KR100386318B1 - 오스테놀 유도체를 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

오스테놀 유도체를 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 오스테놀 유도체 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 크산틴 옥시다제(Xanthine Oxidase) 저해, 유도성 니트릭 옥시드 신타제(inducible Nitric oxide Synthase) 저해, 또는 퀴논 리덕타제(Quinone Reductase) 유도 활성 조성물 및 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 식에서,
R1은 수소; 치환되지 않거나 단일 또는 다중 치환된 (C1-C5)알킬, (C2-C6)알케닐 또는 (C2-C6)알키닐; (C1-C7)알킬카보닐; 벤질; 또는, (C3-C7)알릴카보닐 또는 (C3-C7)알릴카바밀이고,
R2는 수소; 또는 치환되지 않거나 하이드록시 또는 (C1-C5)알킬-OCO-로 치환된 (C2-C5)알킬 또는 (C2-C6)알케닐이거나; 또는
OR1과 R2가 함께 치환되지 않거나 치환된 산소 함유 5 또는 6원 헤테로 고리를 형성할 수 있으며,
단, R1과 R2가 동시에 수소는 아니다.

Description

오스테놀 유도체를 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING CANCER COMPRISING OSTHENOL DERIVATIVES}
본 발명은 오스테놀 유도체 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료에 유용한 약학 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야될 난치병 중의 하나로 전세계적으로 이를 치유하기 위한 치료제의 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이다. 그러나, 암은 그 유발원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 또한, 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암세포만을 선택적으로 제거하지 못하기 때문에 암의 발생후 이를 치료하는 대응방법보다는 암의 발생을 미리 방지하는 암예방(chemoprevention)이 암을 정복한다는 대전제하에서 훨씬 효율적인 방법이 될 것이다.
암의 예방을 위해서는 암발생의 여러 기전을 효율적으로 차단함으로써 정상세포가 암세포로 전이되는 과정을 미연에 방지하거나, 또는 발암기전의 진행을 지연시키거나 회복시킬 수 있는 물질을 사용할 수 있는데, 이러한 물질은 단기 또는 장기 독성이 없어야 하며, 복용이 용이하고 가격이 저렴해야 한다. 암의 발생은 매우 복잡하며 여러 단계에 의하여 진행된다고 알려져 있으며, 발암의 작용기전을 이해하는 것에 의해 암의 예방 및 치료에 쓰이는 약제의 개발이 가능하다.
이런 다단계 발암기전(Multistage Carcinogenesis)은 이미 1947년 베렌블럼(Berenblum) 등에 의해 마우스 피부를 이용한 2단계 발암기전을 이용한 실험모델로 그 개념이 정립되었다(베렌블럼 등의 문헌[Br. J. Cancer,1: 379-382, 1947] 참조). 이런 2단계 모델은 암의 진행과 관련하여 현재 중요한 모델로 연구되고 있으며, 제1단계는 발암(tumor initiation) 단계로 발암물질들에 의하여 직접 및 간접작용으로 세포내의 유전적 기작(genetic machinary)에 영향을 주는 비가역적인 과정으로 DNA와의 작용으로 세포내의 어떤 형태학적 변화도 수반되지 않으며 발암물질의 단 한번의 저농도 투여과정만으로도 충분히 일어난다고 알려져 있다(슬라가(Slagar) 등의 문헌[Cancer Res.,37: 3126-3131, 1977] 참조). 발암제의 예는 벤조피렌(benzo(a)pyrene), 7,12-디메틸벤즈(a)안트라센(7,12-dimethylbenz(a)anthracene) 등이 있다.
제2단계는 암 촉진(tumor promotion) 단계로 발암제에 의하여 생긴 주요 암세포가 어떤 자극에 의하여 암으로 진행되는 과정이다. 암촉진제(tumor promoter)는 일반적으로 발암물질은 아니며 발암제의 작용후 계속적인 작용이 있어야만 하며, 그 예로는 12-O-테트라데카노일포르볼-13-아세테이트(TPA)의 수용체인 프로테인 키나제(protein kinase) C(PKC)에 작용하는 TPA형 암촉진제(예: 포르볼 에스테르, 텔레오시딘(teleocidin))와 비TPA형 암촉진제(예: 오카다산(okadaic acid), 팔리톡신(palytoxin))가 있다. 암촉진제가 나타내는 생화학적 작용기전은 세포형태 변화, 혈소판 응집작용, 세포분열촉진, 세포간 교감억제, 염증작용촉진, 종양원(oncogene)과 전사인자(transcription factor)의 작용촉진, PKC의 활성증가 등이 있다.
보고되어진 암의 예방과 관련된 활성물질의 예는 β-카로틴(수다(Suda) 등 문헌[Carcinogenesis,7: 711-715, 1986] 참조), 세셀린형 쿠마린(니시노(Nishino) 등의 문헌[Carcinogenesis,11: 1557-1561, 1990] 참조), 강황(Curcuma longa)에서 분리된 쿠르쿠민(Curcumin)(라오(Rao) 등의 문헌[Carcinogenesis,14: 2219-2225, 1993] 참조), 파슬리(parsley)에서 분리된 미리스티신(myristicin)(젱(Zheng) 등의문헌[Carcinogenesis,13: 1921-1923, 1992] 참조), 녹차의 에피갈로카테킨-3-갈레이트(카티야(Katiyar) 등의 문헌[Nutrition and Cancer, 18: 73-73, 1992] 참조) 등이 있다.
퀴논 리덕타제(Quinone Reductase)는 II상 효소의 일종으로서 변이원(mutagen)이나 발암물질의 작용을 무독화시키는 효소로 알려져 있으며(루엔지(Luyengi) 등의 문헌[Phytochemistry(in press), 1994] 및 보이드(Boyd)의 문헌[J.B. Lippincott, Vol. 3(10), Philadelphiap, pp. 1-12, 1989] 참조), 이 효소의 활성 유도는 동물을 이용한 모델에서 암발생의 억제와 깊은 상관관계가 있음이 입증되었다(칸(Khan) 등의 문헌[Cancer Res.52, 4050-4052, 1992], 및 프로카스카(Prochaska) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 2394-2398, 1992] 및 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 8232-8236, 1985] 참조). 퀴논 리덕타제의 활성을 유도하는 물질로는 β-나프토플라본, 쿠마린, 디설피람, 인돌 3-아세토니트릴 및 인돌 3-카르비놀, 녹차, 올티플라즈(oltiplaz) 등이 보고되어 있다(와텐베르그(Wattenberg)의 문헌[Cancer Res. 45, 1-8, 1985] 및 [J. Natl. Cancer Inst. 52, 1583-1587, 1974], 리치티(Lichiti) 등의 문헌[J. Cell. Physiol., 113: 433-439, 1982], 로우리(Lowry) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 193: 265-275, 1951], 및 와텐베르그 등의 문헌[Cancer 40, 2432-2435, 1977], [Cancer Res. 39, 1651-1654, 1979], [Cancer Res. 30, 1922-1925, 1970], [Cancer Res. 38, 1410-1413, 1978] 및 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 128, 940-943, 1968] 참조).
본 발명자들은 천연자원들로부터 암 치료에 유용한 활성이 기대되는 식물을 탐색한 결과, 미나리과(Umbelliferae) 식물인 강활(Angelica KoreanaMaxim.)의 추출 분획을 분리·정제하여 획득한 여러 종의 쿠마린(Coumarin) 계열 화합물중 오스테놀(osthenol)이 암 유발 관련 효소인 크산틴 옥시다제(Xanthine Oxidase), 유도성 니트릭 옥시드 신타제(inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS) 등의 활성을 저해하는 것을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 오스테놀을 선도물질로 하여 SAR(structure activity relationship)방법을 통하여 합성된 오스테놀 합성 유도체들의 암 유발 관련 효소인 크산틴 옥시다제 저해, 유도성 니트릭 옥시드 신타제 저해, 또는 퀴논 리덕타제 유도활성 및 동물 실험을 통한 암 예방 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성시켰다.
본 발명의 목적은 오스테놀 유도체 또는 그의 염을 포함하는, 크산틴 옥시다제 저해, 유도성 니트릭 옥시드 신타제의 저해, 또는 퀴논 리덕타제 유도 활성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 오스테놀 유도체 또는 그의 염을 포함하는 각종 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 DMBA(7,12-디메틸벤즈[a]안트라센)를 이용한 피부암 유도 마우스 모델에서의 본 발명에 따른 여러 화합물의 피부암 억제효과를 나타낸 것이고,
도 2은 DMBA로 피부암을 유도한 마우스 모델에서의 화합물 7의 농도에 따른 피부암 억제효과를 나타낸 그래프이며,
도 3는 Balb/c 웅성 마우스의 유선(mammary gland) 조직 배양에서 확인되는 본 발명에 따른 여러 화합물의 종양 발생 억제효과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 오스테놀 유도체 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
화학식 1
상기 식에서,
R1은 수소; 치환되지 않거나 단일 또는 다중 치환된 (C1-C5)알킬, (C2-C6)알케닐 또는 (C2-C6)알키닐; (C1-C7)알킬카보닐; 벤질; 또는, (C3-C7)알릴카보닐 또는 (C3-C7)알릴카바밀이고,
R2는 수소; 또는 치환되지 않거나 하이드록시 또는 (C1-C5)알킬-OCO-로 치환된 (C2-C5)알킬 또는 (C2-C6)알케닐이거나; 또는
OR1과 R2가 함께 치환되지 않거나 치환된 산소 함유 5 또는 6원 헤테로 고리를 형성할 수 있으며,
단, R1과 R2가 동시에 수소는 아니다.
용어 "(C1-C5)알킬"은 탄소수 1 내지 5의 선형 또는 분지형의 일가 포화 탄화수소 라디칼을 의미하고, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 3급-펜틸 등이다.
용어 "(C2-C6)알케닐"은 탄소수 2 내지 6의 선형 또는 분지형의 이가 불포화 탄화수소 라디칼을 의미하고, 예컨대 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 이소부테닐, 2급-부테닐, 3급-부테닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 이소펜테닐, 3급-펜테닐, 1-헵테닐, 2-헵테닐 등이다.
용어 "(C2-C6)알키닐"은 탄소수 2 내지 6의 선형 또는 분지형의 삼가 불포화 탄화수소 라디칼을 의미하고, 예컨대 에티닐, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 이소프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 이소부티닐, 2급-부티닐, 3급-부티닐, 1-펜티닐, 2-펜티닐, 3-펜티닐, 4-펜티닐, 이소펜티닐, 1-헥시닐, 2-헥시닐, 3-헥시닐 등이다.
용어 "(C1-C7)알킬카보닐"은 탄소수 1 내지 7의 선형 또는 분지형의 일가 포화 탄화수소 라디칼을 포함하는 (C1-C7)알킬-CO-를 의미하고, 예컨대 메틸카보닐, 에틸카보닐, 프로필카보닐, 부틸카보닐, 이소부틸카보닐, 2급-부틸카보닐, 3급-부틸카보닐, 펜틸카보닐, 이소펜틸카보닐, 헥실카보닐, 헵틸카보닐 등이다.
용어 "단일 또는 다중 치환된 (C1-C5)알킬, (C2-C6)알케닐 또는 (C2-C6)알키닐"은 1개 이상의 하이드록시, 할로겐, (C1-C5)알킬카보닐 등에 의해 치환된 것을 말한다.
용어 "(C3-C7)알릴카보닐"은 알릴기를 함유하는 탄소수 3 내지 7의 불포화탄화수소를 포함하는 (C3-C7)알릴-CO-를 의미하고, 예컨대 벤조일카보닐 등이다.
용어 "(C3-C7)알릴카바밀"은 알릴기를 함유하는 탄소수 3 내지 7의 불포화탄화수소를 포함하는 (C3-C7)알릴-NHCO-를 의미하고, 예컨대 페닐카바밀 등이다.
용어 "(C2-C5)알킬"은 탄소수 2 내지 5의 선형 또는 분지형의 일가 포화 탄화수소 라디칼을 의미하고, 예컨대 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 2급-부틸, 3급-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 3급-펜틸 등이다.
OR1과 R2가 함께 형성할 수 있는 치환되지 않거나 치환된 산소 함유 5 또는 6원 헤테로 고리는 하이드록시, 하이드록시-(C1-C5)알킬 또는 벤조일옥시-(C1-C5)알킬로 치환된 테트라하이드로푸란, 푸란, 테트라하이드로피란 및 피란 고리 등을 말한다.
약리학적으로 허용가능한 염이란 약리학적으로 허용가능한 통상의 염을 말한다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물에서 바람직한 화합물은 R1이 수소, (C1-C5)알킬카보닐, (C3-C7)알릴카보닐 또는 (C3-C7) 알릴카바밀이고, R2가 CH2=CHCH2-또는 (C2-C5)알킬인 오스테놀 유도체이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 화합물에서 가장 바람직한 화합물은 R1이 수소, CH3CO, C6H5CO 또는 C6H5NHCO이고, R2가 CH2=CHCH2-또는 C3H7-이다.
본 발명의 대표적인 화합물의 구조를 하기 표 1에 나타내었다:
본 발명의 상기 화학식 1의 오스테놀 유도체는 7-하이드록시쿠마린 (화합물 1)을 출발물질로 하여 공지된 방법(로프티(M. Loufty)의 문헌[Pharmazie,1979,34, 672] 및 무리(R. D. H. Murry) 등의 문헌[Tetrahedron,1971,27, 1247] 참조)에 의해 제조할 수 있으며, 전술한 문헌은 모두 본원에 참고로 인용된다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 오스테놀 유도체 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 각종 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 피부암, 위암, 결장암, 유방암 등이 포함된다.
이 약학조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의하여 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 상기 화학식 1의 오스테놀 유도체 및 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 유발 관련 효소 저해 조성물 또는 암 예방 및 치료용 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여하거나 경구투여 할 수 있으며, 하루에 유효성분으로서 체중 1kg당 0.01 내지 10g, 바람직하게는 1 내지 5g의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 증증도에 따라 변화될 수 있다.
하기 실시예에 의해 본 발명을 예시하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하기실험에서 300MHz의1H NMR이 사용되었고, 칼럼용 실리카겔은 메르크사의 실리카겔 60(230-400메시 ASTM)이 사용되었다.
실시예 1
7-알릴옥시-크로멘-2-온(화합물 2)의 합성
무수 디메틸포름아미드(DMF) 6ml에 천연물 움벨리페론(7-하이드록시쿠마린: 화합물 1; 알드리치(Aldrich)사) 500mg(3.09mmol), K2CO31.28g(9.27mmol) 및 KI 513mg(3.09mmol) 및 알릴 브로마이드 544mg(4.5mmol)을 가하고 80℃에서 2시간동안 가열하였다. 에틸아세테이트 30ml를 사용하여 고체를 여과한 후 유기층을 물로 세척하였다. 감압증발하여 얻어진 잔사를 진공건조하여 백색 고체의 표제 화합물 618 mg(수율 99%)을 수득했다.
융점: 86-88℃
1H NMR(CDCl3) δ7.56(d, J=9.3Hz, 1H), 7.30(d, J=8.7Hz, 1H), 6.78(m, 2H), 6.18(d, J=9.6Hz, 1H), 5.97(m, 1H), 5.32(m, 2H), 4.52(m, 2H)
실시예 2
7-프로프-2-이닐옥시-크로멘-2-온(화합물 3)의 합성
무수 DMF 6ml에 천연물 움벨리페론(7-하이드록시쿠마린: 화합물 1)500mg(3.09mmol), K2CO31.28g(9.27mmol), KI 513mg(3.09mmol) 및 프로파질 브로마이드(80중량%) 0.69ml(4.635mmol)을 가하고 80℃에서 2시간동안 가열하였다. 에틸아세테이트 30ml를 사용하여 고체를 여과한 후 유기층을 물로 세척하였다. 감압증발하여 얻어진 잔사를 진공건조하여 백색 고체의 표제 화합물 615mg(수율 99%)을 수득했다.
융점: 120-122℃
1H NMR(CDCl3) δ7.65(d, J=9.6Hz, 1H), 7.40(d, J=8.4Hz, 1H), 6.92(m, 2H), 6.28(d, J=9.3Hz, 1H), 4.77(d, J=2.4Hz, 2H), 2.58(t, J=2.4Hz, 1H)
실시예 3
7-(1,1-디메틸-프로프-2-이닐옥시)-크로멘-2-온(화합물 4)의 합성
무수 DMF 4ml에 천연물 움벨리페론(7-하이드록시쿠마린: 화합물 1) 500mg(3.09mmol), K2CO3828mg(6.0mmol) 및 3-클로로-3-메틸-1-부틴 1.0ml(9.0mmol)을 가하고 90℃에서 24시간동안 가열하였다. 에틸아세테이트 50ml를 사용하여 고체를 여과한 후 유기층을 10% HCl 수용액(20ml)으로 2회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 미황색고체로서 표제 화합물 564mg(수율 80%)을 수득했다.
융점: 134-138℃
1H NMR(CDCl3) δ7.58(d, J=9.3Hz, 1H), 7.29(d, J=8.7Hz, 1H), 7.24(d, J=2.1Hz, 1H), 6.98(dd, J=2.4, 8.7Hz, 1H), 6.20(d, J=9.3Hz, 1H), 2.60(s, 1H), 1.64(s, 6H)
실시예 4
7-(1,1-디메틸-알릴옥시)-크로멘-2-온(화합물 5)의 합성
상기 실시예 3에서 얻은 7-(1,1-디메틸-프로프-2-이닐옥시)-크로멘-2-온(화합물 4) 500mg(2.19mmol)을 에틸아세테이트 10ml에 녹인 용액에 퀴놀린 50mg(10중량%) 및 린들러(Lindlar) 촉매 10mg을 넣었다. 이 반응액을 수소풍선하의 상온에서 5시간동안 교반하고, 에틸아세테이트 50ml를 가하고 2N HCl 수용액(20ml)으로 3회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 백색고체로서 표제 화합물 500mg(수율 100%)을 수득했다.
융점: 80-82℃
1H NMR(CDCl3) δ7.54(d, J=9.6Hz, 1H), 7.23(d, J=8.7Hz, 1H), 6.90(d, J=2.4Hz, 1H), 6.79(dd, J=2.4, 8.7Hz, 1H), 6.16(d, J=9.3Hz, 1H), 6.04(dd, J=10.8, 17.7Hz, 1H), 5.15(m, 2H), 1.46(s, 3H)
실시예 5
7-(1,1-디메틸-프로폭시)-크로멘-2-온(화합물 6)의 합성
상기 실시예 4에서 얻은 7-(1,1-디메틸-알릴옥시)-크로멘-2-온(화합물 5) 49.5mg(4.950mmol)을 에틸아세테이트 3ml에 녹인 용액에 10% 팔라듐 탄소 4mg을 첨가했다. 이 반응액을 수소풍선하의 상온에서 4시간동안 교반하고, 고체를 여과한 후 감압여과한 잔사를 짧은 실리카겔관 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=4:1)로 정제하여 무색 액체로서 표제 화합물 48mg(수율 95%)를 수득했다.
1H NMR(CDCl3) δ7.57(dd, J=0.3, 9.0Hz, 1H), 7.27(d, J=8.4Hz, 1H), 6.88(d, J=2.4Hz, 1H), 6.80(dd, J=2.1, 8.4Hz, 1H), 6.21(d, J=9.3Hz, 1H), 1.69(q, J=7.2Hz, 2H), 1.30(s, 6H), 0.93(t, J=7.2Hz, 3H)
실시예 6
8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7)의 합성
밀봉 튜브 용기에 상기 실시예 1에서 얻은 7-알릴옥시-크로멘-2-온(화합물 2) 8.0g 및 시약용 크실렌 40ml를 가하고 질소를 20분간 통과시킨 후 260℃ 모래욕에서 24시간동안 가열하였다. 상온으로 냉각 후 생성된 흰색 결정을 여과하고 벤젠으로 세척하여 표제 화합물 5.8g(수율 73%)을 수득하였다. 여액을 감압증류한 후 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=1:1)로 정제하여 미황색 고체의 표제 화합물 0.8g(수율 10%)과 미황색 고체의 6-알릴-7-하이드록시쿠마린0.96g(수율 12%)을 수득했다.
화합물 7: 융점: 164-166℃,1H NMR(CDCl3) δ7.65(d, J=9.3Hz, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 6.85(d, J=8.7Hz, 1H), 6.26(d, J=9.3Hz, 1H), 6.03(m, 1H), 5.16(m, 2H), 3.67(d, J=6.3Hz, 2H)
6-알릴-7-하이드록시쿠마린:1H NMR(CDCl3) δ7.65(d, J=9.0Hz, 1H), 7.23(s, 1H), 7.02(s, 1H), 6.25(d, J=9.3Hz, 1H), 6.00(m, 1H), 5.15(m, 2H), 3.45(d, J=6.3Hz, 2H)
실시예 7
아세트산 8-알릴-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스테르(화합물 8)의 합성
에테르 3ml 및 THF 1ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 100mg(0.490mmol)을 녹인 용액에 피리딘 0.1ml 및 염화아세틸0.1ml를 가했다. 반응액을 16시간 상온에서 교반 후, 생성된 고체를 여과한 다음 유기층에 에틸아세테이트 20ml를 가하고 10% HCl 수용액(10ml)으로 3회 세척한 후 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 정제하여 미황색 고체의 표제 화합물 108mg(수율 100%)을 수득했다.
융점: 92-96℃
1H NMR(CDCl3) δ7.62(d, J=9.6Hz, 1H), 7.32(d, J=8.4Hz, 1H), 6.97(d, J=8.7Hz, 1H), 6.33(d, J=9.3Hz, 1H), 5.82(m, 1H), 5.00(m, 2H), 3.49(m, 2H), 2.28(s, 3H)
실시예 8
벤조산 8-알릴-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스테르(화합물 9)의 합성
이염화탄소 1.5ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 13.3mg(0.065mmol)을 녹인 용액에 4-(디메틸아미노)피리딘 24mg(0.195mmol) 및 염화벤조일 14mg(0.098mmol)을 첨가했다. 반응액을 3시간동안 상온에서 교반한 후 유기층에 이염화탄소 20ml를 가하고 포화 NaCl 수용액(10ml)으로 2회 세척한 후, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 15.5mg(수율 77%)를 수득했다.
융점: 118-120℃
1H NMR(CDCl3) δ8.14(m, 2H), 7.65(d, J=9.6Hz, 1H), 7.59(m, 1H), 7.47(m, 2H), 7.36(d, J=8.4Hz, 1H), 7.11(d, J=8.4Hz, 1H), 6.34(d, J=9.6Hz, 1H), 5.85(m, 1H), 4.94(m, 2H), 3.54(m, 2H)
실시예 9
페닐-카바민산 8-알릴-2-옥소-2H-크로멘-7-일 에스테르(화합물 10)의 합성
이염화탄소 2.5ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 50mg(0.245mmol)을 녹인 용액에 피리딘 0.3ml(3.75mmol) 및 페닐이소시아네이트 196mg(1.65mmol)을 첨가했다. 반응액을 2일간 상온에서 교반한 후 생성된 고체를 여과한 다음, 유기층을 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=3:2)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 59mg (수율 75%)를 수득했다.
융점: 122-126℃
1H NMR(CDCl3) δ7.69(d, J=9.6Hz, 1H), 7.37(m, 5H), 7.17(m, 2H), 6.39(d, J=9.6Hz, 1H), 5.92(m, 1H), 5.03(m, 2H), 3.60(br, d, J=6.3Hz, 2H)
실시예 10
8-알릴-7-(1,1-디메틸-프로프-2-이닐옥시)-크로멘-2-온(화합물 11)의 합성
무수 DMF 4ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 204mg(1.0mmol), K2CO3276mg(2.0mmol) 및 3-클로로-3-메틸-1-부틴 0.5ml(4.5mmol)을 가하고 90℃에서 26시간동안 가열하였다. 에틸아세테이트 30ml를 사용하여 고체를 여과한 후 유기층을 10% HCl 수용액(20ml)으로 2회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 152mg(수율 57%)을 수득했다.
융점: 88-92℃
1H NMR(CDCl3) δ7.56(d, J=9.6Hz, 1H), 7.51(d, J=8.7Hz, 1H), 7.20(d, J=9.0Hz, 1H), 6.20(d, J=9.6Hz, 1H), 5.86(m, 1H), 4.95(m, 2H), 3.51(br, d, J=6.1Hz, 2H), 2.58(s, 1H), 1.66(s, 6H)
실시예 11
8-알릴-7-(1,1-디메틸-알릴옥시)-크로멘-2-온(화합물 12)의 합성
상기 실시예 10에서 얻은 8-알릴-7-(1,1-디메틸-프로프-2-이닐옥시)-크로멘-2-온(화합물 11) 50mg(0.185mmol)을 에틸아세테이트 3ml에 녹인 용액에 퀴놀린 5mg(10중량%) 및 린들러 촉매 2mg을 가했다. 이 반응액을 수소풍선하의 상온에서 5시간동안 교반하고, 에틸아세테이트 10ml를 가하고 2N HCl 수용액(10ml)으로 3회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 정제하여 황색고체로서 표제 화합물 43mg(수율 86%)을 수득했다.
융점: 58-62℃
1H NMR(CDCl3) δ7.53(d, J=9.3Hz, 1H), 7.09(d, J=8.7Hz, 1H), 6.98(d, J=8.7Hz,1H), 6.16(d, J=9.3Hz, 1H), 6.08(dd, J=10.8, 17.7Hz, 1H), 5.88(m 1H), 5.15(m, 2H), 4.96(m, 2H), 3.53(d, J=6.3Hz, 2H), 1.47(s, 6H)
실시예 12
8-알릴-7-벤질옥시-크로멘-2-온(화합물 13)의 합성
무수 DMF 6ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 100mg(0.49mmol), K2CO3138mg(1.0mmol) 및 벤질브로마이드 0.09ml(0.75mmol)을 가하고 60℃에서 3시간동안 가열하였다. 에틸아세테이트 30ml를 사용하여 고체를 여과한 후 유기층을 물로 세척하였다. 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 미황색 고체의 표제 화합물 145mg(수율 100%)을 수득했다.
융점: 114-117℃
1H NMR(CDCl3) δ7.55(d, J=9.3Hz, 1H), 7.28(m, 5H), 7.23(d, J=8.7Hz, 1H), 6.82(d, J=8.7Hz, 1H), 6.18(d, J=9.3Hz, 1H), 5.91(m, 1H), 5.12(s, 2H), 4.97(m, 2H), 3.60(m, 2H)
실시예 13
8-알릴-7-메톡시-크로멘-2-온(화합물 14)의 합성
상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7)100mg(0.49mmol)에 95% 에탄올 2ml, NaOH 15mg(0.75mmol) 및 디메틸설페이트 0.047ml(1mmol)을 가하였다. 반응액을 24시간 상온에서 교반한 후 유기층에 이염화탄소 20ml를 가하고 포화 NaCl수용액(10 ml)으로 2회 세척한 후, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 미황색 고체의 표제 화합물 68mg(수율 60%)을 수득했다.
융점: 136-140℃
1H NMR(CDCl3) δ7.56(d, J=9.6Hz, 1H), 7.26(d, J=8.4Hz, 1H), 6.78(d, J=8.4Hz, 1H), 6.17(d, J=9.3Hz, 1H), 5.89(m, 1H), 4.95(m, 2H), 3.85(s, 3H), 3.53(m, 2H)
실시예 14
8-알릴-7-(2-하이드록시-에톡시)-크로멘-2-온(화합물 15)의 합성
상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 100mg(0.49mmol), K2CO30.3g(2.17mmol) 및 2-브로모에탄올 0.053ml(0.75mmol)에 아세톤 5ml를 가하고 24시간동안 가열 환류하였다. 상온으로 냉각한 후 에틸아세테이트 30ml를 가하고 10% HCl 수용액(30ml)으로 2회, 물로 1회 세척하였다. 이어서, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=1:2)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 110mg(수율 91%)을 수득했다.
융점: 136-138℃
1H NMR(CDCl3) δ7.57(d, J=9.3Hz, 1H), 7.27(d, J=8.4Hz, 1H), 6.78(d, J=8.7Hz, 1H), 6.19(d, J=9.3Hz, 1H), 5.92(m, 1H), 4.96(m, 2H), 4.12(m, 2H), 3.92(m, 2H), 3.57(m, 2H)
실시예 15
8-알릴-7-(2-옥소-프로폭시)-크로멘-2-온(화합물 16)의 합성
상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 200mg(0.97mmol), K2CO30.3g(2.17mmol) 및 클로로아세톤 0.093ml(1.16mmol)에 아세톤 5ml를 가하고 24시간동안 가열 환류하였다. 상온으로 냉각한 후 에틸아세테이트 30ml를 가하고 10% HCl 수용액(30ml)으로 2회, 물로 1회 세척하였다. 이어서, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 215mg(수율 86%)을 수득했다.
융점: 116-118℃
1H NMR(CDCl3) δ7.56(d, J=9.3Hz, 1H), 7.25(d, J=8.4Hz, 1H), 6.60(d, J=8.7Hz, 1H), 6.21(d, J=9.3Hz, 1H), 5.92(m, 1H), 4.97(m, 2H), 4.56(s, 2H), 3.62(m, 2H), 2.25(s, 3H)
실시예 16
7-하이드록시-8-프로필-크로멘-2-온(화합물 17)의 합성
상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 1000mg(4.950mmol)을 에틸아세테이트 30ml에 녹인 용액에 10% 팔라듐 탄소 40mg을 첨가했다. 이 반응액을 수소풍선하의 상온에서 10분간 교반하고, 고체를 여과한 후 감압여과한 잔사를 짧은 실리카겔관 크로마토그라피(헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물 920mg(수율 92%)를 수득했다.
융점: 136-140℃
1H NMR(CDCl3) δ6.88(d, J=8.1Hz, 1H), 6.57(d, J=8.4Hz, 1H), 2.91(m, 2H), 2.71(m, 4H), 1.58(m, 2H), 0.97(t, J=7.2Hz, 3H)
실시예 17
아세트산 2-옥소-8-프로필-2H-크로멘-7-일 에스테르(화합물 18)의 합성
THF 6ml에 상기 실시예 16에서 얻은 7-하이드록시-8-프로필-크로멘-2-온(화합물 17) 150mg(0.73mmol)을 녹인 용액에 피리딘 0.24ml(2.92mmol) 및 염화아세틸0.16ml(2.19mmol)을 가했다. 반응액을 2시간동안 가열 환류한 후, 생성된 고체를 에틸아세테이트 20ml를 사용하여 여과한 다음 유기층을 5% HCl 수용액(10ml)으로 2회 세척한 후 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=5:1)로 정제하여 백색 침상 결정의 표제 화합물165mg(수율 92%)을 수득했다.
융점: 76-78℃
1H NMR(CDCl3) δ7.69(d, J=9.6Hz, 1H), 7.35(d, J=8.4Hz, 1H), 7.02(d, J=8.4Hz, 1H), 6.39(d, J=9.3Hz, 1H), 2.75(m, 2H), 2.37(s, 3H), 1.62(m, 2H), 0.98(t, J=7.2Hz, 3H)
실시예 18
4-(7-하이드록시-2-옥소-2H-크로멘-8-일)-부트-2-에노산 메틸 에스테르(화합물 19)의 합성
CH2Cl23ml에 하기 실시예 21에서 얻은 8-하이드록시-8,9-디하이드로-푸로[2,3-h]크로멘-2-온(화합물 22) 20mg(0.101mmol)을 녹인 용액에 (트리페닐포스파닐리덴)-아세트산 메틸 에스테르 40mg(0.121mmol)을 가하고 30분간 상온에서 교반하였다. 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=3:2)로 정제하여 미황색 고체의 표제 화합물 20mg(수율 76%)을 수득했다. 융점: 164-170℃
1H NMR(CDCl3) δ7.62(d, J=9.6Hz, 1H), 7.21(d, J=8.4Hz, 1H), 7.11(m, 1H), 6.77(d, J=8.4Hz, 1H), 6.24(d, J=9.3Hz, 1H), 5.91(m, 1H), 3.75(dd, J=1.5, 6.6Hz, 2H), 3.73(s, 3H)
실시예 19
8-(2,3-디하이드록시-프로필)-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 20)의 합성
THF 4ml중 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 200mg(0.97mmol)의 용액에 피리딘 0.2ml(2.43mmol), N-메틸모르폴린 옥사이드 176mg(1.5mmol) 및 OsO4(4% 수용액) 0.96ml(0.045mmol)을 가하고 2시간동안 가열 환류했다. 상온으로 냉각한 후 NaHSO3수용액 5ml를 가하고 30분간 교반한 후, 에틸아세테이트 30ml를 가하고 물(15ml)로 2회 세척한 후, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: CHCl3:메탄올=6:1)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 187mg(수율 82%)을 수득했다.
융점: 194-196℃
1H NMR(CD3OD) δ7.85(d, J=9.6Hz, 1H), 7.35(d, J=8.7Hz, 1H), 6.84(d, J=8.4Hz, 1H), 6.18(d, J=9.3Hz, 1H), 3.98(m, 1H), 3.51(m, 2H), 3.01(d, J=6.9Hz, 2H)
실시예 20
8H-피라노[2,3-f]크로멘-2-온(화합물 21)의 합성
상기 실시예 2에서 얻은 7-프로프-2-이닐옥시-크로멘-2-온(화합물 3) 514mg(2.57mmol)에 디메틸아닐린 10ml을 첨가하고 24시간동안 가열 환류하였다. 상온으로 냉각한 후 에틸아세테이트 30ml를 첨가하고 10% HCl 수용액(30ml)으로 2회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 백색 고체의 표제 화합물 200mg(수율 39%)을 수득했다.
융점: 150-156℃
1H NMR(CDCl3) δ7.59(d, J=9.6Hz, 1H), 7.20(d, J=8.4Hz, 1H), 6.97(m, 1H), 6.71(dd, J=0.6, 8.4Hz, 1H), 6.24(d, J=9.6Hz, 1H), 5.87(m, 1H), 4.94(m, 2H)
실시예 21
8-하이드록시-8,9-디하이드로-푸로[2,3-h]크로멘-2-온(화합물 22)의 합성
THF 2ml 및 물 2ml중 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7) 200mg(0.97mmol)의 용액에 OsO4(4% 수용액) 0.96ml(0.045mmol) 및 NaIO4320mg(1.5mmol)을 가하고 2시간동안 상온에서 교반하였다. NaHSO3수용액 5ml를 가하고 30분간 교반한 후 에틸아세테이트 30ml를 가하고 물(15ml)로 2회 세척한 후, 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 황색 고체의 표제 화합물 62mg(수율 32%)을 수득했다. 융점: 140-146℃
1H NMR(CDCl3) δ7.58(d, J=9.6Hz, 1H), 7.25(d, J=8.4Hz, 1H), 6.75(d, J=8.1Hz, 1H), 6.16(d, J=9.3Hz, 1H), 3.43(m, 2H)
실시예 22
8-하이드록시메틸-8,9-디하이드로-푸로[2,3-h]크로멘-2-온(화합물 23)의 합성
CH2Cl24ml에 상기 실시예 6에서 얻은 8-알릴-7-하이드록시-크로멘-2-온(화합물 7)을 녹인 후, NaHCO340mg 및 mCPBA(70%) 200mg(1.16mmol)를 가하고 24시간 상온에서 교반하였다. 에틸아세테이트 30ml를 가하고 1N NaOH 수용액(30ml)으로 2회, 물로 1회 세척하고 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=1:1)로 정제하여 백색고체의 표제화합물 130mg(수율 61%)을 수득했다.
융점: 102-108℃
1H NMR(CDCl3) δ7.56(d, J=9.6Hz, 1H), 7.20(d, J=8.1Hz, 1H), 6.68(d, J=8.1Hz, 1H), 6.14(d, J=9.6Hz, 1H), 5.03(m, 1H), 3.86(br, d, J=9.9Hz, 1H), 3.72(dd, J=6.0, 12.3Hz, 1H), 3.35(dd, J=7.5, 16.2Hz, 1H), 3.11(dd, J=7.5, 16.2Hz, 1H)
실시예 23
벤조산 2-옥소-8,9-디하이드로-2H-푸로[2,3-h]크로멘-8-일메틸 에스테르(화합물 24)의 합성
이염화탄소 1.5ml에 상기 실시예 22에서 얻은 8-하이드록시메틸-8,9-디하이드로-푸로[2,3-h]크로멘-12-온(화합물 23) 10mg(0.045mmol)을 녹인 용액에 4-(디메틸아미노)피리딘 24mg(0.195mmol), 벤조일클로라이드 14mg(0.098mmol)을 가했다.반응액을 3시간 상온에서 교반한 후 유기층에 이염화탄소 20ml를 가하고 포화 NaCl 수용액(10ml)으로 2회 세척한 후 감압증발하여 얻어진 잔사를 실리카겔 크로마토그라피(용출액: 헥산:에틸아세테이트=2:1)로 정제하여 무색 액체의 표제 화합물 11mg(수율 76%)을 얻었다.
1H NMR(CDCl3) δ8.03(d, J=7.5Hz, 1H), 7.88(m, 1H), 7.57(d, J=9.6Hz, 1H), 7.49(m, 1H), 7.35(m, 2H), 7.22(d, J=8.4Hz, 1H), 6.71(d, J=8.4Hz, 1H), 6.16(d, J=9.3Hz, 1H), 5.26(m, 1H), 4.50(m, 2H), 3.49(dd, J=9.9, 16.2Hz, 1H), 3.21(dd, J=6.6, 16.5Hz, 1H)
하기 실험에 의해, 본 발명의 오스테놀 유도체가 암 유발 관련 효소를 효과적으로 저해하여 암 예방 및 치료에 유효한지 여부를 확인하였다.
시험예 1
암 유발 관련 효소들에 대한 효과 측정
(1) 퀴논 리덕타제 효소 유도효과
쥐의 간세포주인 Hepa 1c1c7 세포(ATCC CRL-2026)를 배양한 후, 음성 대조군으로 0.5% DMSO(디메틸설폭사이드)를, 양성 대조군으로 퀴논 리덕타제 유도제인 β-나프토플라본(최종 농도 2㎍/㎖)을 처리하였고, 대상 시험물질들을 20, 4, 0.8㎍/ml의 농도로 처리하였다. 48시간동안 배양한 후 용해 완충액(lysis buffer; 10mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM NaCl, 15 mM MgCl2,0.5% NP-40, pH 8.0)에 용해시키고, 여기에 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)가 들어있는 반응 혼합물을 넣어 50분간(37℃, 배양기) 반응시킨 뒤 610nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이 측정치를 이용하여 돌연변이원 및 발암물질의 작용을 무독화시키는 것으로 알려진 퀴논 리덕타제 효소의 활성 증가율이 음성대조군에서의 효소활성 증가율에 대해 1.5배가 될 때의 시험물질 농도를 산출하였다(프로카스카 등의 문헌[Anal. Biochem.169, 328-336, 1988] 참조).
(2) 유도성 니트릭 옥시드 신타제 효소 저해효과
쥐의 마크로파아지인 RAW264.7 세포주(ATCC TIB-71)를 24시간 배양한 후, 양성대조군으로 LPS(2㎍/ml)를, 음성대조군으로 쿠르쿠민(10㎍/ml)을 처리하였고, 대상 시험물질을 20, 4, 0.8㎍/ml의 농도로 처리하였다. 24시간동안 배양한 후, 설파닐아미드 12.5%, 나프틸에틸렌디아민 디클로리드 12.5%를 처리하여 발색시켜 540nm에서 흡광도를 측정하여 이를 IC50(㎍/ml)으로 나타내었다(딩(Ding) 등의 문헌[J. Immunol.141, 2407-2413, 1988] 참조).
(3) 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase) 효소 저해효과
마우스의 배아세포주인 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 배양하여, 24시간 후 동결-해동 방법으로 용해(lysis)시켜 반응 용액(670μM NAD 5㎕, 1.75μM 피루베이트 5㎕,14C-크산틴 0.05㎕, 칼륨 인산완충액(PMSF))과 함께 대상 시험물질들을 20, 4, 0.8㎍/ml의 농도로 처리하여 20분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 셀룰로즈 TLC에 스팟팅(spotting)하고 전개시킨 후 IP(Image Plate) 필름에 감광시켜 BAS-1500(후지필름(Fuji Film))으로 판독하여 기질과 생성물의 비율을 정량함으로써 효소의 활성을 측정하여 IC50(㎍/ml)으로 나타내었다(라이너스(Reiners) 등의 문헌[Cancer Res.,47: 1775-1779, 1987] 참고).
이상의 시험에서 확인된 오스테놀 유도체의 크산틴 옥시다제 또는 유도성 니트릭 옥시드 신타제의 활성 저해, 또는 퀴논 리덕타제 활성 유도 효과를 하기 표 2에 나타내었다:
화합물 크산틴 옥시다제 퀴논 리덕타제 유도성 니트릭 옥시드 신타제
IC50(㎍/ml) 1.5FC IC50(㎍/ml)
0 20 4 10
1 20 20 20
2 20 7.9 20
3 20 20 20
4 20 20 20
5 5.3 20 9.5
6 20 4 20
7 20 20 20
8 20 20 20
9 20 20 20
10 5.14 20 20
11 20 20 20
12 20 20 20
13 20 20 20
14 20 20 20
15 20 20 20
16 20 20 20
17 6.44 20 6.1
18 20 20 20
19 20 20 20
20 20 20 20
21 20 20 6.3
22 20 4 20
23 20 20 20
24 20 20 20
1.5FC: 퀴논 리덕타제의 비활성을 음성대조군의 1.5배로 유도하는데 요구되는 농도(㎍/ml)
시험예 2
오스테놀 유도체들의 암예방 효과
(1) 피부암에 대한 억제효과
실제 동물 모델에서 피부암 억제 효과를 알아보기 위하여 6-7주령 암컷 마우스(체중: 15-20g)를 80마리를 각 그룹당 10마리씩 8개 그룹으로 나누었다. 실험실 적응기간을 1주일 둔 후, 등쪽의 털을 제거하여 2×2cm2의 면적으로 피부를 노출시켜 암개시제로서 DMBA 200㎕(200nM)를 1회 바르고, DMBA를 처리한 지 1주일 후부터발암 촉진을 일으키기 위해 TPA 200㎕(5nM)를 1주에 3회씩, 15주동안 반복하여 등에 발랐다. TPA를 처리함과 동시에 음성대조군은 무처리, 양성대조군은 200nM 쿠르쿠민을 200㎕, 그리고 실험군에는 200nM의 화합물 0, 2, 5, 7, 10 및 17중 어느 하나를 각각 200㎕로 처리하였다. 결과는 마우스당 발생된 종양수로 나타내었으며, 측정 당시 종양은 직경 1 mm 이상의 것을 포함시켰다(타키가와(Takigawa) 등의 문헌 [Cancer Res., 43: 3732-3738, 1983] 참조).
DMBA 및 TPA를 등에 도포함으로써 종양을 유발시킨 마우스 모델을 통한 화합물 0, 2, 5, 7, 10 및 17의 피부암 억제효과를 확인한 결과, 양성 대조군으로 처리한 쿠르쿠민(저해율: 48%)보다는 약하나, 각각 16, 4, 8, 32, 10 및 12%의 피부암 억제 효과를 나타내었으며, 이것은 음성대조군과의 통계학적 비교 결과 유의성을 가지는 것으로 나타났다(도 1 참조).
또한, 실험군중 효과가 우수한 것으로 확인된 화합물 7의 농도에 따른 피부암 억제 효과를 확인하기 위해, 상기와 같은 방법으로 피부암이 유도된 마우스에 화합물 7을 20nM 또는 200nM의 농도로 200㎕씩 처리하고, 양성 대조군으로서 쿠르쿠민 20nM 또는 200nM을 200㎕씩 처리하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 군을 음성 대조군으로 하여 피부암 억제 정도를 조사하였다. 그 결과는 도 2와 같으며, 화합물 7의 피부암 억제 효과는 동량의 쿠르쿠민보다 작지만 시료의 농도에 의존적으로 나타났다.
(2) 유방암에 대한 억제효과
유선 조직을 배양하여 이에 대한 대상시험물질의 암예방 효과를 알아보기 위하여 톰슨(Thompson), 스틸레(Steele) 등의 방법을 변형하여 실험을 수행하였다(톰슨 등의 문헌[Cancer Res.57: 267-271, 1997] 및 스틸레 등의 문헌[J. Cell Biochem Suppl.26: 29-53, 1996] 참조).
4주령 Balb/c 웅성 마우스(구입처: 대한 바이오링크) 66마리를, 각 그룹당 3마리씩 22개 그룹으로 나누어, 한 마리의 마우스로부터 획득할 수 있는 유선조직은 좌우 한 쌍이므로 각 실험군당 6개의 유선조직을 대상으로 실험을 수행하였다. 대조군 및 시험물질 처리군(21개 그룹) 각각에 에스트라디올 1㎍ 및 프로게스테론 1mg으로 9일 동안 처리한 후 유선을 잘라내 100단위의 스트렙토마이신과 페니실린 및 35㎍/ml 글루타민이 첨가된 웨이마우스(Waymouth) 751/1 MB배지(Sigma, USA)가 들어있는 배양접시에 옮긴 후, 배지 l ml당 인슐린 5㎍, 프로락틴 5㎍, 알도스테론 1㎍, 히드로코르티존 1㎍을 첨가하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 그 후 성장촉진 단계인, 배양후 72시간째에 DMBA를 처리함과 동시에 대조군은 무처리, 화합물 처리 실험군에는 화합물 0, 2, 5, 7, 10, 17 및 21중 어느 하나를 각각 1, 10 및 100 ㎍/ml의 농도로 처리하고 새 배지로 옮긴 후, 10일 동안 더 배양하고 쇠퇴단계에서 인슐린(50ng/ml)만 포함된 배지로 10일간 더 배양하였다. 배양이 끝나면 유선을 고정시키고 앨럼 카르민(alumn carmin) 염색액으로 염색하여 전신생병소(preneoplastic lesion)의 형성 및 대조군에 대한 저해 정도를 측정하였다.
DMBA의 처리에 따라 유선조직에서 발생하는 신생조직들은 지속적으로 존재할 경우 유방암으로의 전이 가능성을 가지며, 이에 대해 본 발명의 화합물을 처리했을 경우, 각각의 시료의 처리농도에 의존적으로 신생조직의 발생이 억제되었으며, 따라서 이들 시료들은 유방암에 대하여 억제 효과를 가진 것으로 나타났다(표 3 및 도 3):
(3) JB6 세포주에 대한 발암억제효과
2단계 발암기전에 대한 대상시험물질의 암 유발 억제 효과를 알아보기 위하여 후앙(Huang C.)의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA.94: 11957-11962, 1997] 및동(Dong Z.)의 문헌[Cancer Res.57: 4414-4419. 1997]의 방법을 변형하여 실험에 적용하였다.
즉, 실험이전에 미리 2x DMEM(Dulbecco's modified essential media, 시그마사) 45ml, 우태아혈청 7.5ml, PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4) 7.5ml, 1.25%의 한천용액 40ml를 44℃에서 혼합한 한천-배양배지 혼합액을 만들어 24웰 조직 배양 플레이트(코닝사)에 일정량 분주하여 플레이트 바닥에 고르게 피복시킨 후, 굳을 수 있도록 30-60분간 방치하여 기저 한천 플레이트를 준비해두었다. TPA에 의해 종양발생이 유도되는 마우스의 상피세포인 JB6 세포주(ATCC CRL-2010, 미국)를 배양한 후, 배양중인 JB6 세포(0.5×104cells/ml) 334㎕와 한천-배양배지 혼합액 666㎕를 혼합하고 TPA를 최종농도 100nM로 처리한 각각의 세포현탁액에 대해 대조군의 경우 100% DMSO 5㎕를, 시험군의 경우 대상 시험물질을 각각 20, 4, 0.8, 0.16㎍/㎖ 등의 농도로 처리하였으며, 이를 미리 준비된 기저 한천 플레이트에 250㎕/웰로 분주하여 14일간 배양(37℃, 5% CO2/95% 대기)한 후 생성되는 콜로니 갯수를 기록하여 대조군에서 관찰되는 콜로니 갯수에 대해 시험물질 처리군에서 나타나는 콜로니 수의 상대적인 값을 이용하여 발암 촉진에 있어서 대상 시험물질의 저해 효과(IC50)를 계산하였다(표 4):
오스테놀 합성 유도체들의 JB6 배양 세포에 대한 종양 발생 억제 효과
화합물 IC50(㎍/㎖)
0 19.8
2 15.6
5 19.8
7 14.3
10 18.6
17 17.8
21 18.2
JB6 배양세포에 대한 실험결과, 상기 화합물들은 상기 세포주를 유의성 있게 저해함을 알 수 있다.
(4) 세포 독성 조사
배양된 마우스의 간암세포주인 Hepa 1c1c7(ATCC CRL-2026), 사람의 방광암 세포주인 T24 세포주(ATCC HTB-4), 사람의 전립선암 세포주인 LNCaP 세포주(ATCC CRL-1740)를 시험물질 4㎍/ml 또는 20㎍/ml로 처리하고, PBS로 세척한 후 30㎕/웰의 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색한 후(37℃, 배양기) 200㎕의 SDS 용액(50% 에탄올중의 0.5% SDS)을 각각의 웰에 첨가하여 1시간동안 반응시킨 뒤(37℃, 배양기) 마이크로플레이트 판독기로 610nm에서 흡광도를 측정하였다(표 5)(홀로바우(Holobaugh P.A.) 등의 문헌[J. Immunol. Methods135, 95-99, 1990] 참조):
오스테놀 합성 유도체의 세포 독성 조사 결과
화합물 LNCaP T24 Hepa1c1c7
0 T20=20% T20=30% T20=60%
1 - - -
2 - - -
3 - - -
4 - - -
5 T20=20% T20=50% -
6 T20=80% T20=40% T20=40%
7 - - -
8 - - -
9 - - -
10 T4=60% - -
11 T20=80% - -
12 T20=80% - -
13 T20=70% - -
14 T20=30% - -
15 - - -
16 - - -
17 - - -
18 - - -
19 - - -
20 - - -
21 - - -
22 T20=50% - T20=80%
23 - - -
24 - - -
T20 : 시료 농도 20㎍/㎖에서 암세포가 죽는 비율.T4 : 시료 농도 4㎍/㎖에서 암세포가 죽는 비율.'-': 시료 농도 20㎍/㎖에서 세포독성 나타나지 않음.
시험 결과, 사람의 전립선암 세포주(LNCaP)에 대해 화합물 0, 5, 6, 11, 12, 13, 14, 22는 시료 농도 20㎍/㎖일 경우, 각각 20, 20, 80, 80, 80, 70, 30, 50%의 독성을 보였고, 화합물 10은 4㎍/㎖의 농도에서 60%의 독성을 보였다. 사람의 방광암 세포주(T24)에 대한 독성은 화합물 0, 5, 6이 시료농도 20㎍/㎖에서 각각 30, 50 및 40%로, 간암세포주(Hepa1c1c7)에 대한 독성은 화합물 0, 6, 22가 시료농도 20㎍/㎖에서 각각 60, 40 및 80%로 나타나, 암세포주들에 대해서 강한 세포독성을가짐을 알 수 있었다.
본 발명의 화학식 1의 오스테놀 유도체는 암 관련 효소인 크산틴 옥시다제, 유도성 니트릭 옥시드 신타제 등에 대한 저해활성, 또는 퀴논 리덕타제에 대한 유도활성을 나타내므로 이들 효소와 관련된 암질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식 1의 오스테놀 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용가능한 염 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 조성물:
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1은 수소; 치환되지 않거나 단일 또는 다중 치환된 (C1-C5)알킬, (C2-C6)알케닐 또는 (C2-C6)알키닐; (C1-C7)알킬카보닐; 벤질; 또는, (C3-C7)알릴카보닐 또는 (C3-C7)알릴카바밀이고,
    R2는 수소; 또는 치환되지 않거나 하이드록시 또는 (C1-C5)알킬-OCO-로 치환된 (C2-C5)알킬 또는 (C2-C6)알케닐이거나; 또는
    OR1과 R2가 함께 치환되지 않거나 치환된 산소 함유 5 또는 6원 헤테로 고리를 형성할 수 있으며,
    단, R1과 R2가 동시에 수소는 아니다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1이 수소, (C1-C5)알킬카보닐, (C3-C7)알릴카보닐 또는 (C3-C7)알릴카바밀이고, R2가 CH2=CHCH2-또는 (C2-C5)알킬인 오스테놀 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    R1이 수소, CH3CO, C6H5CO 또는 C6H5NHCO이고, R2가 CH2=CHCH2-또는 C3H7-인 오스테놀 유도체 또는 그의 약리학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    암 질환이 피부암, 위암, 결장암 또는 유방암인 조성물.
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