KR100325901B1 - 효모및포자형미생물을사멸하기위한살균방법및조성물 - Google Patents

효모및포자형미생물을사멸하기위한살균방법및조성물 Download PDF

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엑스옥세미스 인코퍼레이티드
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Abstract

과산화물 그리고 염화물 또는 브롬화물의 존재하에서 할로퍼옥시다제 그리고 적어도 하나의 항균활성증강재로 효모 또는 포자형 미생물을 사멸시키거나 성장을 저해시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다.
적합한 항균활성증강제는 어떤 알파- 아미노산을 포함하고, R1은 수소, 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 1 내지 6탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 또는 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 7 내지 12 탄소원자들 갖는 아릴알킬기이며, 그리고 R2는 수소 또는 1 내지 6탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기인 식(I) 의 화합물이 바람직하다.

Description

효모 및 포자형 미생물을 사멸하기 위한 살균방법 및 조성물
발명의 분야
본 출원은 1991 년 2월 21 일에 출원된 미국출원 제 07/660,994 호의 일부- 계속 출원이다.
본 발명은 효모 및 미생물의 포자형을 사멸하기 위한 방법 및 조성물에 관한것이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 본 시스템의 살균(microbicidal)성질을 증강시키기 위하여 항균(antimicrobial) 활성증강제 및 할로퍼옥시다제(haloperoxidase)를 함께 사용하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경
PCT출원공개 제 WO 92/14484에 기재된 바와같은, 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase) 및 호에오신(eosinophil) 퍼옥시다제와 같은 할로퍼옥시다제는 바람직한 미생물을 제거하거나 표적미생물의 주위의 숙주세포 및 정상세균상(normal flora)과 같은 배지의 다른성분을 충분히 손상시키지 않으면서, 선택적으로 표적미생물에 결합케하고, 과산화물 및 할로겐호물의 존재하에서 표적미생물의 성장을 저해하기 위하여 사용될 수도 있다.
이전부터, 미엘로퍼옥시다제 및 호에오신퍼옥시다제는 기질로서 적당한 할로겐화물 보조인자(X)및 과산화수소가 제공되면 자연계에서 미생물사멸활성을 나타내는 것으로 알려졌다(Klebanoff, 1968, J. Bacteriol, 95: 2131-2138). 그러나, 할로퍼옥시다제의 선택적인 결합성질 그리고 치료, 연구 및 산업적 응용을 위한 이들 시스템의 이용은 단지 최근에와서, 인식되었다. 새롭게 발견된 할로퍼옥시다제의 선택적인 결합성질로 인하여, 병원성 미생물과 같은 표적미생물이 정상 세균상의 구성원과 같은 바람직한 미생물 보다도 더큰 할로퍼옥시다제에 대한 결합능력을 갖는 경우, 바람직한 미생물은 거의 또는 전혀 결합하지 않는 할로퍼옥시다제에 표적미생물은 선택적으로 결합한다. 과산화물 및 할로겐화물의 존재하에서, 표적에 결합된 할로퍼옥시다제는 할로겐화물 산화에 촉매작용을 하고 표적미생물의 표면에서 일중항분자산소(102) 로의 과산화물의 불균화반응(disproportionation)을 용이하게하여, 바람직한 미생물 또는 생리적배지에 최소한으로 부수적인 손상을 가하면서 표적미생물을 선택적으로 사멸시키는 결과를 초래한다. 따라서, PCT 출원공개 제 WO 92/14484호에 기재된 바와같이, 미엘로퍼옥시다제 및 호에오신퍼옥시다제는 인간 또는 동물 피검자의 치료 또는 예방치료에서 선택적으로 병원성 미생물에 결합하고 숙주세포 및 숙주의 정상 세균상에 최소한으로 부수적인 손상을 가하면서 병원성 미생물을 사멸시키는 소독제로서 사용될 수 있다.
또한, 생체와, 특히 생체의학장비를 생체내에서 이용하기전에 피건자의 숙주세포를 손상시키지 않으면서 표적미생물의 성장을 저해하기 위하여 붕대, 수술기구, 봉합장비, 카테테르, 치과용기구, 콘택트렌즈 및 그 유사물과 같은 생체의학장비를 소독하는 이용에서 표적미생물의 성장을 저해하기 위한 소독 또는 살균 제조물에 본 시스템이 사용될 수도 있다. PCT 출원공개 제 WO 92/14484호에 개시된 할로퍼옥시다제시스템은 병원성 미생물의 처치에 매우 효과적이라는 것이 밝혀진 반면에, 효모 및 어떤 포자형성 미생물은 비교적으로 할로퍼옥시다제 항균활성에 대해 면역성을 보유한다.
미생물 생활주기의 포자단계는 대사휴면 그리고 그것의 생장단계시에는 미생물을 사멸시킬 수 있는 환경인자에 대한 저항성에 특징이 있다. 포자발아의 초기단계는 팽창 그리고 휴면으로부터 활성대사로의 변경이라는 특징을 갖는다.
영양성장 예, 발아, 그리고 궁극적으로 생식이 따른다.
세균(bacteria)내생포자 및 진균(fungi) 포자의 발아는 증가된 대사 그리고 열 및 화학적 반응물에 대한 감소된 저항성과 관련이 있다.
발아가 일어나려면, 포자는 환경이 생장 및 생식을 유지하기에 적합한지를 감지하여야 한다. 아미노산 ℓ- 알라닌이 세균포자 발아를 자극하는 것으로 보고되었다(Hills, 1950, J Gen Microbiol 4:38; Halvorson 및 Church, 1957, Bacteriol Rev 21:112).
L-알라닌 및 ℓ-프롤린도 또한 진균포자발아를 개시시키는 것으로 보고되었다(Yangita, 1957, Arch Mikrobiol 26:329).
글리신 및 ℓ- 알라닌과 같은 단순 α- 아미노산이 대사에서 중심적 역할을 한다.
α- 아미노산의 아민전이반응(transmination)또는 탈아민반응(deamination)은 글리코겐 또는 케토겐 탄수화물 그리고 대사 및 성장을 위하여 필요한 질소를 생기게 한다.
예를들면, ℓ-알라닌의 아민전이반응 또는 탈아민반응은 해당대사(Embden-Meyerhof-Parnas경로) 의 최종생산물인 피루베이트를 생기게한다. 피루베이트탈수소효소 복합체에 의한 피루베이트의 산화는 아세틸-CoA, NADH, H+및 CO2를 생기게 한다.
아세틸-CoA는 미토콘드리아의 전자전달계를 유지케하는 트리카르복실산사이클(크렙스사이클)의 개시기질이다. 아세틸-CoA는 또한 스테레올 합성은 물론 지방산 합성의 궁극적인 탄소공급원이다. 단순 α- 아미노산은 발아 그리고 뒤따르는 대사활성에 요구되는 질소, CO2, 글리코겐 및/ 또는 케토겐과 같은 것을 제공할 수 있다.
Zgliczxnski et al. (1968, European J. Biochem 4:540-547)는 미엘로퍼옥시다제가 과산하 수소에 의한 아미노산의 염화물- 의존성 산화에 촉매작용을 하여 암모니아, 이산화탄소 그리고 탈카르복실화, 탈아민화된 아미노산에 상응하는 알데히드를 생기게 한다고 보고하였으며, Strauss et al. (1970, J. Reticuloendothel Soc 7:754-761)는 그렇게 생성된 알데히드가 살균제로서 작용할 수도 있다고 가정하였다.
그러나, Paul et al. (1970, Infect lmmun 2:414-418) 은 미엘로퍼옥시다제- 과산화물- 염화물 시험 시스템에 α- 아미노산 글리신 및 ℓ- 알라닌의 첨가는 실제로 Escherichiacoli 의 사멸을 저해하였다고 보고하였다. 더욱이, Klebanoff(1975, Semin Hemat 12:117-142)는 살세균(bactericidal)작용을 위하여 100mM 아세트알데히드가 요구되었다고 보고하였다.
공개된 자료와는 달리, 지금 놀랍게도 효모 및 미생물의 포자형에 대한 할로퍼옥시다제의 살균작용은 미생물을 항균활성증강제로서 작용하는 어떤 α- 아미노산과 함께 할로퍼옥시다제로 처리함으로써 충분히 증강될 수도 있다는 것이 발견되었다.
발명의 개요
본 발명에 따르면, 과산화물 그리고 염화물 또는 브롬화물의 존재하에서 할로퍼옥시다제 및 적어도 하나의 항균활성증강제로 미생물을 접촉시키는 것으로 이루어진 효모 또는 포자형미생물을 사멸시키거나 이들의 성장을 저해하는 방법 및 조성물이 제공된다.
적합한 항균활성증강제에는 어떤 아미노산들이 포함되며 더음 식의 화합물이 바람직하다.
상기 식에서 R1은 수소, 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 1 내지 6탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 또는 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 7 내지 12 탄소원자를 갖는 아릴알킬기이며, 그리고 R2는 수소 또는 1 내지 6탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이다. 어떤 구체예에서,본 발명이 방법 및 조성물은 의료 제품 또는 재료를 소독하거나 살균하기 위하여 생체외의 효모 및 포자형 미생물을 사멸시키는데 사용될 수도 있다. 다른 구체예에서, 본 방법 및 조성물은 바람직한 미생물을 제거하거나 숙주세포를 충분히 손상시키지 않으면서 인간 또는 동물 피검자를 항진균(antifungal) 및 항효모(antiyeast)처리하는데 사용될 수 있다. 할로퍼옥시다제의 항효모 및 항진균 포자활성은 어떤 α- 아미노산의 존재하에서 충분히 증강된다는 것이 발견되었다. 과산화물 및 할로겐화물도 또한 존재할때에, 표적에 결합된 할로퍼옥시다제가 할로겐화물 산화에 촉매작용을 하고 포자형성 미생물의 표면에서 일중항분자산소로의 과산화물의 불균화반응을 용이하게하여, 표적미생물을 사멸시키는 결과를 얻게 한다. 비록 할로퍼옥시다제 활성이 첨가된 α- 아미노산의 일부의 탈아민반응, 탈카르복실반응에 촉매작용을 하여, 알데히드를 생기게 할 것으로 생각될지라도, 그러한 알데히드가 그렇게 낮은 농도에서 살균작용에 충분히 기여할 것으로 생각되지는 않는다. 할로퍼옥시다제에 의해 생성된 차아염소산 및 일중항분자 산소의 일부를 소비함으로써, 이들 α- 아미노산이 살균작용의 저농도- 의존성 경쟁적 저해에 영향을 미친다고 생각될 수도 있다. 그러나, 효모출아, 포자화된 미생물의 발아, 그리고 아마도 생장미생물의 대사의 촉진에 관한 이들 α- 아미노산의 자극효과는 할로퍼옥시다제의 작용으로 처리된 미생물을 불안정하게 함으로써 살균작용을 크게 증강시킨다.
충분히 증강된 할로퍼옥시다제 항효모 및 항포자활성으로 인하여, 본 발명의 방법 및 조성물은 인간 또는 동물 피검자의 치료 또는 예방치료를 위한 소독처리 그리고 생장의 미생물, 효모 그리고 세균 및 진균 포자의 소독 및 살균을 위한 생제외 이용에 매우 유용하게 되었다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 할로퍼옥시다제에는 호에오신퍼옥시다제(EPO) 및 미엘로퍼옥시다제(MPO) 가 포함된다. 본 발명의 대표적인 항균활성증강제에는 글리신 그리고 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트레오닌, 리신, 페닐알라닌, 티로신의 ℓ- 또는 d- 거울상이성질체(enantiomer)로 구성되어진 군으로 부터 선택된 α- 아미노산 또는 그것들의 알킬에스테르가 포함된다.
바람직한 구체예의 상세한 기재
본 발명은 할로퍼옥시다제 그리고, 할로퍼옥시다제 살균활성에 대해 효모 및 포지형 미생물을 불안정하게 하는 항균활성증강제를 사용하여 효모 및 포자화된 미생물을 사멸 또는 저해하는 방법 및 조성물에 넓게 지시된다. 본 발명의 실시에서, 미생물을 사멸시키거나 성장을 저해하기 위하여, 다량의 할로퍼옥시다제 및 항균활성 증강제 즉 과산화물 및 염화물 또는 브롬화물의 존재시에 효과적인 어떤 α- 아미노산에 미생물을 접촉시킴으로써 효모 및 미생물의 포자형이 사멸하거나 저해된다.
특히 어느 한 바람직한 구체예에서, 분 발명의 방법 및, 조성물은 세균 및 진균을 포함한 광범위한 병원성 미생물에 대하여 증강된 할로퍼옥시다제 항포자 및 항효모활성을 나타내는 소독제로서 사용된다. 숙주조직과의 접촉에 사용하기 위하여, 소독시스템은 병원성 미생물에 대하여 선택적인 친화성을 나타내는 이원자산소첨가(dioxygenating)할로퍼옥시다제 효소의 사용을 기본으로 하고 있다. 그자체로 고효능 살균작용은 관련된 숙주조직파괴 또는 정상세균상의 붕괴없이 표적 미생물에 지시될 수 있다. 즉, 소독작용은 선택적이고 표적미생물에 국한 된다.
적당히 제조되면, 할로퍼옥시다제- 증강제 제조물은 재료 및 장치를 소독하는데 심지어 살균하는데 사용될 수 있다. 고효능 할로퍼옥시다제- 증강제 제조물은 생체외 소독 또는 살균제조물로서 작용할 수 있다. 과산화수소 이용가능성의 시간을 제한함으로써, 할로퍼옥시다제- 증강제 제조물이 숙주조직과의 접촉전에 재료 및 장치의 소독 및 심지어 살균을 확실하게 하기에 충분히 효능적이게 할 수 있다.
과산화물이 고갈되면 정상 세균상 그리고 이들 고효능제조물의 사용과 관련된 숙주조직에 대한 어떤 잠재적인 독성은 없어질 것이고, 그자체로, 해독을 위한 추가적인 세척없이 본 제조물로 처리된 재료 및 장치는 숙주조직과의 접촉에 이용될 수 있다.
본 발명의 대표적인 조성물은 (1)호에오신퍼옥시다제(EPO) 및/ 또는 미엘로퍼옥시다제(MPO)(2) 과산화수소(H2O2) 나 등가의 과산화물 또는 H2O2의 생성을 위한 옥시다제 (3)옥시다제의 기질, 그리고 (4)글리신 또는 ℓ- 알라닌과 같은 항균활성증강제로 이루어진다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명은 생체외, 특히 붕대, 수술기구, 봉합장비, 카테테르, 치과용기구, 콘텍트렌즈 및 그 유사물과 같은 생체의학장비가 소독 또는 살균을 요구하고 본 장비가 후속적으로 숙주조직과 접촉되는 이용에서 효모 및 포자형 미생물의 성장을 저해하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 생체내에서 효모 또는 포자형성 미생물에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위하여 사용될 수도 있다.
본 발명에서 유용한 할로퍼옥시다제는 할로겐화물: 과산화수소산화환원효소(예, 생화학의 국제연합하의 EC No. 1.11.1.7및 EC No. 1.11.1.10)로서 규정되며, 이에 대하여 할로겐화물, 즉 염화물 또는 브롬화물은 전자공여자 또는 환원제이고 과산화물은 전자수용자 또는 산화제이다. 과산화수소로 부터 일중항 분자산소를 할로겐화물에 의존하여 생성시키는 반응에 촉매 작용을 하고 표적미생물에 선택적인 결합을 나타내는 어떤 할로퍼옥시다제가 본 발명에 사용될 수도 있다. 여기서 설명된 바와같이, 현재 특히 바람직한 할로퍼옥시다제에는 호에오신퍼옥시다제(EPO), 메엘로퍼옥시다제(MPO) 및 그것의 결합물이 포함된다. 여기서 상세히 기재된 바와같이, 항균증강제의 함유물은 효모 및 포자형 미생물에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제시스템의 살균능력을 크게 증가시키는데, 이는 그것이 할로포옥시다제시스템의 살균작용에 대하여 이들 형태를 불안정하게 하기 때문이다.
본 시스템의 할로퍼옥시다제 활성에 대한 역효과 또는 본방법 및 조성물의 사용시에 환경에 대한 바람직하지 못한 효과를 만들지 않는 농도로 사용될때에, 본 발명의 항균활성증강제는 효모 및 포자형 미생물에 대한 할로퍼옥시다제 항균시스템의 항균활성을 증강시키는 시약이다. 현재 본 발명에 바람직한 활성증강제에는 식:
의 α- 아미노산 화합물이 포함되며, 상기식에서 R1은 수소, 1 내지 6탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기, 또는 치환되지 않거나 히이드록시 또는 아미노치환된 7 내지 12 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, R2는 수소 또는 1 내지 6탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이다. 여기서 사용되는 것과 같은 아미노산은 위에서 보여지는 바와같이 그것들의 산성형태일 수도 있고 식:
에 의해 나타난 그것들의 양쪽성 형태일 수도 있으며, 상기식에서 R1및 R2는 전술한 바와같은 의미를 갖고, ℓ 또는 d- 거울상이성질체 구조일 수도 있다. 대표적인 알킬 R1기에는 예를들면, 메틸, 히드록시메틸, 이소프로필, 2-이소부틸, 1-이소부틸, 히드록시에틸 및 아미노부틸기가 포함된다. 대표적인 아릴알킬 R1기에는 예를들면, 톨릴 및 히드록시톨릴기가 포함된다. 현재 특히 바람직한 알킬 R2기에는 메틸 및 에틸기가 포함된다. 본 발명의 대표적인 항균활성증강제에는 글리신 그리고 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트레오닌, 리신, 페닐알라닌, 티로신의 ℓ- 또는 d-거울상이성질체로 구성된 군으로부터 선택된 α- 아미노산 그리고 그것들의 알킬에스테르가 포함된다.
현재 가장 바람직한 항균활성증강제는 글리신 및 ℓ- 알라닌이다.
포자벽의 성질 및 두께가 일중항분자산소 및 차아염소산의 치명적인 작용에 대하여 보호를 해준다. 진균포자에 관하여, α- 아미노산에 의해 유도된 포자발아에 의해 산화제에 더욱 민감한 생장형이 만들어진다. 또한 본 발명의 항균활성증강제는 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Candida albicans 를 포함한 효모생장형들의 사멸을 증강시킨다는 것이 주가적으로 밝혀졌다(아래 표 1참조). 이 현상은 효모성장 및 줄아의 α- 아미노산- 이존성 족진에 관련될 수도 있고 할로퍼옥시다제에 의한 사멸에 대한 대사적으로 활성인 그러한 형들의 증가된 민감성에 관련될 수도 있다. 하나의 대안적인 가능성은 α- 아미노산들 또는 그것들의 대사산물들이 H2O2을 생성할 수 있는 진균옥시다제의 기질로서 작용한다는 것이다.
다른 대안적인 가능성은 할로퍼옥시다제에 의해 조정되는 α- 아미노산 탈아민반응-탈카르복실반응에 의한 알데히드생산물이 발아 및 출아를 유도할 수도 있고, 그렇지 않으면 어떤 생명과정에 영향을 줄수도 있다는 것이다.
본 발명의 할로퍼옥시다제의 소독활성은 자아할로겐산염을 형성하는 과산화물과 브롬화물이나 염화물의 반응, 그리고 일중항분자산소를 형성하는 과산화물과 자아할로겐산염의 반응에 관련이 있기 때문에, 본 발명의 조성물의 활성은 적합한 과산화물 및 활로겐화물이 항균활성 부위에 존재하는 것에 의존한다. 어떤 상황에서, 예컨대 자연적으로 존재하는 세균상의 활성으로 인해, 과산화물(예, 과산화수소)은 항균활성 부위에 존재할 수도 있고, 충분한 양의 염화물이 전환반응에서 보조인자로서 작용하기 위하여 생리적 환경(milieu)에 존재할 수도 있다. 이들 환경에서, 어떠한 주가적인 과산화물 또는 할로겐화물이 본 발명의 조성물에 투여되거나 포함될 필요는 없다. 다른 상황에서, 미생물처리 부위에 과산화수소 및/ 또는할로겐화물을 추가적으로 제공하는 것이 필요할 수도 있다. 따라서 원한다면 본 발명의 조성물은 추가적으로 과산화물이나 생체내 또는 생체외에서 과산화물을 생성할 수 있는 시약 그리고 할로겐화물로 이루어질 수도 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 과산화물에는 과산화수소, R 이 수소 또는 1 내지 3개의 탄소원자를 갖는 짧은쇄 알킬기인 식:
R - O O H
의 알킬히드로퍼옥시드, 그리고 브로퍼옥시드 또는 우레아퍼옥시드와 같은 무기과산화물이 포함된다. 유기과산화물의 산화제활성은 다음과 같이 R쇄길이가 증가됨에 따라 일반적으로 감소한다:
R = H > > C H3> C H3C H2> C H3(C H2)2
현재 본 발명의 조성물에 사용하기에 바람직한 과산화물은 과산화수소이다.
또한 본 조성물내에 생체내 또는 생체외에서 과산화수소를 생성케할 수 있는 시약을 포함케함으로써 과산화수소가 항균활성 부위에 이용될 수도 있다.
이러한 목적을 위하여 특히 유용한 시약에는 예컨대, 콜레스테롤옥시다제, 글루코즈옥시다제 및 갈락토즈옥시다제와 같은 옥시다제들이 포함된다.
생체내 이용을 위하여 본 발명의 조성물내에 과산화수소가 직접 포함되는 경우에, 사용되는 양은 최대소독활성을 제공하도록 고안되는 것이 바람직하다. H2O2노출의 기간동안 직접적인 접촉을 피함으로써 숙주 세포 및 조직 그리고 정상세균상에 대한 손상을 피할 수 있다. 따라서, 액체제조물에 포함될때는, 본 발명의 조성물은 액체 조성물의 ml 당 약 1nmol 내지 약 10 μmol 의 과산화산소, 더 바람직하게는 액체조성물의 ml당 약 5nmol 내지 약 5 μmol 의 과산화수소, 그리고 가장 바람직하게는 액체조성물의 ml당 약 10nmol 내지 약 1μmol 의 과산화수소로 이루어질 수도 있다.
생체내에서 과산화수소를 생성가능한 시약, 예, 과산화물생성옥시다제, 는 항균활성의 부위에 존재하는 과산화수소의 양을 동적으로 조절하는데 특히 유용하다. 일정하고 낮은 수준의 H2O2의 농도를 제공하고 유지함으로써 그러한 시약은 본 조성물의 항균활성을 최대화시킨다. 따라서, 사용되어질 그런 시약의 양은 시약의 성질 및 바라는 효과에 매우 의존적일 것이기는 하나, 항균활성의 부위에서 이용가능한 할로겐화물의 형 및 농도에 따라 분당액체의 ml 당 과산화수소 약 1pmol 내지 약 1μmol 의 일정한 상태수준을 생성가능한 것이 바람직할 것이다. 제조물이 소독- 살균용액으로서 사용되어질때에, 옥시다제 및 그것의 기질은 요구된 살균기간동안 비교적 높고 안정한 상태의 H2O2의 농도를 지속하도록 조정될 수 있다.
소독- 살균작용은 옥시다제기질의 고갈과 함께 종료되거나 옥시다제 분해의 속도에 비례한다.
항진균 목적을 위하여, H2O2생성옥시다제로서 예컨대, Nocardia erythropolis로부터의 콜레스테롤옥시다제을 사용하는 것이 현재 특히 바람직하다.
원핵성 세균과는 달리, 진균은 스테롤을 합성한다. 사실, 암포테리신 B(amphotericin B)의 항진균활성은 진균막(membrane)스테로이드, 예, 에르고스테롤에의 결합에 적어도 부분적으로 의존적이다. 에르고스테롤이 대부분의 진균의 우세한 스테롤성분이기는 하나, 다른 스테롤도 존재한다(Weete, 1973, Phytochemistry 12:1843).
Nocardia erythropolis로 부터의 콜레스테롤옥시다제는 선택적으로 △5-3β-올 및 5α-3β- 올을 산화시켜 캐톤을 얻게한다(Smith 및 Brooks, 1974, J. Chromatography 101:373): 예,
콜레스테롤 + O2-콜레스테롤옥시다제 →콜레스테논 + H2O2
에르고스테롤 + O2-콜레스테롤옥시다제 →에르고스테논 + H2O2
이 Nocardia 옥시다제는 비교적 열에 안정하고 50℃에서 촉매활성을 보유한다.
그것은 4 내지 9의 pH 범위에서 활성을 갖고 pH7에서 최대활성을 갖는다. 그것은 1.4 × 105몰/ 리터의 Michaelis상수(Km)을 갖는다(Richmond, 1973, Clin Chem. 19:1350).
H2O2가 존재할때 또는 H2O2- 생성옥시다제에 연결될때, 할로퍼옥시다제는 살진균적(fungicidal)이다.
그러나, 옥시다제로서 콜레스테롤옥시다제를 사용할때, 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 진균사멸은 H2O2만의 생성으로부터 기대된 것보다도 더 컸다. 이 콜레스테롤 옥시다제-의존적인 살진균작용의 증가는 진균스테로이드의 옥시다제 고갈로 인한 진균막 완전성의 파괴에 부분적으로 관련될 수도 있다. 또한 진균은 내생적인 H2O2생성스테롤 옥시다제를 합성할 수도 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 할로겐화물은 브롬화물 또는 염화물일수도 있다. 특정 이용에서 사용되는 할로겐화물의 효용, 선택 및 양은 소독조성물에서 사용되는 할로퍼옥시다제, 원하는 치료효과, 과산화물의 이용가능성 및 다른 인자들과 같은 다양한 인자들에 의존할 것이다. 할로퍼옥시다제가 미엘로퍼옥시다제일때, 할로겐화물은 브롬화물이거나 염화물일 수도 있다.
염화물은 할로겐화물 보조인자로서 제한되지 않을만큼 충분한 수준으로 대부분의 생리적 배지에 존재하기 때문에, 염화물의 외부공급원은 일반적으로 요구되지 않는다.
염화물의 외부공급원이 요망될때에는 사용되어지는 염화물의 양을 용액의 ml 당 약 10μmol 염화물 내지 약 150μmol 염화물의 범위내에서 대략 생리적 조건으로 낮추는 것이 바람직 할 것이다. 할로퍼옥시다제가 호에오신퍼옥시다제일때, 염화물은 보조인자로서는 비교적 비효과적이므로, 따라서 바람직한 할로겐화물은 브롬화물이다.액체 조성물내에 포함될때에, 본 발명의 조성물은 액체조성물의 ml 당 약 1nmol브롬화물 내지 20μmol 브롬화물, 더 바람직하게는 액체조성물의 ml 당 약 10nmol 브롬화물 내지 약 10μmol 브롬화물, 그리고 가장 바람직하게는 액체조성물의 ml 당 약 100nmol브롬화물 내지 약 1μmol 브롬화물로 이루어질 수도 있다.
할로겐화물 대 과산화물의 비율은 효과적인 살균환경을 제제하는데 중요한고려사항이다. 따라서, 상기된 바와같이, 추가적으로 미생물 공격의 장소에 할로겐화물 및 과산화물의 효과적 수준을 보증하기 위하여, 최적살균활성을 제공하는 할로겐화물: 과산화물 비율에서 본 발명의 방법을 실시하는 것이 바람직할 것이다.
예를들면, 할로퍼옥시다제가 MPO이고 할로겐화물이 Cl-일때, Cl 대 과산화물의 비율은 살균활성의 환경에서 바람직하게는 약 1 대 약 40,000,더 바람직하게는 약 50 대 약 40,000 그리고 가장 바람직하게는 약 200 대 약 40,000 의 범위내에서 유지된다. 할로겐 화물이 Br 일때, Br 대 과산화물의 비율은 살균활성의 환경에서 바람직하게는 약 0.1 대 약 4,000, 더 바람직하게는 약 0.5 대 약 2,000 그리고 가장 바람직하게는 약 1 대 1,000의 범위내에서 유지된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 바람직하게는 정상세균상에 최소한의 손상을 끼치면서, 광범위한 포자형 미생물의 성장을 저해하기 위하여 사용될 수 있다. 여기서 사용된 바와같은 "포자형 미생물" 은 세균 또는 진균의 포자형을 포함하기 위하여 사용된 것이다. 포자형성 미생물은 잘알려졌으며 예컨대 Bacillus종 및 Clostridium 종과 같은 세균 그리고 Aspergillis종, Fusarium종, Trichophyton 종 및 그 유사종과 같은 진균이 포함된다.
여기서 사용된 바와같은, 용어 "정상세균상" 은 건강한 숙주의 신체표면내 또는 상에 공생수준으로 통상적으로 존재하는 세균을 의미한다. 정상세균상에는 예컨대, 인간 피검자의 구강, 장 또는 질내의 세균의 젖산패밀리, 예 구강내의 Streptococcus(비리단(viridans), 젖먹이 유아의 장, 외성기, 전방요도 및 질내의Lactobacillus종(예, Tissier's bacillus 및 Doderlein's bacillus)이 포함된다. 숙주의 정상 세균상을 구성하는 미생물들은 잘알려졌다(예. Principles and Practice of Infectious Diseases. 상기 참조. New York, pp. 34-36 및 161). 본 발명의 할로퍼옥시다제는 정상세균상에 우선하여 많은 병원성 세균 및 진균에 선택적으로 결합한다는 것이 밝혀졌다. 생체내 이용에서, 숙주의 정상세균상을 제거하기에는 비효과적인 할로퍼옥시다제의 양으로 숙주를 처리하는 것이 바람직하다.
소독 살균을 위한 생체외적용에서, 확실히 모든 생장형 및 효모형을 완전히 사멸시키기에 충분한 할로퍼옥시다제 고농도가 사용될 수 있다. 그런 조건하에서, 숙주조직 및 정상세균상에 대한 손상은 숙주조직과의 접촉에 앞서 H2O2또는 H2O2-생성시스템을 소비함으로써 피해진다.
일반적으로 본 발명의 조성물은 과산화물 및 할로겐화물의 존재하에서 효모 또는 포자형 미생물을 사멸시키거나 성장을 저해하기에 효과적인 양의 할로퍼옥시다제 및 항균활성증강제로 이루어진다. 본 조성물은 편리하게 액체담체내에 제공될 수도 있다. 담체가 할로퍼옥시드의 선택적인 결합능력을 그리고 효소활성을 충분히 해치지 않는다면, 일반적으로 어떠한 담체도 이러한 목적을 위하여 사용될 수도 있다. 대안적으로, 본 조성물은 액체내에서 용해될때 활성화되는 고체형태 내에 제공될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 과산화물 또는 옥시다제와 같이 과산화물을 생성가능한 시약이 주가되어 이루어질 수도 있으며, 이는 위에서 상세히 기재된 바와같다. 옥시다제-할로퍼옥시다제 시스템은 두개성분의 제조물로서 구성하는데 적합하다. 두개성분의 한 부분은 옥시다제, 할로퍼옥시다제 및 항균활성증강제, 예, 글리신 또는 ℓ- 알라진을 함유하는 용액으로 이루어진다. 두개성분의 다른 부분은 옥시다제의 기질, 예, 콜레스테롤옥시다제의 경우에 콜레스테롤 또는 산소분자, O2로 이루어진다.
기질은 예를들면 고체웨이퍼의 형태로 제공될 수도 있다.
물품, 예, 콘택트렌즈의 살균을 위하여, 콜레스테롤웨이퍼를 살균되어질 물품과 함께 살균 챔버내에 높는다. 콜레스테롤 옥시다제- 할로퍼옥시다제 및 글리신 또는 ℓ- 알라닌용액이 살균을 개시하기 위하여 첨가된다. 콜레스테롤 용해 및 옥시다제에 의한 이용을 용이하게 하기 위하여 본 조성물은 알코올이 추가되어 이루어질 수도 있다. 반응을 추진하기에 충분한 콜레스테롤이 존재하는 일, 이러한 시스템은 지속적인 살균작용을 이룰것이다.
생체내 이용을 위하여, 소독조성물은 인간 및 동물 피검자를 포함한 온혈동물에 국소적 구강 또는 비강 분무방식 또는 미생물 감염의 부위에 활성할로퍼옥시다제를 운반하기에 효과적인 어떤 다른 방식으로서 약제학적으로 허용가능한 어떤 효과적인 형태, 예 국소적, 세정용, 경구식 또는 죄약식 복용형태로 투여될 수 있다. 투여의 경로는 감염원인 미생물과 소독조성물이 직접접촉하도록 고안하는 것이 바람직할 것이다.
국소적 이용을 위하여, 약제학적으로 허용가능한 담체는 액체, 크림, 거품,로션 또는 겔의 형태를 취할 수도 있고, 유기용매, 유화제, 겔화제, 보습제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 방부제, 서방화(time release)제 그리고 소량의 휴멕탄트, 봉쇄제, 염료, 향료 그리고 국소투여를 위한 약제학적 조성물에 일반적으로 사용되는 다른 성분이 추가되어 이루어 수도 있다.
경구적 또는 국소적 투여를 위한 고체복용형태에는 캡슐, 정제, 환약, 좌약, 분말 및 과립이 포함된다.
고체복용형태에서, 본 조성물은 수크로즈, 락토즈 또는 녹말과 같은 불활성 희석제들중의 적어도 하나와 혼합될 수도 있고, 윤활제, 완충제, 장용피(enteric coatings) 그리고 당업자에게 잘알려진 다른 성분이 추가되어 이루어질 수도 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 분 발명의 조성물은 특히 장비 또는 렌즈가 환자 또는 착용자와 접촉되어 사용되도록 의도된 의료장비, 콘택트렌즈 및 그 유사물의 소독 또는 살균과 같은 생체외 이용을 위하여 특수하게 고안될 수도 있다.
이러한 형의 이용을 위하여, 본 조성물은 편리하게 액체 또는 거품의 형태로 제공될 수도 있고, 유화제, 계면활성제, 완충제, 습윤제, 방부제, 그리고 이러한 형의 조성물에서 일반적으로 발견되는 다른 성분을 구비할 수도 있다. 본 발명의 조성물이 봉합용실, 붕대 및 거즈와 같은 흡수성 물질에 스며들게 하고, 스테이플, 지퍼 및 카테테르와 같은 고체상 물질의 표면상에 도포되게 하여 본 조성물을 미생물 감염의 예방을 위한 부위로 운반되도록 할 수도 있다. 이러한 형의 다른 운반시스템은 당업자에게 너무나 명백할 것이다.
치료부위에서 효모 및 포자형 미생물은 물론 생장형 미생물을 사멸하기에 효과적인 양의 할로퍼옥시다제 및 항균활성증강제를 얻기 위하여 본 발명의 조성물내의 할로퍼옥시다제 및 항균증강제의 실제양을 다양하게 바꿀 수도 있다. 따라서, 선택된 양은 치료성격 및 치료부위, 원하는 감응, 살균작용의 원하는 지속기간 및 다른 인자에 의존할 것이다. 일반적으로 할로퍼옥시다제가 미엘로퍼옥시다제 일때에, 본 발명의 액체조성물은 적어도 액체조성물의 ml 당 0.01 피코몰(pmol)의 미엘로퍼옥시다제, 더 바람직하게는 액체조성물의 ml 당 약 0.1pmol 내지 약 500pmol의 미엘로퍼옥시다제, 그리고 가장 바람직하게는 액체조성물의 ml 당 약 0.5pmol 내지 약 50pmol 의 미엘로퍼옥시다제로 이루어질 것이다. 호에오신퍼옥시다제의 복용량은 유사하게 사용될 수도 있다.
선택적으로 동일한 조성물내에 호에오신퍼옥시다제 및 미엘로퍼옥시다제 양자를 포함하는 것이 어떤 이용에서는 바람직할 수도 있다. 일반적으로 본 발명의 액체 조성물은 적어도 0.005μmol/ml의 항균활성증강제 즉, 글리신 및 알라닌과 같은 α- 아미노산, 그리고 더 바람직하게는 0.05μmol/ml 내지 50μmol/ml의 그러한 항균활성증강제로 이루어질 것이다.
위에서 상세히 기재된 비와같이, 원함에 따라 과산화물 생성을 위한 옥시다제, 옥시다제의 기질 및 할로겐화물과 같은 다른 성분들이 포함될 수도 있다.
추가로, 특정한 이용을 위하여 요청될 수도 있는 바와같이, 성분들이 단일제조물내에 제조될 수도 있고, 또한 후에 사용되는 동안 혼합되어지는 2개의 제조물로 분리될 수도 있다. 단일 제조물을 위하여 할로겐화물, 옥시다제, 옥시다제의 보결분자단, 옥시다제의 환원기질 또는 산소분자와 같은, 이용부위에서 이용가능한하나의 필수 시스템 성분은 조기반응 그리고 시스템 성분의 고갈을 방지하도록 본 제조물로 부터 빼는 것이 바람직하다.
설명을 위한 실시예에서와 같이, 콘택트렌즈용액으로서 사용하기에 적합한 조성물은 1 내지 20pmol/ml 의 호에오신퍼옥시다제 및/ 또는 미엘로퍼옥시다제, 0.1 내지 1μmol/ml의 글리신, 0.01 내지 10 단위의 글루코즈옥시다제, 그리고 50 내지 500mEq/L 의 염화물 및 0.1 내지 1mEq/L 브롬화물로 이루어질 수도 있다. 상기 조성물은 혐기성 조건하에서 1 내지 10μmol/ml의 글루코즈와 결합되며 완성된 제조물은 액체소독제 또는 살균용액으로서 사용될때까지 혐기상태에 있어야 한다. 공기, 즉 산소분자에 대한 노출은 제조물의 소독- 살균작용을 활성화시킨다.
앞의 내용이 설명을 위하여 제시된 것이지 제한의 목적으로 제시된 것이 아닌 다음의 대표적인 실시예와 연결되면 더욱 잘 이해될 것이다.
실시예
실시예 1
옥사다제- 할로퍼옥시다제에 의한 세균, 효모 및 진균 포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과
옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 세균, 효모 및 진균 포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과를 다음과 같이 결정하였다. 배양배지를 Nocardia erythropolis로부터의 콜레스테롤옥시다제(Richmond, W., "Preparation and Properties of a Cholesterol Oxidase from Nocardia sp and lts Application to the Enzymatic Assay of Total Cholesterol in Serum" Clin Chem. 19 (12): 1350-1356(1973) 의절차에 따라 제조됨)0.1단위(즉, 4㎍)를 함유하는 50mM 아세테이트 완충액, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOxEmis. Inc., San Antonio. Texas. U.S.A., Lot ＃ 1899201)또는 20pmol(1.5 ㎍)돼지 EPO(ExOXEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201), 100mEq/L Cl, 및 1mEq/L Br 로 부터 제조하였다. Staph. aureus. Cand. albicans, 및 Asperg. fumigatus의 1×107세포로 배양배지를 접종함으로써 배양혼합물을 제조하였다. 50mM MOPS완충액을 첨가하여 배양혼합물의 pH를 7로 조정하였다.
8.5%에탄올내의 콜레스테롤을 배양혼합물에 첨가하여 최종농도를 7mM(7μmol/ml) 로 되게하였다. 배양혼합물의 최종부피는 1ml이었다. 본 혼합물을 22℃에서 4 시간동안 배양하였고 그다음 미생물을 플레이팅(plating) 하였다(S. aureus를 트립티카제콩(soy) 한천상에 플레이팅하였고; C. albicans 및 A. fumigatus 를 Sabourand's 덱스트로즈 한전상에 플레이팅하였다).
약 24 시간(A. fumigatus 의 경우 약 72-96시간) 후, 본 생물체의 생존능력의 척도로서 콜로니형성단위(CFU) 를 계수하였다. 그 결과는 표 1에 보여진다.
표 1
†는 50mM 아세테이트 완충액이 1mM ℓ- 알라닌을 함유한다는 것을 가리킨다.
표 1에 보여진 바와같이, 콜레스테롤 및 MOP또는 EPO는 효능있는 살균시스템을 제공한다.
이 결합물은 1mM ℓ- 알라닌의 존재 또는 부재하에서 107Staphylococcus aureus를 사멸시키었다. 그러나, 콜레스테롤 옥시다제- 할로퍼옥시다제 시스템내의 ℓ- 알라닌의 함유는 Candida albicans 효모형 및 Aspergillus fumigatus포자 양자를 완전히 사멸시키는데 필요하였다.
실시예 2
Aspergillus fumigatus 포자에 대한 할로겐퍼옥시다제 살균활성 작용에 미치는 잠재적인 아미노산 항균활성증강제의 효과
100mEq/L 의 염화물 및 0.1mEq/L 의 브롬화물을 함유하는 pH6의 50mM 아세트산나트륨완충액 내에 5.6mM 글루코즈를 함유하는 배양배지에 아래의 표 2-8에서 지시된 양의 글루코즈옥시다제(실시예 1에서의 콜레스테롤대신) 을 각 시험이 함유한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 절차를 따름으로써 할로퍼옥시다제 살균작용을 위한 증강제로서의 다양한 잠재적인 아미노산의 효과를 결정하였다.
아래의 표 2-8에 지시되어 있는 잠재적인 아미노산 활성인자를 본 혼합물에 첨가하여 최종농도를 0.5,0.5 또는 0.05μmol/ml을 되게하였고, 배양혼합물을 Aspergillus fumigatus의 약 1×107포자로 접종하였다. 본 화합물을 90 분동안 주위온도에서 배양하였고 그다음 실시예 1에 기재된 바와같이 플레이팅하였다. 플레이트를 35℃에서 밤새 배양하고나서, 추가로 2일동안 배양하였다. 본 생명체의 생존능력의 척도로서 콜로니형성 단위를 계수하였다.
지방족 아미노산 글리신, ℓ- 알라닌, ℓ- 발린, ℓ- 로이신 및 ℓ- 이소로이신을 상기 된 바와같이 시험하였다. 그 결과는 다음의 표 2에 보여진다.
표 2
표 2에 보여지는 바와같이, 시험되어지는 각각의 지방족 아미노산은 A. fumigatus 포자에 대한 호에오신퍼옥시다제 및 미엘로퍼옥시다제 양자의 할로퍼옥시다제 항균활성에 상당한 증강효과를 나타내었고, 글리신 및 ℓ- 알라닌의 경우 가장 큰 증강효과를 나타내었다.
디카르복실아미노산 및 아미드 ℓ- 아스피리긴산, ℓ- 아스파라긴, ℓ- 글루탐산 및 ℓ- 글루타민, 그리고 아미노산 ℓ- 프롤린 및 ℓ- 히드록시프롤린을 상기된 바와같이 시험하였다.
그 결과는 다음의 표 3에 보여진다.
표 3
표 3에 보여지는 바와같이, 시험되어진 어떤 농도에서도 시험되어진 디카르복실아미노산 또는 아미노산의 어떤것도 상당한 할로퍼옥시다제 항균활성증강 효과를 나타내지 않았다.
히드록시아미노산 ℓ- 세린 및 ℓ- 트레오닌, 그리고 염기성 아미노산 ℓ- 리신, ℓ히스티딘 및 ℓ- 아르기닌을 상기된 바와같이 시험하였다.
그 결과는 다음의 표 4에 보여진다.
표 4
표 4에 보여지는 바와같이, 히드록시아미노산 ℓ- 세린 및 ℓ- 트레오닌 양자는 에오시노퍼옥시다제에 의한 A. fumigatus 포자의 사멸을 상당히 증강시키었고, 한편 ℓ- 트레오닌 및 염기성 아미노산 ℓ- 리신은 미엘로퍼옥시다제 항균활성을 증강시키는데 효과적이었다.
염기성 아미노산 ℓ- 히스티딘 및 ℓ- 아르기닌은 상당한 항균효과를 나타내지 않았다.
히스티딘은 일중항분자산소에 매우 반응적이므로, 그 자체로, 그것이 포자발아를 자극할 수 있는 능력을 숨길수도 있는, 할로퍼옥시다제 작용에 대한 유효한 경쟁적 저해를 낳을 것으로 기대된다.
술퍼아미노산 ℓ- 시스테인 및 ℓ- 메티오닌, 그리고 방향족 아미노산 ℓ- 페닐알라닌, ℓ- 티로신 및 ℓ- 트립토판을 상기된 바와같이 시험하였다. 그 결과는 표 5에 보여진다.
표 5
표 5에 보여지는 바와같이, 황아미노산은 호에오신퍼옥시다제 또는 미엘로퍼옥시다제의 항균활성을 증가시키는데 비효과적이었다. 방향족 아미노산 ℓ- 페닐알라닌 및 ℓ- 티로신양자는 호에오신퍼옥시다제 및 미엘로퍼옥시다제에 의한 A.fumigatus 의 사멸을 상당히 증강시킨다는 것을 나타내었고, 한편 ℓ- 트립토판은 상당한 효과를 나타내지 않았다. 이들 황 및 방향족 아미노산도 또한 일중항분자산소에 비교적 반응적이고, 할로퍼옥시다제 작용을 경쟁적으로 저해할 수도 있으며, 이는 포자발아를 자극할 수 있는 그것들의 능력을 숨길 것이다. 이것은 왜 ℓ- 페닐알라닌 및 ℓ- 티로신이 저농도에서 시험될때 가장 효과적인지를 설명해준다.
알라닌의 거울상이성질체 구조 그리고 알라닌의 이성질체 구조 및 유도의 효과를 상기한 바와같이 시험하였다.
그 결과는 다음의 표 6에 보여진다.
표 6
표 6에 보여지는 바와같이 알라닌의 ℓ- 및-d- 거울상이성질체 양자가 미엘로퍼옥시다제 및 호에오신퍼옥시다제에 의한 A. fumigatus 의 사멸을 증강시키는데 매우 효과적이었고 한편 β- 알라닌은 상당한 증강효과를 나타내지 않았다. 유사하게, ℓ- 알라닌의 메틸에스테르는 항균활성의 상당한 증강을 만들었다. ℓ- 알라닌- ℓ- 알라닌 디펩티드는 상당한 증강활성을 나타내지 않았다.
트레오닌의 거울상 이성질체의 구조의 효과를 상기한 바와같이 시험하였다. 그 결과는 다음의 표 7에 보여진다.
표 7
아미노산형 및 농도: 할로퍼옥시다제에 의한 Aspergillus fumigatus포자의 사멸에 미치는 효과
표 7에서 보여진 바와같이, ℓ- 및 d- 거울상이성질체 양자는 미엘로퍼옥시다제 및 호에 오신퍼옥시다제에 의한 A. fumigatus 의 사멸을 상당히 증강시켰다.
ℓ- 알라닌 및 피루브산, 그리고 글리신 및 글리옥실산을 이용하여, 증강성 α- 아미노산의 α- 케토산형을 사용한 효과를 상기한 바와같이 시험하였다. 그 결과는 다음의 표 8에 보여진다.
표 8
표 8에 보여진 바와같이, 피루브산 및 글리옥실산은 ℓ- 알라닌 및 글리신의 활성증강 효과를 나타내지 않는다.
실시예 3
다른 항진균 시스템에 미치는 항균활성증강제의 효과
일반적인 항진균화합물 니스타틴 및 암포테리신 B의 항균효과에 미치는 ℓ-알라닌의 효과를 결정하기 위하여, 실시예 2의 할로퍼옥시다제- 글루코즈옥시다제 대신 니스타틴 또는 암포테리신 B를, 그리고 0(대조군) 또는 10μmol/ml의 ℓ- 알라닌 및 미생물로서 fusarium moniliforme을 사용하여 실시예 2의 절차를 따랐다. 그 결과는 다음의 표 9에 보여진다.
표 9
니스타틴 및 암포테리신 B항진균 활성에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과
표 9에서 볼 수 있는 바와같이, ℓ- 알라닌의 첨가는 Fusarium moniliforme의 니스타틴- 의존적 사멸을 두배로 하였으나 Fusarium moniliforme의 암포테리신 B- 의존적 사멸에는 아무영향을 미치지 못했다.
Aspergillus fumigatus 및 Fusarium moniliforme의 포자와 함께 소독화합물 과산화수소(H2O2) 및 차아염소산나트륨(NaCl0)을 사용하여 전술한 절차를 반복하였다. 그 결과는 다음의 표10에 보여진 바와같다.
표 10
과산화수소 및 치아염소산나트륨 항진균 활성에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과
암포테리신 B를 사용한 것과같이, ℓ- 알라닌과 함께 사용되어질때 과산화수소 또는 차아 염소산염의 소독력이 상당히 증강되는 것이 보이지 않는다. 사실, ℓ- 알라닌이 진균을 사멸시키는 과산화물 그리고 특히 차아염소산염을 저해하는 것으로 여겨진다. 그러한 조건하에서, 아마도 ℓ- 알라닌은 경쟁적인 저해인자로서 작용한다.
실시예 4
할로퍼옥시다제 의한 추가적 생물체의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과
0(대조군) 또는 10μmol/ml의 ℓ- 알라닌 그리고 이들 생물체에 대한 시험당2,10 또는 50pmol의 미엘로퍼옥시다제 또는 호에오신퍼옥시다제를 사용하여 실시예 2의 절차를 따름으로써 Fusarium moniliforme, Tricophyton rubrum 및 Crytococcus neoformans에 대한 할로퍼옥시다제 항균활성에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과를 결정하였다. 그결과는 다음의 표 11(F.moniliforme, ATCC ＃ 38159). 표 12(T. rubrum, ATCC ＃ 28188, 18753 및 18758) 및 표 13(C.neoformans, ATCC ＃ 14115)에 보여진다.
표 11
할로퍼옥시다제에 의한 Fusarium monilirorme 의 사멸
표 12
표 13
할로퍼옥시다제에 의한 cryptococcus neoformans의 사멸
표11에 보여지는 바와같이, 미엘로퍼옥시다제 및 호에오신퍼옥시다제 양자는 ℓ- 알라닌의 존재 또는 부재하에서 Fusarium moniliforme에 대하여 매우 효과적이다. 사실, EPO는 글루코즈옥시다제의 부재하에서 효과적인 것으로 밝혀졌다.
표12에서 보여지는 바와같이 Trichophyton의 완전한 사멸은 ℓ- 알라진의 존재하에서 호에 오신퍼옥시다제에 의해 얻어졌고, 한편 미엘로퍼옥시다제에 의한 사멸의 상당한 증강이 얻어졌다.
표13에 보여지는 바와같이, ℓ- 알라닌도 또한 호에오신퍼옥시다제에 의한 Cryptococcus neoformans의 사멸을 상당히 증강하며, 한편 미엘로퍼옥시다제 활성에서 약간의 증강이 보인다.
실시예 5
Candida albicans에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 콜레스테롤옥시다제 농도의 효과
100mEq/L Cl. 1mEq/L Br, 및 1mM ℓ- 알라닌을 함유하는 500mM 아세테이트 완충액내에 지시된 바와같이 여러 다른 양의 Nocordia erythropolis로부터의 콜레스테롤옥시다제(0.1단위=4㎍), 10pmol(1.4 ㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A. Lot ＃ 1899201) 또는 10pmol(0.7㎍)돼지 EPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 192921)을 각 시험이 함유한다는 점을 제외하고는 실시예 1의 절차를 따름으로써 Candida albicans에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 콜레스테롤옥시다제 농도의 효과를 결정하였다. 완충액으로서 50mM MOPS를 첨가하여 pH 를 6.7로 조정했다. 최종현탁액은 8.5% 에탄올내에 7mM(7μmol/ml) 콜레스테롤을 함유하였다. 최종부피는 1ml 이었다. 37℃에서 2시간동안 배양한후에, 미생물을 Sabouraud's 텍스트로스 한천상에 플레이팅하였다. 그 결과는 계수된 콜로니드형성단위(CFU) 로서 표14에 나타난다.
표 14
Candida albicans에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 콜레스테롤옥시다제 농도의 효과
†는 50mM 아세테이트 완충액이 ℓ- 알라닌을 함유하지 않는다는 것을 가리킨다.
표 14에 보여지는 바와같이, C.albicans의 완전한 사멸은 0.025단위 콜레스테롤옥시다제 그리고 10pmol MPO 및 1mM ℓ- 알라닌에 의해 관찰되었다. ℓ- 알라닌의 부재시에는 0.1 단위 콜레스테롤옥시다제 및 10pmol MPO 에 의한 사멸이 관찰되지 않았다. EPO가 할로퍼옥시다제로 치환되었을때, 유사한 결과가 얻어졌다.
실시예 6
세균에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 콜레스테롤옥시다제 농도의 효과
실시예 5의 C. albicans 대신 Escherichia coli 를 사용하여 실시예 5의 절차를 따랐다. 각 시험은 100mEq/L Cl, 1mEq/L Br, 및 1mM ℓ- 알라닌을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액내에 지시된 양의 Nocardia erythropolis로부터의 콜레스테롤옥시다제(0.1단위=4㎍). 10pmol(1.4㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201) 또는 10pmol(0.7㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201)을 함유하였다. 완충액으로서 50mM MOPS를 첨가하여 pH 를 6.7로 조정했다. 최종 현탁액은 8.5% 에탄올내에 7mM(7μmol/ml) 콜레스테롤을 함유하였다. 최종부피는 1ml 이었다. 37℃에서 2시간동안 배양한후에, 미생물을 트립티가제 콩 한천상에 플레이팅하였다. 그 결과는 계수된 콜로니형성단위(CFU) 로서 다음의 표15에 나타낸다.
표 15
Escherichia coli에 대한 옥시다제-할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 콜레스테롤 옥시다제 농도의 효과
†는 50mM 아세테이트 완충액은 ℓ- 알라닌을 함유하지 않는다는 것을 가리킨다.
표15에 보여지는 바와같이, MPO 및 EPO에 의한 Escherichia coli의 완전한사멸은 1mM ℓ- 알라닌의 부재 또는 존재하에서 시험되어진 모든 콜레스테롤옥시다제 농도(0.0125 내지 0.1단위) 에서 관찰되었다. 동일한 결과가 Staphylococcus aureus에 대해서도 관찰되었다(자료에는 보이지 않음).
실시예 7
콜린옥시다제를 사용한 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 세균, 효모, 및 진균 포자의 사멸
H2O2- 생성옥시다제로서 0.2단위 콜린옥시다제을 함유하는 점을 제외하고는 실시예 1의 절차를 따랐다. 지시된 곳에서 본 반응은 100mEq/L Cl-및 1mEq/L Br-을 함유하는 50mM 아세테이트완충액내에 Alcaligenes종으로 부터의 0.2단위(즉 20㎍)콜린옥시다제, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201) 또는 20pmol(1.5㎍)돼지 EPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201)을 함유하였다. 완충액으로서의 50mM MOPS를 첨가하여 pH 를 7로 조정했다. 콜린의 최종농도는 150mM(150μmol/ml) 이었다. 최종부피는 1ml이었다. 22℃에서 4시간동안 배양한 후, 미생물을 플레이팅하였다(S.aureus 을 트립티카제콩한천상에 플레이팅하였고 C.albicans 및 A.fumigatus을 Sabouraud's 덱스트로오즈 한천상에 플레이팅하였다) 그 결과는 계수된 클로닝 형성단위(CFU) 로서 표16에 나타난다.
표 16
콜린옥시다제- 할로펴옥시다제에 의한 Staphylococcus aureus, Candidaalbicans, 및 Aspsrgillus fumigatus 포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과;
†는 50mM 아세테이트완충액이 1mM ℓ- 알라닌을 함유한다는 것을 가리킨다.
실시예 8
락테이트옥시다제를 사용한 옥시다제- 할로포옥시다제에 의한 세균, 효모 및 진균 포자의 사멸
H2O2- 생성옥시다제로서 0.2단위 락테이트옥시다제를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 7의 절차를 따랐다. 지시된 곳에서 본 반응은 100mEq/L Cl 및 1mEq/L Br-을 함유하는 50mM아세테이트 완충액내에 Pediococcus종으로부터의 0.2단위(즉, 5㎍)락테이트옥시다제, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201) 또는 20pmol(1.5㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., SanAntonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201)를 함유하였다. 완충액으로서 50mM MOPS 를 첨가하여 pH 를 7로 조정했다. 락테이트의 최종 농도는 150mM(150μmol/ml) 이었다. 4시간동안 배양(22℃) 후에 미생물을 플레이팅하였다. S.aureus 를 트립티카제콩한천상에 플레이팅하였다. C.albicans 및 A.fumigatus를 Sabouraud's 텍스트로즈 한천상에 플레이팅하였다. 그 결과는 계수된 콜로니형성단위로서 표17에 나타낸다.
표 17
락테이트옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Staphylococcus aureus, Candida albicans, 및 Aspergillus fumigatus포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과:
†는 50mM 아세테이트완충액이 1mM ℓ- 알라닌을 함유한다는 것을 가리킨다.
실시예 9
알코올옥시다제를 사용한 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 세균, 효모 및 곰파이의 사멸
H2O2- 생성옥시다제로서 0.2단위 알코올옥시다제를 사용하는 점을 제외하고는 실시예 7의 절차를 따랐다. 지시된 곳에서 본 반응은 100mEq/L Cl-및 1mEq/L Br 을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액내에 Candida boidinii 로부터의 0.2단위(즉, 21㎍)알코올 옥시다제, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201) 또는 20pmol(1.5 ㎍)돼지 EPO(ExOxEmis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201)을 함유하였다. 완충액으로서 50mM MOPS를 첨가하여 pH 를 7로 조정했다. 알코올의 최종농도는 150mM(150μmol/l)이었다. 최종부피는 1ml이었다. 22℃에서 4시간동안 배양한 후에, 미생물을 플레이팅 하였다. S.aureus 를 트립티카제콩한천상에 플레이팅하였다. C.albicans 및 A. fumigatus 를 Sabouraud's 텍스트로즈한천상에 플레이팅하였다.
그결과는 계수된 콜로니형성단위(CFU) 로서 표18에 나타난다.
표 18
알코올 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Staphylococcus aureus, Candldaalbicans, 및 Aspergillus fumigatus포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과:
†는 50mM 아세테이트완충액이 1mM ℓ- 알라닌을 함유한다는 것을 가리킨다. MPO 또는 EPO와 함께, 콜레스테롤옥시다제(표 1), 콜린옥시다제(표16) 및 락테이트옥시다제(표17) 는 ℓ- 알라닌의 존재 또는 부재하에서 Staphylococcus aureus는 완전히 사멸하였다. ℓ- 알라닌이 있거나 없거나, 알코올옥시다제 및 EPO에 의한 사멸은 완전했으나, 알코올 옥시다제 및 MPO에 의한 사멸은 단지 부분적이었다(표18).
Candida albicans는 ℓ- 알라닌의 존재하에서만 콜레스테롤옥시다제(표1) 및 콜린옥시다제(표16) 그리고 MPO 또는 EPO에 의해 전부사멸하였다. ℓ- 알라닌의 부재시에는, 살균작용은 대략 50 퍼센트 사멸로 제한된다. 락테이트옥시다제(표17)및 알코올옥시다제(표18) 는 ℓ- 알라닌의 존재 또는 부재시에 MPO 또는 EPO에 의한 Candida albicans 의 사멸을 이끄는데 효과적이지 못하였다. ℓ- 알라닌의 존재시에, 콜레스테롤옥시다제(표1) 및 콜린옥시다제(표16)는 MPO 또는 EPO에 의한 Aspergillus fumigatus포자의 완전한 사멸을 도와주었다.
그러나, ℓ- 알라닌의 부재시에, 단지 부분적인 사멸만이 관찰되었다. 비록 완전하지는 못할지라도, ℓ- 알라닌의 존재시에 락테이트옥시다제(표17) 및 알코올옥시다제(표18) 양자는 EPO와 함께는 90%이상의 포자를 사멸시켰고, MPO 와 함께는 50% 이상의 포자를 사멸시켰다. ℓ- 알라닌의 부재시에, 락테이트옥시다제 또는 알코올옥시다제 어느것도 MPO 또는 EPO에 의한 Aspergillus fumigatus 포자의 사멸을 도와주지 못했다.
실시예10
콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Bacillus 및 Aspergillus 포자의 사멸에 미치는 잠재적인 활성인자 물질의 효과
미생물학 문헌은 포자의 발아 및 생장형의 활성인자로서 기능할 수도 있는 여러 물질을 기재하고 있다. 분생자(condidiospore) 발아에는 글루코즈, 포스페이트 및 아미노산이 요구되는 것이 보고되었다. L- 프롤린 또는 ℓ- 알라닌이 아미노산 요구를 충족시킨다. 다른 아미노산 및 비타민은 덜 효과적이다(Yanigita, 1957, Arch Mikrobiol 26: 329).
여러 다른 유기화합물이 발아를 자극하는 것으로 보고되었다. 이것들에는 페네틸알코올(Lingappa et al., 1970, Arch Mikorbiol 72: 97), 코우마린(Weber 및Hess, 1974, The Fungal Spore, p. 178, Wiley-Interscience), 및 푸르푸랄 유도체(Sussman et al., 1959, Mycologia 51: 237)이 포함된다.
본 반응이 100mEq/L Cl 및 1mEq/L Br 을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액내에 Nocardia erythropolis로 부터의 0.1단위(즉, 4㎍)콜레스테롤옥시다제, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201)또는 20pmol(1.5 μg)돼지 EPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201) 그리고 지시된 양의 ℓ- 알라닌 또는 ℓ- 프롤린을 함유하는 점을 제외하고는 전술한 절차를 따름으로써 콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Bacillus cereus 내생포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닌 및 ℓ- 프롤린의 효과를 결정하였다. 50mM MOPS 완충액을 첨가함으로써 pH 를 ∼7 로 조정하였다. 콜레스테롤의 최종농도는 8.5% 에탄올내의 5mM(5μmol/ml) 이었다. 최종부피는 1ml 이었다. 지시된 기간동안의 배양(22℃) 후, 생존미생물을 트립티카제콩한천상에 플레이팅하였다. 그결과는 계수된 콜로니형성단위(CFU) 로서 표19에 보여진다.
표 19
Bacillus cereus 포자에 대한 콜레스테롤옥시다제-할로퍼옥시다제 살균작용에 미ℓ- 알라닌 및 ℓ- 프톨린의 효과:
30분동안의 배양후, 활성인자로서 ℓ- 알라닌 또는 ℓ- 프롤린이 있는 경우 MPO(20pmol)와 함께 콜레스테롤옥시다제(0.1단위) 는 Bacillus cereus포자를 완전히 사멸시켰다. 그러나, 어떠한 증강물질이 첨가되지 않더라도 사멸은 완전하였다. 비록 더 오랜동안의 배양기간이 요구되더라도, EPO 와 함께 콜레스테롤옥시다제를 사용하여 유사한 결과를 얻었다. 할로퍼옥시다제의 부재시에는 ℓ- 알라닌 또는 ℓ- 프롤린의 첨가가 콜레스테롤옥시다제의 시멸활성을 크게 증가시키지는 않았다. 옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 사멸에 대한 이들 세균의 내생포자의 직접적인 민감성이 매우 커서 ℓ- 알라닌 또는 ℓ- 프롤린의 어떤 효과도 30 분과 같이 초기에 관찰되는 전부 사멸속에 감춰진다.
본 반응이 100mEq/L Cl 및 1mEq/L Br 을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액내에 Nocardia erythropolis로 부터의 0.1단위(즉, 4㎍)콜레스테롤옥시다제, 20pmol(2.8㎍)돼지 MPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201)또는 20pmol(1.5 μg)돼지 EPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas,U.S.A., Lot ＃ 1929201) 그리고 지시된 양의 시험되어질 물질을 함유하는점을 제외하고는 전술한 절차를 따름으로써 콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제에 의한 Aspergilus fumigatus 포자의 사멸에 미치는 ℓ- 알라닐, ℓ- 프롤린, 코우마린 및 펜에틸알코올의 효과를 결정하였다. 50mM MOPS완충액을 첨가함으로써 pH를 ∼7 로 조정하였다. 콜레스테롤의 최종농도는 8.5% 에탄올내의 5mM(5μmol/ml) 이었다. 최종부피는 1ml 이었다. 지시된 기간동안의 배양(37℃) 후, Aspergillus fumigatus 를 Sabouraud's 덱스트로즈한천상에 플레이팅하였다. 그결과는 계수된 콜로니형성단위(CFU) 로서 표20에 나타난다. PEA 는 펜에틸알코올을 위한 아크로님이다. 시험되어진 4개의 잠재적인 활성인자물질중에, ℓ- 알라닌만이 MPO 또는 EPO와 함께 콜레스테롤옥시다제의 사멸능력을 증가시켰다. 할로퍼옥시다제의 부재시에는, 활성인자의 어느 것도 콜레스테롤옥시다제의 사멸성을 증가시키지 않았다.
표 20
Aspergillus fumigatus 포자에 대한 콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 ℓ- 알라닌, ℓ- 프롤린, 코우마린 및 펜에틸알코올의 효과:
본 제조물에의 l- 알라닌의 함입은 포자 및 생장형 양자에 대한 옥시다제- 할로퍼옥시다제의 살진균 작용을 크게 증가시킨다. L-알라닌은 아민질소, CO2, 아세틸-CoA, 및 환원성동등물을 제공하며 그 자체로 할로퍼옥시다제의 작용에 대해 진균을 불안정하게 할것으로 여겨진다. 전에 보여진 바와같이(표3), 할로퍼옥시다제- 글루코즈옥시다제에 의한 사멸에서 ℓ- 프롤린은 증강물질로서 효과적이지 못하다.
실시예11
(1) 콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제 및 (2)고체형태의 콜레스테롤로 이루어진 2개성분의 소독제
콜레스테롤 옥시다제- 할로퍼옥시다제 시스템을 (1)콜레스테롤옥시다제- 할로퍼옥시다제및 항균활성증강제 ℓ- 알라닌을 함유하는 용액 그리고 (2)고체웨이퍼의 형태의 콜레스테롤로 이루어진 2개성분의 제조물로서 구성하였다. 콜레스테롤을에테르로 용해시키고, 콜레스테롤용액을 표면에 붓고, 에테르가 증발되도록 함으로써 콜레스테롤웨이퍼를 제조하였다. 그 결과 얻어진 콜레스테롤의 박판(Sheet) 을 대략 10㎎ 의 적당한 크기의 직사각형으로 절단하였다.
콜레스테롤웨이퍼(대략 10㎎/웨이퍼)을 Aspergillus fumigatus포자를 함유하는 시험관에 놓았다. MPO 또는 EPO와 함께 콜레스테롤옥시다제롤, 그리고 MPO 또는 EPO 없이 콜레스테롤옥시다제를 시험관에 첨가하여 살진균 작용을 개시시켰다. 본 시스템을 ℓ- 알라닌이 있는 것과 없는것, 그리고 에탄올이 있는 것과 없는 것에 의해 시험하였다. 에탄올을 첨가하여 콜레스테롤 용해를 용이하게 할 수 있는 그것의 능력을 시험하였다. 증가된 콜레스테롤 용해성은 옥시다제의 기질로서 이용 가능한 콜레스테롤의 증가를 의미할 것이다. 일단 개시되면, 본 시스템을 30분 내지 4시간범위의 시간간격 동안 주위온도(22 ℃)에서 배양하도록 한다. 본 반응은 100mEq/L Cl 및 1mEq/L Br 을 함유하는 50mM 아세테이트 완충액내에 Nocardia erythropolis로 부터의 0.1단위(즉, 4㎍)콜레스테롤옥시다제, 10pmol(1.4㎍)돼지 MPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1899201)또는 10pmol(0.7 μg)돼지 EPO(ExOx Emis, Inc., San Antonio, Texas, U.S.A., Lot ＃ 1929201)을 함유하였다. 50mM MOPS 완충액을 첨가함으로써 pH를 ∼7 로 조정하였다. 기질 콜레스테롤은 고제 웨이퍼의 형태로 존재하였다(약10㎎). 지시된 곳에서 본 반응은 10μmol/ml ℓ- 알라닌 및 10%에탄올을 함유하였다. 최종부피는 1ml이었다. 지시된 기간의 배양(22℃) 후, Aspergillus fumigatus를 Sabouraud's 덱스트로즈한천상에 플레이팅하였다. 그 결과는 계수된 콜로니형성단위(CFU's) 로서 나타난다. ND는 본 실험이 실행되지 않았음을 가리킨다. 그 결과는 표 21에 나타난다.
표 21
에탄올과 함께 그리고 에탄올 없이 기질로서 고체콜레스테롤을 사용한 경우 Aspergillus fumigatus 포장에 대한 콜레스테롤옥시다제-할로퍼옥시다제 살균작용에 미치는 ℓ- 알라닌의 효과:
표21에 보여지는 바와같이, 에탄올 및 ℓ- 알라닌의 존재시에, 콜레스테롤옥시다제-MPO제조물은 30분 경과시에 포자를 10배 사멸시키는데 기여하고, 1,2 및 4시간 경과시에 완전한 사멸에 기여한다. 에탄올 및 ℓ- 알라닌은 존재하나 할로퍼옥시다제가 부재하는 경우에, 콜레스테롤옥시다제는 단지 4시간의 배양후에만 약간 효과적이었다. 가장 효과적인 제조물은 에탄올 및 ℓ- 알라닌을 함께한 콜레스테롤옥시다제-EPO이었다. 완전한 포자 사멸은 모든 시험간격에서 관찰되었다.
에탄올의 함유는 시험되어진 제조물 모두의 효과를 크게 증가시켰다. 살포자작용(sporadical action) 은 10%에탄올의 존재시에 더욱 빠르고 더욱 강력했다. 이에탄올 효과는 콜레스테롤옥시다제 활성의 증가를 초래하는 증가된 고체콜레스테롤 용해의 결과일 수도 있다. 또한, 그 결과는 10%에탄올이 콜레스테롤옥시다제-할로퍼옥시다제 기능에 결정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 설명해준다. 또한, 본 제조물내에 적당한 양의 에탄올 또는 다른 비독성 용매의 함유는 콜레스테롤의 부재시에 본 시스템의 살균력을 유지하는데 도움을 주고 본 반응혼합물의 보존기간을 개선해 준다.
당업자에게는 본 발명의 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변용이 전술의 내용으로 부터 명백할 것이다. 그러한 변형 및 변용의 어떤 것도 종래의 기술에 의해 배제되는 것을 제외하고는 첨부된 특허청구의 범위의 범위내에 있는 것이 의도된다.

Claims (27)

  1. 과산화물 및 염화물 또는 브롬화물의 존재하에서 할로퍼옥시다제와 다음식:
    (상기 식에서 R1은 수소, 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 1 내지 6 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, R2는 수소 또는 1 내지 6 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이다) 의 적어도 하나의 항균활성증강제로 미생물을 접촉시키는 것으로 이루어지는 효모 또는 포자형 미생물을 사멸시키거나 성장을 저해하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 미엘로퍼옥시다제, 호에오신퍼옥시다제 및 그것들의 결합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 항균활성증강제가 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트리오닌, 리신으로 구성된 군으로부터 선택된 α -아미노산 또는 그 군의 구성원 중의 어떤 것의 알킬에스테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 미엘로퍼옥시다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 호에오신퍼옥시다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 미생물을 0.01 내지 500pmol/ml의 할로퍼옥시다제 그리고 0.005 내지 50μ mol/ml의 항균활성증강제로 이루어진 액체용액으로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 액체용액이 0.1pmol/ml 내지 500pmol/ml의 할로퍼옥시다제 그리고 0.05μ mol/ml 내지 50μ mol/ml의 항균활성증강제로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 용액이 용액의 ml 당 0.5pmol 내지 50pmol의 할로퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 액체용액이 과산화물 또는 과산화물을 생성하는 시약을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 할로퍼옥시다제와 다음식:
    (상기식에서 R1은 수소, 치환되지 않거나 히드록시 또는 아미노 치환된 1 내지 6 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, R2는 수소 또는 1 내지 6 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이다)의 적어도 하나의 항균활성증강제로 이루어진 효모 또는 포자형 미생물을 사멸시키거나 성장을 저해하기 위한 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 미엘로퍼옥시다제, 호에오신퍼옥시다제 및 그것들의 결합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 항균활성증강제가 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트레오닌, 리신으로 구성된 군으로부터 선택된 α -아미노산 또는 그 군의 구성원중의 어떤 것의 알킬에스테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 미엘로퍼옥시다제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 액체담체내에 0.01 내지 500pmol/ml의 미엘로퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 0.1pmol/ml 내지 500pmol/ml의 미엘로퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 0.5pmol/ml 내지 50pmol/ml의 미엘로퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 액체담체내에 0.005 내지 50μ mol/ml의 항균활성증강제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 0.05μ mol/ml 내지 50μ mol/ml의 항균활성증강제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제11항에 있어서, 할로퍼옥시다제는 호에오신퍼옥시다제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 액체담체내에 0.01 내지 500pmol/ml의 호에오신퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 액체담체내에 0.1pmol 내지 500pmol/ml의 호에오신퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 0.5pmol/ml 내지 50pmol/ml의 호에오신퍼옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 10nmol/ml 내지 10μ mol/ml의 브롬화물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  24. 제10항에 있어서, 과산화수소 또는 옥시다제에 대한 기질의 존재시에 과산화물을 생성하는 옥시다제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 옥시다제에 대한 기질의 존재시에, 분당 ml 당 100pmol 내지 50μ mol의 과산화물을 생성하는데 효과적인 과산화물생성옥시다제로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  26. 제10항의 조성물로 이루어진 소독-살균용액.
  27. 제26항에 있어서, 액체담체내에 미엘로퍼옥시다제, 호에오신퍼옥시다제 또는 그것들의 결합물 0.1pmoL/ml 내지 500pmol/ml, 그리고 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 세린, 트레오닌, 리신으로 구성된 군으로부터 선택된 α -아미노산 또는 그 군의 구성원중의 어떤 것의 알킬에스테르 0.005μ mol/ml 내지 50μ mol/ml로 이루어진 것을 특징으로 하는 소독-살균용액.
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