KR101618577B1

KR101618577B1 - 돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 상기 바이러스에 감염된 동물의 혈청 진단 방법

Info

Publication number: KR101618577B1
Application number: KR1020140099008A
Authority: KR
Inventors: 주한수; 정현규
Original assignee: 주식회사 한수양돈연구소
Priority date: 2014-08-01
Filing date: 2014-08-01
Publication date: 2016-05-18
Also published as: KR20160015963A

Abstract

본 발명은 돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 본 바이러스의 혈청 진단 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명은 1) PEDV(돼지 유행성 설사병 바이러스) RNA가 검출 확인된 시료들을 어린 돼지에 경구 접종후 설사 발현 초기에 장 융모(intestinal villi)를 함유하는 소장 내벽의 장 유제액을 수확하는 단계; 2) 상기 장 유제액의 PEDV를 조직 배양액으로 Vero 세포에 감염시키는 단계; 3) 상기 Vero 세포를 트립신이 함유된 배양 배지에서 세포 단분자막(monolayers)으로 계대 배양하는 단계; 및 4) 상기 Vero 세포의 계대 배양에서 PEDV 특이성 세포 변성 효과 (Cytopathic effects; CPE)를 나타내는 균주를 확인하는 단계;를 포함하는 PEDV의 분리 및 배양 방법, 상기 방법으로 분리된 PEDV 분리주를 연속적으로 저온에서 계대배양하여 저온 순화된(low temperature adapted) PEDV 균주의 제조 방법, 1) 상기 방법으로 분리된 PEDV 분리주를 FCS(fetal calf serum)가 함유된 배지에서 Vero 세포에 감염시키는 단계; 2) 상기 Vero 세포를 FCS가 결여되고 저량의 트립신이 함유된 배지에서 바이러스를 증식 계대시키고, 최종적으로 트립신이 결여된 배지에서 PEDV가 증식할 수 있도록 상기 Vero 세포를 연속적으로 배양하는 단계; 및 3) 상기 Vero 세포를 점차 FCS 농도가 증가하는 혈청이 함유된 배지에서 배양함으로써 PEDV를 증식시키는 단계;를 포함하는 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)의 제조 방법, 1) 상기 방법으로 제조된 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)를 Vero 세포에 감염시키고 초기 세포 변성(cytopathic effects; CPE)시키는 단계; 및 2) 상기 세포 변성된 Vero 세포로부터 PED rSerum 바이러스의 외피 단백질을 추출하는 단계;를 포함하는 PED rSerum 바이러스의 외피 단백질의 추출방법, 및 1) 상기 방법으로 제조된 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)를 Vero 세포에 감염시키고, 상기 감염된 Vero 세포를 고정하는 단계; 2) 상기 고정된 Vero 세포를 시험하고자 하는 돼지 혈청으로 희석시키는 단계; 및 3) 상기 희석된 Vero 세포를 복제된 바이러스 역적정(back-titration), 형광색소 또는 효소가 결합된 항-돼지(anti-swine) IgG를 반응시켜 Vero 세포가 발색되도록 유도 및 ELISA와 방사성 면역 확산의 원리가 결합된 방사성 면역 확산 효소 분석법(RIDEA = radial immunodiffusion enzyme assay) 중에서 선택된 어느 한 방법에 의한 PED 바이러스 혈청 내성주를 이용한 PED 바이러스 감염된 돼지의 항체 측정 방법을 제공한다. 본 발명에 의한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 항체 측정 방법은 돼지 전염성 설사 질병의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체와 면역학적으로 결합성이 있는 시료내의 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 존재를 경제적이며 간편하게 진단할 수 있다.

Description

돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 상기 바이러스에 감염된 동물의 혈청 진단 방법 {Methods for isolation and propagation of PEDV, preparations of low temperature adapted and serum resistant PEDV strains, extraction of PEDV envelope proteins, and methods for antibody tests to PEDV in swine serum}

본 발명은 야외 감염 시료로부터 돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 돼지 유행성 설사병 바이러스에 감염된 동물의 혈청 진단 방법에 관한 것이다.

코로나 바이러스에 의한 돼지의 주요 전염병의 원인체로는 돼지 유행성설사병 바이러스(Porcine epidemic diarrhea virus; PEDV), 전염성 위장염 바이러스(Transmissible gastroenteritis virus; TGEV), 돼지 호흡기 코로나 바이러스(Porcine respiratory coronavirus; PRCV) 등이 있으며, 이중 PEDV와 TGEV는 국내에서도 오래 전부터 매년 발생하면서 양돈 산업에 막대한 피해를 입히고 있다.

돼지 유행성 설사병 (Porcine Epidemic Diarrhea, PED)은 유럽에서 처음 발생되었으며 한국을 비롯한 여러 아시아 각국에 수년 전부터 많은 피해를 주고 있다. 특히 이 병은 최근에 미국, 캐나다 및 남미 일부 국가에까지도 퍼져 세계적인 관심이 집중되고 있다.

PED 바이러스에 감염된 농장에서는 1주령 이내의 자돈에서는 구토와 심한 설사 증상을 보이며 거의 100% 치사율을 보인다. 신생 자돈 폐사는 4-8주간 지속되며 어미 돼지가 감염되어 만들어진 항체 초유를 먹은 돼지에서는 폐사가 예방될 수 있다.

현재 본 병을 예방할 수 있는 백신이 만들어져 판매되고 있으나, 충분한 방어 효과를 주지 못하므로 양돈 농가에서는 PED 바이러스가 감염된 자돈의 분변 또는 장 유제액을 만들어 분만 전 임신돈에 인공감염 시킴으로서 모돈이 면역 항체를 형성하게 하고 초유를 통해 자돈에 먹게 함으로서 질병으로부터 방어하게 한다. 그러나 이 인공감염 과정 또한 복잡하고 균일하게 실시하지 못함으로써 충분한 방어효과를 보지 못하는 농가가 많다.

아울러, PEDV는 치료가 불가능하기 때문에 예방과 차단방역을 통하여 피해를 경감케 하고 있다. 본 바이러스의 특성상 실험실내 진단이 용이치 않으며 돼지 전염성 위장염 바이러스 감염증과 임상증상이 동일한 관계로 진단상 많은 문제점을 안고 있다. 게다가, PEDV의 진단을 위하여 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR, Kweon et al., J. V. M. S, 59(3): 231-232, 1997) 법인데, 이 방법은 진단과정에 소요되는 장비가 고가이고, 전문기술을 필요 로하며, 진단상 고가의 효소 및 제반비용으로 진단 비용이 많이 들고 야외에 적용하기에는 적당하지 않은 것이 현실이다.

오늘날 시판되고 있는 백신 주는 종자 바이러스가 오래전에 분리되었고 조직배양세포에 장기간 계대 배양되고 순환과정을 거치는 동안 본 바이러스의 방어 항원이 변질되었거나 방어 항원량이 부족하여 만족할만한 효과를 얻지 못하는 걸로 알려지고 있다.

이에, 본 발명자들은 PEDV를 손쉽게 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 송아지 혈청(FCS) 없이 트립신의 첨가 배지에서만 증식하던 PED 바이러스를 트립신 없이 혈청이 존재하는 상태의 PEDV 혈청 내성 순화주 (PEDV rSerum)를 제조하고, 상기 PEDV 혈청 내성 순화주를 이용하여 고농도의 PED 바이러스 외피단백질을 만드는 법을 고안하였으며, 상기 PEDV 혈청 내성 순화주가 감염된 Vero 세포를 면역형광항체법 (immunofluorescent antibody, IFA) 또는 면역효소법(immunoperoxidase monolayer antibody, IPMA)을 이용하여 감염 후 돼지에서 생성되는 항체 측정법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지유행성 설사병 바이러스 분리와 배양법, 저온 순화주와 혈청 내성주(PEDV rSerum주) 제조법, 상기 바이러스의 외피 단백질의 추출방법 및 상기 혈청 내성주를 Vero 세포에 감염시키고 이것을 시험하고자하는 돼지 혈청으로 희석시킨 후, 상기 Vero 세포를 형광색소 또는 면역 효소 PED 바이러스 감염된 돼지로부터 본 바이러스의 혈청 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) PEDV(돼지 유행성 설사병 바이러스) RNA가 검출 확인된 시료들을 어린 돼지에 경구 접종후 설사 발현 초기에 장 융모(intestinal villi)를 함유하는 소장 내벽의 장 유제액을 수확하는 단계; 2) 상기 장 유제액의 PEDV를 조직 배양액으로 Vero 세포에 감염시키는 단계; 3) 상기 Vero 세포를 트립신이 함유된 배양 배지에서 세포 단분자막(monolayers)으로 계대 배양하는 단계; 및 4) 상기 Vero 세포의 계대 배양에서 PEDV 특이성 세포 변성 효과 (Cytopathic effects; CPE)를 나타내는 균주를 확인하는 단계;를 포함하는 PEDV의 분리 및 배양 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 분리된 PEDV 분리주를 연속적으로 저온에서 계대배양하여 저온 순화된(low temperature adapted) PEDV 균주의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 1) 상기 방법으로 분리된 PEDV 분리주를 FCS(fetal calf serum)가 함유된 배지에서 Vero 세포에 감염시키는 단계; 2) 상기 Vero 세포를 FCS가 결여되고 저량의 트립신이 함유된 배지에서 바이러스를 증식 계대시키고, 최종적으로 트립신이 결여된 배지에서 PEDV가 증식할 수 있도록 상기 Vero 세포를 연속적으로 배양하는 단계; 및 3) 상기 Vero 세포를 점차 FCS 농도가 증가하는 혈청이 함유된 배지에서 배양함으로써 PEDV를 증식시키는 단계;를 포함하는 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 1) 상기 방법으로 제조된 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)를 Vero 세포에 감염시키고 초기 세포 변성(cytopathic effects; CPE)시키는 단계; 및 2) 상기 세포 변성된 Vero 세포로부터 PED rSerum 바이러스의 외피 단백질을 추출하는 단계;를 포함하는 PED rSerum 바이러스의 외피 단백질의 추출방법을 제공한다.

본 발명은 1) 상기 방법으로 제조된 PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)를 Vero 세포에 감염시키고, 상기 감염된 Vero 세포를 고정하는 단계; 2) 상기 고정된 Vero 세포를 시험하고자 하는 돼지 혈청으로 희석시키는 단계; 및 3) 상기 희석된 Vero 세포를 복제된 바이러스 역적정(back-titration), 형광색소 또는 효소가 결합된 항-돼지(anti-swine) IgG를 반응시켜 Vero 세포가 발색되도록 유도 및 ELISA와 방사성 면역 확산의 원리가 결합된 방사성 면역 확산 효소 분석법(RIDEA = radial immunodiffusion enzyme assay) 중에서 선택된 어느 한 방법에 의한 PED 바이러스 혈청 내성주를 이용한 PED 바이러스 감염된 돼지의 항체 측정 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명과 직접적으로 관련이 있는 학술적 배경과 본 발명의 장점을 다음과 같이 기술하고자 한다.

1) 야외 농장 시료로부터 PEDV 분리법

PEDV는 다른 바이러스와 달리 분리 및 배양이 아주 어려우므로, 이 바이러스에 감염진단을 위해서는 PCR법에 주로 의존한다. 본 바이러스 분리율에 관한 발표 논문은 없지만, PEDV PCR 양성 시료 100 개 이상을　배양했을 때, 1개 시료 정도가 분리 배양이 성공되는 걸로 알려지고 있다. 실제 우리나라에서 지난 10여년 이상 동안 다만 2건의 분리 배양 보고만 있을 뿐이다 (권창희, 박봉균).

그러나, 본 바이러스와 배양세포의 특성을 잘 이해함으로서 분리 및 배양 성공률을 높일 수 있다는 것을 본 발명을 통해 확인할 수 있다. 본 발명은 신선한 바이러스를 분리 재료로 준비, 세포 배양법, 감염 세포 계대법을 개선하여 성공률이 높은 분리법을 제공한다.

2) PEDV 저온 순화주 제조(low temperature sensitive mutant)

일반적으로 바이러스가 잘 자랄 수 있는 적정 온도는 37℃이나, 어떤 바이러스는 저온(32℃)에 장기간 순화시킴으로써 37℃에서는 바이러스의 증식이 현저하게 저하되는 특성을 보인다. 이와 같이 만들어진 온도 민감 돌연변이주(temperature sensitive mutant)들은 병원성이 저하된 상태에서 비강 접종용 백신으로 응용되어 지고 있다. 실제 신체 부분 중 비강 내 온도가 최저임으로 비강 내에서 증식으로 높은 점막 면역(mucosal immunity)을 생성하는데 목표를 두고 있다. 이들 저온 순화주의 이용은 인플루엔자 바이러스를 이용하여 이미 많은 연구가 이루어져 있고 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자(parainfluenza)-3 바이러스, 라이노바이러스(rhinovirus), EHV(equine herpes virus) 등을 이용한 보고가 있으나, PED 바이러스에 대한 보고는 아직 없다.

본 발명은 PEDV를 32℃에 순화 배양하고, PEDV 저온 순화주(low temperature sensitive PEDV mutant)를 제조하고, 나아가서는 비강 접종용 PEDV　백신으로 응용 하고자 한다.

3) PEDV 혈청 내성 순화주 (PEDV rSerum）제조

PED 바이러스를 증식시키기 위해서는 원숭이 콩팥세포(Vero)의 배양이 필수적이고 Vero 세포 배양을 위해서는 배지에 주 영양소로서 2-10%의 송아지혈청 (fetal calf serum; FCS)의 첨가가 또한 필수적이다. 실험실에서 일반적으로 PEDV 의 배양 증식을 위해서는 FCS 첨가 없이 트립신(Trypsin)만 첨가된 배지를 사용하고 있다. 이는 FCS 성분이 트립신의 작용을 억제하고 Vero 세포의 수용체(receptors)를 차단하여 PEDV의 세포 접촉 감염을 억제하기 때문이다.

현재 PEDV에 감염된 돼지의 중화 항체 역가를 측정하기 위해서는 FCS 없이 트립신이 첨가된 배지를 사용해야 하고 또한 검사용 돼지혈청 자체가 바이러스 증식을 억제함으로써 여러 단계 세척 과정을 거처야 하며 복잡하면서 많은 시간이 소요 된다. 따라서 본 바이러스가 트립신 없이 혈청이 존재하는 상태 (혈청 내성주; PEDV ｒSerum) 에서도 잘 증식할 수 있다면 혈청 중화법의 이용이 간편하게 된다. 또한 PEDV ｒSerum을 이용하면 Vero 세포를 동시에 배양할 수 있음으로 많은 이점이 있다.

4) PEDV　외피 단백질 추출법

PEDV의 방어 항원은 코로나 바이러스의 특성상 외피 단백질 (envelope proteins)에 있으며 그중에서도 스파이크 단백질(Spike proteins)이 중요한 것으로 알려지고 있다. 그러므로 다량의 PEDV 외피 단백질을 효과적으로 생산할 수 있는 방법의 확립이 본 바이러스 단백질 백신 개발을 위한 핵심이 될 수 있다. 또한 이들 외피 단백질을 이용 하여 본 바이러스 감염에 대한 항체 검사법을 개발할 수 있다. 본 발명을 통해 감염된 Vero 세포막에 축적된 PEDV 외피 단백질을 추출할 수 있는 기법을 고안하였다.

5) 돼지 혈청 내 PEDV 감염후 항체 검사법

PEDV 감염된 돼지에서 생기는 항체는 ELISA, 면역형광항체(Immunofluorescent antibody: IFA), 또는 혈청 중화(Serum neutralization: SN) 시험법으로 검사하고 있다. 이들 3가지 방법 중 중화 시험법은 살아있는 PEDV를 항원으로 사용함으로 방어능력을 측정하는데 중요한 지표로 알려지고 있다. 그러나 트립신을 사용해야 한다는 바이러스의 특성상 검사 과정이 복잡하고 예민성이 좋지 못해 낮은 역가의 결과를 나타낸다. 따라서 본 발명에서는 PEDV 혈청 내성 주 (PEDV rSerum)를 만들고 트립신 첨가 없이도 혈청 중화 시험을 할 수 있음으로 간편하고 높은 예민성의 결과를 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서 PED 바이러스 혈청 내성 주를 Vero 또는 MARC-145 세포에 감염시키고 시험하고자 하는 돼지 혈청으로 희석시킨 후, 상기 세포를 면역효소로 PED 바이러스 항체를 측정하는 돼지 유행성 설사병 바이러스의 진단 방법을 확립 하였다.

본 발명은 1) PEDV(돼지 유행성 설사병 바이러스) RNA가 검출 확인된 시료들을 어린 돼지에 경구 접종후 설사 발현 초기에 장 융모(intestinal villi)를 함유하는 소장 내벽의 장 유제액을 수확하는 단계; 2) 상기 장 유제액의 PEDV를 조직 배양액으로 Vero 세포에 감염시키는 단계; 3) 상기 Vero 세포를 트립신이 함유된 배양 배지에서 세포 단분자막(monolayers)으로 계대 배양하는 단계; 및 4) 상기 Vero 세포의 계대 배양에서 PEDV 특이성 세포 변성 효과 (Cytopathic effects; CPE)를 나타내는 균주를 확인하는 단계;를 포함하는 PEDV의 분리 및 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 PEDV의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 1) 단계의 어린 돼지는 3-7일 령인 것이 바람직하고, 상기 2) 단계의 PEDV의 Vero 세포에 감염은 장 유제액을 10 ㎍/㎖의 트립신(trypsin)이 첨가된 조직 배양액 (MEM, minimal essential medium)에 1:5 내지 1:10으로 현탁액으로 이루어지는 것이 바람직하고, 상기 2) 단계의 Vero 세포는 장 유제액 접종 전 트립신이 결여되고 FCS와 항생제가 보충한 MEM 배지를 사용하여 3-7일령이 되도록 배양한 후 MEM, TPB(Tryptose phosphate broth) 및 트립신을 함유한 세척배지로 세척하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 PEDV의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 3) 단계의 단분자막은 3-7일 령의 Vero 세포 단분자막인 것이 바람직하고, 상기 3) 단계의 단분자막의 계대 배양은 37℃에 1시간 동안 흡착시킨 후, MEM, TPB 및 5-10 ㎍의 트립신을 함유한 배양 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하는 것이 바람직하고, 이때 상기 배양은 배양 배지를 매일 갈아주어 상기 Vero 세포를 건강한 세포로 유지하며 5-7일간 배양하며 감염세포를 긁어 세포 부유액을 새로운 세포에 접종 계대 시키는 것이 보다 바람직하며, 상기 TPB는 트립톤(tryptose), 포도당, NaCl(Sodium chloride), 2가 염기의 인산나트륨(dibasic Sodium phosphate) 및 증류수로 이루어지는 것이 더더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 PEDV의 분리 및 배양 방법에 있어서, 상기 4) 단계의 CPE 확인은 PCR법 양성 여부를 확인하고, 부분(partial) 또는 전장(Full-length) 서열 결정(sequencing)으로 확정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 저온 순화된(low temperature adapted) PEDV 균주의 제조 방법에 있어서, 상기 저온 계대배양은 34℃에서 2~10번 계대배양 후, 32℃에서 30~70번 계대배양하는 것이 바람직하다.

본 발명의 ED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV rSerum)의 제조 방법에 있어서, 상기 2) 단계의 저량의 트립신은 5 ㎍/㎖ 이하이고, 상기 배지는 FCS이 함유하는 MEM(minimum essential medium)인 것이 바람직하고, 상기 3) 단계의 FCS 농도는 1%에서 10%로 점차적으로 늘려 계대배양되는 것이 바람직하다.

본 발명의 PED rSerum 바이러스의 외피 단백질의 추출방법에 있어서, 상기 초기 세포 변성은 10~20%인 것이 바람직하고, 상기 추출된 PEDV의 외피 단백질은 웨스턴 블럿(Western blot)법을 이용하여 단백질을 분획시키고 PED에 회복된 돼지 항혈청을 감작시켜 확인하고 희석 배수에 따라 단백질의 농도를 정량하는 것이 바람직하다.

본 발명의 PED 바이러스 혈청 내성주를 이용한 PED 바이러스 감염된 돼지의 항체 측정 방법에 있어서, 상기 3) 단계의 효소는 퍼옥시다제(Peroxidase)인 것이 바람직하다.

상기와 같이 구성되는 본 발명에 의한 돼지 유행성 설사병 바이러스의 항체 측정 방법은 돼지 전염성 설사 질병의 원인체인 돼지 유행성 설사병 바이러스 항체와 면역학적으로 결합성이 있는 시료내의 돼지 유행성 설사병 바이러스 항원의 존재를 경제적이며 간편하게 진단할 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 더욱 구체적으로 제시하여 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 이하의 실시예는 이 기술 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 상기와 같은 실시예들에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 야외 재료로부터 PED 바이러스 분리 및 배양법

우선 PEDV를 분리하고자 하는 야외 시료에 높은 역가의 살아있는 PED 바이러스가 있어야 한다. 보통 qPCR에서는 PEDV RNA양을 cT 수치로 표시하여 측정하지만 정확한 방법은 감수성 있는 돼지에 직접 감염시켜 돼지 감염량(Pig infective dose) 시험을 해 보아야 한다.

본 발명에서는 야외 시료에서 PEDV RNA가 검출 확인된 재료들을 3일령 돼지에 각각 경구 접종한 후 설사 발현 초기에 소장 내벽(장 유제액)을 긁어 사용하였다. 따라서 시료내 생존 바이러스 양이 최고로 달한 재료라 볼 수 있다. 이들 소장 재료는 10 ㎍/㎖의 트립신(trypsin)이 첨가된 조직 배양액 (MEM, minimal essential medium)에 1:5 또는 1:10으로 현탁액을 만들고 3-7일 동안 배양된 Vero 세포에 감염시켰다. 이때 Vero 세포는 24-웰 세포 배양 플레이트에 8% FCS와 항생제를 보충한 MEM을 이용하여 3-7일령이 되도록 미리 준비 해두어야 하며, 장 유제액 접종 전에 세척배지 (WM 배지 - MEM 450 ㎖ + TPB 50 ㎖ + 트립신 1.0 ㎍)으로 2회 세척하였다. 장 유제액이 접종된 (0.2 ㎖/well) Vero 세포 단분자막(monolayers)은 37℃에 1시간 동안 흡착시키고 1.5 ㎖/well의 배양 배지를 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이때 단분자막 상태에 따라서 5-10 ㎍ 트립신이 함유한 배양 배지(CM 배지 - MEM 450 ㎖ + TPB 50 ㎖ + 트립신 5.0 - 10 ㎍)을 매일 갈아주면서 건강한 세포로 유지하면서 5-7일간 배양하였다.

이때, 상기 TPB(Tryptose phosphate broth)는 Teknova Cat No. T0800으로 그 성분은 2.0% 트립톤(tryptose), 0.2% 포도당, 0.5% NaCl(Sodium chloride), 0.25% 2가 염기의 인산나트륨(dibasic Sodium phosphate), 500 ㎖ 증류수로 이루어지고, 실온에서 여과 및 저장하였다.

초대 배양에서는 PEDV 특이성 세포 변성 효과 (Cytopathic effects; CPE)가 나타나지 않는 것이 보통이다. 이들 감염 재료를 계대배양 시에는 3-7일령된 Vero 세포 단분자막을 세척 배지로 2회 세척 후 감염시킨 부유액 (세포 상층액 1 ㎖/well을 제거하고 바닥 세포를 긁어 세포와 남은 배양액 0.5 ㎖에 부유) 0.2 ㎖/well을 접종하고 37℃에 1시간 흡착 후 배양 배지를 주입하였다. 이와 같은 방법으로 5회 까지 계대 후 PEDV CPE가 보이지 않을 경우에 바이러스 분리 음성으로 간주하였다. 일단 PEDV CPE가 보이는 시료를 PCR법으로 양성을 확인하고 부분(partial) 또는 전장(Full-length) 서열 결정(sequencing)을 해서 PEDV로 확정하였다.

본 발명에서 상기 방법을 이용해서 6개 시료를 분리 시도한 결과 한 개 시료 에서 (PEDV HS-1 - PEDV　cT value 16.4) 2대째 또 다른 한 개(PEDV HS-2 - PEDV cT value 15.4)에서 4대째 PEDV 특이적 CPE가 관찰되었다. PEDV HS-1 균주는 전체 RNA 게놈 28,033 뉴클레오티드를 서열 결정하고 PEDV로 유전자 은행에 등록하였다.

<실시예 2> PED 바이러스 저온 순화주 고안

PEDV 분리주 (PEDV　HS-1, 3번 계대)를 3-7일 령의 Vero 세포 단분자막에 접종하고 34℃에 배양 (5번 계대, 전체 25일 배양)하고 온도를 더 낮추어 32℃에 (45번 계대, 전체 96일 배양) 연속 계대배양 한 후 저온 순화된(low temperature adapted) PEDV 균주를 완성시켰다. 이와 같이 저온에 순화된 바이러스를 각각 다른 온도에서 감염 역가를 측정한 결과 하기 표 1과 같은 결과를 얻었다. PEDV 저온 순화주 (PEDV　HS-1 32℃, 45번 계대)는 낮은 온도 (32℃)에서 높은 역가를 보였으나 37℃에서는 현저하게 낮은 역가를 보였다.

저온 순화주의 Vero 세포에서 온도별 감염역가

EDV 균주	테스트 온도	감염 역가(TCID50/0.1 ㎖)
HS-1 37℃ 3번 계대	37℃	5.5
HS-1 34℃ 5번 계대	37℃	4.5
HS-1 32℃ 45번 계대	37℃	1.0
HS-1 32℃ 45번 계대	32℃	5.0

<실시예 3> PED 바이러스 혈청 내성주 (PEDV serum resistant: PEDV rSerum) 고안

PEDV HS-1 균주를 5% FCS가 함유된 배지(minimum essential medium, MEM)를 이용하여 3-5일간 증식된 Vero 세포에 감염하고 37℃에 1시간 흡착한 후 MEM 배지에 FCS 없이 트립신 농도를 낮추어 (최종농도 5 ㎍/㎖)을 넣어 바이러스를 증식 계대시켰다. 이때 Vero 세포는 바이러스 감염 전 먼저 혈청 없는 MEM으로 2-4회 세척하여 잔유 FCS를 완전히 제거하여야 한다. 이와 같이 바이러스 계대 중 트립신의 농도를 5 ㎍/㎖에서 단계적으로 낮추어 트립신이 완전히 없는 상태에서도 PEDV가 증식할 수 있도록 연속적으로 배양하였다. 그 다음 단계에서는 PEDV가 배지 내 트립신이 없으면서 혈청이 함유되더라도 증식할 수 있도록 1%에서 10%로 점차적으로 늘려 FCS이 함유된 배지를 이용하여 PEDV가 증식할 수 있도록 순화주를 만들고 마지막 PEDV HS-1 rSerum 균주가 작성되었다.

<실시예 4> PED 바이러스의 외피 단백질 추출

외피단백질을 가진 바이러스들이 세포 속에 들어가 증식되어 세포 밖으로 나오기 전에 세포막에 집결되는 과정을 이용하여 일단 PED 바이러스를 Vero 세포에 감염시키고 초기 세포 변성(<20% cytopathic effects)이 일어났을 때 세포를 긁어 감염된 세포를 모은 후 원심과정을 통해 상층액을 버리고 남은 감염 세포를 회수하였다. 이때 세포변성이 80% 이상이 되면 모든 바이러스가 세포 밖으로 유출됨으로 바이러스의 농축이 거의 불가능하다.

감염된 세포양의 tris/EDTA 용액내 5-10 배의 0.5% 트리톤(triton) X-100을 넣고 4-25℃에서 15-24시간 동안 교반시켰다 (참조 : HS Joo, Molitor TW and Leman AD(1984) Radial immunodiffusion enzyme assay for detection of antibodies to pseudorabies virus. Am J Vet Res 45:2096-2098). 그 이후 용액을 3,000 rpm에 30분간 원심하고 상층액을 외피단백질 항원으로 사용하였다. 이때 단백질의 정성분석은 웨스턴 블럿(Western blot)법을 이용하여 단백질을 분획시키고 PED에 회복된 돼지 항혈청을 감작시켜 확인하고 희석 배수에 따라 단백질의 농도를 정량하였다.

<실시예 5> PED 바이러스 감염 후 돼지에서 항체측정법

감염된 돼지의 항체를 측정하기 위해서는 ELISA 또는 중화 항체법 (참조: (2) JS Oh, DS Song, JS Yang 등 (2005) Comparison of an ELISA with serum neutralization test for serodiagnosis of PEDV infection. Vet Sci 6(4) 349-352)들이 사용되나 과정이 복잡하여 보다 간편한 방법이 요구된다. 본 발명은 PEDV rSerum 바이러스를 이용하여 혈청 중화 시험법을 간편화하였다. 실제 많은 실험실에서 오 등(2005)이 보고한 방법을 개량하여 하기와 같이 검사를 실시하고 있다.

5-8% FCS와 항생제가 보충된 MEM을 사용한 96-웰 플레이트내에 2-5일 령 Vero 세포를 준비한다. 새로운 96-웰 마이크로플레이트에 0.1 ㎖의 MM을 첨가하고 연속적인 2-배 희석으로 1:2에서 1: 256으로 각 테스트 혈청 (0.1 ㎖)을 희석한다 (혈청 시료당 8웰). MM내 PEDV의 최적 희석을 제조하고, 모든 웰에 PEDV를 첨가한다. 상기 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 잘 교반하여 배양한다. 1시간이 되기 전에, 0.2 ㎖의 WM으로 2번 Vero 세포 플레이트를 세척한다. 혈청 및 바이러스 혼합액 0.1 ㎖을 Vero 세포 플레이트로 옮겨 감염시킨다 (낮은 혈청 희석으로 출발). 동일한 Vero 세포 플레이트중의 하나에 복제된 바이러스 역적정(back-titration)을 수행하고, 0.1 ㎖의 Vero 세포를 각 희석된 바이러스에 첨가한다. (상기에서 사용된 바이러스의 원액, 1:10, 1:100, 1:1,000 & 1:10,000으로 희석) 1시간 동안 37℃에서 상기 플레이트를 배양한다. 0.2 ㎖의 WM 배지로 2번 Vero 세포 플레이트 (혈청-바이러스 혼합액)를 세척한다. 각 웰에 0.2 ㎖의 MM을 첨가하고 37℃에서 배양한다. 역적정 웰에서 매일 CPE를 관찰한다. CPE가 바이러스 역적정의 1:10 희석에서 관찰될 때, SN 결과를 결정한다.

본 발명에서는 시험 단계를 줄이고 PEDV rSerum을 사용하여 하기와 같이 간편하고 용이하게 검사할 수 있도록 개량하였다.

1. 96-웰 마이크로플레이트내에 트립신 없이 5% FCS가 보충된 0.1 ㎖ MEM을 첨가하고 연속적인 2-배 희석으로 1:2에서 1: 256으로 각 테스트 혈청 (0.1 ㎖)을 희석하였다 (혈청 시료당 8웰).

2. PEDV rSerum 희석액이 MEM에서 50-100 TCID50가 되도록 제조하고 모든 웰에 바이러스 0.1 ㎖을 첨가하였다.

3. 상기 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 잘 교반하여 배양하였다.

4. 5% FCS를 갖는 MEM에서 2 x 10⁵/㎖ 의 농도에서 0.1㎖ Vero 세포를 첨가하였다.

5. 복제된 바이러스 역적정(back-titration)을 수행하고, 0.1 ㎖의 Vero 세포를 각 희석된 바이러스에 첨가하였다.

6. 역적정 웰에서 매일 CPE를 관찰하였다. CPE가 바이러스 역적정의 1:10 희석에서 관찰될 때, SN 결과를 결정하였다.

또 다른 방법으로는 PEDV rSerum가 감염된 Vero 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 만들어 50% 아세톤으로 고정시켜 검사 플레이트를 만들고 시험 혈청을 1:4, 1:16, 1:64, 1:256 .... 으로 희석하여 검사 플레이트에 감작시키고 2회 세척 후 형광색소 또는 효소(Peroxidase)를 붙인 항돼지(anti-swine) IgG를 반응시켜 발색이 되는 세포는 항체 양성으로 판독하게 하였다.

또 다른 방법으로는 돼지 가성광견병 바이러스의 항체 검사를 위해 개발된 방사성 면역 확산 효소 분석법(RIDEA = radial immunodiffusion enzyme assay, 주 등 1984)과 본 발명에서 기술한 PEDV 외피 단백질을 이용하여 돼지에서 PEDV 항체를 검사할 수 있는 법을 개발하고 PEDV 항체 테스트 RIDEA법을 표준화시켰다. 상기 분석법은 ELISA와 방사성 면역 확산의 원리를 결합한 것이다. 항원과 항체의 하룻밤 동안의 반응 이후에 칼라 원형 지역의 직경을 측정함에 의해 PEDV 항체의 역가의 정량화를 측정하였다. 방사성 면역 확산 효소 분석법의 특이성 및 민감성을 표준 바이러스-중화 테스트 방법과 비교하였고, 그 결과 높은 상관관계를 측정하였다 (r = 0.694, P less than 0.0001). PEDV　RIDEA법은 반복시 같은 결과를 보여 주며 수행하기가 용이함이 나타났다.

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이상, 본 발명의 바람직한 실시 예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims

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1) PEDV(돼지 유행성 설사병 바이러스) RNA가 검출 확인된 시료들을 어린 돼지에 경구 접종후 설사 발현 초기에 장 융모(intestinal villi)를 함유하는 소장 내벽의 장 유제액을 수확하는 단계;
2) 상기 장 유제액의 PEDV를 조직 배양액으로 Vero 세포에 감염시키는 단계;
3) 상기 Vero 세포를 트립신이 함유된 배양 배지에서 세포 단분자막(monolayers)으로 계대 배양하는 단계; 및
4) 상기 Vero 세포의 계대 배양에서 PEDV 특이성 세포 변성 효과 (Cytopathic effects; CPE)를 나타내는 균주를 확인하는 단계;를 포함하는 PEDV 분리주를 연속적으로 32~34℃에서 계대배양하여 저온 순화된(low temperature adapted) PEDV 균주의 제조 방법.
제 10항에 있어서, 저온 계대배양은 34℃에서 2~10번 계대배양 후, 32℃에서 30~70번 계대배양하는 것을 특징으로 하는 저온 순화된 PEDV 균주의 제조 방법.
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