JP3632032B2 - 狂犬病ウイルスの複製およびその定量的検出のための細胞系ならびに方法 - Google Patents

Description

本発明は、感染性狂犬病ウイルスの複製のための永久細胞系および方法、この細胞系を用いて細胞変性効果（CPE）によるその定量的検出方法、ならびに狂犬病ウイルスの複製阻害剤の検出方法に関する。
タンパク質およびウイルス抗原を産生させるためには生存細胞が要求される。現在の技術水準においては、この目的に二倍体細胞株または永久細胞系が、それらが所望のタンパク質またはウイルス抗原の産生に適当であることを条件に使用される。二倍体細胞株に比較して、永久細胞系ではそれらが際限なく増殖する、すなわち不死化されているという利点がある。このような永久細胞系では二倍体細胞株とは異なり細胞分化が起こらないので、永久細胞系は広い継代範囲にわたって、細胞および抗原複製に関して一定の性質を発揮する。二倍体細胞株はその限られた細胞寿命（継代数）に加えさらに、二倍体細胞株の出発材料として必要な臓器、組織およびニワトリの胚でさえも、適当な量が常に利用できるとは限らないという欠点がある。しかもこの出発材料は潜在的におよび／または不顯性に汚染されている（ウイルス、マイコプラズマおよび細菌により）場合があり、その結果、至適な再現性のある抗原の産生は保証されない。
一方、狂犬病ウイルスは、様々は種に由来する培養細胞中で複製できることは知られているが、細胞変性効果が得られたという文献中の報告はきわめて少ない（Egertら,Acta Virol.33:353−358,1989;Consalesら,J.Virol.Meth.27:227−286,1990;Campbell ＆ Charlton,Development in veterinary virology:Rabies Kluwer Academic Publishers,Boston,Dordrecht,London,1988）。細胞変性効果（CPE）とは、光学顕微鏡下に容易に検出できる、ウイルスに依存する特異的な細胞崩壊（溶解）である。
しかしながら一般に、狂犬病ウイルスの培養組織中での複製はCPEを全く伴わずに進行する（Campbell ＆ Charlton,1988）か、またはそれがあってもウイルス依存性の細胞変性的変化は不規則なものでしかない（Kaplan ＆ Koprowski,Laboratory techniques in rabies,III.Edit.Wld.Hlth.Org.Monograph Series 23,Geneva,1973）かもしくは一過性にしか起こらない（Smithら,Intervirol.8:92−99,1977）ので、これらの細胞系を用いた場合には、CPEの評価による狂犬病ウイルスの信頼できる検出は不可能である。
したがって本発明は、これらの欠点のない、すなわち一般的に、感染性狂犬病ウイルスの高感度での定量的な検出に使用できる改良された収率で細胞変性効果（CPE）を伴って感染性狂犬病ウイルスの複製を可能にする永久細胞系および方法の提供という技術的問題に基づくものであった。
この技術的問題は、請求の範囲に特徴づけられた具現的態様の提供により解決される。
驚くべきことに、細胞変性効果（CPE）を有する狂犬病ウイルスが、新規な永久細胞系PH−２において、高収率で複製できることが見出されたのである。異なるウイルス科からの他のウイルス種、たとえばピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルスおよびトガウイルスも同様にこの細胞系で複製可能である。この細胞系は、ウイルス抗原の産生およびウイルスと抗体の検出の両者に適している。とくにラブドウイルスに属する狂犬病ウイルスがこの細胞系内で複製された場合には常に細胞変性効果（CPE）を生じ、その結果として、この細胞系が狂犬病ウイルスおよび狂犬病ウイルス（中和）抗体の簡単な検出および定量的測定にとくに適していることは驚くべきことである。
したがって、本発明は永久細胞系PH−２およびそれに由来する細胞系に関する。細胞系PH−２は

BraunschweigにDSM ACC2165の受入番号で寄託されている。
本発明はその好ましい実施態様においては、細胞変性効果を有する狂犬病ウイルスを複製する方法において、新規な細胞系を複製すべきウイルスで感染させ、それを適当な条件下においてインキュベートし、ウイルス粒子が十分高力価に達したのち、ウイルス粒子を単離および精製することからなる方法に関する。
現在の技術水準において知られている方法、たとえば超遠心分離、限外ろ過、クロマトグラフィー等が、上記方法で得られついで化学的または物理的に崩壊させたウイルス粒子から、ウイルス抗原を単離および精製するために使用できる。この方法で得られたこれらの抗原はとくに、ワクチンの製造または診断の目的に使用できる。したがって、さらに他の好ましい実施態様においては、本発明は、狂犬病ウイルス粒子を得る方法において、それらが得られたのち、ウイルス粒子からウイルス抗原を単離および精製することからなる方法に関する。
狂犬病ウイルスは、本発明の新規な細胞系を用いると現在の技術水準で知られている細胞系を用いた場合に比べてより効率的に複製させることができるのみでなく、同時に細胞変性効果も生じるという事実は、サンプル中の狂犬病ウイルスを高感度の簡単な方法で検出すること、およびそれらを定量的に測定することを可能にする。
したがって、さらい他の好ましい実施態様は、細胞変性効果に基づいて狂犬病ウイルスを検出する方法において、新規な細胞系を検出すべき狂犬病ウイルスの含有が疑われるサンプルと接触させ、細胞をインキュベートし、ついでウイルスの複製をCPEの顕微鏡下での確認により検出することからなる方法に関する。この方法を実施するためには、ウイルスサンプルを、たとえばマイクロタイタープレートまたは本技術分野の熟練者には周知の他の細胞培養容器内に播いた培養細胞に添加し、実験終了時まで放置するかまたは与えられた吸着時間後に細胞培養培地とともに除去して新鮮な細胞培養培地で置換する。培養細胞は規則的に、たとえば接種後第５日〜第７日まで、光学顕微鏡を用いてCPEを検査する。
とくに好ましい実施態様においては、新規検出方法の検出感度は現在の技術水準［蛍光抗体法（FITC）］に比べてほぼ1log₁₀段階高い。
このほかに、新規な細胞系を使用するとウイルス複製の阻害剤の検出も可能である。これらの阻害剤は、ウイルス複製−吸着／侵入、ウイルス核酸の脱外被、転写および翻訳、ならびに翻訳後タンパク修飾、ウイルスのアッセンブリーおよび発芽のいずれの段階に対して活性であってもよい。この場合、阻害剤は、たとえば、中和抗体、ウイルスおよび細胞受容体に対する化学的もしくは生物学的リガンド、化学療法剤またはインターフェロンもしくは他のサイトカインであってもよい。ウイルス複製の阻害は、本発明の細胞系におけるCPEの不存在によって容易に検出できる。阻害の検出のための実験の実施方法は本技術分野の熟練者には周知の通りである。
したがって、本発明はまた、狂犬病ウイルスの複製の阻害剤の検出方法において、阻害剤の存在下における本発明の新規な細胞系でのウイルスの複製の阻害をCPEの不存在によって検出することからなる方法に関する。
以下の実施例は本発明を例示するものである。
実施例 １
PH−２細胞系の取得
永久細胞系PH−２を発生させるためには、一次ウマ皮膚細胞を、同時に実験室で複製させた数個の永久サル腎臓細胞（Vero M）数個と混合した。このようにすると、Vero細胞とは形態学的に識別できる細胞が驚くべきことに、ウマ皮膚線維芽細胞をオーバーグロウした。これらの細胞を単離して、PH−２と命名した。
PH−２細胞の核型構成をVero M細胞の場合と表１に比較する。PH−２細胞はVero M細胞と染色体付随体およびその染色体分布パターンが相違する。

狂犬病ウイルスはPH−２細胞系内で複製して細胞変性効果を生じるが、これは出発細胞系（Vero）には認められない。
実施例 ２
培養ニワトリ線維芽細胞（標準方法）および培養PH−２細胞内における狂犬病ウイルス株Flury LEP（ATCC VR−138）の力価の比較
培養ニワトリ線維芽細胞中で複製されたウイルスはBehringwerke AGの標準産物として得られた。
ニワトリ線維芽細胞は、ウイルスの力価測定の24時間前にプロトコールに従いマイクロタイタープレートに播いた。PH−２細胞は力価測定の開始直前にマイクロタイタープレートに沈着させた。ニワトリ線維芽細胞の場合は、細胞の接種用培地は１％ウシ胎児血清（FCS）およびNSPを含有する培地３とし、一方PH−２細胞の場合はEME培地ならびに２％FCSおよびNSPとした。狂犬病ウイルスは培地３にlog₁₀段階で希釈した。各希釈段階について、８ウエルの対応する培養型をウエルあたり200μｌの希釈液で接種した。培養液をついでCO₂インキュベーター中37℃でインキュベートした。
ニワトリ線維芽細胞の場合は、試験開始３〜５日後に細胞がFITC−抗体で染色されたならば力価を読み取った（蛍光法）。培養PH−２の場合は、試験後第５日〜第７日に狂犬病ウイルスによって生じたCPEに基づいて力価を顕微鏡によって読み取った。力価は

によって計算した。

比較試験から明らかなように、PH−２細胞において顕微鏡で測定された力価は、ニワトリ線維芽細胞で認められた力価より平均して1log₁₀段階高い。これは、狂犬病ウイルスの検出操作の著しい単純化に加えて、この方法が、現在の技術水準において利用可能な検出方法に比べて明らかに高感度でもあることを証明する結果である。
実施例 ３
PH−２細胞における狂犬病ウイルスの複製（複製曲線）
Rouxディッシュ中で濃密に増殖させたPH−２細胞を、培地を血清を含まないEME培地に交換したのち、狂犬病ウイルスによって感染多重度0.01で感染させ、37℃でインキュベートした。表３に示した時間間隔で感染Rouxディッシュからサンプルを採取し、感染ウイルス粒子の含量を測定した。得られた値を以下の表３に掲げる。

表３の値から明らかなように、狂犬病ウイルスはPH−２細胞系中において高力価に複製できる。すなわち、この細胞系は狂犬病ウイルス抗原の製造にきわめて適している。
実施例 ４
継代数の異なるPH−２における狂犬病ウイルス力価の再現性試験
同一の狂犬病ウイルスプレパレーション、Flury LEP株を用いて36,85および100回継代培養したPH−２細胞における力価を測定した。
以下の表４に一連の実験結果を示す。

この表の結果から明らかなように、狂犬病ウイルスに対するPH−２細胞系の感度は、試験した継代範囲すなわち36〜100継代数において変化なく維持されている。

Claims (5)

1. 名称PH−２（寄託番号:DSM ACC2165）の永久細胞系、または狂犬病ウイルスが細胞系において複製 された場合に細胞変性効果（CPE）を生じる、該永久細 胞系に由来する細胞系。
2. CPEをもつ狂犬病ウイルスを複製する方法において、
   ａ）請求項１記載の細胞系を複製すべきウイルスで感染させ、
   ｂ）上記細胞をインキュベートし、ついで
   ｃ）ウイルス粒子を単離および精製する
   ことからなる方法。
3. 請求項２において得られたウイルス粒子からウイルス抗原を単離し、精製することからなる狂犬病 ウイルスのウイルス抗原を産生する方法。
4. 請求項１記載の細胞系内におけるウイルスの複製によって生じる細胞変性効果に基づいて狂犬病ウイルスを検出する方法において、
   ａ）上記細胞系を検出すべき狂犬病ウイルスの含有が疑われるサンプルと接触させ、
   ｂ）上記細胞をインキュベートし、ついで
   ｃ）インキュベーシヨンの開始後、ウイルス感染によって生じるCPEを顕微鏡で確認することによってウイルスを確認する
   ことからなる方法。
5. 狂犬病ウイルスの複製の阻害剤を検出する方法において、阻害剤の存在下における請求項１記載の細胞系内でのウイルスの複製の阻害を、CPEの不存在によって検出する方法。