KR100397247B1 - 래비스바이러스를복제시키고이를정량적으로검출하기위한세포주및방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 영구 원숭이 신장(vero-M) 세포주로부터 기원한 영구 세포주에 관한 것이다. 이 세포주는 세포병리 효과(CPE)를 갖는 래비스 바이러스를 증식시키고 CPE의 수단에 의해 이를 민감하게 검출하는 것을 가능하도록 한다. 이 세포주를 사용함에 의해 래비스 바이러스를 증식시키고 검출하는 방법외에, 본 발명은 또한 예를 들어, 바이러스 수용체에 대한 리간드 또는 중화 항체와 같은 래비스 바이러스 복제 억제제를 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

광견병 바이러스를 복제시키고 이를 정량적으로 검출하기 위한 세포주 및 방법
본 발명은 감염성 광견병 바이러스를 복제시키기 위한 영구 세포주(permanent cell line) 및 방법과 이러한 세포주를 사용하는 세포병변 효과(CPE)에 의한 이의 정량적 검출 및 광견병 바이러스 복제 억제제를 검출하는 방법에 관한 것이다.
살아있는 세포는 단백질 및 바이러스 항원을 제조하기 위해 요구된다. 당해 분야에서, 이배체 세포주 또는 영구 세포주는 바람직한 단백질 또는 바이러스 항원을 제조하기에 적합한 경우 이러한 목적을 위해 사용된다. 이배체 세포주와 비교하여, 영구 세포주는 제한된 성장을 나타내지 않으므로, 즉 이들은 사멸되지 않으므로 유리하게 이용된다. 광범위한 계대배양 범위에 걸쳐, 이러한 영구 세포주는 세포 및 항원 복제와 관련된 항상성을 나타내는데, 이는 이러한 영구 세포주의 경우, 이배체 세포주에서와 같은 세포 분화가 일어나지 않기 때문이다. 이배체 세포주의 제한된 수명(계대배양 수)과는 별도의, 이들 세포주의 또 다른 심각한 단점은 이배체 세포주용 출발 물질로서 요구되는 기관, 조직 및 또한 닭 배아가 적절한 양으로 항상 유용하지 않다는 것이다. 더우기, 출발 물질은 잠복적으로 및/또는 드러나지 않게 바이러스, 마이코플라스마(mycoplasma) 및 세균에 의해 오염될 수 있으며, 이의 결과로 최적으로 재생 가능한 항원 생산이 보증되지 않는다.
광견병 바이러스가 다수 종에서 기원한 세포 배양물내에서 복제가능하다고 공지되어 있다고 해도, 세포병변 효과가 수득되었음을 나타내는 문헌은 단지 소수이다[참조: Egert et al., Acta Virol 33(1989), 353-358, Consales et al., J. Virol. Meth 27(1990), 227-286, Campbell and Charlton, in: Development in veterinary virology: Rabies Kluwer Academic Publishers, Boston, dordrecht, London, 1988]. 세포병변 효과(CPE)는 바이러스성의 특이적인 세포 파괴(분해)이며, 이는 광학 현미경하에서 용이하게 측정될 수 있다.
그러나, 일반적으로, 조직 배양물중 광견병 바이러스의 복제는 특정의 CPE 없이 진행되거나[참조: Campbell and Charlton(1988)], 바이러스성 세포병변 변화는 일정하지 않거나[참조: Kaplan and Koprowski, Laboratory techniques in rabies, III. Edit. Wld. Hlth. Org, Monograph Series 23, Geneva(1973)], 또는 단지 일시적으로 일어나기 때문에[참조: Smith et al., Intervirol. 8(1977), 92-99], 이들 세포주가 사용되는 경우 광견병 바이러스는 CPE를 평가함에 의해 확실하게 검출될 수 없다.
따라서, 본 발명은 상기 단점을 나타내지 않는 영구 세포주 및 방법을 제공하는 기술적 문제에 근거하며, 즉 이는 일반적으로 감염성 광견병 바이러스가 개선된 수율과 세포병변 효과(CPE)를 나타내면서 복제되도록 하고, 이들을 민감한 방식에 의해 정량적으로 검출하는데 사용할 수 있게 하는 것이다.
이러한 기술적 문제는 청구의 범위에서 특징화되는 양태를 제공함에 의해 해결된다.
놀랍게도, 세포병변 효과(CPE)를 갖는 광견병 바이러스는 신규한 영구 세포주 PH-2에서 고 수율로 복제됨이 밝혀졌다. 피코르나바이러스, 헤르페스바이러스, 파라믹소바이러스, 레오바이러스 및 토가바이러스와 같은 상이한 바이러스 군으로부터의 기타 바이러스 종이 또한 이 세포주내에서 복제될 수 있다. 이 세포주는 바이러스 항원의 생산 및 바이러스와 항체 검출 모두에 적합하다. 특히 라브도바이러스에 속하는 광견병 바이러스가 이러한 세포주내에서 복제되는 경우 항상 세포병변 효과(CPE)를 생성한다는 사실은 놀라운 것이며, 이의 결과로, 이러한 세포주는 광견병 바이러스 및 광견병 바이러스 항체를 단순히 검출하고 정량적으로 측정하는데 있어 특히 적합하다.
결과적으로, 본 발명은 영구 세포주 PH-2 및 이로부터 유도된 세포주에 관한 것이다. 세포주 PH-2는 브라운슈바이크(Braunschweig) 소재의 기탁기관(DSM Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen)에 기탁번호 제 DSM ACC 2165호로 기탁되어 있다.
바람직한 양태로서, 본 발명은 신규한 세포주를 복제시킬 바이러스로 감염시키고, 이를 적합한 조건하에서 배양하며, 이들이 충분히 고역가에 이른 후에 바이러스 입자를 분리 및 정제함을 포함하는, 세포병변 효과를 갖는 광견병 바이러스를 복제하는 방법에 관한 것이다.
당해 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 한외원심분리, 한외여과, 크로마토그래피등을 사용하여 상기 방법으로 수득된 바이러스 입자로부터 바이러스 항원을 분리 및 정제한 후, 화학적 또는 물리적으로 분해할 수 있다. 이러한 방법으로 수득된 항원은 특히 백신을 제조하거나 진단 목적으로 사용될 수 있다. 또한 바람직한 양태에서, 본 발명은 결과적으로 바이러스 입자가 수득된 후 바이러스 입자로부터 바이러스 항원을 분리 및 정제함을 포함하는, 광견병 바이러스 입자를 수득하기 위한 방법에 관한 것이다.
당해 분야에 공지된 세포주를 사용하는 경우 보다 신규한 세포주를 사용하는 경우 광견병 바이러스가 더욱 효율적으로 복제될 수 있을 뿐만 아니라, 세포병변효과도 동시에 일어날 수 있다는 사실은, 민감하고 단순한 방식으로 샘플중에서 광견병 바이러스를 검출하고 이들을 정량적으로 측정하는 것을 가능하도록 하는 것이다.
따라서, 추가의 바람직한 양태는 검출하고자 하는 광견병 바이러스를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플을 신규한 세포주와 접촉시키고 이 세포를 배양한 후 CPE의 현미경적 측정 수단에 의해 복제하는 바이러스를 검출하는 것을 포함하여, 세포병변 효과를 기본으로 하여 광견병 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법을 수행하기 위하여, 바이러스 샘플은 예를 들면, 미세역가 플레이트내로 배양된 세포 배양물 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 기타 세포 배양 용기에 가한 다음 실험이 끝날때까지 두거나 제공된 흡착 시간후 세포 배양 배지와 함께 제거하고 새로운 세포 배양 배지로 교체한다. 세포 배양물은 예를 들면 접종 후, 광학 현미경을 사용하여 CPE에 대해 5 내지 7일째까지 규칙적으로 실험한다.
특히 바람직한 양태로서, 신규한 검출 방법에 있어서, 검출 감도는 당해 분야의 기술[형광-항체 기술(FITC)]과 비교하여 대략 1 log10 단계가 높다.
이외에, 바이러스 복제의 억제제는 신규한 세포주를 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 억제제는 바이러스 복제의 모든 단계, 즉 흡착/침투, 바이러스 핵산 탈외피, 전사 및 해독외에 해독후 단백질 변형, 바이러스 조립 및 버딩(budding)에서 활성일 수 있다. 이와 관련하여, 억제제는 예를 들면, 중화 항체, 바이러스 및 세포 수용체에 대한 화학적 및 생물학적 리간드, 화학치료요법제 또는 인터페론이나 기타 사이토킨일 수 있다. 바이러스 복제의 억제는 청구된 세포주내에서 CPE의 부재하에 용이하게 측정할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 억제를 검출하는 실험이 어떻게 수행되는지를 알 것이다.
결과적으로, 본 발명은 신규한 세포주내에서 억제제의 존재하에 바이러스의 복제의 억제를 CPE의 부재에 의해 검출함을 포함하는 광견병 바이러스 복제의 억제제를 검출하기 위한 방법에 관한 것이다.
하기 실시예에서 본 발명을 예시한다.
실시예 1
PH-2 세포주의 수득
영구 세포주 PH-2를 개발하기 위하여, 말과의 원시 피부 세포를 연구소내에서 동시에 복제시킨 소수의 영구 원숭이 신장 세포(Vero M)와 혼합한다. 이를 수행한 후, Vero 세포와 형태학적으로 구별되는 세포가 말과의 피부 섬유아세포상에서 현저하게 생장한다. 이 세포를 분리하여 PH-2 세포라 명명한다.
PH-2 세포의 핵형을 표 1에서 Vero M 세포의 것과 비교한다. PH-2 세포는 염색체 전체량 및 이의 염색체 분포 패턴에 있어서 Vero M 세포와는 상이하다.
[표 1]
Figure pct00001
광견병 바이러스는 PH-2 세포주내에서 CPE를 나타내며 복제하고 이는 초기의 세포주(Vero)에서는 그렇지 않다.
실시예 2
닭 섬유아세포 배양물(표준 방법) 및 PH-2 세포 배양물중에서 광견병 바이러스인, 균주 Flury LEP(ATCC VR-138)의 역가 비교
닭 섬유아세포 배양물내에서 복제된 바이러스를 표준 산물(Behringwerke AG 공급원)로서 입수한다.
바이러스 역가를 측정하기 24시간 전에, 닭 섬유아세포를 프로토콜에 따라 미세역가 플레이트내에 접종한다. PH-2 세포는 적정이 시작되기 직전에 미세역가 플레이트에 둔다. 닭 섬유아세포의 경우, 세포를 접종하기 위한 배지는 1% 태 송아지 혈청(FCS) 및 NSP를 함유하는 배지 3이지만, PH-2 세포의 경우에는 EME 배지 및 2% FCS 와 NSP이다. 광견병 바이러스를 log10 단계에서 배지 3으로 희석시킨다. 각각의 희석 단계를 위해, 상응하는 배양물 타입 8개 웰에 200㎕의 희석물/웰을 접종한다. 이 배양물을 37℃에서 CO2인큐베이터내에서 항온처리한다.
닭 섬유아세포 배양물의 경우에, 역가는 시험을 개시한지 3 내지 5일 후부터 세포가 FITC-표지된 항체(형광 방법)로 염색된 후 판독하며; PH-2 배양물의 경우에는, 시험을 시작한 지 5 내지 7일째부터 CPE가 광견병 바이러스에 의해 유발되는 것을 기준으로 하여, 현미경적으로 판독한다. 역가는 카르버(Karber) 법으로 계산한다.
비교 역가의 결과를 하기 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
비교 시험으로부터 명백해지는 바와 같이, 현미경적 검측에 의한 PH-2 세포내에서 측정된 역가는 닭 섬유아세포에서 발견된 역가보다 평균 1 log10 단계 더 높다. 이것은 광견병 바이러스를 검출하기 위한 방법을 현저히 단순화시키는 것 외에, 또한 이 방법이 당해 분야에서 유용한 검출 방법보다 더욱 민감함을 입증한다.
실시예 3
PH-2 세포내에서 광견병 바이러스 복제(복제 곡선)
로욱스 디쉬(Roux dish)내에서 고밀도도 성장시킨 PH-2 세포를, 배지를 혈청이 없는 EME 배지로 바꾼 후, 광견병 바이러스로써 0.01의 감염다중도로 감염시키고 37℃에서 항온처리한다. 샘플을 표 3에 나타낸 시간 간격후 감염된 로욱스 디쉬로부터 제거하고 감염성 바이러스 입자의 함량을 측정한다, 밝혀진 값을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00003
표 3의 값으로부터 명백해지는 바와 같이, 광견병 바이러스는 PH-2 세포주내에서 고 역가로 복제될 수 있다. 따라서, 이 세포주는 광견병 바이러스 항원을 제조하는데 매우 적합하다.
실시예 4
상이한 PH-2 계대배양에 있어서 광견병 바이러스 역가의 재생성의 시험
동일한 광견병 바이러스 제제인, Flury LEP 균주를 사용하여 PH-2 세포의 36회, 85회 및 100회 계대배양시 역가를 측정한다.
하기 표 4는 일련의 시험 결과를 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00004
표의 결과로부터 명백해지는 바와 같이, 광견병 바이러스에 대한 PH-2 세포주의 감도는 시험된 계대배양 범위, 즉 36 내지 100회 계대배양에 있어서도 변하지 않는다.

Claims (6)

  1. PH-2로 지명된 영구 세포주(기탁 번호 제DSM ACC2165호) 또는 이로부터 유도된 세포주.
  2. (a) 제1항에 따른 세포주를 복제할 바이러스로 감염시키는 단계;
    (b) 이 세포를 배양하는 단계 및
    (c) 바이러스가 충분히 높은 역가에 도달한 후에 이 바이러스 입자를 분리 및 정제하는 단계를 포함하여, 세포병변 효과(CPE)를 나타내는 광견병 바이러스를 복제하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 단계 (c)이후, 추가로 바이러스 항원을 바이러스 입자로부터 분리시켜 정제하는 방법.
  4. (a) 세포주를 검출할 광견병 바이러스를 포함하는 것으로 여겨지는 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 이 세포를 배양하는 단계 및
    (c) 바이러스 감염에 의해 유발된 세포병변 효과를 현미경적으로 확인함에 의해 배양이 시작된 후 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 제1항에 따른 세포주내에서 바이러스의 복제에 의해 유발된 세포병변 효과를 기준으로 하여 광견병바이러스를 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 추가로 검출 감도가 형광-항체 기술(FITC)과 비교하여 대략 1 log10단계 더 높은 방법.
  6. 억제제의 존재하에 제1항에 따른 세포주내에서 바이러스 복제의 억제를 CPE의 부재에 의해 검출함을 포함하여, 광견병 바이러스 복제 억제제를 검출하는 방법.
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