계에 공지된 다양한 방법이 이용될 수 있으나, 본 발명에서는 세포의 형태 관찰, DNA fragmentation assay 및 케스페이즈-3 활성도 측정과 같은 방법을 이용하였으며, 도 5a 내지 도 5d에 도시된 바와 같이, p43 단백질에 의하여 혈관내피세포의 성장이 억제됨은 물론 세포고사가 유도되었음을 확인할 수 있었으며, 케스페이즈 활성 또한 높음을 확인할 수 있었다. 케스페이즈-3는 세포내에서 세포고사를 유도한다고 알려져 있는 단백질로서 케스페이즈-3의 활성이 높다는 것은 곧 세포고사가 진행되고 있다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 p43 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강제, 혈관생성 억제제 또는 종양 억제제는 사람이나 동물에 투여될 수 있는 형태라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 캐리어에 지지된 형태로 투여되는 것이 바람직하다.

상기 캐리어로는 고체, 반도체, 액상 희석제, 충진제, 다른 제제 보조제 중의 적어도 하나가 0.1 내지 99.55의 비율로 사용된다. 상기 치료제는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 조직내 국부, 피하, 근내, 동맥 또는 정맥내, 그리고 직장내 투여일 수 있다. 상기 투여 경로에 적합한 투여 형태는 종래의 기술 수단을 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여는 고체 또는 액체 단위 투여 형태, 예컨대 벌크 분말제, 분말제, 과립제, 정제, 캡슐제, 시럽 및 현탁제 등을 사용하여 실시될 수 있다. 경구 투여의 단위 투여 형태는 필요한 경우 마이크로켑슐화될 수 있다. 이러한 제제를 더 코팅하거나 또는 중합체나 왁스에 활성 성분을 함입함으로써, 활성 기간이 연장될 수 있으며 서방성이 얻어질 수 있다.

상기 치료제의 투여량은 환자의 연령, 체중, 투여 경로, 질병, 그의 정도 및 다른 인자를 고려하여 바람직하게 결정될 수 있다.

한편, 본 발명자들은 상기 p43 단백질상의 C-말단 부위인 EMAP II의 3차원적 구조를 X-ray 크리스탈로그래피를 통하여 밝혔으며, 11개의 β-가닥과 3개의 α-가닥으로 구성된 구조임을 확인할 수 있었다. 최종 모델은 1.8Å에서 정제된 결과 비대칭 유니트(30166 잔기)당 2개의 분자와 193개의 물분자를 포함하고 있었다.

EMAP II 구조는 중심부를 이루는 β1(10-21 잔기), β2(28-34 잔기),β3(40-46 잔기), β4(59-66 잔기), β5i(70-72 잔기), β6i(75-77 잔기), β7(79-85 잔기), β8(90-92 잔기), β9(103-106 잔기), β10(132-134 잔기) 및 β11(140-142 잔기) 11개의 β- 가닥 구조와 측면의 α1(53-56 잔기), α2(119-123 잔기) 및 α3(124-130 잔기) 3개의 α- 헬릭스 구조로 구성되어 있다.

또한, p43 단백질의 N-말단 부위는 β1 내지 β7과 α1으로 구성되어 있으며, 올리고뉴클레오티드 및 올리고사카라이드가 결합되는 올리고뉴클레오티드/올리고사카라이드 결합-폴드(OB fold)라 불리는 구별된 구조 모티프를 형성한다. EMAP II의 OB 폴드는 β3 및 β4 가닥사이에 위치한 짧은 α1 헬릭스 구조에 의해 연결된 5개의 Greek-key β-베럴(β 1-3, β4, β7)구조를 포함하고 있다. C-말단은 β8 내지 β11 가닥, α2 , α3 및 몇개의 긴 루프들로 이루어져 있다. 상기 C-말단 부위는 N-말단 부위보다 긴 루프들을 포함하고 있으며, 다른 어떤 구조와도 유사성을 갖지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

p43 단백질, N-말단 및 C-말단 단백질의 발현 및 정제

p43 단백질과 EMAP II에 의한 다양한 사이토카인 활성 및 종양 억제, 혈관생성 억제 효과를 비교하기 위하여 우선 상기 단백질들을 재조합 단백질 형태로 발현시켜 분리, 정제하였다.

전장 p43 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 공지의 방법(Parket al.,J. Biol. Chem. 274:16673-16676)에 따라 다음과 같이 제조하였다. 일본 암 연구소(Cancer Institute)의 Kiyataka Shiba 박사로부터 제공받은 플라스미드 pM338로부터 p43 유전자를Nde1 및Xho1 제한효소를 사용하여 절단해 낸 후, 서열번호 3 및 서열번호 4로 각각 표시되는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여, 95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 1분의 조건에서 PCR을 수행하였다. 또한, N-말단 및 C-말단을 암호화하는 cDNA는 각각 서열번호 5 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8으로 표시되는 프라이머 쌍을 사용한 PCR을 수행하여 분리하였다.

상기에서 획득된 cDNA를 각각EcoR1/Sal1,Nde1/Xho1 및EcoR1/Sal1을 사용하여 pET28a 플라스미드(Novagen, Madison, USA)내로 클로닝하였다.

상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 대장균 BL21(DE3)내로 형질전환시킨 후, 형질전환된 대장균을 LB 배지(Luria Broth: 1g NaCl, 1g Bacto-trypton, 0.5g yeast extract) 100㎖에 배양시킴으로써 상기 유전자를 His-tag 융합 단백질의 형태로 발현시켰다. 재조합 단백질을 발현하는 세포를 수확한 후, 완충액(20mM KH₂PO₄, 500mM NaCl, pH 7.8, 2mM 2-머켑토에탄올)으로 현탁시켰고, 상기 현탁액을 초음파로 분쇄시켰다. 25,000g에서 상기 분쇄액을 원심분리한 후, 상층액을 얻었고 발현된 단백질은 니켈 친화 크로마토그래피(nickel affinity chromatography)로 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이,약 43kD의 분자량을 갖는 p43 단백질, 약 21kDa의 분자량을 갖는 N-말단 단백질 및 약 26kDa의 분자량을 갖는 C-말단 단백질(EMAP II)이 순수하게 분리된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 2>

p43 단백질에 의한 사이토카인 유도

실시예 1에서 분리된 p43 단백질의 사이토카인 유도 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 인간 단핵구 THP-1 세포(human monocytic THP-1, ATCC)를 10% FBS, 50㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)/페니실린(penicillin)이 포함된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)상에서 배양한 후, 24 웰 플레이트에 2 ×10⁶개 세포씩 분주하였다. 2시간 후 상기 실시예 1에서 정제된 p43 단백질 및 EMAP II를 각각 0.5, 5, 50 및 500nM의 농도로 처리하였다. 2시간 후, 상기 처리된 세포에서의 IL-6, IL-8 및 TNF-α유도 여부 및 농도를 상기 사이토카인에 대한 항체를 사용한 ELISA 키트(PharMingen)를 이용하여 측정하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 상기 각각의 사이토카인의 양은 p43 50nM을 처리하였을 때와 EMAP II 500nM을 처리하였을 때 유도 정도가 같았다. 즉, p43이 사이토카인 유도에 보다 효과적임을 보여줌으로써 면역증강제 기능을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.

이후, p43 또는 EMAP II에 의한 MMP-9의 분비 유도를 젤라틴 자이모그래피를수행하여 측정하였다(Birkedal-Hansenet al.,Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:1173-1178, 1982). 인간 단핵구 THP-1(human monocytic THP-1)세포 배양액 중 상층액을 취하여 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 첨가하여 샘플을 준비하였고, 0.1% 젤라틴이 첨가된 10% 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 자이모그램 겔 상에서 전기영동하여 전개시켰다. 상기 겔은 재생 버퍼(renaturation buffer)로 30분 동안 세척하였고, 전개 버퍼(developing buffer, 50mmol/ℓTris-HCl. pH 7.5, 0.15mol/ℓNaCl, 10mmol/ℓCaCl₂, 0.02% NaN₃)로 실온에서 30분 동안 세척하였다.

이후, 상기 세척된 자이모그램 겔을 상기 전개 버퍼로 37℃에서 24시간 동안 반응시켰고, 이후 쿠마시 블루(comassie blue) R-250 용액으로 염색하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 p43 또는 EMAP II가 처리된 세포에서는 MMP-9이 분비된 반면, 대조군에서는 MMP-9이 분비되지 않았다. 또한, EMAP II 보다는 p43을 처리하였을때, 보다 많은 양의 MMP-9이 분비되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

p43 단백질의 화학주성 실험

본 발명자들은 p43 단백질 및 EMAP II의 인간 흑색종 세포에 대한 시험관내 운동성 어세이(in vitro motility assay)를 수행하여 상기 p43단백질이 보다 효과적인 대식 세포를 유인하는 화학주성 물질임을 확인하였다.

p43 및 EMAP II의 화학적 활성도는 젤라틴이 코팅된 8㎛ 크기의 폴리비닐피롤리딘-프리 폴리카보네이트 필터(polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate filter, Neuroprobe, Cabin John, USA)를 사용하여 48웰 마이크로케모텍시스 쳄버내에서 공지된 방법에 의하여 측정되었다(Aznavoorianet al.,J. Biol. Chem. 271:3247-3254, 1996). 상기 측정은 각각 3회씩 수행되었다.

도 4에 도시된 바와 같이, p43 단백질을 1 내지 10ng/㎖ 처리하였을때, 화학주성이 크게 유도된 반면, EMAP II 처리시에는 낮은 반응을 보였다. 이러한 결과들로부터 p43 단백질 자체가 이의 분해물인 EMAP II보다 효과적인 종양 억제제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

p43 단백질에 의한 혈관생성 억제 효과

4-1) 세포 배양

p43 단백질에 의한 혈관생성 억제 효과 측정에 사용된 BAEC(Bovine aorta endothelial cell)는 소의 대동맥으로부터 채취하여 배양하였다. 상기 세포는 20% 소혈청(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지상에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양되었다.

4-2) p43 단백질에 의한 혈관내피세포 성장의 억제

상기 실시예 4-1)과 같이 배양된 BAEC에 p43 단백질 100nM을 처리한 후, 24시간 뒤 현미경으로 관찰하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, p43 단백질이 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 p43 단백질을 처리한 세포는 성장이 억제되고 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 각각 p43 전장(F), p43 C-말단(C) 및 p43 N-말단(N) 펩티드를 농도별로 처리한 후, 세포고사 정도를 현미경으로 측정한 결과, p43 전장(F)에 의한 세포고사 유도율이 p43 C-말단(C)을 처리한 세포의 세포고사 유도율보다 높음을 확인할 수 있었다(도 5b 참조).

4-3) DNA fragmentation assay

p43 단백질을 처리한 세포에서의 세포고사 유도 정도를 확인하기 위하여 공지된 방법에 따라 DNA fragmentation assay를 수행하였다(Ko,Y.G.et al.,J. Immunol. 162:7217-7223, 1999). 상기 BAEC 세포에 p43 100nM을 처리하고 24시간 뒤 세포를 수확하였다. 세포 침전물에 용해 버퍼(100mM Tris-HCl, pH 8.5, 5mM EDTA, 0.2 M NaCl, 0.2% SDS, 0.2mg/㎖ proteinase K) 500㎕를 처리하고 37℃에서 24시간 동안 반응시켜 염색체 DNA를 얻었다. 상기 염색체 DNA를 1.5M NaCl과 에탄올을 처리하여 침전시킨 후, RNase 200㎍/㎖을 처리하여 RNA를 제거하였다. 상기 RNA가 제거된 염색체 DNA를 1.8% 아가로즈 겔상에서 전개시켜 DNA fragmentation 정도를 확인하였다. 도 5c에 도시된 바와 같이, p43 단백질을 처리하지 않은 대조군 세포로부터 분리한 염색체 DNA는 분획이 일어나지 않았으나, p43 단백질을 처리한 세포로부터 분리한 염색체 DNA의 경우 분획이 일어났음을 확인할 수 있었다. 즉, p43 단백질을 처리한 혈관내피 세포에서는 세포고사가 진행되었음을 확인할 수있었다.

4-4) 케스페이즈-3 활성도 측정

p43 단백질의 세포고사 유도 정도를 확인하기 위하여 BAEC 세포에 p43 단백질을 처리한 후, 케스페이즈 활성도를 측정하였다.

상기 실시예 4-1)에서 배양한 BAEC 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 후, p43 단백질 100nM을 처리하였다. 24시간 뒤, 세포를 수확하여 차가운 용해 버퍼(20mM HEPES, pH 7.5, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 0.5% NP-40, 0.1mM PMSF) 500㎕씩를 처리하였다. 상기 세포 용해물을 4℃, 15,000g에서 5분 동안 원심분리 시켰고, 상층액을 모아 케스페이즈 활성도 측정에 사용하였다. 상기 상층액 40㎍에 어세이 버퍼(20mM HEPES, pH 7.5, 2mM DTT, 10% 글리세롤, 100μM 케스페이즈 기질(Ac-YVAD-pNA for Casp-1; Ac-DEVD-pNA for Casp-3; Ac-IETD-pNA for Casp-8; Ac-LEHD-pNA for Casp-9, Calbiochem, 미국)을 첨가하고 30℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 케스페이즈 활성에 의해 분리되는 니트로아닐린(nitroaniline)은 UV-VIS 흡광계(Pharmacia Biotech, 스웨덴)을 사용하여 405nm에서 측정하였다. 그 결과, 도 5d에 도시된 바와 같이, p43 단백질을 처리한 세포가 대조군 세포에 비해 케스페이즈-3 활성도가 높음을 확인할 수 있었다. 세포고사는 케스페이즈-3 활성에 의해 유도되기도 하므로, 이러한 결과는 p43 단백질이 세포고사를 유도한다는 것을 보여주는 것이다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 p43 전장 단백질이 사이토카인을 효과적으로 유도하여 면역 반응을 증가시키며, 종양 및 혈관생성을 효과적으로 억제할 수 있음을 보였다. 따라서, 본 발명의 p43 단백질은 이를 유효성분으로 하는 면역증강제, 종양 억제제 또는 혈관생성 억제제로 사용될 수 있다.

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 면역증강용 약학조성물.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 혈관생성 억제용 약학조성물.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 p43 단백질을 유효성분으로 하는 종양 억제제.