KR100951118B1 - 돼지 면역글로불린 지의 에프씨 도메인의 세포 표면 발현용벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 면역글로불린 지(Immunoglobulin G; 이하 “IgG"라 한다)의 에프씨(Crystallized Fragment; 이하 ”Fc“라 한다) 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 숙주세포에 바이러스를 증식시키는 경우 바이러스 외피에 Fc가 포함됨으로써 다양한 돼지 질병 관련 바이러스에 대하여 면역능이 우수한 백신을 손쉽게 생산할 수 있도록 해준다.

돼지 IgG, Fc 유전자, 표면 발현, 벡터

Description

돼지 면역글로불린 지의 에프씨 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법{A vector for cell surface expression of pig IgG Fc domian, a host cell transformed with the vector and a manufacturing method of vaccine against viruses related to pig diseases using the host cell}

본 발명은 돼지 면역글로불린 지(Immunoglobulin G; 이하 “IgG"라 한다)의 에프씨(Crystallized Fragment; 이하 ”Fc“라 한다) 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기 숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자와 돼지 트랜스페린 수용체(transferrin receptor; 이하 “TR”이라 한다)의 트랜스멤브레인(transmembrane; 이하 “TM”이라 한다) 도메인을 코딩하는 유전자를 라이게이션하고, 이를 벡터에 삽입함으로써, 재조합 단백질의 N-말단에 위치하는 돼지 TR의 TM 도메인이 세포막에 고정되고, 재조합 단백질의 C-말단에 위치하는 돼지 IgG의 Fc 도메인을 구성하는 힌지(hinge), CH2 및 CH3, 또는 CH2 및 CH3이 세포 표면에 발현되도록 제조한 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 숙주세포 및 상기 숙주세포에 돼지 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식된 바이러스를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법에 관한 것이다.

IgG는 면역 글로불린 중에서 가장 큰 역할을 한다. 감염 방어에 도움이 되며, 주로 혈관 밖에서 세균이나 그 독소와 결합하여 그들의 침입을 방지한다. 특히, IgG는 외부에서 침입한 세균이나 그 독소와 결합하여 옵소닌화(opsonization)하므로써 항체-의존 세포-매개세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; CDCC) 기전에 따라 대식세포(macrophage)에 의해 숙주로부터 이물질을 제거한다. IgG는 중쇄와 경쇄로 이루어지며, Y자형을 형성하는데, 파파인에 의해서 Fab 부분과 Fc 부분으로 나누어진다. 이중 Fab 부분의 가변영역(variable region)은 여러 가지로 변화하여 대부분의 항원과 결합한다. Fc 부분은 대식구와 림프구의 수용체와 결합하여 세포의 활성화를 촉진한다.

한편, 문헌에 의하면, 세포 표면에 발현한 인간 IgG의 Fc 도메인이 탐식세포 표면의 Fc 수용체를 자극하여 탐식세포를 활성화시킨다고 보고된 바 있으며(Stabila et al., Nat Biotechnol 1998, 16(13):1357-60), 마우스 IgG의 Fc 도메인을 돼지 신장세포주인 CPK와 토끼 신장세포주인 RK13 등의 세포 표면에 발현시키고, 상기 세포에 외피를 갖고 있는 바이러스를 감염, 증식시켜, 이로부터 얻어진 바이러스를 이용하여 불활성화 백신을 제작하고, 동물에 접종하여 면역시키면 항체생산의 유도가 증가되며, 공격접종에 대해서도 우수한 방어능을 갖게됨이 보고된 바 있다(Takashima et al., Vaccine 2005, 23:3775-82).

그러나, 현재까지 돼지 항체 Fc 도메인에 대한 발현연구는 보고된 바 없다. 다만, 돼지 항체의 유전정보에 대한 연구가 현재까지 지속적으로 진행 중에 있으며(Butler et al., Development and Comparative Immunology 2006, 30:199-221), 돼지의 IgG 계열 항체의 염기서열은 보고된 바 있다(Kacskovics et al., J Immunol 1994, 153:3566-73).

한편, TR은 세포외에서 철분을 운반하는 트랜스페린에 대한 세포막 수용체로서 당단백질의 일종이다. 상기 TR은 세포 표면에 존재하면서 트랜스페린과 강하게 결합하여 수용체 매개 세포내 이입을 통해 철 이온이 세포 안으로 들어가게 하는데 중요한 역할을 수행한다. 세포 표면에서 수용체로 작용하는 대부분의 TM 도메인들은 N-말단이 세포 바깥쪽으로 향하고, C-말단은 세포질 쪽으로 향하는 1형의 TM 도메인이지만, TR의 TM 도메인은 N-말단이 세포질 쪽을 향하고, C-말단이 세포바깥쪽을 향하는 2형의 TM 도메인인 특징을 갖고 있다.

본 발명자들은 돼지 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현 방법을 연구하던 중, 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자를 이용하여 돼지 IgG 항체의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현되도록 하는 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 형질전환한 세포주의 표면에 돼지 IgG의 Fc 도메인이 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 돼지 IgG의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 돼지 IgG Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 숙주세포에 돼지 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 돼지 질병 관련 바이러스에 대 한 백신의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 돼지 IgG의 Fc 도메인이 세포 표면에 발현되도록 하기 위해, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자와 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자를 라이게이션하고, 이를 벡터에 삽입함으로써, 재조합 단백질의 N-말단에 위치하는 돼지 TR의 TM 도메인이 세포막에 고정되고, 재조합 단백질의 C-말단에 위치하는 돼지 IgG의 Fc 도메인을 구성하는 힌지(hinge), CH2 및 CH3, 또는 CH2 및 CH3이 세포 표면에 발현되도록 하였다. 즉, 도 1에 나타낸 바와 같이, 돼지 TR의 TM 도메인이 N-말단을 이루며 세포막에 결합하고, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 구성하는 힌지, CH2 및 CH3, 또는 CH2 및 CH3가 순차적으로 C-말단을 이루도록 발현되게 하였다.

또한, 본 발명의 벡터에는 형질전환 효율을 바로 확인할 수 있도록 형광단백질 유전자를 포함시켰고, 형질전환체의 선발을 위해 항생제 저항성 유전자가 포함되도록 하였다.

따라서, 본 발명에 따른 벡터는 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자 이외에 복제원점, 프로모터, 형광 단백질 유전자 및 항생제 저항성 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이와 같이 구성된 벡터로 형질전환된 숙주세포는 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하게 된다.

상기 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 16으로 표시된 것일 수 있다.

상기 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자는 힌지, CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자일 수 있으며, 바람직하게는 이들 유전자는 서열번호 7 또는 서열번호 20으로 표시된다. 또한, 상기 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자는 CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자일 수도 있으며, 바람직하게는 이들 유전자는 서열번호 8로 표시된다.

또한, 본 발명의 벡터는 형광단백질 유전자를 포함한다. 상기 형광 단백질 유전자는 배양세포에 대한 형질전환효율을 형광현미경으로 바로 확인하기 위한 마커단백질로서 사용하였으며, 바람직하게는 녹색형광단백질(green fluorescent protein; 이하 “GFP”라 한다)을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 형질전환체의 선발마커로서 항생제 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 항생제 저항성 유전자로는 제네티신(G418), 네오마이신, 하이그로마이신, 제오신 및 푸로마이신 저항성 유전자 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 제오신 또는 푸로마이신 저항성 유전자를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 바람직한 복제원점으로는 진핵세포 또는 원핵세포 복제원점일 수 있으며, 예를 들면, SV40(Simian virus 40), EBV(Epstein Barr Virus), pUC 복제원점 등을 포함할 수 있다.

나아가, 본 발명의 벡터는 목적 유전자의 전사개시활성을 가지는 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 RNA 중합효소에 대한 결합 부위를 포함하고, 암호화 영역의 상류(upstream)에 위치해 있을 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 프로모터로는 CMV(Cytomegalovirus), SV40(Simian virus 40), TK(Thymidine kinase), EF-1α(Elongation factor-1 alpha), β-casein, RSV(Respiratory syncytial virus), CMV5 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자의 프로모터로서 pEF-1α를 사용하였고, 형광단백질 유전자의 프로모터로서 CMV를 사용하였다(도 2 참조).

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서는 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자 및 형광단백질 유전자의 프로모터로서 CMV5를 사용하였다(도 20 참조).

이외에도, 본 발명의 벡터는 목적 유전자의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나, 이에 영향을 주는 비해독화된 핵산서열로서 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등을 포함할 수 있다.

이와 같은 구조를 가진 본 발명의 벡터로 가장 바람직하게는 도 12, 도 13 또는 도 25에 나타낸 바와 같은 유전자 지도를 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자 및 GFP 유전자를 각각 클로닝하고, 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자와 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 라이게이션 한 후, 이를 GFP 유전자를 포함한 pBudGFP에의 삽입하여 "pBGFP-pIgGFc" 및 "pBGFP-pIgGdHFc"를 각각 제조하였다. 즉, 돼지 TR의 TM 도메인을 코 딩하는 유전자를 포함한 "pGpTRR2" 플라스미드를 BamH1 및 SacII로 절단하고, 여기에 동일한 제한효소로 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 포함한 “pGpIgG1FcR” 및 “pGpIgG1dHFcR” 플라스미드를 절단하여 수득한 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 삽입하여 "pGpTRpIgG1Fc" 및 “pGpTRpIgG1dHFc"를 각각 제조하였다. 그 다음 상기 "pGpTRpIgG1Fc" 및 “pGpTRpIgG1dHFc"를 Not1 및 PmeI으로 절단하여 수득한 절편을 CMV 프로모터-GFP 유전자-SV40p(A) 및 제오신 내성 유전자를 포함한 “pBudGFP" 플라스미드의 동일한 자리에 삽입하여 pEF-1α, 돼지 TR, 돼지 IgG의 Fc, pCMV 및 GFP의 유전자들이 순차적으로 작동가능하게 연결된 "pBGFP-pTR-Fc" 및 "pBGFP-pTR-dHFc" 플라스미드를 각각 제조하였다(도 11 참조).

본 발명의 다른 구체예에서는 돼지 TR의 TM 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 “pT7" 플라스미드에 각각 클로닝하여 "pT7/TR" 플라스미드 및 “pT7/Fc" 플라스미드를 제조하고, 상기 클로닝된 두 플라스미드를 제한효소로 절단하고, 라이게이션하여 ”pT7/TR-Fc" 플라스미드를 제조하였다. 다음으로 상기 “pT7/TR-Fc" 플라스미드로부터 제한효소를 처리하여 TR-Fc 단편을 얻은 후, 이를 ”pCMV5-IRES-GFP" 벡터에 라이게이션하여 CMV5, TR-Fc, IRES 및 GFP의 유전자들이 순차적으로 작동가능하게 연결된 “pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드를 제조하였다(도 22, 도 24 및 도 25 참조).

본 발명에 따른 벡터는 당업계에 공지된 방법에 따라 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), PEG, DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀법 (cationic liposome), 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.

본 발명의 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포로는 포유류세포인 것이 바람직하며, 본 발명의 목적에 적합한, 즉, 돼지 질병과 관련되며, 외피를 가진 바이러스가 증식할 수 있는 세포로서, 예를 들면, PK-15(돼지 신장세포), ST(돼지 고환세포), Vero(원숭이 신장세포), MA-104(원숭이 신장세포), MARC(마우스 B-세포), Neuro-2A(마우스 신경아芽세포), BGK(흑염소 신장세포), RK-13(토끼 신장세포), BHK(햄스터 신장세포), HRT-18(사람 결장세포), SK-N-AS(사람 신경아세포), MDCK(개 신장세포) 등을 들 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 원숭이 신장세포인 Vero 세포와 돼지 신장세포인 PK-15를 사용하였다.

본 발명의 숙주세포는 돼지 IgG의 Fc 도메인을 상기 숙주세포의 표면에 발현하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서는 본 발명의 벡터로 vero 세포를 형질전환한 후, Zeocin^TM을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환된 세포주를 선발하였으며, 구체적으로 “pBGFP-pTR-Fc"로 형질전환된 세포주 ”Vero-pIgGFc1” 1종과 “pBGFP-pTR-dHFc"로 형질전환된 세포주 ”Vero-pIgGdHFc(1)”, ”Vero-pIgGdHFc(2)” 및 ”Vero-pIgGdHFc(3)” 3종을 선택적으로 선발하였다(실시예 1의 4. 참조).

나아가, 본 발명자들은 상기에서 선발한 형질전환체의 돼지 IgG의 Fc 도메인의 발현능을 ELISA 또는 형광항체법을 이용하여 분석하였다(실시예 1의 5. 참조). 그 결과, “Vero-pIgGFc1” 및 “Vero-pIgGdHFc(2)”, “Vero-pIgGdHFc(3)”에서 돼지 IgG의 Fc 도메인 발현을 확인할 수 있었으나, “Vero-pIgGdHFc(1)”의 경우 제오신 내성을 나타내고, GFP를 발현하였으나, 돼지 IgG의 Fc 도메인은 발현하지 않는 것으로 나타났다(도 15 내지 도 17).

또한, 본 발명자들은 본 발명의 형질전환 Vero 세포주 “Vero-pIgGFc1”, “Vero-pIgGdHFc(2)” 및 “Vero-pIgGdHFc(3)”에서 돼지 IgG의 Fc 도메인의 존재를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다(실시예 1의 6. 참조). 그 결과, 상기 돼지 IgG의 Fc 도메인을 발현하는 3종의 세포주에서 약 50kDa에 해당하는 돼지 IgG의 Fc 도메인 단백질 밴드를 확인할 수 있었다(도 18 참조).

마지막으로, 본 발명자들은 본 발명의 형질전환 Vero 세포주 “Vero-pIgGFc1”, “Vero-pIgGdHFc(2)” 및 “Vero-pIgGdHFc(3)”의 세포막 및 이들 세포에서 증식된 바이러스의 외피에 돼지 IgG의 Fc 도메인 발현 여부를 골드 입자가 콘쥬게이션된 프로테인 A 항체를 이용하여 확인하였다(실시예 1의 7. 참조). 그 결과, 3종의 세포주 모두에서는 세포막 및 이들 세포에서 증식하여 버딩(budding)하기 전의 돼지 오제스키바이러스의 바이러스 외피에 골드 입자가 반응함을 확인할 수 있었다(도 19).

이상과 같은 결과로부터, 본 발명자들은 상기 형질전환 세포주 중 “Vero-pIgGFc1”을 서울의대 암연구소 내 한국세포주연구재단(KCLRF; Korean Cell Line Research Foundation)에 2007년 8월 17일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00165로 기탁하였다.

본 발명의 다른 구체예에서는 본 발명의 벡터로 PK-15 세포를 형질전환 한 후, 푸로마이신을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환 세포주를 선발하였고, 구체적으로 “pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc"로 형질전환한 세포주 3종(”클론 3-1” 내지 ”클론 3-3”)을 선택적으로 선발하였다(실시예 2의 7. 참조).

나아가, 본 발명자들은 상기에서 선발한 형질전환체의 돼지 IgG의 Fc 도메인 발현능을 ELISA 또는 형광항체법을 이용하여 분석하였다(실시예 2의 8. 참조). 그 결과, “클론 3-1” 및 “클론 3-2”에서 GFP의 발현을 확인할 수 있었고, “클론 3-1”, “클론 3-2” 및 “클론 3-3”에서 푸로마이신 내성을 나타내고, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 발현함을 확인하였다(도 27 및 도 28 참조).

이상과 같은 결과로부터, 본 발명자들은 상기 형질전환 세포주 중 “클론 3-1”을 ”CPK/SFc”로 명명하여 서울의대 암연구소 내 한국세포주연구재단에 2007년 4월 2일자로 기탁번호 KCLRF-BP-00154로 기탁하였다.

따라서, 본 발명에 따른 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 세포주에 바이러스의 외피가 있는 돼지 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키면, 바이러스가 세포 밖으로 나오는 과정에 입자 표면에 돼지 IgG의 Fc 도메인을 함유하게 되고, 이렇게 바이러스 외피에 돼지 IgG의 Fc 도메인을 함유한 바이러스로 제조한 생독 백신 또는 불활성화 백신의 경우, 이들 백신을 돼지에 접종하면 돼지의 다양한 탐식세포(phagocyte)로 구성되는 항원제시세포(antigen presenting cell)의 표면에 발현하고 있는 Fc 도메인에 대한 수용체를 자극하는 등 세포면역과 체액면역을 증가시킴으로서 면역 자극효과가 향상된다. 따라서, 본 발명에 따른 돼지 IgG의 Fc 도메인이 세포 표면에 발현되는 세포주는 이 세포주에서 증식가능한 외피가 있는 다양한 바이러스에 대하여 면역능이 우수한 다양한 종류의 백신을 손쉽게 생산할 수 있게 해준다.

그러므로, 본 발명은 (a) 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 세포주에 돼지 질병 관련 바이러스를 감염시키고, 증식시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 돼지 질병 관련 바이러스는 외피가 있는 바이러스가 바람직하며, 예를 들면 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지로타바이러스(PoRotaV), 돼지오제스키병바이러스(ADV), 일본뇌염바이러스(JEV), 돼지콜레라바이러스(HCV), 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV), 돼지인플루엔자바이러스(SIV), 돼지폭스바이러스(SPV) 등이 있다.

상기 (a) 단계에서 세포주에 바이러스를 감염 및 증식시키는 과정은 당업자에 의하여 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이를 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 개발한 세포주가 50~80%를 형성하게 되면 특정 바이러스를 감염시킨다. 감염 소요 시간과 증식 기간은 바이러스 종류에 따라 다양할 수 있으며, 일반적으로 감염 소요 시간은 대개 3시간에서 12시간 정도이며, 증식 기간은 3일에서 1주일간이다. 해당 바이러스에 따른 감염과 증식이 종료되면, 배양 상층액을 수거한다. 상기 배양 상층액 속에는 바이러스 외피에 Fc를 함유한 바이러스가 포함되어 있다. 변이 세포를 제거하기 위하여, 벡터에 삽입된 항생제 저항 유전자에 따 라 특정 항생제를 포함한 배지에 세포를 3대 간격으로 배양하여, 세포 변이 가능성을 제거한다. 이와 같은 방법으로 증식된 바이러스는 바이러스 외피에 Fc를 함유하게 된다.

상기 (b) 단계에서, 단계 (a)로부터 얻은 증식된 바이러스로부터 생독 백신 또는 불활성화 백신의 제조방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 특히, 불활성화 백신을 제조하고자 하는 경우, 포르말린 또는 제조사의 지시서에 따른 특정한 방법으로 바이러스를 처리하여 이를 불활성화시키고, 불활성화된 바이러스를 통상의 방법으로 정제하여, 바이러스 원액의 무균실험 및 바이러스 함량실험 등을 실시하고, 보존제 및 완충액 생리식염수를 가하여 희석 혼합 또는 안정제를 첨가한다. 최종 원액은 무균 실험과 보존제 함량 시험을 실시할 수 있다. 최종 백신은 원하는 바에 따라 동결건조, 액상 등의 상태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 발현벡터는 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하도록 할 수 있으며, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 바이러스를 증식시키는 경우, 바이러스 외피에 돼지 IgG의 Fc 도메인이 포함됨으로써 다양한 돼지 질병 관련 바이러스에 대하여 면역능이 우수한 백신을 용이하게 생산할 수 있도록 해준다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1]

1. 돼지 TR 및 돼지 IgG 의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자들의 클로닝

<1-1> 돼지 간장, 비장세포 및 PK -15 세포주로부터 총 RNA 의 분리

돼지 TR 및 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 RT-PCR 방법을 이용하였으며, 이를 위해 각각에 대한 mRNA가 풍부한 세포로부터 총 RNA를 분리하여 cDNA를 제작하였다. 사람 트랜스페린 수용체(human transferrin receptor; 이하 “hTR”이라 한다)의 경우 왕성한 증식을 나타내는 세포에 많이 존재한다(Larrick and Cresswell, J Supramol Struct . 1979, 11:579-86).

이에 따라 돼지 TR 유전자를 클로닝하기 위해 돼지 간조직의 간세포 또는 돼지 신장세포주(porcine kidney cell line [ATCC-CCL33]; 이하 "PK-15 세포주"라 한다)로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 또한, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 조혈장기인 돼지 비장조직의 비장세포에서 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA의 추출은 RNeasy 미니 키트(Qiagen)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였고, 추출한 총 RNA는 -70℃에 보관, 사용하였다.

<1-2> 돼지 TR 의 TM 도메인을 코딩하는 유전자의 클로닝

돼지 TR 유전자를 클로닝하기 위해 돼지 TR 유전자를 증폭할 수 있는 프라이 머를 다음과 같은 방법으로 제작하였다. Schneider 등(J Cell Sci Suppl. 1985, 3:139-49)이 보고한 논문, GenBank accession number X01060의 hTR 염기서열, Stabila 등(Nat Biotechnol. 1998, 16(13):169-49)이 보고한 hTR의 TM 도메인 유전자 증폭용 프라이머 정보를 참고로 하여 Python 등(J Anim Breed Genet. 2005, 122(s1):5-14)이 보고한 GenBank accession number AF416763의 돼지 TR 유전자의 염기서열에서 돼지 TR의 TM 도메인 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다.

돼지 TR 센스 프라이머(이하 "pTRf"라 한다)는 NotI 싸이트, Kozak 염기서열과 개시코돈 순으로 5' 말단에 연장시켜(5’-AGCGGCCGC-GCCACC-ATG- ATGGATCAAGCTAGA-3', 서열번호 1) 설계하였으며, pTR 안티센스 프라이머(이하 “pTRr"이라 한다)는 BamHI 싸이트를 연장시켜(5’-CGCGGATCC- ATCTGTTTTTGATTCTACACG-3’, 서열번호 2) 설계하고, 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.

상기 <1-1> 돼지 간조직의 간세포 또는 PK-15 세포주로부터 추출한 총 RNA 2 ㎍, 2 pmole의 pTRr 프라이머(서열번호 2) 및 SuperScript^TM II 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 42℃에서 50분간 반응하여 일차 가닥 cDNA를 제조하였다.

상기 돼지 TR 유전자의 cDNA 5 ㎕, 10 pmole/㎕의 pTRf(서열번호 1) 및 pTRr 프라이머(서열번호 2) 각 1 ㎕와 Expand Long Template PCR system (Roche, Germany)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃ 2분 반응 후, 94℃ 10초, 54℃ 30초, 68℃ 4분 조건에서 10 사이클 실시 후, 94℃ 15초, 54℃ 30초, 68℃ 4분을 시작으로 매 사이클마다 20초를 증가시키는 조건에서 20 사이클을 실시한 후, 68℃에서 8분 연장 반응을 실시하였다.

PCR 실시 후, 증폭된 유전자를 EcoRI으로 절단하고, 전기영동으로 그 크기를 확인하였다. 그 결과, 도 3의 레인 1 및 레인 2와 같이 돼지 간조직과 돼지 신장세포주(PK-15) 모두에서 약 320 bp에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다.

각각의 증폭된 유전자를 pGemTeasy(Promega)에 TA 클로닝하여 "pGpTRR2" 플라스미드를 제조하고, 염기서열을 분석하여 확인하였다. 돼지 TR의 염기서열(서열번호 3) 및 "pGpTRR2" 플라스미드의 유전자 지도는 각각 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같다.

<1-3> 돼지 IgG 의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자의 클로닝

돼지 IgG의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해, 돼지 IgG의 Fc 도메인 유전자 증폭용 프라이머를 다음의 방법으로 설계하였다. Kacskovics 등(J Immunol. 1994, 153(8):3565-73)이 보고한 GenBank accession number U03778의 유전자의 유전정보 및 염기서열을 참고하여 돼지 IgG의 Fc 도메인 유전자를 증폭하기 위한 3종의 프라이머를 설계하였다.

돼지 IgG의 힌지, CH1 및 CH2 도메인에 해당하는 Fc 도메인(이하 “pIgG-Fc”라 한다) 유전자 부위를 클로닝하기 위해 센스 프라이머(이하 “pIgG-Fcf”라 한다) 및 돼지 IgG의 힌지를 제외한 CH1 및 CH2 도메인에 해당하는 Fc 도메인(이하 “pIgG-dHFc”라 한다) 유전자 부위를 클로닝하기 위해 센스 프라이머(이하 “pIgG-dHFcf"라 한다)를 사용하였고, 안티센스 프라이머(이하 "pIgG1r"이라 한다)는 “pIgG-Fc" 및 “pIgG-dHFc" 유전자를 증폭하는데 공통적으로 사용하였다. “pIgG-Fcf" 프라이머는 BamHI 싸이트를 5' 말단에 연장시켜 (5’-CGCGGATCC- GTGGCCGGGCCCTCGGTCTTC-3’, 서열번호 4) 설계하였으며 “pIgG-dHFcf" 프라이머 역시 BamHI 싸이트를 5' 말단에 연장시켜 (5’-CGCGGATCC -GGAATACACCAGCCGCAAACA-3’, 서열번호 5) 설계하였고 안티센스 프라이머인 “pIgG1r"는 중지 코돈(stop codon) 뒤로 PmeI 싸이트를 연장시켜 (5'-CGGTTTAAACTCATTTACCCTGAGTCTTGGA -3’, 서열번호 6) 설계하고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.

상기 <1-1>의 돼지 비장조직의 비장세포로부터 추출한 총 RNA 2 ㎍, 2 pmole의 “pIgG1r" 프라이머(서열번호 6) 및 SuperScriptTM II 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 42℃에서 50분간 반응하여 일차 가닥 cDNA를 작 성하였다.

pIgG-Fc 유전자를 증폭하기 위해서는 10 pmole/㎕의 “pIgG-Fcf" 프라이머(서열번호 4)와 “pIgGlr" 프라이머 각 1 ㎕를 첨가하였고, pIgG-ΔhFc 유전자를 증폭하기 위해서는 “pIgG-dHFcf"와 “pIgGlr" 프라이머 각 1 ㎕를 첨가하여 두 유전자 모두 상기의 IgG1 유전자의 cDNA 5 ㎕를 동일하게 첨가하여 Expand Long Template PCR system (Roche, Germany)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 각각 PCR을 실시하였다. PCR 반응조건은 94℃ 2분 반응 후, 94℃ 10초, 54℃ 30초, 68℃ 4분 조건에서 10 사이클과 94℃ 15초, 54℃ 30초, 68℃ 4분을 시작으로 매 사이클 마다 20초를 증가시키는 조건에서 20 사이클을 실시한 후, 68℃에서 8분 연장 반응을 실시하였다.

PCR 실시 후, 증폭된 산물을 EcoRI으로 절단하고 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과, “pIgG1-Fc” 유전자는 도 3의 레인 4, “pIgG1-dHFc"는 도 3의 레인 5와 같이 각각 약 710 bp, 660 bp에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었다.

이들 각각을 pGemTeasy(Promega)에 TA 클로닝하여 “pGpIgG1FcR” 및 “pGpIgG1dHFcR” 플라스미드를 제조하고, 염기서열을 분석하여 확인하였다. “pIgG-Fc” 및 “pIgG-dHFc” 유전자의 염기서열은 각각 도 6(서열번호 7) 및 도 8(서열번호 8)에 나타낸 바와 같고 “pGpIgG1FcR" 및 “pGpIgG1dHFcR” 플라스미드의 유 전자 지도는 도 7 및 도 9에 나타낸 바와 같다.

2. GFP 유전자의 클로닝

배양세포에 대한 형질전환 효율을 형광현미경으로 바로 확인하기위한 마커 단백질로서 GFP를 사용하고자 GFP 유전자를 증폭, 클로닝하고 이를 포함하는 플라스미드를 제조하였다.

GFP 유전자의 증폭을 위해 먼저 프라이머를 다음과 같이 설계하였다. phrGFP-N1(Stratagene) 플라스미드로부터 제조사의 염기서열 및 유전자 지도를 참조로 CMV 프로모터 앞에 존재하는 NsiI 싸이트로 부터 SV40 폴리아데닐레이션 시그널(Polyadenylation signal; 이하 “p(A)"라 한다) 뒤쪽의 MluI 싸이트까지 PCR 증폭이 가능하도록 센스 프라이머 “GFPnsiF" (5'-ATGCATTAGTTATTAATAGT-3', 서열번호 9) 및 안티센스 프라이머 “SV40mluR" (5'-ACGCGTTAAGATACATTGAT-3', 서열번호 10)을 설계하고 올리고핵산을 주문합성(Bioneer, Korea)하여 사용하였다.

센스 프라이머 “GFPnsiF(서열번호 9)” 및 안티센스 프라이머 “SV40mluR(서열번호 10)” 각 100 pM, phrGFP-N1 플라스미드 DNA 0.1 ㎍ 사용하고, 어닐링(annealing) 온도를 60℃ 조건으로 30 사이클 수행하여 CMV 프로모터로 GFP가 발현되도록 하는 유전자를 PCR 증폭하였다.

상기 PCR 증폭산물을 전기영동한 결과, 약 1.8 kb에 해당하는 밴드를 확인할 수 있었으며, 이를 pGemTeasy(Promega)에 TA 클로닝하여 “pGGFPR” 플라스미드를 제작하였다.

상기 "pGGFPR" 플라스미드를 SpeI 및 EcoRI으로 처리하여 CMV 프로모터-GFP유전자-SV40p(A)를 포함하고 있는 약 1.3 kb의 유전자 분절을 수득하고, 이를“pBudCE4.1" (Invtrogen) 플라스미드를 SpeI 및 EcoRI으로 처리하여 수득한 3.8 kb의 유전자 분절과 라이게이션(ligation)함으로써 “pBudGFP" 플라스미드를 제조하였으며 플라스미드의 유전자 지도는 도 10에 나타낸 바와 같다.

3. 본 발명에 따른 돼지 TR 의 TM 유전자, IgG 의 Fc 도메인 유전자 및 GFP 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조

돼지 TR의 TM 유전자와 “pIgG-Fc” 또는 “pIgG-dHFc” 유전자를 연결한 후 pBudGFP에의 삽입하여 "pBGFP-pIgGFc" 및 "pBGFP-pIgGdHFc"를 제조하였다.

먼저, 상기 <1-3>에서 PCR 증폭 후 클로닝된 된 “pIgG-Fc” 또는 “pIgG-dHFc”유전자를 포함하는 “pGpIgG1FcR" 및 “pGpIgG1dHFcR” 플라스미드를 각각 BamHI 및 SacII로 처리하여 각각 716 bp 및 671 bp의 유전자 단편을 수득하고, <1- 2>에서 제조한 “pGpTRR2" 플라스미드를 BamHI 및 SacII로 처리하여 수득한 3.3 kb의 유전자 단편과 라이게이션하므로써 “pGpTRpIgG1Fc” 및 “pGpTRpIgG1dHFc” 플라스미드를 각각 제조한 다음 제한효소 분석으로 확인하였다. 확인된 “pGpTRpIgG1Fc” 및 “pGpTRpIgG1dHFc” 플라스미드 각각을 NotI 및 PmeI로 처리하여 1,011 bp 및 966 bp의 유전자 단편을 수득하고, 실시예 2에서 제조한 pBudGFP 플라스미드를 NotI 및 PmeI로 처리하여 수득한 5.0 kb의 유전자 단편과 라이게이션하여 돼지 IgG1 항체의 Fc를 세포표면에 발현하도록 유도하는 최종적인 플라스미드인 “pBGFP-pTR-Fc" 및 “pBGFP-pTR-dHFc" 2종을 제조하였다(도 11). 플라스미드 “pBGFP-pTR-Fc" 및 “pBGFP-pTR-dHFc의 각각의 유전자 지도는 도 12 및 도 13에 나타낸 바와 같다.

4. 본 발명에 따른 플라스미드“ pBGFP - pTR - Fc ” 및 “ pBGFP - pTR - dHFc ”를 이용한 세포주의 트랜스펙션 및 선발

<4-1> 세포주의 트랜스펙션

먼저, Fc 도메인을 세포막 표면에 발현하는 세포주를 작성하기 위한 트랜스펙션은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 상기 3.에서 제조한 “pBGFP-pTR-Fc" 및 “pBGFP-pTR-dHFc" 플라스미드 DNA 각각을 Vero 세포(ATCC CCL-81, USA)에 FuGENE^® HD 트랜스펙션 리에이젼트(Roche)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 형 질전환시켰다. 즉, 2 ㎍의 플라스미드 DNA를 무혈청배지(α-MEM에 비필수아미노산 만 첨가) 100 ㎕에 혼합하고, 여기에 3 ㎕의 FuGENE^® HD 트랜스펙션 리에이전트 용액을 첨가 혼합한 후, 무혈청배지 800 ㎕를 첨가시켜 공동형질전환 혼합물(cotransfection mixture)을 제조하고, 이를 실온에서 15분간 방치하였다. 한편, 6웰에 80% 정도 단층으로 형성된 Vero 세포주에, 상기에서 제조한 형질감염 혼합물을 한 방울씩 떨어뜨리면서 첨가하여 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양하고 도 14에 나타낸 바와 같이, 형광현미경에서 GFP 발현 여부를 관찰하여 형질전환 정도를 확인하였다.

<4-2> 형질전환체의 선발

Zeocin^TM을 첨가한 배지를 이용하여 상기 <4-2>의 형질전환 세포주 중에서 형질전환 Fc 발현 세포주를 선택적으로 선발하였다.

형질전환 24시간 후, GFP의 발현을 확인한 다음 6웰의 각세포를 100 ㎜ 페트리디쉬로 각각 옮긴 후 일반배양배지 즉, 5% 소태아혈청(Hybriserum, Austria), 비필수아미노산(Gibco) 및 항균-항진균제(Gibco)가 첨가된 DMEM(Gibco)에Zeocin^TM(Invitrogen)이 500 ㎍/㎖되게 첨가한 배지로 교환하여 배양하였다. 2-3대 계대배양하여 생존한 Vero 세포 군락(colony)를 클로닝 실린더(cylinder)에서 트립 신(Gibco)으로 소화한 후 수확하여 개별적으로 배양하여 각 세포주를 작성하고 그중 세포 증식능이 우수한 세포주로서“pBGFP-pTR-Fc"로 형질전환한 세포주 ”Vero-pIgGFc1” 1종과 “pBGFP-pTR-dHFc" 로 형질전환한 세포주 ”Vero-pIgGdHFc(1)”, ”Vero-pIgGdHFc(2)” 및 ”Vero-pIgGdHFc(3)” 3종을 선발하였다.

5. ELISA 또는 형광항체법을 이용한 본 발명에 따른 형질전환 세포주의 Fc 발현능 분석

<5-1> ELISA 를 이용한 분석

상기 4.에서 트랜스펙션 후 제오신 내성을 가진 단일 클론으로 선발된 각각의 Vero 세포주의 Fc 발현 여부를 ELSIA를 이용하여 확인하였다. 이때 대조군으로 형질전환하지 않은 Vero 세포주를 이용하였다.

먼저, 세포를 4%의 파라포름아데하이드(Paraformaldehyde, Sigma)가 첨가된 PBS로 실온에서 10분간 고정하고, 아세톤(Aceton, sigma)과 메탄올(methanol)을 동량으로 혼합하여 -20℃에 보관한 혼합액으로 얼음에서 2분간 처리하여 세포의 투과성을 높인 후 3%의 소혈청알부민(Bovine serum albumin; 이하 “BSA”라 한다, Sigma)이 첨가된 PBS에서 에이치알피(Horse radish peroxidase; 이하 “HRP"라 한다)가 콘쥬게이트된 항 돼지 IgG(H+L) 항체(HRP conjugated anti-porcine IgG; 이하 “항-돼지 IgG HRP"라 한다, KPL)로 실온에서 1시간 반응시켰다. 그 다음 SureBlue^TM TMB Microwell peroxidase substrate (KPL)사용하여 발색하고 ELISA 리더(Bio-Rad)로 650㎚에서 흡광도(Optical density; 이하 "OD"라 한다)를 측정하였다.

그 결과 도 15에 나타낸 바와 같이, 항-돼지 IgG HRP를 반응시키지 않은 세포주들은 Fc의 발현 여부와 관계없이 모든 세포주에서 0.1 이하의 낮은 OD값을 나타냈고 항-돼지 IgG HRP를 반응시킨 세포주인“Vero-pIgGFc1” 및 “Vero-pIgGdHFc(2)”, “Vero-pIgGdHFc(3)”에서는 3종 모두 0.75이상의 높은 OD값을 나타내 Fc 발현을 확인할 수 있었다. 반면, 형질전환 시키지 않은 Vero 세포주(Vero-WT)에서는 역시 0.1이하의 낮은 OD 값을 나타냈다. 한편, “Vero-pIgGdHFc(1)” 경우 제오신 내성을 나타내고 GFP를 발현했으나 Fc는 발현하지 않았다.

<5-2> 형광항체법을 이용한 분석

상기 4.에서 트랜스펙션 후 제오신 내성을 가진 단일 클론으로 선발된 각각의 Vero 세포주의 Fc 발현 여부를 형광항체법을 이용하여 분석하였다. 즉, 세포주 각각을 고정하거나 고정하지 않는 방법으로 FITC로 콘쥬게이션된 항돼지(FITC conjugated porcine IgG(H+L); 이하 “항-돼지 IgG FITC"라 한다, KPL) 항체를 이용하여 형광여부를 형광현미경으로 관찰하여 확인하였다.

그 결과, 형질전환시키지 않은 Vero 세포주(Vero-WT)에서는 고정여부에 관계없이 형광을 확인할 수 없었으나 형질전환된 세포주인 “Vero-pIgGFc1” 및 “Vero-pIgGdHFc(2)”, “Vero-pIgGdHFc(3)”에서는 고정하거나 고정하지 않거나 구분없이 3종 모두 밝은 형광을 나타내어 Fc 발현을 확인할 수 있다. 다만, 고정된 세포에서는 도 16에 나타낸 바와 같이 핵막 주위 등 세포질 부분에서 밝은 형광을 확인할 수 있었고, 고정하지 않은 세포의 경우는 3종 세포 모두에서 세포표면에 발현되는 형광을 도 17에 나타낸 바와 같이 확인할 수 있었다.

6. 웨스턴 블롯 분석을 이용한 본 발명에 따른 형질전환 세포주에서 돼지 Fc 단백질의 확인

상기 4.에서 트랜스펙션 후 제오신 내성을 가진 단일 클론으로 선발된 각각의 Vero 세포주 “Vero-pIgGFc1” 및 “Vero-pIgGdHFc(2)”, “Vero-pIgGdHFc(3)”에서 Fc 단백질의 존재를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다. 이때 대조군으로는 형질전환하지 않은 Vero 세포주(Vero-WT)를 사용하였다.

상기 세포주를 대상으로 먼저 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하고 알칼라인 포스포타아제(alkaline phosphotase)가 콘쥬게이션(conjugation)된 항 돼지 IgG 항체(alkaline phosphotase conjugated anti-porcine IgG; 이하 “anti-porcine IgG AP"라 한다)를 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 실시하였다.

각 세포주를 25 ㎠의 플라스크에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 3일간 배양한 후 PBS로 2회 세척하고 스크레퍼(scraper)로 긁어 세포를 각각 수확하였다. 이를 12,000 rpm에서 5분간 원침하고 상층액을 제거한 세포에 세포 추출 용액(cell extraction buffer. BIOSOURCE, CA)을 500㎕ 첨가하여 용해시켰다. 그 다음 10초씩 2회 초음파 파쇄(sonication)하고 14,000 rpm에서 10분간 원심분리한 상층액 새로운 에펜돌프 튜브로 옮기고 최종농도가 1mM되게 PMSF(Phenylmethylsulfonyl floride Benzylsulfonyl fluoride, Sigma)를 첨가하였다.

준비된 세포추출물을 10%의 SDS-PAGE 겔에서 단백질 사이즈 마커와 함께 190 볼트(volt)에서 약 4시간 전기영동을 실시하고 전개된 단백질을 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane; 이하 “PVDF막"이라 한다, Millipore, MA)에 전기를 이용하여 옮기고 블로킹용액 즉, 5% 되도록 무지방 건유(nonfat dried milk)가 첨가된 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS) 용액으로 실온에서 1시간 블로킹(blocking)을 실시하였다. 그 다음 알칼라인 포스포타아제(alkaline phosphotase)가 콘쥬게이션(conjugation)된 염소유래 항-돼지 IgG(H+L) AP (BETHYL, Texas)를 1:1,000배로 블로킹 용액에 희석한 용액에서 PVDF막을 실온에서 1시간 반응시킨 후 PBS-T 용액으로 3회 세척하였다. 세척된 PVDF막은 1-STEPTM NBT-BCIP (Pierce, IL)용액으로 발색하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 Fc를 발현하는 세포주들에서만 약 50 kDa에 해당하는 Fc 단백질 밴드를 확인할 수 있었다.

7. 골드 입자를 이용한 본 발명에 따른 형질전환 세포주의 돼지 Fc 세포 표면 발현여부 확인

상기 4.에서 트랜스펙션 후 제오신 내성을 가진 단일 클론으로 선발된 각각의 Vero 세포주의 세포막 및 이들 세포에서 증식된 바이러스의 외피에 Fc 발현 여부를 골드 입자가 콘쥬게이션된 프로테인 A 항체를 이용하여 확인하였다.

먼저, 본 발명에서 선발한 Vero 세포주가 75 ㎠ 조직배양 플라스크에 80-90% 단층(mono layer)이 형성되었을 때 조직배양액을 제거하고 세포수와 대비하여 0.1 ～ 1 m.o.i. (multiplicity of infection) 되도록 돼지 오제스키바이러스를 배양액에 희석한 접종액으로 37℃에서 1시간 정치하여 감염시킨 후 접종액을 제거하고 신선한 조직배양액을 넣은 후 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 3일간 배양한 후 수확하 였다. 전자현미경으로 확인하기 위하여 수확한 각각의 세포주를 PBS로 세척한 후 돼지 IgG의 Fc 부분과 결합력이 강한 프로데인 A(protein A)에 10㎚ 골드(Gold) 입자를 콘쥬게이션시킨 프로테인 A 항체(british-Biocell International, PAG10)를 반응시킨 후 전자현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 형질전환 시키지 않은 Vero 세포주(Vero-WT)의 경우 세포막 및 이 세포에서 증식된 돼지 오제스키바이러스 외피에서는 골드 입자의 반응을 확인할 수 없었다. 그러나, “Vero-pIgGFc1” 및 “Vero-pIgGdHFc(2)”, “Vero-pIgGdHFc (3)” 세포주 모두에서는 도 19에 나타낸 바와 같이 세포막 및 이들 세포에서 증식하여 버딩(budding)하기 전의 돼지 오제스키바이러스의 바이러스 외피에 골드 입자가 반응함을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 형질전환 세포주들의 세포 표면에 돼지 Fc가 발현됨을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2]

1. 돼지 비장세포 및 PK -15 세포주로부터 총 RNA 의 분리

돼지 TR의 TM 유전자를 클로닝하기 위하여 돼지 신장세포주(porcine normal kidney cell line)에서 총 RNA를 추출하였고, 돼지 IgG의 Fc 도메인 유전자를 클로닝하기 위하여 면역적인 활동이 왕성한 장기(비장)를 선택하였으며(Takasima, 2005), 국내 양돈농가 사육 돼지의 비장을 적출하고, 이를 균질화(homogenization)하여, QuickGene RNA Cultured Cell Kit(Fujifilm)와 QuickGene-810(Fujifilm)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 각각의 총 RNA를 추출 하였다. 추출된 총 RNA는 -80℃에 보관, 사용하였다.

2. 총 RNA 로부터 돼지 TR 의 TM 유전자의 증폭, 클로닝 및 염기서열 분석 확인

돼지 IgG의 Fc 유전자를 세포 외피막에 발현시킬 수 있는 기능적인 유전자만을 증폭하기 하기 위해서 Takasima 등(2005)이 공시한 프라이머를 참조하여 GenBank accession number AF416763의 돼지 TR 전장 코딩서열(Transferrin receptor complete cds)을 바탕으로 N-말단의 부분의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 설계하였다.

돼지 TR 센스 프라이머(이하 "TR-F"라 한다)는 BamHI 싸이트, 코작 염기서열과 개시코돈(ATG) 순으로 cds 시발점에서부터 시작하여 5’- GGATCC - GCCACC -ATG-ATGGATCAAGCTAGA-3‘ (30mer; 서열번호 14)로 설계하였으며, 돼지 TR 안티센스 프라이머(이하 ”TR-R"이라 한다)는 kpnI 싸이트를 연결시켜 5’-GGTACCATCTGTTTTTGATTCTACACGT-3’ (28mer; 서열번호 15)로 설계하고 올리고핵산을 주문합성(Espec oligo, Japan)하여 사용하였다.

상기 1.에서 PK-15 세포에서 추출한 총 RNA 1㎍과 2.5μM의 Oligo dT 프라이머를 이용하여 M-MLV 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 42℃에서 30분간 반응한 후, 99℃(heat block)에서 5분간 방치한 하고, 4℃에서 식혀 cDNA를 획득하였다.

PrimeScript^TM RT-PCR Kit를 이용하여 획득한 돼지 cDNA 1㎍에 TR-F(20μM) 프라이머와 TR-R(20μM) 프라이머를 각각 0.5㎕를 첨가하여 제조사의 방법에 따라 PCR 반응액을 조성하였으며, 반응조건으로는 94℃ 1분 반응 후(pre-denaturation), 94℃ 30초(denaturation), 60℃ 30초(annealing), 72℃ 30초(elongation)에서 30 cycle 실시 후, 72℃ 5분간(post-elongation) 반응을 PCR machine(MJ research)을 이용하여 실시하였다. PCR 반응이 종료 후, 첫 번째 PCR 반응액을 1㎕(template)를 취하여 첫 번째와 동일한 PCR 반응액을 조성하였으며, 2nd PCR의 반응조건으로는 94℃ 1분 반응 후(pre-denaturation), 94℃ 30초(denaturation), 63℃ 30초(annealing), 72℃ 30초(elongation)에서 30 cycle 실시 후, 72℃ 5분간(post-elongation) 반응을 PCR machine(MJ research)을 이용하여 실시하였다.

PCR 반응 종료 후, 1% 아가로오스(agarose)에 전기영동(electrophoresis)하여 318 bp의 목표 유전자 밴드(band)를 확인할 수 있었으며, 증폭된 유전자는 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3.1(ABI)과 3130 Automatic Genetic Analyzer(ABI)를 이용하여 DNA 염기서열을 분석하고, 종래의 GenBank 데이터 베이스에 등록된 해당 유전자와 상동성 정도를 분석하였다. 증폭된 유전자는 TA 클로닝 벡터(Novagen, USA)에 클로닝하여 “pT7/TR" 플라스미드 벡터를 작성하였다.

클로닝한 돼지 TR의 TM 염기서열(서열번호 16)과 아미노산 서열(서열번호 17) 및 "pT7/TR" 플라스미드의 유전자 지도는 도 21과 도 22와 같다.

3. 총 RNA 로부터 돼지 IgG 의 Fc 유전자의 증폭, 클로닝 및 염기서열 분석 확인

현재까지 밝혀진 돼지 IgG 유전자를 정렬(alignment)하고 상동성(homology)을 비교하여 GenBank accession number M81770의 유전자를 바탕으로 돼지의 IgG의 Fc 부분 중에서 힌지, CH2 및 CH3 부분의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 설계하였다.

돼지 IgG Fc 부분 중 힌지, CH2 및 CH3 부분의 유전자를 증폭시키기 위해 돼지 IgG Fc 센스 프라이머(이하 “IgG-F”라 한다)는 5‘쪽에 KpnI 제한효소 인식서열을 연결시켜 5’-GGTACC-CGTGTTGGAACAAAGACCAAAC-3' (28mer; 서열번호 18)로 설계를 하였으며, 돼지 IgG Fc 안티센스 프라이머(이하 “IgG-R”라 한다)는 5‘쪽에 BamHI 제한효소 인식서열을 연결시켜 5’-GGATCC-TCATTTACCCTGAGTCTTGGAG-3' (28mer; 서열번호 19)로 설계하고 올리고핵산을 주문합성(Espec oligo, Japan)하여 사용하였다.

상기 1.에서 한국 돼지의 비장에서 추출한 총 RNA 1㎍과 2.5μM의 Oligo dT 프라이머를 이용하여 M-MLV 역전사효소(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 42℃에서 30분간 반응한 후, 99℃(heat block)에서 5분간 방치한 하고, 4℃에서 식혀주어 cDNA를 획득하였다.

PrimeScript^TM RT-PCR Kit를 이용하여 획득한 돼지 cDNA 1㎍에 sIgG-F(20μM) 프라이머와 sIgG-R(20μM) 프라이머를 각각 0.5㎕를 첨가하여 제조사의 방법에 따라 PCR 반응액을 조성하였으며, 반응조건으로는 94℃ 1분 반응 후(pre-denaturation), 94℃ 30초(denaturation), 60℃ 30초(annealing), 72℃ 30초(elongation)에서 35 cycle 실시 후, 72℃ 5분간(post-elongation) 반응을 PCR machine(MJ research)을 이용하여 실시하였다. PCR 반응이 종료 후, 첫 번째 PCR 반응액을 1㎕(template)를 취하여 첫 번째와 동일한 PCR 반응액을 조성하였으며, 2nd PCR의 반응조건으로는 94℃ 1분 반응 후(pre-denaturation), 94℃ 30초(denaturation), 63℃ 30초(annealing), 72℃ 30초(elongation)에서 35 cycle 실시 후, 72℃ 5분간(post-elongation) 반응을 PCR machine(MJ research)을 이용하여 실시하였다.

PCR 반응 종료 후, 1% 아가로오스에 전기영동하여 711 bp의 목표 유전자 밴드를 확인할 수 있었으며, 증폭된 유전자는 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver. 3.1(ABI)과 3130 Automatic Genetic Analyzer(ABI)를 이용하여 DNA 염기서열을 분석하고, 종래의 GenBank 데이터 베이스에 등록된 해당 유전자와 상동성 정도를 분석하였다. 증폭된 유전자는 TA 클로닝 벡터(Novagen, USA)에 클로닝하여 “pT7/Fc" 플라스미드 벡터를 작성하였다.

클로닝한 돼지의 IgG Fc 부분의 염기서열(서열번호 20)과 아미노산 서열(서열번호 21) 및 "pT7/Fc" 플라스미드의 유전자 지도는 도 23과 도 24와 같다.

4. 클로닝한 돼지 TR 의 TM 유전자와 돼지 IgG 의 Fc 유전자를 결합시켜 새로운 “pT7Blue/TR-Fc” 플라스미드 벡터의 구축

상기 3.에서 PCR 증폭 후 pT7 blue 벡터에 클로닝한 돼지 IgG Fc(pT7/Fc) 유전자를 KpnI으로 처리하여 318 bp의 유전자 단편을 겔 추출(gel extraction) 방법으로 취하고, 상기 2.에서 PCR 증폭 후 pT7 blue 벡터에 클로닝한 돼지 트랜스페린 수용체(pT7/TR) 유전자를 또한 KpnI으로 처리하여 3.6 kb의 유전자의 단편을 얻은 후, 셀프-라이게이션(self-ligation)을 방지하기 위하여 CIAP 처리를 한다. 두 유 전자 단편(pT7/TR와 pT7/IgG)을 라이게이션하여 “pT7/TR-Fc" 플라스미드를 작성하고, 이렇게 형성된 플라스미드 DNA를 DH5α competent cell에 트랜스포메이션(transformation) 시키고, 제한효소를 이용한 RFLP 방법(제한효소 절편 길이 다양성, restriction fragment-length polymorphism)을 이용하여 플라스미드 벡터의 구축을 확인하였다. 확인된 “pT7/TR-Fc" 플라스미드를 BamHI으로 처리하여 1029bp의 돼지 TR-IgG Fc 유전자(TR-Fc)를 획득한 후, 이 유전자 단편을 새로운 플라스미드(pCMV5-IRES-GFP)에 삽입하기 위한 전처리를 한다. TR-Fc에 클레노우(klenow) 처리를 하여 블런트 말단(blunt ending)으로 만들어 주고, 또한 pCMV5-IRES-GFP 벡터도 BglII로 처리하고 클레노우를 37℃에서 10분간 처리 한 후, 50℃에서 30분간 CIAP 처리를 해준다. 준비된 TR-Fc 단편과 pCMV5-IRES-GFP 벡터 유전자 단편을 라이게이션하여 “pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드를 작성하고, 이렇게 형성된 플라스미드 DNA를 DH5α competent cell에 트랜스포메이션 한다. 트랜스포메이션한 후, Alkalysis mini-prep 방법을 이용하여 DNA를 추출하여 제한효소를 이용한 RFLP 방법으로 궁극적으로 획득하고자 하는 최종산물(pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc)을 확인하였다. 플라스미드의 유전자 지도는 도 25에 나타내었다.

5. “ pCMV5 - IRES - GFP / TR - Fc " 유전자 단편의 PK -15 세포주로 트랜스펙션

도 26과 같이, 돼지의 바이러스의 증식이 가능한 돼지 신장세포 유래의 PK-15에 종래의 포유류세포 트랜스펙션(mammalian cell transfection)법에 준해 상기 4.에서 작성한 “pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드를 PK-15 세포에 Lipofectamin(invitrogen)을 이용하여 트랜스펙션을 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 1㎍의 플라스미드 DNA에 무혈청배지(OPTI-MEM, Gibco) 100㎕에 혼합하고, 여기에 6㎕의 Plus reagent 용액을 첨가 혼합하고, 또 다른 튜브에 무혈청배지(OPTI-MEM, Gibco) 100㎕를 분주하고 Lipofectamin reagent를 4㎕를 첨가하고 실온에서 15분간 방치하였다. 반응 종료 후, 무혈청배지에 Lipofectamin reagent를 첨가한 시료를 전부 취하여 플라스미드 DNA(Plus reagent를 첨가)에 첨가 혼합시켜 DNA-리포좀(DNA-liposome)액을 제조하고, 이를 실온에서 15분간 방치하였다. 이 사이에 PK-15 세포의 융합도(confluency)가 50∼80%인 웰을 선택하여 무혈청배지(OPTI-MEM, Gibco) 800㎕를 분주해 주었다. 반응이 종료된 후 50∼80%의 단층을 형성한 PK-15 세포가 존재하는 웰에 DNA-리포좀액(형질감염 혼합물)을 웰 전체에 골고루 분주되게 한 방울씩 첨가해주었다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 12시간 반응을 하고, 혈청이 첨가된 배지(7.5% FCS RPMI 1640)로 교환한 후, 24시간 배양하고 형광현미경을 이용하여 GFP 유전자의 발현 여부를 관찰하였다. 또한 HRP-Rabbit Anti-Porcine IgG(H+L) 항체(Zymed)를 이용한 direct immunostain 방법으로 Fc 발현 유무를 확인하였다.

6. 푸로마이신을 첨가한 배지를 이용한 형질전환 Fc 발현 세포주의 약제 감수성 클론의 선발( selection )

혈청이 첨가된 PRMI 1640(7.5% FCS, Gibco)에 푸로마이신(sigma)의 농도가 400㎍/㎖되게 세포배양 배지를 제조하였다. GFP 유전자의 발현을 형광현미경을 통해서 확인한 6-웰 세포를 100㎜ 페트리디쉬로 옮긴 후, 푸로마이신이 첨가된 배지로 배양을 한다. 트렌스펙션 후, 푸로마이신에 약재내성 세포주에 대한 제한 희석 세포 클로닝을 최소한 3회 이상 반복하여 수행하였다. 최종적으로 약재의 내성을 보이는 세포주 클론에 대한 복수의 스탁(stock)을 확보하여 IgG Fc 발현여부를 확인하였다.

7. 세포 ELISA 또는 형광항체법을 이용한 푸로마이신 내성 세포주의 돼지 Fc 발현 확인

각 세포주 클론에 대한 Fc 단백의 발현 확인시험은 암시야 환경에서 형광현미경을 이용하여 GFP 유전자의 발현 유무를 관찰하고(도 27 참조), 또한 발현단백의 분자량을 확인하기 위해서는 세포단백 분획을 종래의 SDS-PAGE법을 통해 얻어, 셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)(Bio-Rad)에 세포분획을 종래의 기법에 준하여 전이시킨 후, mouse anti-swine IgG Fc-specific horseradish peroxidase-conjugated antidody(sigma)를 이용해 발현단백의 분자량을 확인하였다.

ELISA법을 이용한 Fc 발현유무 및 발현량도 각 세포주 클론별로 확인을 하였다. 간략하게 서술을 하면, 세포를 96-웰 조직배양용 플레이트(Corning)에 각 웰 당 100,000개의 Fc 발현 세포를 시딩한 후, HRP-Rabbit Anti-Porcine IgG(H+L) 항체(Zymed)로 항원-항체 반응을 수행한다. 발색액 SAT blue를 첨가하고 30분간 방치한 다음 O.D 490nm로 ThermoMax plate reader(Molecular Devices)를 이용해 흡광도를 측정하였다.

확인 결과 도 12와 같이 정상적인 세포에서는 동일한 cellular ELISA 과정을 거쳐서 490nm에서 0.1 이하의 낮은 수치를 보였으며, 선발된 클론에서는 클론별로 개체 차이를 보였지만 안정된 높은 O.D 같은 나타내어 Fc를 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 28 참조).

도 1은 돼지 IgG의 Fc 도메인 부분을 세포 표면에 발현하는 모식도이다.

A---일반적으로 항체가 항원과 결합하는 형태이며 항체의 각 구성부분인 도메인들과 명칭을 나타낸다.

B 및 C---돼지의 트랜스페린 수용체의 트랜스멤브레인 도메인이 NH 말단을 이루며 세포막에 결합하고, 돼지 IgG 항체의 Fc 부분을 발현하는 두 가지 형태를 보여주는 모식도로서 B는 돼지 IgG 항체의 힌지 부분과 CH2 및 CH3 도메인, C는 CH2 및 CH3 도메인 순으로 COOH 말단을 이루도록 발현되게 하는 모식도이다.

도 2는 돼지 IgG의 Fc 부분이 포유동물 세포의 표면에 발현되도록 하기 위한 유전자 삽입용 “pBGFP-pIgGFc" 및 “pBGFP-pTR-pIgGdHFc" 플라스미드의 구성 모식도이다.

도 3은 돼지 TR 유전자 및 돼지 IgG의 Fc 유전자를 각각 PCR 증폭하고 클로닝한 후 EcoRI으로 절단하여 전기영동한 사진이다.

레인 1---돼지 간조직으로부터 클로닝한 TR 유전자

레인 2---돼지 신장세포주(PK-15)로부터 클로닝한 TR 유전자

레인 3---1 kb DNA 사이즈 마커

레인 4---돼지 비장조직으로부터 클로닝한 Fc 유전자 (H+CH2+CH3)

레인 5---돼지 비장조직으로부터 클로닝한 Fc 유전자 (CH2+CH3)

도 4는 5' 말단에 NotI 싸이트, Kozak 및 개시코돈(ATG), 3' 말단에 BamHI 싸이트를 삽입하여 클로닝한 돼지 TR의 TM 도메인 유전자의 염기서열이다.

도 5는 클로닝한 돼지 TR 유전자를 포함한 “pGpTRR2" 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 6은 5' 말단에 BamHI 싸이트와 3'말단에 PmeI 싸이트를 삽입하여 클로닝한 것으로서, 돼지의 IgG의 힌지를 포함한 Fc 부분(pIgG-Fc) 유전자의 염기서열이다.

도 7은 클로닝한 돼지 IgG의 힌지를 포함한 Fc 부분인 ”pIgG-Fc“ 유전자를 포함한 “pGpIgG1FcR" 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 8은 5' 말단에 BamHI 싸이트와 3' 말단에 PmeI 싸이트를 삽입하여 클로닝한 것으로서, 돼지 IgG의 힌지를 포함하지 않는 Fc 부분(pIgG-dHFc) 유전자의 염기서열이다.

도 9는 클로닝한 돼지 IgG의 힌지를 포함하지 않는 Fc 부분인 “pIgG-dHFc” 유전자를 포함한 “pGpIgG1dHFcR" 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 10은 세포에 형질전환시 그 효율을 GFP 발현정도로 쉽게 확인하기 위하여, pBudCE4.1 플라스미드에 CMV 프로모터에 의해 GFP유전자가 발현되도록 삽입하여 제조한 “pBugGFP" 플라스미드의 유전자지도이다.

도 11은 유전자 삽입용 “pBGFP-pTR-pIgGFc" 및 “pBGFP-pTR-pIgGdHFc" 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 모식도로서 GFP 유전자의 삽입 단계와 pTR과 pIgG-Fc 및 pTR과 pIgG-dHFc를 각각 삽입하는 단계를 나타낸 것이다.

도 12는 GFP 유전자와 “pTR-pIgG-dHFc” 유전자가 이중으로 발현되도록 작성한 “pTR-pIgGdHFc” 유전자 삽입용 최종단계의 “pBGFP-pTR-dHFc" 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 13은 GFP 유전자와 “pTR-pIgG-Fc” 유전자가 이중으로 발현되도록 작성한 “pTR-pIgG-Fc” 유전자 삽입용 최종단계의 “pBGFP-pTR-Fc" 플라스미드의 유전자 지도이다.

도 14는 Vero 세포를 각각 “pBGFP-pTR-Fc" 및 “pBGFP-pTR-dHFc" 플라스미드로 형질전환시키고, GFP 유전자의 발현을 광학현미경 및 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

A---“pBGFP-pTR-Fc”으로 형질전환한 Vero 세포

B---“pBGFP-pTR-dHFc”으로 형질전환한 Vero 세포

도 15는 본 발명에 따른 형질전환 세포주에서 돼지 IgG 항체의 Fc 발현여부를 항 돼지 IgG(H+L) 항체를 이용한 ELISA 분석으로 확인한 결과이다.

A---항 돼지 IgG(H+L) 항체를 반응시키지 않은 세포주

B---항 돼지 IgG(H+L) 항체를 반응시킨 세포주

도 16은 본 발명에 따른 형질전환 세포주의 고정된 상태에서 돼지 IgG의 Fc 발현여부를 FITC가 콘쥬게이션된 항 돼지 IgG 항체(FITC conjugated anti-porcine IgG)를 사용하여 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

A---“Vero-pIgGdHFc(2)” 세포주

B---“Vero-pIgGFc1” 세포주

C---형질전환 시키지 않은 대조군의 정상 Vero 세포주(Vero-WT)

도 17은 본 발명에 따른 형질전환 세포주의 고정하지 않은 상태에서 돼지 IgG의 Fc 발현여부를 FITC가 콘쥬게이션된 항 돼지 IgG 항체를 사용하여 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 18은 본 발명에 따른 형질전환 세포주에서 돼지 IgG의 Fc 단백질의 존재를 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)으로 확인한 사진이다.

레인 1---정상 Vero 세포주(Vero-WT) 용해물(lysate)

레인 2---“Vero-pIgGdHFc(2)” 세포주 용해물

레인 3---“Vero-pIgGdHFc(3)” 세포주 용해물

레인 4---“Vero-pIgGFc1” 세포주 용해물

레인 5---염색(pre-stained) 단백질 사이즈 마커

도 19는 본 발명에 따른 형질전환 세포주에서 돼지 IgG의 Fc의 표면 발현 여부를 확인하기 위해 세포주를 오제스키바이러스로 감염시키고 골드 입자(gold particle)가 결합된 프로테인 A 항체와 반응시켜 전자현미경으로 확인한 사진이다.

A---세포막에서 버딩(budding)되는 바이러스의 외피가 되는 막표면에 반응한 골드 입자

B---절개된 바이러스 구형 말단부위 외피부분에 반응한 골드 입자

C---세포막을 따라 외부에서 반응한 골드 입자

도 20은 세포의 표면에 돼지 IgG의 Fc 유전자를 발현시키기 위한 플라스미드 벡터(pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc)의 구조 모식도이다.

도 21은 세포의 표면에 돼지 IgG의 Fc 유전자를 발현시키기 위해 클로닝한 돼지의 TR의 TM 도메인의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 5' 말단에 BamHI 제한효소 인식부위, 코작 및 개시코돈(ATG)과 3‘ 말단에 KpnI 제한효소 인식부위를 삽입하여 클로닝을 용이하게 하였다.

도 22는 돼지의 신장세포주에서 추출한 총 RNA에서 RT-PCR을 통해 증폭한 TR의 TM 도메인 유전자를 pT7 blue 벡터(novagen, USA)에 TA 클로닝한 “pT7/TR" 플라스미드의 유전자 지도 모식도를 나타낸다.

도 23은 돼지 IgG의 Fc 부분 중 힌지, CH2, CH3 부위의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 5' 말단에 kpnI 제한효소 인식부위와 3‘ 말단에 BamHI 제한효소 인식부위를 삽입하여 클로닝을 용이하게 하였다.

도 24는 돼지의 비장조직에서 추출한 총 RNA에서 RT-PCR을 통해 증폭한 IgG Fc 부분의 유전자를 pT7 blue 벡터(novagen, USA)에 TA 클로닝한 “pT7/Fc" 플라스미드의 유전자 지도 모식도를 나타낸다.

도 25는 돼지 TR의 TM 도메인 유전자와 돼지의 IgG의 Fc 유전자를 이중으로 발현할 수 있는 "pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드의 유전자 지도 모식도를 나타낸다.

도 26은 클로닝한 “pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc” 플라스미드를 돼지의 신장세포주(PK-15)에 트랜스펙션시켜 세포의 표면에 돼지 IgG의 Fc 유전자가 발현되는 일련의 과정을 보여주는 모식도이다.

도 27은 "pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드를 PK-15 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 암시야 환경에서 형광현미경을 이용하여 GFP 유전자의 발현 여부를 관찰한 사진이다. 사진의 좌측은 광학현미경 사진이고, 우측은 형광현미경 사진을 나타낸다.

도 28은 "pCMV5-IRES-GFP/TR-Fc" 플라스미드를 PK-15 세포주에 트랜스펙션시킨 후, 푸로마이신 약제 감수성을 기본으로 선발된 단일 클론 PK-15 세포에 세포성 ELISA를 실시하여 IgG 항체의 Fc 부분의 발현여부를 490nm로 흡광도를 측정한 그래프이다.

<110> National Veterinary Research and Quarantine Service Komipharm International Co., Ltd <120> A vector for cell surface expression of pig IgG Fc domian, a host cell transformed with the vector and a manufacturing method of vaccine against viruses related to pig diseases using the host cell <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTR sense primer <400> 1 agcggccgcg ccaccatgat ggatcaagct aga 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTR antisense primer <400> 2 cgcggatcca tctgtttttg attctacacg 30 <210> 3 <211> 324 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 3 agcggccgcg ccaccatgat ggatcaagct agatcagcat tctctagttt gtttggcgga 60 gaaccattgt catacacccg gtttagtctg gctcggcagg tagatggtga taacagtcat 120 gtggagatga agctagcagc agatgaagaa gaaaatgttg acagcaacac aaggagtaac 180 cacatcggtg tcgcaaaacc aaaaaggcta aatggatatg tctgctatgg gattattgct 240 gtaatcacct ttttcttgat tggatttatg attggctact tggcctattg taaacgtgta 300 gaatcaaaaa cagatggatc cgcg 324 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgG-Fcf primer <400> 4 cgcggatccg tggccgggcc ctcggtcttc 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgG-dHFcf primer <400> 5 cgcggatccg gaatacacca gccgcaaaca 30 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pIgG1r primer <400> 6 cggtttaaac tcatttaccc tgagtcttgg a 31 <210> 7 <211> 712 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 7 cgcggatccg gaatacacca gccgcaaaca tgtcccatat gcccaggctg tgaagtggcc 60 gggccctcgg tcttcatctt ccctccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccagacc 120 cccgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtc agcaaggagc acgccgaggt ccagttctcc 180 tggtacgtgg acggcgtaga ggtgcacacg gccgagacga gaccaaagga ggagcagttc 240 aacagcacct accgtgtggt cagcgtcctg cccatccagc accaggactg gctgaagggg 300 aaggagttca agtgcaaggt caacaacgta gacctcccag cccccatcac gaggaccatc 360 tccaaggcta tagggcagag ccgggagccg caggtgtaca ccctgccccc acccgccgag 420 gagctgtcca ggagcaaagt cacgctaacc tgcctggtca ttggcttcta cccacctgac 480 atccatgttg agtggaagag caacggacag ccggagccag agaacacata ccgcaccacc 540 ccgccccagc aggacgtgga cgggaccttc ttcctgtaca gcaaactcgc ggtggacaag 600 gcaagatggg accatggaga caaatttgag tgtgcggtga tgcacgaggc tctgcacaac 660 cactacaccc agaagtccat ctccaagact cagggtaaat gagtttaaac cg 712 <210> 8 <211> 667 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 8 cgcggatccg tggccgggcc ctcggtcttc atcttccctc caaaacccaa ggacaccctc 60 atgatctccc agacccccga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtcagcaa ggagcacgcc 120 gaggtccagt tctcctggta cgtggacggc gtagaggtgc acacggccga gacgagacca 180 aaggaggagc agttcaacag cacctaccgt gtggtcagcg tcctgcccat ccagcaccag 240 gactggctga aggggaagga gttcaagtgc aaggtcaaca acgtagacct cccagccccc 300 atcacgagga ccatctccaa ggctataggg cagagccggg agccgcaggt gtacaccctg 360 cccccacccg ccgaggagct gtccaggagc aaagtcacgc taacctgcct ggtcattggc 420 ttctacccac ctgacatcca tgttgagtgg aagagcaacg gacagccgga gccagagaac 480 acataccgca ccaccccgcc ccagcaggac gtggacggga ccttcttcct gtacagcaaa 540 ctcgcggtgg acaaggcaag atgggaccat ggagacaaat ttgagtgtgc ggtgatgcac 600 gaggctctgc acaaccacta cacccagaag tccatctcca agactcaggg taaatgagtt 660 taaaccg 667 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFPnsiF primer <400> 9 atgcattagt tattaatagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40mluR primer <400> 10 acgcgttaag atacattgat 20 <210> 11 <211> 100 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 11 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Ser Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Ala Asp Glu Glu Glu Asn Val 35 40 45 Asp Ser Asn Thr Arg Ser Asn His Ile Gly Val Ala Lys Pro Lys Arg 50 55 60 Leu Asn Gly Tyr Val Cys Tyr Gly Ile Ile Ala Val Ile Thr Phe Phe 65 70 75 80 Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Ala Tyr Cys Lys Arg Val Glu 85 90 95 Ser Lys Thr Asp 100 <210> 12 <211> 232 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 12 Gly Ser Gly Ile His Gln Pro Gln Thr Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys 1 5 10 15 Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser 130 135 140 Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile 145 150 155 160 His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr 165 170 175 Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe 195 200 205 Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys 225 230 <210> 13 <211> 216 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 13 Ser Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 1 5 10 15 Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 20 25 30 Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn 50 55 60 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp 65 70 75 80 Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro 85 90 95 Ala Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu 100 105 110 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser 115 120 125 Lys Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile 130 135 140 His Val Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe 180 185 190 Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys 210 215 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TR-F primer <400> 14 ggatccgcca ccatgatgga tcaagctaga 30 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TR-R primer <400> 15 ggtaccatct gtttttgatt ctacacgt 28 <210> 16 <211> 318 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 16 ggatccgcca ccatgatgga tcaagctaga tcagcattct ctagtttgtt tggcggagaa 60 ccattgtcat acacccggtt tagtctggct cggcaggtag atggtgataa cagtcatgtg 120 gagatgaagc tagcagcaga tgaagaagaa aatgttgaca gcaacacaag gagtaaccac 180 atcggtgtcg caaaaccaaa aaggctaaat ggatatgtct gctatgggat tattgctgta 240 atcacctttt tcttgattgg atttatgatt ggctacttgg cctattgtaa acgtgtagaa 300 tcaaaaacag atggtacc 318 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 17 Gly Ser Ala Thr Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Ser Leu 1 5 10 15 Phe Gly Gly Glu Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln 20 25 30 Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Ala Asp Glu 35 40 45 Glu Glu Asn Val Asp Ser Asn Thr Arg Ser Asn His Ile Gly Val Ala 50 55 60 Lys Pro Lys Arg Leu Asn Gly Tyr Val Cys Tyr Gly Ile Ile Ala Val 65 70 75 80 Ile Thr Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Ala Tyr Cys 85 90 95 Lys Arg Val Glu Ser Lys Thr Asp Gly Thr 100 105 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-F primer <400> 18 ggtacccgtg ttggaacaaa gaccaaac 28 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG-R primer <400> 19 ggatcctcat ttaccctgag tcttggag 28 <210> 20 <211> 717 <212> DNA <213> Sus sp. <400> 20 ggtacccgtg ttggaacaaa gaccaaacca ccatgtccca tatgcccagc ctgtgaatcg 60 ccagggccct cggtcttcat cttccctcca aaacccaagg acacccccat gatctcccgg 120 acaccccagg tcacgtgcgg taccgtggta gttgatgtga gccaggaaaa cccggaggtc 180 cagttctcct ggtacgtgga cggcgtagag gtgcacacgg cccagacgag gccaaaggag 240 gagcagttca acagcaccta ccgcgtggtc agcgtcctgc ccatccagca ccaggactgg 300 ctgaacggga aggagttcaa gtgcaaggtc aacaacaaag acctcccagc ccccatcaca 360 aggatcatct ccaaggccaa agggcagacc cgggagccgc aggtgtacac cctgccccca 420 cacgccgagg agctgtccag gagcaaagtc agcataacct gcctggtcat tggcttctac 480 ccacctgaca tcgatgtcga gtggcaaaga aacggacagc cggagccaga gggcaattac 540 cgcaccaccc cgccccagca ggacgtggac gggacctact tcctgtacag caagttctcg 600 gtggacaagg ccagctggca gggtggaggc atattccagt gtgcggtgat gcacgaggct 660 ctgcacaacc actacaccca gaagtctatc tccaagactc agggtaaatg aggatcc 717 <210> 21 <211> 236 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 21 Gly Thr Arg Val Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro 1 5 10 15 Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Pro Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Gly Thr 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu 65 70 75 80 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 100 105 110 Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu 130 135 140 Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro 165 170 175 Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr 180 185 190 Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly 195 200 205 Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 210 215 220 Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys 225 230 235

Claims (11)

1. (a) 돼지 트랜스페린 수용체의 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 유전자 및 돼지 면역글로불린 G의 Fc 도메인을 코딩하는 유전자를 포함하는 돼지 면역글로불린 G의 Fc 도메인의 세포 표면 발현용 벡터로 형질전환시킨 숙주세포에 돼지 질병 관련 바이러스를 감염시켜 증식시키는 단계; 및

   (b) 상기 (a) 단계에서 증식된 바이러스를 이용하여 생독 백신 또는 불활성화 백신을 제조하는 단계를 포함하는 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 트랜스멤브레인 도메인을 코딩하는 유전자가 서열번호 3 또는 서열번호 16으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 Fc 도메인을 코딩하는 유전자가 힌지(hinge), CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자, 또는 CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자임을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 힌지, CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자가 서열번호 7 또는 서열번호 20으로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 제3항에 있어서, CH2 및 CH3를 코딩하는 유전자가 서열번호 8로 표시되는 것임을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 도 12, 도 13 또는 도 25에 나타낸 바와 같은 유전자 지도를 갖는 것임을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 숙주세포는 포유류세포인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 기탁번호 KCLRF-BP-00165인 숙주세포인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 기탁번호 KCLRF-BP-00154인 숙주세포인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 돼지 IgG의 Fc 도메인을 세포 표면에 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 돼지질병 관련 바이러스는 돼지유행성설사바이러스(PEDV), 돼지전염성위장염바이러스(TGEV), 돼지로타바이러스(PoRotaV), 돼지오제스키병바이러스(ADV), 일본뇌염바이러스(JEV), 돼지콜레라바이러스(HCV), 돼지생식기호흡기증후군바이러스(PRRSV), 돼지인플루엔자바이러스(SIV) 및 돼지폭스바이러스(SPV)로 이루어진 군 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

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