KR100306244B1 - 근육 질병 및 장애 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 p185^erbB2수용체와 결합하는 화합물을 포함하는 척추동물의 근조직 질병 및 장애 치료용 조성물에 관계한다. 이들 화합물들은 심근, 골격근 및 평활근의 분화 및 잔존을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

Description

근육 질병 및 장애 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING MUSCLE DISEASE AND DISORDERS}

본 발명은 근세포에 대한 성장, 분화 및 잔존인자(survival factors)인 척추동물 종에서 발견된 폴리펩타이드를 투여함으로써 근육조직의 질병 및 장애를 예방 또는 완치시키기 위한 조성물에 관계한다.

척추동물 성체에서 근육조직은 부수세포(satellite cell)로 불리우는 예비 근아세포(reserve myoblasts)로부터 재생될 것이다. 부수세포는 근육 조직의 전반에 걸쳐 분포되어 있고 질병 또는 손상이 없는 때에는 유사분열이 정지된 상태에 있다. 근육에 대한 손상 후 또는 질병으로부터의 회복중에, 부수세포는 다시 분열주기로 돌입하여 증식하고 1) 기존의 근섬유로 편입되거나 또는 2) 새로운 근섬유를 형성하는 다핵성 근관(multinucleate myotube)으로의 분화를 수행할 것이다. 근아세포는 궁극적으로 대체 근섬유를 만들어내거나 기존의 근섬유로 융합되어 수축기관 성분들의 합성에 의해 섬유의 둘레를 증가시킨다. 이러한 과정은 예컨대, 포유동물에서 일어나는 유도 근섬유 퇴행(induced muscle fiber degeneration)에 뒤이은 거의 완벽한 재생에 의해 설명된다; 근육 모세포(muscle progenitor cell)는 증식하고 서로 융합하여 근섬유를 재생시킨다.

성인(및 태아) 근아세포의 증식 및 분화를 조절하는 몇몇 성장인자들이 시험관내에서 확인되었다. 섬유아세포 성장인자(Fibroblast growth factor: FGF)는 근세포에 대하여 유사분열촉진성이고 근육 분화의 저해제이다. 형질전환 성장인자(Transforming growth factor β : (TGFβ))는 근아세포 증식에 대해서는 아무런 영향도 미치지 않지만, 근육분화의 억제제이다. 인슐린-유사 성장인자(Insulin-like growth factor : (IGFs))는 설치류에서 근아세포 증식 및 분화를 모두 촉진하는 것으로 알려졌다.

혈소판 유래 성장인자(Platelet derived growth factor : (PDGF))도 근아세포에 대해 유사분열촉진성이고 근세포 분화에 대한 강력한 억제제이다(Florini 및 Magri, 1989 : 256: C701-C711 참고).

척추동물 종에서 근육조직 및 뉴론 모두는 근아세포의 증식 및 분화를 촉진하는 인자들의 잠재적 공급원이다. 신경 유래의(즉, 신경원성인) 신경근계(neuromuscular system)를 침범하는 질병에 있어서, 침범된 신경이 분포된 근조직은 점진적으로 무력해지고 쇠약해진다. 말초신경 재생 및 신경계 및 근장애 질병으로부터 회복되는 중에, 뉴론들은 상술한 근재생을 유발하는 성장인자의 공급원을 제공하고 약화 및 위축으로부터 근육의 회복에 대한 메카니즘을 제공할 수 있다.

최근에 기술된 성장인자군인 뉴레귤린(neuregulins)은 운동뉴론(Marchioni et al.,Nature362:313, 1993) 및 염증성 세포(Tarakhovsky et al.,Oncogene6:2187-2196(1991))에 의해 합성된다. 뉴레귤린 및 관련 p185^erbB2결합 인자들은 정제, 클로닝 및 발현되었다(Benveniste et al.,PNAS 82: 3930-3934, 1985; Kimura et al.,Nature 348:257-260, 1990; Davis and Stroobant,J. Cell. Biol. 110:1353-1360, 1990; Wen et al.,Cell 69:559, 1992; Yarden and Ullrich,Ann. Rev. Biochem. 57:443, 1988; Holmes et al.,Science 256:1205, 1992; Dobashi et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8582, 1991; Lupu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 89:2287, 1992). 재조합 뉴레귤린은 말초 글리아(glia)에 대하여 유사분열촉진성인 것으로 밝혀졌고(Marchioni et al.,Nature362:313, 1993) 신경근 접합부(neuromuscular junction)의 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Falls et al.,Cell72:801, 1993). 따라서 신경원성 질병 및 신경 손상으로부터의 회복과 관련된 뉴론 및 염증성 세포의 재생은 운동뉴론의 재유수화(remyelination)와 운동뉴론의 그들의 표적과의 적당한 연결부를 형성하는 능력을 조정하는 인자들의 공급원을 제공한다. 근육이 재신경지배를 받게 된 후에 운동 뉴론은 근육에 인자들을 제공하여 근육의 성장 및 잔존을 촉진할 수 있다.

현재, 근육의 분화와 잔존을 촉진하는 유용한 치료조성물은 없다. 이러한 치료법은 여러가지 신경 및 근육 질병 및 장애를 치료하는데 유용할 것이다.

본 발명자들은 이하에서 글리아 성장인자(glial growth factors), 아세틸콜린 수용체 유도 활성(acetylcholine receptor inducing activity: ARIA), 헤레귤린, 뉴(neu) 분화인자, 및 더욱 일반적으로 뉴레귤린(neuregulins)이라고 칭하는 단백질을 이용함으로써 근세포의 유사분열촉진성 분화 및 잔존을 증가시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 우리는 이러한 화합물들이 근세포의 증식 및 근관(myotube)의 분화 및 잔존 모두를 유발할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 현상은 골격근 조직외에 심근 및 평활근 조직에서도 일어날 수 있다. 따라서, 상기 화합물들, 이들 화합물들의 합성을 유발할 수 있는 조절 화합물들, 및 근육상의 수용체에 결합함에 의해서 또는 기타의 수단에 의해 리간드-수용체 복합체에 의해 활성화된 제 2 메신져 시스템을 자극함으로써 이들 화합물들을 의태(mimic)한 소분자들은 모두 근육 질병의 예방 및 완치 치료제로 매우 유용하다.

본 발명의 신규한 양상은 근세포의 유사분열촉진, 잔존, 성장 및 분화를 유발하는 성장인자로서 상술한 단백직들을 이용하는 것을 포함한다. 이러한 효과를 수득하기 위한 근세포의 치료는 근세포를 본원에 기술된 폴리펩타이드와 접촉시킴으로써 이루어진다. 상기 치료는 순수한 근육 손실을 서행 또는 정지시키거나 척추동물에 존재하는 근육의 양 또는 질을 증가시키기 위해 제공될 수 있다.

이들 인자들은 척추동물에 유효량의 폴리펩타이드 또는 관련 화합물들을 투여함으로써 척추동물(바람직하게, 포유동물, 더욱 바람직하게는 사람)에서 근세포 유사분열촉진, 분화 및 잔존을 일으키도록 이용될 수 있다. 근육에 대한 뉴레귤린 효과는 예컨대, 미오신 H 사슬(Heavy chain) 느린 및 빠른 이소폼(isoform)과 같은 수축기관의 특정한 이소폼의 합성을 유발함으로써 근육성능을 향상시킴에 의하여; 디스트로핀(dystrophin)과 같지만 이에 한정되지 않는 보호 분자의 합성을 유발함으로써 근섬유의 잔존을 촉진함에 의하여; 및/또는 예를들어 신경근 접합부에서 아세틸콜린 수용체 분자를 증가시킴으로써 근육 신경지배를 향상시킴에 의해 일어날 수 있다.

본원에서 근세포(muscle cell)라는 용어는 근육 조직에 기여하는 모든 세포를 말한다. 근아세포, 부수세포, 근관, 또는 근원섬유 조직은 모두 '근세포'라는 용어에 포함되고, 모두 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있다. 근세포 효과는 골격근, 심근 및 평활근내에서 유도될 수 있다.

유사분열촉진은 골격근, 평활근 또는 심근의 근아세포 또는 부수세포를 포함하는 근세포내에서 유발될 수 있다. 본원에서 사용될 때 유사분열촉진이라는 용어는 환자에게서 새로운 근세포의 생성을 초래하는 모든 세포분열을 말한다. 보다 구체적으로, 시험관내 유사분열촉진은 세포들이 배가시간(doubling time)의 두 배와 같은 기간 동안에 표지제(labelling agent)에 노출될 때, 비처리세포에 비하여 유사분열지수(mitotic index)가 50%, 더욱 바람직하게 100%, 그리고 가장 바람직하게 300% 증가하는 것으로 정의된다. 상기 유사분열지수는 S 기(S phase) 동안에만 혼입되는 추적자(즉, BrdU)의 존재하에서 배양된 경우에 표지된 핵을 갖는 컬처내 세포의 분율이고, 배가시간은 컬처내 세포의 수가 2 배로 증가하는데 요구되는 평균시간으로 정의된다.

생체내(in vivo) 유사분열촉진에 대한 효과는 S 기(S phase) 동안에만 혼입되는 추적자(즉, BrdU)에 노출된 포유동물의 근육조직에 있는 표지된 부수세포의출현에 의해 측정할때 부수세포 활성화의 증가로 정의된다. 유용한 치료제는 생체내에서 포유동물이 15분을 초과하는 기간동안 표지제에 노출되고 치료 투여량의 유사분열촉진인자를 투여한후 10시간 과 24시간 사이에 조직들이 분석될 때, 대조군 포유동물에 비하여 적어도 10%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 및 가장 바람직하게 200% 이상까지 부수세포 활성화를 증가시키는 화합물로 정의된다. 대안으로, 생체내 부수세포 활성화는 면역학적 분석방법 또는 RNA 분석방법에 의해 중간 필라멘트 비멘틴의 출현을 모니터함으로써 검출할 수 있다. 비멘틴(vimentin)이 분석되는 경우에, 유용한 유사분열촉진인자는 치료유효량의 투여량이 공급될때 근육조직내에서의 비멘틴의 검출가능한 수준의 발현을 유발하는 것으로 정의된다.

본원에서 사용되는 경우에 근발생(myogenesis)은 근관을 만들어 내기 위한 근아세포의 모든 융합을 의미한다. 가장 바람직하게, 근발생에 대한 효과는 근아세포 융합의 증가 및 근육분화 프로그램의 가능화로 정의된다. 유용한 근발생 치료제는 시험관내에서 융합지수(fusion index)를 증가시키는 화합물로 정의된다. 더욱 바람직하게, 상기 화합물은 대조군에 비하여 융합지수를 적어도 2.0배 증가시키고, 그리고 가장 바람직하게는 3배 이상 증가시킨다. 융합지수는 컬처내에 존재하는 핵의 총수에 대한 컬처내 다핵세포에 존재하는 핵의 분율로 정의된다. 상기 백분율은 근발생 화합물에 6일간 노출된 후에 분석된 세포들에 대한 것이고, 비처리 대조군에 대한 상대치이다. 근발생은 근관의 단위면적당 핵의 수를 평가함에 의해서 또는 웨스턴 분석법(Western analiysis)에 의해 근육 특이성 단백질의 농도를 측정함에 의해서 평가될 수도 있다. 바람직하게, 상기 화합물은 예컨대본원에 개시된 분석방법을 이용할 때 근관밀도(density of myotubes)를 적어도 2.0배 증가시키고, 가장 바람직하게 상기 화합물은 3배 이상 근관밀도를 증가시킨다.

근육의 성장은 섬유크기(fiber size)의 증가에 의해 및/또는 섬유수의 증가에 의해 일어날 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에 근육의 성장은 A) 습윤중량(wet weight)의 증가, B) 단백질 함량의 증가, C) 근섬유 수의 증가, D) 근섬유 직경의 증가에 의해 측정될 수 있다. 근섬유 성장의 증가는 직경을 단면 타원체의 단축으로 정의할 때 직경의 증가로 정의될 수 있다. 유용한 치료제는 이전에 유사하게 처리된 대조군 동물(즉, 근육 성장 화합물로 처리되지 않은 퇴행된 근육조직을 갖는 동물)에 비해 적어도 10% 정도 근육이 퇴행된 동물에 있어서 습윤증량, 단백질 함량 및/또는 직경을 10% 이상, 더욱 바람직하게 50% 이상, 및 가장 바람직하게 100% 이상 증가시키는 것이다. 근섬유의 수를 증가시킴으로써 성장을 증가시키는 화합물은 그것이 질병에 걸린 조직에서 근섬유의 수를 적어도 1%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 50% 증가시킬 때 치료제로 유용하다. 이러한 백분율값은 화합물이 투여되어 국부적으로 작용하는 경우에 비처리되고 질병에 걸리지 않은 비교 포유동물에 있어서 또는 대측성인 병에 걸리지 않은 근육에 있어서의 기초수준에 대하여 상대적으로 결정된 것이다.

본원에서 사용되는 경우에 근섬유의 잔존(survival)은 괴사 또는 괴저에 의해 확인되는 근섬유 손실의 방지 또는 다른 메카니즘에 의한 근섬유 손실의 방지를 말한다. 본원에서 사용될 때, 잔존은 비처리 대조군에 비하여 적어도 10%의 세포 사멸율의 감소, 더욱 바람직하게 적어도 50% 의 감소, 및 가장 바람직하게 적어도300%의 감소를 가리킨다. 잔존율(rate of survival)은 세포들이 분화후 8일(즉, 배지를 20% 부터 0.5%까지의 혈청으로 교체한 뒤 8일 경과후)일 때 컬처내 죽은 세포에 대해 특이적인 염료(예컨대, 프로피디움 이오다이드)로 염색가능한 세포를 계수함으로써 측정될 수 있다. 본원에서 사용되는 경우에, 근육 재생은 근육 모세포로부터 새로운 근섬유가 형성되는 과정을 의미한다. 재생을 위한 유용한 치료제는 상술한 바와 같이 적어도 약 1%, 더욱 바람직하게 적어도 20%, 및 가장 바람직하게 적어도 50% 새로운 섬유(new fiber)의 수를 증가시킨다.

본원에서 사용되는 경우에, 근세포의 분화는 수축기관(미오피브릴)과 같은 근섬유의 성분들을 특정하는 근육 발생 프로그램(muscle developmental program)의 유도를 의미한다. 분화를 위한 유용한 치료제는 유사하게 처리된 대조군 동물에 있는 동등한 조직에 비하여, 질병에 걸린 조직에 있는 모든 근섬유 성분의 양을 약 10%이상, 더욱 바람직하게 50%이상, 및 가장 바람직하게 100%이상 증가시킨다.

본원에서 사용되는 경우에, 근육의 위축(atrophy)은 근섬유 둘레의 현저한 감소를 의미한다. 심각한 근육 위축은 질병에 걸리지 않고, 손상되지 않은 또는 정상적으로 사용되는 조직에 비하여 질병에 걸리고, 손상된 또는 쓰지 않는 근육조직의 근섬유 직경이 적어도 10% 감소하는 것을 의미한다.

본원에 개시된 폴리펩타이드 및 기타의 화합물들을 이용하여 질병 또는 장애를 치료하는 조성물도 본 발명의 일부이다. 치료될 수 있는 근육장애의 예로는 근장애, 영양장애, 근신경 전도성 질병, 외상성 근육손상, 및 신경 손상과 같은 골격근 질병 및 장애들을 포함한다. 심근장애, 허혈성 손상, 선천성 질병, 및 외상성 질병과 같은 심근 병변은 동맥경화증, 혈관병변 및 선천성 혈관질병과 같은 평활근 질병 또는 장애와 마찬가지로 본 발명에 의해 치료될 수 있다. 예를들어, 뒤시엔느형(Duchennes) 근육 디스트로피, 베커 디스트로피(Beckkers' dystrophy), 중증 근무력증(Myasthenia gravis)은 본 발명의 조성물을 이용하여 치료될 수 있는 세 가지 질병들이다.

본 발명은 또한 횡문근육종과 같은 근세포 기원 종양을 예방 및 치료하기 위한 조성물도 포함한다.

본 발명의 조성물은 신경영양성 인자(neurotrophic factor)의 결핍에 의해 유발되는 질병으로 고생하는 환자를 치료하는데에도 이용될 수 있다. 신경영양성 인자의 결핍이란 병에 걸리지 않은 개체에 비하여 신경영양성 인자의 양이 신경근 접속 및/또는 근육 강도를 검출가능한 정도로 감소시키기에 충분한 만큼 감소된 것을 의미한다. 신경영양성 인자는 병에 걸리지 않은 개체에서 측정된 것 보다 10% 적은 수준으로 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 인자는 병에 걸리지 않은 개체에서 보다 20% 낮은 수준으로 존재할 수 있고, 가장 바람직하게 상기 수준은 유사한 상황하에서 병에 걸리지 않은 개체에 비해 80% 까지 저하된다.

본 발명 조성물의 작용은 뉴레귤린 단백질들이 동일한 유전자에 의해 코드화된다는 사실을 이용한다. 여러가지 전령 RNA(mRNA) 접속 변이체들(splicing variants)(및 그들의 결과 단백질들)은 이 유전자로부터 유래되고 이들 산물들중 다수는 P185^ergB2에 결합하여 그것을 활성화시킨다. 이 유전자의 산물들은 근세포유사분열촉진활성(하기 실시예 1 및 2 참조), 분화(실시예 3 및 6), 및 잔존(실시예 4 및 5)을 증명하기 위해 이용되었다. 본 발명은 상술한 용도를 근세포 유사분열촉진인자, 분화인자, 및 잔존인자와 같은 활성을 갖는 모든 공지된 뉴레귤린 유전자(본원 및 위에서 열거된 참고자료에 기술된) 산물의 용도를 제공한다. 가장 바람직하게, 재조합 사람 GGF2 (rhGGF2)가 이들 조성물에 이용된다.

본 발명은 또한 아직 본래의 형태대로 분리되지 않은, 뉴레귤린의 다른 접속 변이체에의 용도에도 관계한다. 도 29는 공지된 접속 양상을 나타낸 것이다. 이러한 양상은 PCR(Polymerase Chain Reaction) 실험(역전사 RNA에 대한), cDNA 클론(본원에 제공된) 분석, 및 뉴레귤린을 코드화하는 공표된 서열의 분석(Peles et al., Cell69:205 (1992) 및 Wen et al., Cell69:559 (1992))에 의해 밝혀졌다. 이들 양상들은 물론 기타의 본원에 기술된 양상들은 존재하는 가능한 접속 변이체들을 나타낸다. 접속 변이체들은 Goodearl 등에 의해 1993년 3월 24일에 출원된 미국특허출원 08/036,555호에 상세하게 기술되어 있다(본원에 참고자료로 첨부).

더욱 상세하게, 근세포의 세포분열, 잔존, 분화 및 성장은 근세포를 하기 식으로 정의되는 폴리펩타이드와 접촉시키거나

WBAZCX

여기서 WBAZCX는 도 30(서열 132-143, 156, 157, 159, 169-178, 191-202 및 212-214)에 도시된 폴리펩타이드 분절로 구성되고; 여기기 W는 폴리펩타이드 분절 F를 포함하거나 부존재하고; 여기서 Z는 폴리펩타이드 분절 G를 포함하거나 부존재하고; 여기서 X는 폴리펩타이드 분절 C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL,C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL, 또는 C/D C/D' D' HKL를 포함하고 및/또는 근세포를 하기 식으로 표현되는 폴리펩타이드와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.

YBAZCX

여기서 YBAZCX는 도 30(서열 132-143, 156, 157, 159, 169-178, 191-202 및 212-214)에 도시된 폴리펩타이드 분절로 구성되고; 여기서 Y는 폴리펩타이드 분절 E를 포함하거나 부존재하고; 여기서 Z는 폴리펩타이드 분절 G를 포함하거나 부존재하고; 여기서 X는 폴리펩타이드 분절 C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL, 또는 C/D C/D' D' HKL을 포함한다.

일반적으로, 상술한 폴리펩타이드들의 N-말단은 F 또는 E 폴리펩타이드 분절 중 하나로 시작한다. F 폴리펩타이드가 존재하는 경우에 그것은 단백질의 성숙과정에서 절단되어 성숙 폴리펩타이드를 만들 수 있다. E 서열이 존재하는 경우에, N-말단 신호 서열인 처음 50 아미노산들이 폴리펩타이드에 존재하지 않을 수 있다.

더우기, 본 발명은 근세포에

―MDA-MB 231 사람 유방 세포주로부터 분리된 30kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―글리아세포에 대한 쥐 I-EJ 형질전환된 섬유아세포 세포주로부터 분리된35kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―SKBR-3 사람 유방 세포주로부터 분리된 75kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―쥐 I-EJ 형질전환된 섬유아세포 세포주로부터 분리된 44kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―활성화된 쥐 복막 마크로파지로부터 분리된 25kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―MDA-MB 231 사람 유방 세포로부터 분리된 45kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―글리아세포에 대한 ALT-2 사람 T-세포주로부터 분리된 7 내지 14kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―소의 신장세포로부터 분리된 25kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―뇌로부터 분리된 42kD ARIA 폴리펩타이드 인자 ; 0-2A 글리아 모세포를 자극하는 46-47kD 폴리펩타이드 인자 ; 또는

―43-45kD 폴리펩타이드 인자, GGFIII,175(1992년 8월 17일에 출원된 미국특허출원 제 07/931,041호, 본원에 참고자료로 첨부)를 포함하는 근세포 치료용 조성물도 포함한다.

본 발명은 각각 도 37 내지 도 42 및 서열 206 내지 211의 EGFL1, EGFL2, EGFL3, EGFL4, EGFL5, 및 EGFL6 폴리펩타이드를 포함하는 근세포 치료용 조성물도 추가로 포함한다.

근세포의 치료를 위해 도 44에 도시된 서열을 갖는 GGF2 폴리펩타이드를 포함하는 조성물도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 다른 중요한 양상은 아래의 폴리펩타이드를 포함하는 근세포 치료용 조성물이다:

(a) FCP (fetal calf plasma)의 존재시에 글리아 세포 유사분열촉진활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 분자량이 약 30kD 내지 약 36kD이며, 및 그의 아미노산 서열내에 하나 이상의 하기 펩타이드 서열을 포함하는 염기성 폴리펩타이드 인자:

F K G D A H T E (서열: 1)

A S L A D E Y E Y M X K (서열: 2)

T E T S S S G L X L K (서열: 3)

A S L A D E Y E Y M R K (서열: 7)

A G Y F A E X A R (서열: 11)

T T E M A S E Q G A (서열: 13)

A K E A L A A L K (서열: 14)

F V L Q A K K (서열: 15)

E T Q P D P G Q I L K K V P M V I G A Y T (서열: 165)

E Y K C L K F K W F K K A T V M (서열: 17)

E X K F Y V P (서열: 19)

K L E F L X A K; 및 (서열 32)

⒝ FCP (fetal calf plasma)의 존재시에 글리아 세포 유사분열촉진을 자극하는 것으로 알려져 있고, 분자량이 약 55kD 내지 약 63kD이며, 및 그의 아미노산 서열내에 하나 이상의 하기 펩타이드 서열을 포함하는 근세포 치료용 염기성 폴리펩타이드 인자:

V H Q V W A A K (서열: 33)

Y I F F M E P E A X S S G (서열: 34)

L G A W G P P A F P V X Y (서열: 35)

W F V V I E G K (서열: 36)

A S P V S V G S V Q E L Q R (서열: 37)

V C L L T V A A L P P T (서열: 38)

K V H Q V W A A K (서열: 48)

K A S L A D S G E Y M X K (서열: 49)

D L L L X V (서열: 39)

소분자량 폴리펩타이드 인자 및 고분자량 폴리펩타이드 인자로부터 유래된 상술한 펩타이드 서열의 이용방법들도 본 발명의 양상이다. 상기 펩타이드에 대한 단클론성 항체들도 그 자체로 유용한 조사수단 및 치료제이다.

따라서, 본 발명은 근세포 치료에 유용한 활성을 갖고 아래의 DNA 서열에 의해 코드화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물도 포괄한다:

⒜ 각각 서열 129-131에 해당하는, 도 27A, 도 27B 도 27C 중 어느 하나에 도시된 DNA 서열;

⒝ 서열 85에 해당하는, 도 21에 도시된 DNA 서열;

⒞ 도 27A(서열 129에 해당)에 도시된 서열의 뉴클레오티드 281-557로 표현되는 DNA 서열; 또는

⒟ 전술한 ⒜, ⒝, 또는 ⒞에 의한 DNA 서열 중 어느 하나에 혼성화될 수 있는 DNA 서열.

하기 인자들은 근세포 유사분열촉진인자들이다:

(a) 소의 뇌하수체 재료로부터 수득되는 경우에, 환원조건에서 또는 그렇지 않은 조건에서 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 측정된 분자량이 약 30kD 내지 약 36kD이고, 근아세포의 분열을 자극하는 것을 포함하는 근세포 유사분열촉진활성을 가지며, 역상 HPLC에 의해 분리된 경우 4℃에서 0.1% 트리플루오르아세트산내에서 10주간 항온배양된 후에 상기 활성의 적어도 50%를 보유하는 염기성 폴리펩타이드 인자; 및

(b) 소의 뇌하수체 재료로부터 수득되는 경우에, 비환원조건하에서 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 측정된 분자량이 약 55kD 내지 약 63kD이고, 인자의 사람 균등물은 DNA 클론 GGF2HBS5에 의해 코드화되고, 근세포 유사분열촉진활성을 가지며, 역상 HPLC에 의해 분리된 경우 4℃에서 0.1% 트리플루오르아세트산내에서 4일간 항온배양된 후에 상기 활성의 적어도 50%를 보유하는 염기성 폴리펩타이드 인자.

따라서, 본 발명의 다른 중요한 양상은 아래 인자들의 용도이다:

(a) 근세포의 분열을 자극하는 것을 포함하는 세포 유사분열촉진활성을 갖는 일군의 사람 및 소 폴리펩타이드 인자. 이들 펩타이드 서열들은 각각 제 30, 31,32 및 33도, 서열 132-133에 나타내었다.

(b) 근세포의 분열을 자극하는 것을 포함하는 세포 유사분열촉진활성을 갖고, Lupu 등, Science249: 1552 (1990); Lupu등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 2287(1992); Holmes 등, Science256: 1205(1992); Peles 등.69: 205(1992); Yarden 및 Peles Biochemistry30: 3543(1991); Dobashi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8582(1991); Davis 등. Biochem. Biophys. Res. Commun.179: 1536(1991); Beaumont 등. 특허출원 PCT/US91/03443(1990); Bottenstein, 미국특허 제5,276,145호(1994. 4.1 특허허여); 및 Greene 등, 특허출원 PCT/US91/02331호(1990)에 의해 개괄된 방법에 따라 정제 및 특성화된 일군의 폴리펩타이드 인자.

(c) 근세포의 분열을 자극하는 것을 포함하는 글리아 세포 유사분열촉진활성을 갖는 폴리펩타이드 인자(GGFBPP5). 아미노산 서열은 도 31, 서열 144에 나타내었다.

근세포 치료는 발현가능한 유전적 구조물내에 있는 상술한 폴리펩타이드 화합물을 코드화하는 DNA를 투여하는 것에 의해서도 달성될 수 있다. 상기 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA는 DNA를 세포내로 배송하는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 환자에게 투여될 수 있다. 예를들어, 레트로바이러스 벡터, 일렉트로포레이션, 리포좀이 DNA를 배송하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 자연적인 공급원(조직 또는 세포주)으로부터 분리된 형태의 또는 재조합 수단에 의해 제조된 형태의 상기 단백질 군의 용도를 포함한다.

p185^erbB2수용체에 특이적으로 결합하는 다른 화합물들, 특히 펩타이드도 본 발명에 따라 근세포 유사분열촉진인자로서 이용될 수 있다. 후보 화합물들은 통상적으로 p185^erbB2결합에 대해 검색될 수 있고, 만약 결합한다면, 이어서 본원에 기술된 방법을 이용하여 글리아 세포 유사분열촉진활성에 대해 검색될 수 있다.

본 발명은 현저하게 감소된 활성을 시현하지 않는 상기 폴리펩타이드 인자들의 변형물 또는 균등물의 이용도 포함한다. 예컨대, 활성에 심각한 악영향을 미치는 일 없이 아미노산 조성 또는 서열이 변화된 변형물들도 본 발명에 포함된다. 따라서 본원에 포함된 효과 및 용도의 기술은 본 발명의 일부인 변형된 또는 균등한 인자들의 이용 효과 및 용도를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

위에서 기술되고 도 30, 31도, 32도 및 33도에 도시된 사람 펩타이드 서열(각각 서열 132-146)들은 자연 공급원(적당한 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리)으로부터 총길이 상보성 DNAs(cDNAs)로서 분리될 수 있거나 당업자에 의해 개개의 엑손(예컨대, 상이한 엑손으로 유래된)에 의해 DNA 구조물로 조립될 수 있는 일군의 접속 변이체(splicing variants)를 나타내는 것이다.

본 발명은 또한 근세포를 치료하는, 즉 유효량의 상술한 폴리펩타이드를 투여함으로써 근육의 유사분열촉진, 근발생, 분화 또는 잔존을 유발하는 약물의 제조방법도 포함한다. 이러한 약제는 상기 폴리펩타이드를 제약학상 유용한 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 선택적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와함께 및/또는 단위조제형태로 각각 제약학 또는 수의학 용도로 제형화된 상술한 인자들중의 어느 하나를 포함하는 제약학 또는 수의학 제형의 용도이다. 본 발명의 인자들을 사용함에 있어서, 적합한 제형 또는 조성물을 제공하기 위해 종래의 제약학 및 수의학 실무가 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 일부로 이용되는 제형들은 정맥내, 피하, 근육내, 안와내, 안, 심실내, 두개내, 피막내, 척수내, 소뇌연수조내, 복강내, 극소부에, 비강내, 연무법, 난자법과 같은 일례의 비경구 투여, 및 경구, 구강, 직장 또는 질 투여에 적용될 수 있다.

본 발명의 제형은 환자에게 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 발현하는 숙주세포를 이식하거나 본 발명의 제형을 방출하는 외과적 삽입물을 이용함으로써 투여될 수도 있다.

비경구용 제형은 액상 용액 또는 현탁액 형태일 수 있고; 경구투여용 제형은 정제 또는 캡슐 형태일 수 있으며; 비강내 투여용 제형은 분말, 비강 적제(nasal drop) 또는 에어로졸 형태일 수 있다.

당업계에 주지되어 있는 제형 제조방법은 예컨대, 'Remington's Pharmaceutical Science'에 기술되어 있다. 비경구투여용 제형들은 예컨대, 부형제로서 멸균수 또는 염수를 포함할 수 있고, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물로부터 채취한 오일을 포함하고, 또는 수소첨가 나프탈렌, 생체적합성, 생물분해성 락티드 폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체들은 본 발명 인자들의 방출을 조절하는데 이용될 수 있다. 인자에 대한 다른 이용가능한 비경구적 배송 시스템은 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입용 제형은 부형제로서 예컨대, 락토오즈를 포함할 수 있고, 또는 예컨대, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 디옥시콜레이트를 포함하는 수용액일 수 있고 또는 비강 적제 형태로 투여하기 위한 유성 용액 또는 비강내에 투여되는 겔 형태일 수 있다. 비경구투여용 제형들은 또한 구강투여용 글리코콜레이트, 직장투여용 메톡시살리실레이트, 또는 질투여용 시트르산을 포함할 수도 있다.

본 발명의 인자들은 단독으로 활성제로 사용되거나 다른 활성성분들, 예컨대, 신경계 질병에서 신경원세포 잔존을 촉진할 수 있는 다른 성장인자들 또는 펩티다아제 또는 프로테아제 저해제와 함께 이용될 수도 있다.

본 발명 제형내에서 본 발명 인자의 농도는 투여되어야 하는 용량 및 투여경로를 포함하는 다수의 요소에 의존하여 변화될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 상기 인자들은 비경구투여를 위해 약 0.1%-10% w/v의 화합물을 포함하는 생리적 완충수용액으로 제공될 수 있다. 일반적인 투여량 범위는 매일 단위체중당(㎏) 약 1㎎/㎏ 내지 약 1g/㎏이고; 바람직한 투여량 범위는 매일 단위체중당 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏이다. 투여되어야 하는 바람직한 투여량은 투여 대상의 병태생리 상태 호전의 유형 및 정도, 환자의 전체적인 건강, 제형의 구성 및 투여경로에 의존한다.

본 발명의 폴리펩타이드 인자들은 아래의 표준적인 기술에 따라 단클론성 항체와 같은 항체를 만들기 위한 면역항원으로 이용될 수도 있다. 이들 항체들은이어서 치료 또는 진단을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 인자들의 비정상적인 수준으로부터 결과되는 근육질병과 관련된 상태들은 아마도 이러한 항체들을 이용해서 추적해낼 수 있을 것이다.시험관내기술들이 표준방법을 이용하여 분리된 시료에 대해 분석할 때 이용될 수 있다. 예를들어, 항체들이 종양 영상법 분야의 기술을 이용하여 체외에서 영상화될 수 있는 방사성 동위원소로 표지되는 영상법(IMAGING METHOD)도 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 일반적인 양상은 바람직하게 근육 질병 또는 장애를 치료하는 약물의 제조에 본 발명의 인자를 이용하는 것이다. 'GGF2'라는 호칭은 GGF-Ⅱ 단백질(즉, GGF2HBS5, GGF2BPP3)로부터 유래된 펩타이드 서열 데이타에 의해 이전에 분리된 모든 클론에 대해서 사용되고, 단독으로 존재하는 경우에(즉, GGF2 또는 rhGGF2), GGF-Ⅱ 단백질(즉, 플라스미드 HBS5로부터 곤충세포내에서 생산된 것)로부터 유래된 펩타이드 서열 데이타에 의해 분리된 플라스미드에 의해 코드화된 재조합 사람 단백질을 나타내기 위해 사용된다. GGFHBS5 클론으로부터의 재조합 사람 GGF는 GGF2, rhGGF2 및 GGF2HBS5 폴리펩타이드라 한다.

본원에서 사용되는 경우에, 치료란 근세포 유사분열촉진, 잔존, 및/또는 분화를 증가시키기 위한 목적 및/또는 근세포 위축 및 퇴행을 감소시키기 위한 목적으로 본원에 개시된 화합물을 투여하는 것을 의미한다. 가장 바람직하게, 치료란 근세포 질병 또는 장애의 증후 및 진전을 감소시키거나 완화하기 위한 것이다. 본원에서 사용되는 경우에, 치료란 건강한 개체에 있는 근세포를 증가시키거나 변화시키기 위해 화합물을 투여하는 것도 포함한다. 치료는 본원에 개시된 화합물에 대하여 감수성이고 반응성인 근세포를 유효량의 상술한 화합물들과 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 화합물들의 저해제들도 또한 근세포 증식 질병을 정지시키거나 서행시키는데 이용될 수도 있다.

도 1는 rhGGF2의 근아세포 유사분열촉진유발 분석 결과를 도시한 그래프이다;

도 2는 근관에 있는 핵의 수에 대한 rhGGF2의 효과를 도시한 그래프이다;

도 3는 분화된 근관의 잔존에 대한 rhGGF2의 효과를 도시한 잔존분석 그래프이다;

도 4는 사람 혈소판 유래 성장인자, 사람 섬유아세포 성장인자, 사람 표피 성장인자, 사람 백혈구 저해인자, 및 사람 인슐린-유사 성장인자 Ⅰ 및 Ⅱ와 비교한 분화된 근관의 잔존에 대한 rhGGF2의 효과를 도시한 잔존분석 그래프이다;

도 5는 rhGGF2 존재시 두첸스(Duchenne) 근육 디스프로피 세포의 생존 증가를 나타낸 그래프이다;

도 6는 AchR 델타 서브유니트 전사조절 요소의 조절하에서의 hGH 리포터 유전자로부터 C2 세포내 사람 성장 호르몬(hGH) 발현의 증가를 나타낸 그래프이다. 이러한 증가는 배지내 GGF2의 첨가에 의존한다.

도 7는 증가된 양의 GGF2를 C2 세포에 첨가한 후의 hGH 리포터 합성 및AchRs에 대한 붕가로톡신(bungarotoxin:BTX) 결합의 증가를 나타낸 그래프이다;

도 8, 9도, 10도 및 11도는 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ, 서열 1-20, 22-29, 32-50 및 165로부터 유래된 펩타이드 서열이다(이하의 실시예 11-13 참조);

도 9, 패널 A는 퇴행성(deqenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브 및 퇴행성 PCR 프라이머를 설계하는데 이용된 GGF-Ⅰ 펩타이드의 서열을 열거한 것이다(서열 1, 17, 및 22-29). 패널 A에 있는 서열 중의 일부는 합성 펩타이드 설계에도 이용되었다. 패널 B는 변성 프로브 및 변성 PCR 프라이머를 설계하는데 이용하기에 너무 짧은(6 아미노산 미만) 신규한 펩타이드 서열을 나타낸 것이다(서열 17 및 32);

도 11, 패널 A는 변성 올리고뉴클레오티드 프로브 및 변성 PCR 프라이머를 설계하는데 이용된 GGF-Ⅱ 펩타이드 서열을 열거한 것이다(서열 42-49). 패널 A에 있는 서열 중의 일부는 합성 펩타이드 설계에도 이용되었다. 패널 B는 변성 프로브 및 변성 PCR 프라이머를 설계하는데 이용하기에 너무 짧은(6 아미노산 미만) 신규한 펩타이드를 나타낸 것이다(서열 50);

도 12, 13도A, 13도B, 14도, 15도, 16도, 17도, 18도 및 19도는 이하의 실시예 8에 관련된 것으로, 본 발명의 인자들의 유사분열촉진활성을 서술한 것이다.

도 20, 21도, 22도, 23도, 24도, 25도, 26도 및 27도는 실시예 10에 관련된 것으로, 간단히 설명하면 다음과 같다;

도 20는 도 7, 패널 A 및 도 9, 패널 A에 열거된 신규한 펩타이드 서열들로부터 설계된 변성 올리고뉴클레오티드 프로브(서열 51-84)를 열거한 것이다;

도 21(서열 85 및 187)는 변성 올리고뉴클레오티드 프로브 609 및 650의 결합부위를 포함하는 재조합 소 지놈성 파아지 GGF2BG1로부터의 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자 서열을 전개 도시한 것이다(도 18, 서열 66 및 69를 각각 참고). 도시된 것은 제 3 해독틀에 있는 DNA 서열의 암호가닥(coding strand) 및 추론된 아미노산 서열이다. 인자 2로부터의 펩타이드 12의 서열(굵은 체)은 66 아미노산 개방 해독틀(뉴클레오티드 75272)의 일부이다;

도 22는 뇌하수체 전엽으로부터의 RNA에 존재하는 소 GGF-Ⅱ 암호서열의 분절을 분리하는 실험에 이용된 변성 PCR 프라이머(패널 A, 서열 86-104) 및 유일(unique) PCR 프라이머(패널 B, 서열 105-115)를 열거한 것이다;

도 23는 PCR 증폭 실험에 의해 수득된 9 가지의 서로 상이한 인접한 소 GGF-Ⅱ cDNA 구조물 및 서열을 도시한 것이다. 도면의 최상단 선은 특성화된 cDNA구조에 기여하는 암호서열의 구성을 나타낸 것이다 ;

도 24는 소 재조합 파아지 GGF2BG1의 물리적 지도이다. 상기 소 DNA 분획은 대략 길이가 20kb 정도이고 소 GGFⅡ 유전자의 두 개의 엑손(굵은 체)을 포함한다. 효소 Xbal, SpeⅠ, Ndel, EcoRⅠ, Kpnl, 및 SstⅠ에 대한 제한부위가 이 물리지도상에 배치되었다. 빗금 친 부분은 서열분석을 위해 2차클로닝된 분획이다;

도 25는 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자의 3 가지의 선택적인 유전자 산물의 구조의 개략도이다. 엑손들은 그들의 발견 순서대로 A에서부터 E로 열거되었다. 선택적인 접속 양식 1, 2 및 3은 3 개의 서로 중첩되는 추론된 단백질 구조(GGF2BPP 1, 2 및 3)를 생성하는데, 이들은 도 27A, 도 27B, 도 27C에 나타내었다(이하에서 설명);

도 26(서열 116-128)는 도 27A, 27도B, 및 27도C에 도시된 추론된 단백질 서열중에서 동정된 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ 서열과 도 9 및 도 11에 열거된 신규한 펩타이드 서열을 비교도시한 것이다. 상기 도면은 신규한 9 개의 GGF-Ⅱ 펩타이드 서열중에서 6 개는 이들 추론된 단백질 서열로 설명이 됨을 보여준다. GGF-Ⅰ과 유사한 두 개의 펩타이드 서열들도 발견되었다;

도 27A (서열 129 및 188)는 도 25에 도시된 접속 양식 1번으로부터 수득된 cDNA의 암호가닥 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자의 이러한 일부 cDNA는 206 아미노산 길이의 단백질을 코드화한다. 굵은 선으로 표기한 펩타이드는 도 10 및 제12도에 제시된 목록으로부터 동정된 것들이다. 포도당화 가능 부위와 폴리아데닐화 신호 AATAAA는 밑줄을 그어 표현하였다;

도 27B (서열 130 및 189)는 도 25에 도시된 접속 양식 2번으로부터 수축된 cDNA의 암호가닥 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 추정 GGF-Ⅱ 유전자의 이러한 일부 cDNA는 281 아미노산 길이의 단백질을 코드화한다. 굵은 선으로 표기한 펩타이드는 도 7 및 제9도에 제시된 목록으로부터 동정된 것들이다. 포도당화(glycosylation) 가능 부위와 폴리아데닐화 신호 AATAAA는 밑줄을 그어 표현하였다;

도 27C (서열 131 및 190)는 도 25에 도시된 접속 양식 3번으로부터 수득된 cDNA의 암호가닥 DNA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 도시한 것이다. 추정 소GGF-Ⅱ 유전자의 이러한 일부 cDNA는 257 아미노산 길이의 단백질을 코드화한다. 굵은 선으로 표기한 펩타이드는 도 9 및 도 11에 제시된 목록으로부터 동정된 것들이다. 포도당화 가능 부위와 폴리아데닐화 신호 AATAAA는 밑줄을 그어 표현하였다;

제28도는 후술하는 실시예 16에 관련된 것으로, 서던 블롯상의 다양한 포유류 DNA에 대한 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자의 교차 혼성화분석의 자동방사능사진을 나타낸 것이다. 필터는 도면에 열거된 종으로부터의 EcoRI-절단 DNA(5㎍/레인)의 레인들을 포함한다. 프로브는 각 DNA 샘플중에서 도 24에 도시된 물리적 지도로부터 예상되는 바와같이 소 DAN내에 4 kb 분획을 포함하는 하나의 강한 밴드를 검출한다. 상대적으로 약한 강도의 밴드들도 관찰되는데, 이들은 관련된 DNA 서열을 나타낼 것이다. 개개의 서로 다른 포유동물 DNA 시료로부터의 강한 혼성화 밴드는 아마도 이들 종들의 GGF-Ⅱ 유사체를 나타낼 것이다.

도 29는 대표적인 접속 변이체의 개략도이다. 암호분절들은 F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', H, K, 및 L로 표시하였다. 정제된 단백질로부터 유래된 펩타이드 서열들의 위치는 'o'로 표시하였다.

도 30(서열 132-143, 156, 157, 159, 169-178, 191-202, 및 212-214)는 GGF 암호분절의 DNA 서열 및 예상된 펩타이드 서열의 리스트이다. 라인 1은 소 GGF의 예상된 아미노산 서열이고, 라인 2는 소 GGF의 뉴클레오티드 서열이며, 라인 3은 사람 GGF의 뉴트클레오티드 서열(헤레귤린)(뉴클레오티드 염기 매치는 세로선으로 나타내었다)이고, 라인 4는 예상된 소의 서열과 상이한 사람 GGF/헤레귤린의 예상된 아미노산 서열 리스트이다. 암호분절 E, A' 및 K는 소의 서열만을 나타낸다. 암호분절 D'는 사람(헤레귤린) 서열만을 나타낸다.

도 31(서열 144 및 203)는 BPP5의 예상된 GGF2 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이다. 상단은 뉴클레오티드 서열이고, 하단은 예상된 아미노산 서열이다.

도 32(서열 145 및 204)는 GGF2BPP2의 예상된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이다. 상단은 뉴클레오티드 서열이고, 하단은 예상된 아미노산 서열이다.

도 33(서열 146 및 205)는 GGF2BPP4의 예상된 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열이다. 상단은 뉴클레오티드 서열이고, 하단은 예상된 아미노산 서열이다.

도 34(서열 147-149)는 두 가지의 GGF 펩타이드 서열(GGF2BPP4 및 GGF2BPP5)과 사람 EGF(hEGF) 펩타이드 서열을 나란히 정렬하여 도시한 것이다. *는 보존된 시스테인의 위치를 나타낸다.

도 35는 GGF의 양의 증가에 따른 GGF 활성의 수준(쉬반세포 유사분열 촉진성 분석) 및 약 200kD 단백질의 티로신 인산화 수준(항인산화티로신 다클론성 항체에 의해 발생된 웨스턴 블롯의 자동방사능사진의 200kD 밴드의 강도)을 도시한 것이다.

도 36는 도 30에 도시된 서열로부터 유래된 접속 변이체의 리스트이다.

도 37는 EGFL1의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 150 및 206).

도 38는 EGFL2의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 151 및 207).

도 39는 EGFL3의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 152 및 208).

도 40는 EGFL4의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 153 및 209).

도 41는 EGFL5의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 154 및 210).

도 42는 EGFL6의 서열로, 상단은 핵산서열이고 하단은 예상된 아미노산 서열이다(서열 155 및 211).

도 43는 클론의 암호분절 지도이다. T3은 클론으로부터 mRNA를 만들기 위해 사용된 박테리오파아지 프로모터이다. R은 측면에 위치하는 EcoRⅠ 제한 효소부위이다. 5' UT는 5' 비해독 부위를 나타낸다. E, B, A, C, C/D' 및 D는 암호분절을 의미한다. o는 해독개시 부위이고, Λ는 소 E 분절과 상동성이 있는 부위의 5' 경계(실시예 17 참고)이고 3' UT는 3' 비해독 부위를 의미한다.

도 44는 GGF2HBS5의 예상된 아미노산 서열(중간) 및 핵산 서열(상단)이다(서열 21 및 186). 기부 중간 서열은 GGF-Ⅱ 조제로부터 유래된 펩타이드 서열을 나타낸다(도 8 및 도 9 참고).

도 45A는 분획별 양이온교환컬럼에 의한 rGGF의 정제를 도시한 그래프이다; 도 45B는 상기 도 45A에 기술된 분획 및 GGF-Ⅱ 특이성 항체를 이용한 웨스턴 블롯의 사진이다.

도 46는 GGFHBS5, GGFHFB1, 및 GGFBPP5 폴리펩타이드의 서열(서열: 166, 167 및 168)이다.

도 47는 플라스미드 pcDHRFpolyA의 지도이다.

본 발명은 분리 및 정제된 뉴레귤린 인자 및 이들 인자들을 코드화하는 DNA서열, 이들 인자들의 근육외 농도를 증가시키는 조절 화합물, 및 이들 인자들과 유사한 화합물을생체내및시험관내에서 근세포의 근세포 유사분열촉진, 분화, 및 생존을 유발하기 위해 이용하는 방법에 관계한다.

GGF/p185^erbB2결합 뉴레귤린 단백질을 코드화하는 유전자가 일군의 단백질을 발생시키는 다수의 다양한 크기를 갖는 서로 상이하게 접속된 RNA 전사체들을 만들어낸다는 것은 분명한 사실이다. 이들 단백직들은 길이가 서로 상이하고, 일부의 공통 펩타이드 서열 및 일부의 유일(unigue) 펩타이드 서열을 포함한다. 이들 인자들이 하나의 유전자에 의해 코드화된다는 결론은 소의 뇌하수체 전엽 및 사람 유방암세포(MDA-MB-231)로부터 회수할 수 있는 서로 상이하게 접속된 RNA 서열에 의해 뒷받침된다. 이러한 결론에 대한 추가의 증거는 근조직에 대한 유사분열촉진인자로 기능하고 p185^erbB2수용체에 대한 리간드로도 기능하는 단백질의 크기의 범위로부터 찾을 수 있다(이하 참조).

GGF/p185^erbB2결합 단백질을 코드화하는 유전자들이 서로 상동성이라는 사실을 뒷받침해 주는 다른 증거는 뉴클레오티드 서열 비교에 의해 수득된다. Holmes 등(Science256: 1205-1210, 1992)은 수용체 단백질 p185^erbB2과 특이적으로 상호작용하는 45kD 사람 단백질(헤레귤린-α)의 정제를 증명하였다. Peles 등(Cell69: 205, (1992)) 및 Wen 등(Cell69: 559, (1992))은 'neu 분화인자(NDF)'로 불리우는 단백질을 코드화하는 쥐 세포로부터 분리된 상보성 DNA를 기술하고 있다. 상기 NDF cDNA의 해독 산물은 p185^erbB2결합 활성을 갖는다. 몇몇 다른 그룹들은 p185^erbB2결합 활성을 갖는 다양한 분자량의 단백질들의 정제를 보고하였다. 이러한 그룹들은 Lupu 등 ((1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2287); Yarden 및 Peles ((1991) Biochem. 30: 3543); Lupu 등((1990) Science 249: 1552); 및 Dobashi 등 ((1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1536) 및 Huang 등((1992) J. Biol. Chem. 257:l1508-11512)을 포함한다.

본 발명자들은 p185^erbB2수용체 결합 단백질들이 근세포 유사분열촉진을 촉진하여 근관 형성(근발생)을 촉진한다는 것을 발견하였다. 이러한 자극에 의해 근아세포의 형성이 증가되고 근관의 형성(근발생)이 증가한다. 본원에 기술된 화합물들은 또한 향상된 근육성장, 근세포의 분화 및 잔존을 자극한다. 이러한 리간드들은 GGF'S, 뉴레귤린, 헤레귤린, NDF, 및 ARIA를 포함하나 이들에 국한되는 것은 아니다. 이러한 유사분열촉진활성의 결과로, 이들 단백질들, 이들 단백질들을 코드화하는 DNA, 및 관련 화합물들은 근육조직의 외상성 손상 또는 질병으로 고생하는 환자에게 투여될 수 있다. 유사분열촉진을 위해서 제공되는 모든 방법들은 근발생을 위해서도 유용하다. 이들 리간드들의 저해제(항체 및 펩타이드 분획과 같은)들은 근육 유래성의 종양치료를 위해 투여될 수 있을 것이다.

이들 화합물들은 본원에 기술(실시예 9-17)되고 Holmes 등,Science 256: 1205(1992); Peles 등,Cell 69: 205(1992); Wen 등,Cell 69: 559(1992); Lupu등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA89: 2287(1992); Yarden 및 Peles,Biochemistry 30: 3543(1991); Lupu 등,Science 249: 1552 (1990); Dobashi 등,Biochem.Biophys. Res. Comm.179: 1536(1991); Huang 등,J. Biol. Chem.257:l1508-11512(1992); Marchionni 등, Nature 362:313, (1993); 및 GGF-Ⅲ 특허(모두 본원에 참고자료로 첨부된다)에 기술된 프로토콜을 이용하여 수득될 수 있다. 이들 화합물들중 다수에 대하여 그 서열 및 특성이 밝혀져 있다. 서열에 대해서는 도 8-11도, 20-27C, 29-34, 36-44 및 46도 참조. 단백질의 특성에 대해서는 제 12-19, 28 35, 45A 및 45B도 참조.

화합물들은 이하에서 기술될 방법을 이용하여시험관내에서 그들의 유용성에 대해서 분석될 수 있다.생체내시험은 실시예 1 및 Sklar 등, In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A:433-434, 1991에 기술된 대로 수행될 수 있다.

기타의 실시양태

본 발명은 근육의 유사분열촉진을 유발하기 위해서 다른 자연발생의 GGF 폴리펩타이드는 물론 도 30의 암호분절(서열 132-143, 156, 157, 159, 169-178, 191-202 및 212-214)과 실질상 상동성인 임의의 단백질의 이용방법을 포함한다. 또한 본 발명은 대립형질 변이체, 자연 돌여변이체, 유도 돌연변이체; 자연발생 핵산에 대한 높거나 낮은 엄격성(stringency)(높고 낮은 엄격성의 정의는 Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1 - 6.3.6. 참고, 본원에 참고자료로 첨부된다) 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코드화되는 단백질들의 이용; 및 GGF 폴리펩타이드에 대한 항혈청에 의해 특이적으로 결합되는 폴리펩타이드 또는 단백질들의 이용을 포함한다. 상기 용어는 근육의 유사분열촉진 유발을 위해 도 28의 서열을 함유하는 GGF 폴리펩타이드를 포함하는 키메라성 폴리펩타이드를 이용하는 것도 포함한다.

이하의 실시예 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인자들은 넓은 범위의 세포 유형에 대해 유사분열촉진활성을 시현한다. 위의 제형 및/또는 약물 및 그들의 제조와 관련된 본 발명의 개괄적인 설명은 명백하게 적당한 산물 및 용도를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하에서 본원에 기술된 특허청구범위를 더욱 더 뒷받침해 줄 수 있는 일군의 실험들이 기술된다. 본 발명과 관련된 이하의 실시예들은 본 발명 또는 현재 알려져 있거나 후에 개발될 본 발명의 이러한 변형물을 구체적으로 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예들은 재조합 사람 GGF2(rhGGF2)가 1차 사람 근육 컬처에 몇가지 효과를 부여한다는 우리의 발견을 예증해 준다. rhGGF2는 근육 컬처에 대한 세 가지의 독립적인 생물활성 분석에서 현저한 효과를 갖는다. 상기 폴리펩타이드는 아융합성 무활동 근아세포의 증식에 의해 측정할 때 유사분열촉진을 증가시키고, 성장인자의 존재하에서 융합성 근아세포에 의한 분화를 증가시키며, 염료 배출의 손실로 측정할 때 분화된 근관의 생존을 증가시키고 아세틸콜린 수용체 합성을 증가시킨다. 이러한 활성들은 근육 치료, 재생 및 근육 퇴행에 대한 예방적 효과 유발에 대한 GGF2 및 기타의 뉴레귤린들의 효능을 나타내준다.

실시예 1

근아세포에 대한 rhGGF의 유사분열촉진 활성

하기 실시예 14에 기술된 대로 클론 GGF2HBS5를 재조합 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포에서 발현시켜, 그 결과로서 수득된 재조합 사람 GGF2를 컬처(40㎕/㎖로 조정배지가 첨가된)내 근아세포에 첨가하였다. 근아세포(057A 세포들)들을 24웰 디쉬에서 전융합(preconfluence)되도록 배양하였다. 배지를 제거하고 40㎕/㎖ 농도로 GGF2 조정배지를 포함하거나 포함하지 않고 0.5%의 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM으로 교환하였다. 2일 경과후 배지를 교환하고 5일 경과 후 세포를 고정하여 염색하였다. 근아세포내 핵의 수로 총 핵수를 계수하였다(표 1).

처리	총 핵수/㎟	근관내 핵	융합 지수
대조군	395 ± 28.3	204 ±9.19	0.515 ± 0.01
GGF 40㎕/㎖	636 ± 8.5	381 ± 82.7	0.591 ± 0.15

GGF 처리된 근아세포(636 핵)는 비처리된 대조군(395 핵)에 비하여 증가된 총 핵수를 나타내 유사분열촉진활성이 있음을 나타내준다. rhGGF2 처리된 근관은 비처리 대조군(204 핵)에 비하여 대단히 많은 수의 핵(381 핵)을 갖는다. 따라서, rhGGF2는 증식 및 세포 잔존 증가에 의해 핵의 총수를 증가시킨다. rhGGF2는 또한 근관의 형성을 향상시킬 것이다.

rhGGF2의 유사분열촉진활성은 생체내에서 삼투 미니 펌프에 의해 쥐 근육에 GGF2 및 [³H]티미딘을 계속적으로 공급함으로써 측정될 수 있다. 근육 용적은 1주 내지 2주간 처리한 후의 습윤중량에 의해 측정된다. DNA 복제는 비처리 및 rhGGF2-처리된 근육에서 자동방사능사진(Sklar et al., In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A: 433-434, 1991)을 위해 코팅한 후의 섹션에 있는 표지된 핵의 수를 계수함으로써 측정될 수 있다. 신경제거된 근육도 쥐 동물 모델내에서 상기 방법에 의해 조사하였는데, 이러한 방법은 근육 위축 및 치료에 있어서의 rhGGF2의 역할을 평가할 수 있도록 해준다. 평균 섬유 직경도 근위축의 예방에 대한 FGF의 효과를 사정하는데 이용될 수 있다.

실시예 2

근세포 유사분열촉진유발에 대한 rhGGF2의 효과

무활동 1차 클론성 사람 근아세포를 전술한 대로 준비하였다(Sklar R., Hudson, A., Brown, R.,In Vitro Cellular and Developmental Biology1991; 27A:433-434). 무활동 세포를 10μM BrdU, 0.5% FCS가 함유된 DMEM의 존재하에서 표기된 약제(rhGGF2 조정배지, 메틸프레드니솔론을 포함하거나 포함하지 않는 PDGF, 및 대조군 배지)로 처리하였다. 2일 경과한 후 30분간 PBS내 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 70% 알콜로 세정하였다. 이어서 항-BrdU 항체와 함께 항온배양하고 세정하여, 항체결합을 과산화효소 반응으로 가시화하였다. 단위 면적당 염색된 핵의 수를 계량하였다. 결과는 GGF2가 대조군에 비하여 단위면적당 표지되 핵의 수를 증가시키는 것으로 나타났다(표 2 참조).

사람 근아세포에 대한 GGF의 유사분열촉진 효과

처리	표지된 핵/㎠	T-테스트 p 값
대조군	120 ± 22.4
감염된 대조군	103 ± 11.9
GGF 5 ㎕/㎖	223 ± 33.8	0.019
PDGF 20 ng/㎖	418 ± 45.8	0.0005
IGFI 30 ng/㎖	280 ± 109.6	0.068
메틸프레드니솔론 1.0μM	142 ± 20.7	0.293

혈소판 유래 성장인자(PDGF)를 양성 대조군으로 이용하였다. rhGGF2외에 메틸프레드니솔론(코르티코스테로이드)도 이용하였는데, DNA 표지상의 현저한 증가를 나타내지는 않았다.

균질성 정도로 정제된(＞95% 순도) rhGGF2도 사람 근아세포에 대해 유사분열촉진성이다(도 1).

재조합 사람 GGF2도 1차 사람 근아세포의 유사분열촉진을 유발한다(표 2 및 도 1 참조). 유사분열촉진성 분석은 상술한 방법대로 수행한다. 이어서 BrdU양성 세포의 수를 총 세포수로

나누어 유사분열지수(mitotic index)를 계산한다.

실시예 3

근세포 분화에 대한 rhGGF2의 효과

정제된 rhGGF2(95% 순도)의 근세포 분화에 대한 효과를 조사하였다(도 2). 배양배지내의 혈청의 함량을 20%로부터 0.5%까지 낮추어 융합성 근아세포 컬처를 분화하도록 유발하였다. 시험 컬처를 6일간 지정된 농도의 rhGGF2로 처리하고, 배양배지를 2일마다 교환해주었다. 이어서 컬처를 고정, 염색하고 밀리리터당 핵의 수를 계수하였다. 도 2에 나타낸 데이타는 rhGGF2가 존재하는 경우에, 대조군에 비하여 근관에 있는 핵의 수가 크게 증가된다는 것을 증명해준다.

실시예 4

분화된 근관의 잔존(Survival)에 대한 rhGGF2의 효과

분화된 근관의 잔존은 rhGGF2 처리에 의해 현저하게 증가된다. 근육 컬처를 rhGGF2의 존재하에서 분화시켜, 여러 시간대에 프로피디움 이오디드 염색에 의해 사멸된 근관의 수를 계수하였다. 도 3를 통해서 알 수 있는 바와 같이, rhGGF2 처리된 컬처에서는 분화의 제 4, 5, 6, 및 8일에 사멸된 근관의 수가 감소되었다. 근관내 핵의 수는 8일간의 분화후에 비처리된 컬처에 비해 GGF2 처리에 의해 현저하게 증가되었다. 구체적으로, 게임사(geimsa) 염색후 동일한 플레이트상에서 계수할 때, 대조군은 8.6 근핵/㎟인 반면에, rhGGF2 처리된 컬처는 57.2 근핵/㎟(p=0.035)를 나타내었다.

근육 컬처에 대해 작용하는 것으로 알려진 다른 성장인자를 가지고 잔존 분석도 행하였다. rhGGF2 효과는 시험된 성장인자들 가운데 독특하였다(도 4). 이러한 실험에서 rhGGF2 처리된 플레이트와 함께 컬처들을 지정 농도의 여러가지 성장인자들로 평행하게 처리하였다. 근관의 잔존은 057A 근아세포의 8일간의 분화시에 위와 같이 측정하였다. 각 인자들의 농도는 다음과 같았다: rhGGF2: 100ng/ml; 사람 혈소판 유래 성장인자: 20ng/ml; 사람 염기성 섬유아세포 성장인자: 25ng/ml; 사람 표피 성장인자: 30ng/ml; 사람 백혈구 저해인자: 10ng/ml; 사람 인슐린 유사 성장인자 Ⅰ: 30ng/ml; 사람 인슐린 유사 성장인자 Ⅱ: 25ng/ml.

분화된 근관의 사멸에 대한 관찰된 보호는 rhGGF2가 여러가지 근육 질병으로 특징지위지는 근육 퇴행의 조정을 위한 치료법으로서 유망함을 나타내준다. 따라서 뉴레귤린의 근육외 농도를 증가시키는 약제는 예방효과를 갖고 근육-파괴성 장애의 진전을 완화하며 근육 분화, 치료, 조정 및 재생을 증가시킬 수 있다.

실시예 5

rhGGF2는 Duchenne 근육 디스트로피 로커스에서 유전적 결함을 갖는 분화된 근관의 잔존을 증진한다

rhGGF2의 근관잔존에 대한 양성적 효과는 변성 장애에 대한 강력한 효능을 반영한다. 정상 근육 컬처에서 관찰되는 반응이 병에 걸린 개체로부터 유래된 컬처에서도 나타나는지를 확인하기 위하여 근관 잔존에 대한 상기 효과를 클론-유래 일차 뒤시엔느형 근아세포에 대해 시험하였다. 도 5에 제시된 데이타는 정상 개체에 대해 이용된 것과 동일한 근육 배양 조건(상기 실시예 4)을 이용하여 수득한 것이다. 대조군((p=0.032)에 비하여, rhGGF2는 분화된 뒤시엔느형 근육 컬처에서 사멸된 근관의 수를 현저하게 감소시켰다. 농도는 다음과 같았다; GGF2: 100ng/ml; 사람 혈소판 유래 성장인자: 20ng/ml; 사람 인슐린 유사 성장인자 Ⅰ: 30ng/ml.

본 실시예는 rhGGF2가 분화된 뒤시엔느형 근관의 잔존을 증가시킬 수 있다는 것을 증명해주고, 또한 rhGGF2가 포유동물에서 근육의 퇴행 및 파괴 과정을 서행시키거나 예방할 수 있다는 것에 대한 확실한 증거를 제공해준다.

실시예 6

분화 프로그램에 대한 rhGGF2의 효과: MHC Slow 및 디스트로핀 단백질의 유도

정제된 rhGGF2의 근육 컬처 분화에 대한 효과를 컬처 용해물의 웨스턴 분석에 의해 조사하였다. 근육 특이성 단백질의 수준을 3회 처리된 컬처 및 비처리 컬처에서 측정하였다. 이들 컬처들을 준비하여 플레이트의 크기를 150㎜로 증가시킨 것외에는 상술한 바와 같이 처리하고, Sklar R., 및 Brown등(J. Neurol. Sci. 101:73-81, 1991)에 기술된 대로 근육 컬처 층을 웨스턴 분석을 위해 벗겨내었다. 표 A에 제시된 결과는 웨스턴상에 로딩된 단백질의 양당 유사농도로 rhGGF2 처리가디스트로핀, 미오신 H 사슬(MHC, 성인 느린 및 빠른 이소폼)을 포함하는 몇몇 근육 특이성 단백질의 수준을 증가시키지만, HSP72 또는 MHC 신생아 이소폼의 수준은 증가시키지 않는다는 것을 보여준다. rhGGF2에 의해 유도된 근육 특이성 단백질의 수준은 근핵/㎟의 수에 있어서의 양적 증가와 유사하였다(표 3).

수치	대조군 ± SD	rhGGF2 처리 ± SD	P
총 단백질(㎍)	554 ± 38.4	798 ± 73.6	0.007
근핵/㎟	29.0 ± 12.2	106 ± 24.1	0.008
MHC 빠른/㎍ 단백질	1.22 ± 0.47	4.00 ± 0.40	0.001
MHC 느린/㎍ 단백질	0.17 ± 0.13	1.66 ± 0.27	0.001
MHC 신생/㎍ 단백질	0.30 ± 0.27	0.55 ± 0.04	0.199
디스트로핀/㎍ 단백질	6.67 ± 0.37	25.5 ± 11.0	0.042
HSP 72/㎍ 단백질	3.30 ± 0.42	4.54 ± 0.08	0.008

신생아 이소폼은 rhGGF2 처리에 의해 현저하게 증가되지 않기 때문에, 성인 미오신 H 사슬 이소폼에서 rhGGF2 의존성 증가(느린 것은 타잎 Ⅰ 사람 근섬유에서 발견되고; 빠른 것은 타잎 2А 및 2В 사람 근섬유에서 발견된다)는 근관의 성숙(maturation)을 나타낸다. 쥐의 근육 발생중에 MHC 이소폼은 태아로부터 신생아 형태로 전환되고, 이것은 뒤이어 성숙한 성인 느린 및 빠른 MHC 이소폼으로 전환된다(Periasamy et al.,J. Biol. Chem. 259:13573-13578, 1984; Periasamy et al.,J. Biol. Chem. 260:15856-15862, 1985; /Wieczorek et al.,J. Cell Biol.101:618-629, 1985). 신경세포 또는 조직의 부재하에서 근육은 자동적으로 이러한 이소폼 변화를 수행할 수 있지만, 쥐의 근육 이식편은 쥐의 척수의 존재하에서 배양될 때만 성인 빠른 MHC 이소폼을 발현한다(Ecob-Prince et al.,J. Cell Biol.103:995-1005, 1986). MHC 이소폼 변화가 신경에 의해 영향을 받는다는 것에 대한 부가적인 증거는 Whalen등에 의해 확립되었다(Deve. Biol. 141:24-40, 1990); 노텍신(notexin) 처리된 쥐 근육의 재생후에는 새로운 신경제거된 근육내에서 성인 빠른 MHC 이소폼만 만들어졌지만, 신경재생지배된 재생 근육은 빠른 및 느린 성인 MHC 이소폼을 모두 만들었다. 따라서 rhGGF2가 성인 MHC 이소폼의 합성을 증가시킨다는 표 3에 제시된 증거는 rhGGF2가 뉴론의 신경재생지배를 의태한 것일 수 있는 근육의 발생적 성숙(developmental maturation)을 유발할 수 있다는 것을 나타내준다.

실시예 7

근육내에서 rhGGF2를 포함하는 뉴레귤린은 아세틸콜린 수용체의 합성을 유발한다.

아세틸콜린 수용체(AchR) 소단위 단백질의 발현은 근육세포를 뉴레귤린에 노출시킴으로써 유발될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명자들은 근육세포를 rhGGF2와 접촉시키는 것이 아세틸콜린 수용체 소단위 단백질의 합성을 유발할 수 있다는 것을 입증하였다. 이러한 rhGGF2 노출에 뒤이은 유발은 두 가지 방법으로 관찰되었다: 첫 째로, 우리는 리포터 유전자 구조물의 생성을 통해서 사람 성장호르몬의 증가된 발현을 검출하였고, 둘 째로 우리는 세포에 대한 알파-붕가로톡신의 증가된 결합을 검출하였다.

이하의 실시예에서는 쥐의 근아세포 세포주 C2가 이용되었다. C2 세포를 사람 성장호르몬 전체-길이 cDNA에 연결된 쥐의 아세틸콜린 수용체(AchR) 델타 소단위 유전자의 5' 조절서열을 포함하는 트랜스유전자(transgene)에 의해 트랜스펙션되었다(Baldwin and Burden, 1988, J. Cell Biol. 107:2271-2279). 이러한 리포터 구조물은 배지내로 분비되는 성장호르몬의 양을 사정함으로써 AchR 델타 유전자 발현의 유발을 측정할 수 있게 해준다. 상기 세포주는 배지내 혈청의 농도를 20%로부터 0.5% 까지 낮춤으로써 근관을 형성하도록 유도될 수 있다.

구체적으로, 쥐의 C2 근아세포를 AchR-사람 성장호르몬 리포터 구조물로 트랜스펙션하여, rhGGF2 처리후 hGF의 발현을 분석하였다. 두 가지의 서로 다른 실험의 결과를 표 4 및 도 6(hGF 발현) 및 도 7(hGF 발현 및 알파-붕가로톡신 결합)에 요약하였다. 도시된 것은 rhGGF2로 처리된 근육 컬처의 사람 성장호르몬 및 붕가로톡신 결합에 대한 투여량 반응곡선이다.

AchR 델타 소단위/hGF 트랜스유전자의 발현 및 AchR 합성에 대한 rhGGF2의 효과

	실험 1	실험 2
GGF(㎕)	hGF(ng/ml)	hGF(ng/ml)	AchR(cpm/mg 단백질)
0	9.3 + 2.1	5.7 + 2.1	822 + 170
0.1	- -	6.8 + 1.5	891 + 134
0.5	- -	12.0 + 0.9	993 + 35
1.0	- -	9.7 + 2.3	818 + 67
5.0	17.5 + 2.8	14.7 + 3.5	1300 + 177
10.0	14.3 + 3.2	14.1 + 3.3	1388 + 137
15.0	22.0 + 1.4	- -	- -

C2 근관을 37℃에서 1시간 동안 차가운 α-BTX(20nM)로 처리하고, 배양배지로 2회 세정한 후 GGF2로 처리하였다. 배양배지는 1㎎/㎖의 농도로 우혈청 알부민으로 조정하였다. 24시간 경과 후, 배양배지를 제거하고 hGH 분석을 위해 보관하였다. 근육 컬처를 37℃에서 1시간 동안¹²⁵I-α-BTX(20nM)로 처리하고, 1% SDS를 함유하는 PBS로 세정 및 스크랩하였다. 차가운 α-BTX(40nM)의 존재하에서 비-특이적 결합을 측정하였다. 세포 균등액에 대하여 방사성을 카운트하고 총 단백질양을 분석하였다.

rhGGF2의 존재는 hGH 유전자 발현에 있어서 2배 이상의 증가를 초래하는바, 이는 rhGGF2가 아세틸콜린 수용체의 델타 소단위의 합성을 유발한다는 것을 나타내준다. 더우기, 붕가로톡신 결합의 증가는 이들 소단위 단백질들의 기능적인 아세틸콜린 수용체로의 조립과 일치된다. 이러한 데이타 해석을 보강하기 위해서 rhGGF2에 대해서 반응성이 아닌 메탈로티엔 프로모터(metallothiene promotor)에 연결된 hGF 리포터를 갖는 컬처에 대해서 분석을 반복하였다. 이러한 대조 실험의 결과는 hGH 반응이 AchR 델타 소단위 유전자 조절 요소의 전사적 활성화를 통해서 중재된다는 것을 보여주었다.

이들 결과들은 rhGGF2가 자가면역 질병인 중증 근무력중에 대한 치료의 일부로서 AchRs를 보충하는데 유용함을 나타내준다. 이러한 활성은 근육의 재-신경재생지배(re-innervation) 중에서 가장 중요한 단계를 자극함으로써 말초신경 재생 및 신경병증을 치료하는데 유리할 수도 있다.

실시예 8

정제된 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ의 추가의 유사분열촉진 활성

GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ 쌍방을 포함하는 고도로 정제된 시료의 유사분열촉진 활성을 정량 방법을 이용하여 시험하였다. 상기 정량방법은 하나의 마이크로컬처가 DNA 합성, 세포 모르폴러지, 세포 수 및 세포 항원의 발현에 대해서 조사되도록 허용한다. 이러한 기술은 이전에 Muir등(Analytical Biochemistry185: 377-382, 1990)에 의해서 보고되었던 방법을 변형한 것이다. 주된 변형은: ⑴ 코팅되지 않은 미소적정 플레이트의 사용, ⑵ 웰당 세포수, ⑶ 10% FCS 대신에 5% FBP(Fetal Bovine Plasma)의 사용, 및 ⑷ 컬처에 동시에 첨가된 유사분열촉진인자 및 브로모디옥시유리딘(BrdU)의 존재하에서의 항온배양시간이다. 또한 세포 단층은 세포의 손실을 방지하기 위해 고정되기 전에 세정되지 않았고, 단클론성 쥐 항-BrdU 항체 및 과산화효소 결합 염소 항-쥐 면역글로불린(IgG) 항체의 항온배양시간은 분석의 감수성을 증가시키기 위하여 배가되었다. 쥐의 좌골 신경 쉬반세포에 대해 최적화된 분석은 세포 배양 조건에 대한 적당한 변형 후에 몇몇 세포주에 대하여도 이용되었다.

Ⅰ. 유사분열촉진성 시험방법

제 1일에, 정제된 쉬반세포를 코팅되지 않은 96 웰 플래이트상 5% FBP/Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 플래이팅하였다(5,000 세포/웰). 제 2일에, GGFs 또는 다른 시험 인자들은 물론 BrdU를 배양액에 최종농도가 10㎛가 되도록 첨가하였다. 48시간(4일) 경과 후에 배지를 흡출함으로써 BrdU 혼입을 종료시키고 세포들을 실온에서 20분간 200μL/웰의 70% 에탄올로 고정시켰다. 다음으로, 세포들을 물로 세정하고 37℃에서 10분간 100㎕ 2N HCl과 함께 항온배양하여 DNA를 변성시켰다. 흡출하고나서, 웰에 0.1M 브롬산 버퍼(pH 9.0)를 충진하여 잔류 산을 중화하고, 세포들을 PBS(phospate buffered saline)로 세정하였다. 이어서, 37℃에서 15분간 세포들을 50㎕의 블로킹 버퍼(0.1% Triton × 100 및 2% 정상 염소 혈청 함유 PBS)로 처리하였다. 흡출하고나서, 단클론성 쥐 항-BrdU 항체(Dako Corp., Santa Barbara, CA)(50㎕/웰, 1.4㎍/㎖ 블로킹 버퍼로 희석된 것)를 가하여 37℃에서 2시간 동안 항온배양하였다. 결합되지 않은 항체들을 0.1% Triton × 100 함유 PBS로 3회 세정하고, 과산화효소 결합 염소 항-쥐 IgG 항체(Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50㎕/웰, 2㎍/㎖ 블로킹 버퍼로 희석된 것)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. PBS/Triton으로 3회 세정하고 최종적으로 PBS로 수세한 후, 0.05%의 가용성 색소원 o-페닐렌디아민(OPD) 및 0.02% H₂O₂를 함유하는 50mM 포스페이트/시트레이트 버퍼(pH 5)를 100㎕/웰씩 각 웰에 넣었다. 40㎕/웰의 2N 황산을 함유하는 새 플레이트로 각 웰로부터 80㎕씩 파이페팅함으로써 반응을 실온에서 5-20분 경과한 후에 종결시켰다. 플레이트 리더(Dynatech Labs)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 단층을 포함하는 분석 플레이트를 PBS로 2회 세정하고나서 불용성 산물을 생성하기 위해 100㎕/웰의 기질 디아미노벤지딘(DAB) 및 0.02% H₂O₂를 첨가함으로써 BrdU-DNA를 면역세포화학적으로 염색하였다. 10-20분 경과한 후에 물로 세정함으로써 염색반응을 종결시키고, BrdU-양성 핵을 검출하여 인버티드 현미경을 사용하여 계수하였다. 때로, 음성 핵을 0.001% 톨루이딘 불루로 반대염색하여 전과 같이 계수하였다.

Ⅱ. 유사분열촉진성 분석용 세포주

Swiss 3T3 섬유아세포:Flow Labs로부터 수득한 세포들을 10% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에 넣어 37℃의, 공기중에 10% CO₂가 포함되어 있는 습윤한 대기조건하에서 방치하였다. 2일마다 세포들에게 양분을 공급하거나 이차배양하였다. 유사분열촉진성 분석을 위해 완전배지에 5,000 세포/웰의 밀도로 세포들을 플레이팅하여 세포들이 융합하고 정지될 때까지 1주간 항온배양하였다. 혈청 함유 배지를 제거하고 세포 단층을 혈청이 없는 배지로 2회 세정하였다. 유사분열촉진인자및 10μM BrdU를 함유하는 무혈청 배지 100㎕를 각 웰에 첨가하여 48 시간 동안 항온배양하였다. GGFs 및 혈청 또는 PDGF(양성표준으로서)에 대한 투여량(dose) 반응을 수행하였다.

BHK (Baby Hamster Kidney) 21 C13 섬유아세포:

European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)로부터 수득한 세포들을 5% 트립토스 포스페이트 육즙, 5% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 GMEM(Glasgow Modified Eagle Medium)에 넣어 37℃의 공기중에 5% CO₂가 포함되어 있는 습윤한 대기조건하에서 방치하였다. 2-3일마다 세포들에게 양분을 공급하거나 이차배양하였다. 유사분열촉진성 분석을 위해 완전배지에 2,000 세포/웰의 밀도로 세포들을 플레이팅하여 세포들을 24시간 동안 항온배양하였다. 이어서 혈청함유 배지를 제거하고 혈청이 없는 배지로 세정한 후 100㎕의 0.1% FCS 함유 GMEM 또는 GMEM만으로 혈청 함유 배지를 대체하였다. 10μM BrdU와 함께 GGFs 및 FCS 또는 bFGF를 양성표준으로서 첨가하여 48 시간 동안 항온배양하였다. 이어서 쉬반세포에 대하여 기술한 것과 같은 방법으로 세포 배양을 수행하였다

C6 Rat Glioma 세포주:계대(passage) 39에서 수득된 세포들을 5% FCS, 5% 말 혈청(HS), 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에 넣어 37℃의 공기중에 10% CO₂가 포함되어 있는 습윤한 대기조건하에서 방치하였다. 3일마다 세포들에게 양분을 공급하거나 이차배양하였다. 유사분열촉진성 분석을 위해 완전배지에 2,000 세포/웰의 밀도로 세포들을 플레이팅하여 24시간 동안 항온배양하였다. 이어서 무혈청 배지로 세정한 후 배지를 0.1% FCS를 함유하는 1:1 DMEM 및 F12 배지 혼합물로 대체하였다. GGFs, FCS 및 aFGF에 대한 투여량 반응을 수행하고 세포들을 다른 유형의 세포들에 대하여 종래에 기술된 바와 같이 ELISA로 처리하였다.

PC12 (Rat Adrenal Pheochromocytoma Cells):ECACC로부터 수득한 세포들을 콜라겐 코팅된 플라스크내 10% HS, 5% FCS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에 넣어 37℃의, 공기중에 5% CO₂가 포함되어 있는 습윤한 대기조건하에서 방치하였다. 3일마다 80%의 배지를 교체하여 세포들에게 양분을 공급하였다. 유사분열촉진성 분석을 위해 콜라겐 코팅된 플레이트상(50㎕/웰 콜라겐, Vitrogen Collagen Corp., 1: 50으로 희석된 것, 37℃에서 30분간) 완전배지에 3,000 세포/웰의 밀도로 세포들을 플레이팅하여 세포들을 24시간 동안 항온배양하였다. 새로운 1 mM 인슐린 또는 1% FCS 함유 RPMI 또는 RPMI만으로 배지를 대체하였다. 양성표준으로서의 FCS/HS(1:2) 및 GGFs에 대한 투여량 반응을 앞에서와 같이 수행하였다. 48 시간 경과한 후에 세포들을 고정시켜 전술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다.

Ⅲ. 유사분열촉진성 분석의 결과: 본 실시예에 제시된 모든 실험들은 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ의 혼합물(GGFs)을 포함하는 Sepharose 12 크로마토그래피 정제 단계로부터 수득된 고도로 정제된 시료를 이용하여 수행하였다.

첫 째로, BrdU 혼입 분석의 결과를 J. P. Brockes(Methods Enzymol.147: 217, 1987)에 의해 기술된, 분열세포의 DNA내로의¹²⁵I-UdR 혼입에 기초한 쉬반세포에 대한 종래의 유사분열촉진성 분석 결과와 비교하였다.

도 12는 동일한 세포 배양 조건(5,000 세포/웰, 5% FBP/DMEM, GGFs 존재하에서 48시간 동안 배양)에서 수행된 상기 두 가지 분석방법에 의해 수득된 데이타의 비교결과를 나타낸 것이다. 명백하게 나타나는 바와 같이, 결과는 비슷한데, 곡선이 그래프의 좌측으로 즉, 저농도의 GGFs로 이동한 것에서 알 수 있는 바와 같이 BrdU 혼입 분석의 결과가 조금 더 민감한 것처럼 보인다.

'유산분열촉진성 시험방법' 섹션에서 기술된 바와 같이, OPD 과산화효소 반응의 가용성 생성물의 세기를 독출함으로써 면역반응성 BrdU-DNA를 정량한 후에, 세포 단층을 포함하고 있는 최초의 분석 플레이트에 대하여 BrdU-양성 핵을 염색시키는 불용성 DAB 생성물을 발생시키는 2차 반응을 수행할 수 있다. 이어서, 마이크로컬처를 인버티드 현미경으로 조사하여, 세포 모르폴러지, BrdU-양성 핵 및 음성 핵의 수를 측정할 수 있다.

도 13a 및 도 13b에서는 490nm에서 흡광도를 읽음으로써 측정된 BrdU-DNA 면역반응성을 동일한 컬처에 대해서 계수된 BrdU-양성 핵의 수 및 웰 당 총 세포수에 대한 BrdU-양성 핵의 백분율과 비교하였다. 표준편차는 10% 미만이었다. 상기 두 가지의 평가방법은 매우 양호한 상관관계를 나타내고 고투여량의 GGFs에서 측정값 사이의 불일치는 BrdU-양성으로 검출된 세포내에서 DNA 합성의 정도가 상이한 것에 의해 설명될 수 있다.

따라서 BrdU 혼입 분석은¹²⁵I-UdR 혼입 분석과 비교될 때 쉬반세포에 대한 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 관한 추가의 유용한 정보를 제공해 줄 수 있다. 예를 들어, 도 15에 기록된 데이타는 GGFs가 쉬반세포에 대해서 DNA 합성을 유도하는 작용을 할 수 있지만, 저투여량에서는 48시간 경과후 마이크로컬처내에 존재하는 음성 세포의 수를 증가시키는 것을 보여준다.

이어서 상기 분석은 서로 다른 출처로부터의 여러가지 세포주에 대하여 이용되었다. 도 15에서는 GGFs에 대한 쉬반세포 및 Swiss 3T3 섬유아세포의 유사분열촉진 반응이 비교된다; 3T3 섬유아세포에서는 낮은 반응이 수득되었음에도 불구하고, 일부 분명한 BrdU-양성 핵이 이 컬처내에서 검출되었다. 대조표준 컬처를 몇몇 투여량의 FCS 및 사람 재조합 PDGF의 존재하에서 동시에 주행시켰는데, 세포들이 적당한 자극(도시되지 않은)에 대하여 반응할 수 있는 것으로 나타났다.

섬유아세포의 GGFs에 대한 반응 능력을 BHK 21 C13 세포주를 이용하여 추가로 조사하였다. 이러한 신장으로부터 유래된 섬유아세포들은 접촉저해를 나타내지 않거나 융합시 무활동상태에 도달하지 않는다. 따라서, 실험조건을 세포 생존력을 손상시키지 않는 매우 낮은 기초 증식(background proliferation)을 갖도록 설계하였다. GGFs는 도 16 및 도 17에 도시된 바와 같이 BHK21 C13 세포에 대하여 상당한 유사분열촉진성을 갖는다. 도 16는 0.1% FCS의 존재하에서 GGFs에 의해 자극된 BHK21 C13 세포에 의한 DNA내로의 BrdU 혼입을 보여준다. FCS에 대한 우수한 유사분열촉진성은 세포배양 조건이 비제한적임을 나타내는 것이다. 도 17에서 GGFs의 유사분열촉진 효과는 BrdU-양성 및 BrdU-음성 세포수 및 웰 당 계수된 총 세포수로 표현된다. 데이타는 중복해서 진행한 2회 실험의 대표값이고; 웰 당 적어도 3 회씩 계수하였다. 쉬반세포에 대해서 관찰된 바와 같이 저투여량에서의 증식효과 외에, GGFs는 또한 비반응성 생존세포의 수를 증가시킨다. BrdU-양성 세포의 백분율은 컬처에 첨가되는 GGFs의 양의 증가에 비례한다. 고투여량의 GGFs의 존재하에서 48시간 경과한 후 총세포수는 최소한 배가되었는데, 이는 GGFs가 BHK21 C13 세포에서 DNA 합성 및 증식을 초래함을 증명해준다. 동일한 조건 하에서, 2% FCS의 존재하에서 48시간 동안 유지된 세포들은 약 6배 정도의 증가를 나타낸다(도시하지는 않음).

C6 글리오마 세포들은 글리아 세포 특성 연구를 위한 유용한 모형을 제공해준다. 발현된 표현형은 세포 계대에 의존하는 것으로 보이는데, 세포들은 초기단계일수록 성상교세포 표현형과 유사하고, 후기 단계(70 계대 이상)일수록 희돌기교세포 표현형과 유사하다. 본 실시예에서 사용된 C6 세포들은 계대 39 내지 계대 52이었다. C6 세포들은 매우 증식적인 집단이므로, 실험조건을 매우 낮은 기초 BrdU 혼입을 갖도록 적정화하였다. FCS에 대한 투여량반응(도 18)에 나타나는 바와 같이, 0.1% 혈청의 존재는 유사분열촉진성에 큰 영향을 미치는 일 없이 세포 생존력을 유지하는데 필요하였다.

도 19는 aFGF(acidic Fibroblast growth factor) 및 GGFs에 대한 유사분열촉진 반응을 FCS(8%)의 존재하에서 수득된 최대 BrdU 혼입의 백분율로 나타낸 것이다. 수치는 중복해서 진행된 2회 실험의 평균값이다. GGFs의 효과는 순수한 aFGF 조제의 효과와 동등하였다. aFGF는 C6 세포에 대한 특이적 성장인자로 기술되어 왔고(Lim R.등, Cell Regulation1: 741-746,1990), 이러한 이유 때문에 그것은 양성 표준으로 사용되었다. 마이크로컬처내 세포 밀도가 높기 때문에 직접 BrdU-양성 세포 및 음성 세포를 계수하는 것은 불가능하다. 현재까지 보고된 세포주와 대조적으로, PC12 세포들은 PC12 세포가 혈청(세포 유지를 위해 일상적으로 사용되는 것과 같은 FCS HS의 혼합물)에 대하여 반응할 수 있는 배양조건하에서 처리될 때, GGFs에 대하여 어떠한 명백한 반응성도 나타내지 않았다. 그럼에도 불구하고 웰 당 플레이팅된 세포의 수는 PC12 세포의 거동에 영향을 미치므로 추가적인 실험이 요구된다.

실시예 9

정제된 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ의 아미노산 서열

고도로 정제된 소 뇌하수체 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ을 이용하여 아미노산 서열분석 연구를 수행하였다. 서열의 설명을 위해 종래의 일문자 코드를 이용하였다. 환원되고 카르복시메틸레이티드된 시료에 대해 수행된 리실엔도펩티다아제 및 프로테아제 V8 절단, 및 11% SDS-PAGE의 55-65 RD(상기한 마커에 대한 상대적인 MW) 지역으로부터 용출된 재료에 대해 수행된 GGF-Ⅱ의 리실엔도펩티다아제 절단에 의해 펩타이드들을 수득하였다.

GGF-Ⅰ에 대해서 총 21 펩타이드 서열(도 8, 서열 1-20, 165 참고)을 수득하였는데, 이들중 12 펩타이드(도 9, 서열 1, 22-29, 17, 19 및 32 참고)는 기존의 단백질 데이타베이스에 존재하지 않는 것이므로 유일-서열(unique sequences)을 나타낸다. GGF-Ⅱ에 대해서는 총 12 펩타이드 서열(도 10, 서열 42-50 및 161-163 참고)을 수득하였는데, 이들중 10 펩타이드(도 12, 서열 42-50 참고)는 기존의 단백질 데이타베이스에 존재하지 않는 것이므로 유일-서열을 나타낸다(하나의 예외는 펩타이드 GGF-Ⅱ 06으로, 이것은 중요성이 없고 일정한 소수의 잔기를 갖는 다수의 단백질에서 동일한 서열을 보여준다). 이러한 신규한 서열들은 GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ의 진정한 아미노산 서열의 일부분에 해당될 가능성이 매우 높다.

서열 GGF-Ⅰ 07 및 GGF-Ⅱ 12에 대하여 특별한 관심이 경주될 수 있는데, 이들은 명백하게 서로 밀접하게 관련되어 있다. 상기 유사성은 이들 펩타이드들의 서열이 지정된(assigned) GGF 종의 것임이 거의 확실하고 감염 단백질로부터 유래된 것이 아니라는 것을 나타내준다.

또한, 펩타이드 GGF-Ⅱ 02에서, 서열 X S S는 X로 표기된 위치에 있는 아스파라긴상의 N-결합된 탄수화물 부분의 존재와 일치한다.

일반적으로, 도 8 및 제10도에서, X는 사이클내에 동일한 크기의 하나 이상의 시그날이 있거나 시그날이 전혀 존재하지 않기 때문에, 하나의 위치가,확실하게 특정될 수 없는 서열 사이클을 가리키는 미지의 잔기를 나타낸다. 에스터리스크(*)로 표기한 것은 콜링된 최종 아미노산이 그 펩타이드내에 존재하는 최종 아미노산에 해당하는 경우의 폴리펩타이드들을 의미한다. 나머지 펩타이드에서 콜링된 최종 아미노산 다음의 시그날 강도는 그 펩타이드의 말단까지 서열 콜링을 계속하기에 불충분하였다. 오른쪽 컬럼은 GCG 패키지 FASTA 및 TFASTA 프로그램을 이용하여 NBRF 및 EMBL 서열 데이타베이스를 분석한 컴퓨터 데이타베이스 검색 결과이다. 이 컬럼내에 있는 단백질의 명칭은 최대로 2 가지의 부정합(mismatch)을 허용하는 콜링된 펩타이드 아미노산 서열을 갖는 그 서열의 일부의 정체(identity)를 나타낸 것이다. 물음표는 허용된 3 가지의 부정합을 나타낸다. 이용된 약자는 다음과 같다:

HMG-1 High Mobility Group protein-1

HMG-2 High Mobility Group protein-2

LH-alpha Luteinizing hormone alpha subunit

LH-beta Luteinizing hormone beta subunit

실시예 10

GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ 펩타이드를 포함하는 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 분리 및 클로닝

펩타이드 서열 정보 및 라이브러리 검색을 이용하여 본원에 개설된 대로 GGF-Ⅱ 뉴클레오티드 서열의 분리 및 클로닝을 아래에 기술된 방법으로 수행하였다. 도 10 및 도 11의 펩타이드들은 본원에 개시된 기술에 따라 GGF-Ⅰ 뉴클레오티드 서열의 분리 및 클로닝을 위한 시발점으로 사용될 수 있다. 그 대신에, 도 20(서열 51-84)는 이러한 목적을 위해 이용가능한 변성 올리고뉴클레오티드 프로브를 나타낸 것이고, 도 22(서열 86-115)는 이용가능한 PCR 프라이머를 열거한 것이다. GGF-Ⅱ의 경우와 마찬가지로 DNA 서열 및 폴리펩타이드 서열도 이러한 방법으로 수득될 수 있고, 또한 이러한 DNA 서열을 혼입시키는 DNA 구조물 및 발현벡터들, 이러한 구조물/벡터들을 혼입시킴으로써 유전적으로 변형된 숙주 세포들, 및 이러한 숙주들을 배양하여 수득가능한 단백질도 수득가능한 것이어야 한다. 본 발명은 그러한 대상을 포괄한다.

Ⅰ. 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머의 설계 및 합성

변성 DNA 올리고머 프로브는 아미노산 서열(정제된 GGF 단백질로부터 생성된 펩타이드로부터 유래된)을 뉴클레오티드 서열로 역해독함으로써 설계되었다. 올리고머들은 DNA 서열의 암호가닥 및 비암호가닥 중의 하나를 나타내었다. 올리고머 설계시 세린, 아르기닌, 또는 류신이 포함되는 경우에, 혼동을 피하기 위해 두 개의 서로 다른 합성물을 제조하였다. 예를들어, 세린은 537 및 538 또는 609 및610에 있는 것과 같은 TCN 또는 AGY 중의 하나에 의해 코드화되었다. 유사 코돈의 분할은 아르기닌 또는 류신에 대해서도 행해졌다(예컨대, 544, 545). DNA 올리고머들은 0.2 마이크로몰 스케일 합성으로 작동되고 β-시아노에틸 화학을 이용하는 Biosearch 8750 4-column DNA 합성기(DNA synthesizer)를 이용하여 합성하였다. 올리고머들을 컬럼(500Å CpG 수지)으로부터 분리하여 농축 수산화암모니움으로 55-60℃에서 6-24시간 동안 처리하여 탈보호하였다. 탈보호된 올리고머들을 진공(Speedvac) 하에서 건조하고 15% 아크릴아마이드(20 모노: 1 비스), 7M 요소 함유 50mM Tris-붕산염-EDTA 완충액으로 전기영동하여 정제하였다. 전체 길이의 올리고머들을 겔에 UV를 조사하여 검출하고, 이어서 밴드를 절제하여 교반하면서 4-16시간 동안 1.5㎖ H₂O에 DNA 올리고머들을 용출하였다. 용출물을 건조시킨 후 0.1㎖ H₂O에 재현탁시켜 260nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기 식에 의해 농도를 구하였다:

(A 260 × 단위/㎖) (60.6/길이)= X μM)

H₂O를 첨가하여 모든 올리고머의 농도를 50μM로 조정하였다.

위와 같이 하여 설계된 변성 프로브를 도 20, 서열 54-88에 도시하였다.

PCR 프라이머는 다음의 변형을 가한 것외에는 기본적으로 프로브에 이용된 것과 동일한 방법에 의해서 제조하였다. 제한부위를 포함하는 13 뉴클레오티드로 구성된 링커를 벡터내로의 클로닝에 이용하기 위한 변성 올리고머의 5' 말단에 포함시켰다. 1000Å CpG 수지를 이용하여 1μM 스케일로 DNA를 합성하되 4 가지의뉴클레오티드 모두가 통상적으로 변성 프로브내로 혼입되는 위치에는 이노신을 사용하였다. PCR 프라이머의 정제는 겔 전기영동 정제후 에탄올로 침전시켜 실시하였다.

Ⅱ. 라이브러리의 구성 및 검색

소의 지놈 DNA 라이브러리를 Stratagene(카탈로그 번호: 945701)으로부터 구입하였다. 상기 라이브러리에는 벡터 람다 DashⅡ내에 클로닝된 2×10⁶15-20kb Sau3Al 부분 소 DNA 분획들이 포함되어 있다. 소 뇌의 전체 cDNA 라이브러리를 Clonetech(카탈로그 번호: BL 10139)로부터 구입하였다. 상보성 DNA 라이브러리는 소의 전체 뇌로부터, 소의 뇌하수체로부터, 및 소의 뇌하수체 전엽으로부터 제조된 mRNA로부터 구성되었다(In Vitrogen; Stratagene). In Vitrogen은 두 가지의 cDNA 라이브러리를 만들었다: 하나의 라이브러리는 벡터 람다 g10내에 클로닝된 것이고, 다른 하나는 pcDNAI(플라스미드 라이브러리)내에 클로닝된 것이다. 상기 Stratagene 라이브러리는 벡터 람다 unizap내에 클로닝하여 제조되었다. 총괄하여, 상기 cDNA 라이브러리들은 천사백만 일차 재조합 파아지를 포함하였다.

소의 지놈 라이브러리를 23×23 cm 플레이트(Nunc)상E. coliK12 숙주 균주 LE392에 150,000 내지 200,000 파아지 플레이크/플레이트로 플레이팅하였다. 각 플레이트는 대략적으로 하나의 소 지놈 균등물에 해당한다. 37℃에서 밤새 배양한 후에 플레이트를 냉각하여 Maniatis 등(2:60-81)의 방법에 따라 복제 필터를 만들었다. 비하전된 나이론 막(Pall Biodyne A 또는 MSI Nitropure)상의 각 플레이트로부터 4 개의 플레이크 리프트를 만들었다. UV로 5분간 처리하거나 진공상태하에서 2시간 동안 80℃로 가열하여 가교시킴으로써 막상에 상기 DNA를 고정하였다. DNA 프로브를 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(New England Biolabs)를 이용하여 감마³²P ATP(New England Nuclear; 6500 Ci/mmol)로 공급자의 설명에 따라 표지하였다. 간단하게, 50 pmol의 변성 DNA 올리고머를 600μCi 감마³²P- ATP 및 5 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제의 존재하에 37℃에서 30분간 항온배양하였다. 반응을 종결시키고, 겔 전기영동 로딩 버퍼를 첨가한다음 방사성 표지된 프로브를 전기영동에 의해 정제하였다.³²P 표지된 프로브를 겔 슬라이스로부터 절제하여 물로 용출하였다. 대안으로, DNA 프로브를 Schowalter 및 Sommer(Anal. Biochem177: 90-94, (1989))의 프로토콜에 따라 α-³²P-dATP 또는 α-³²P-dCTP의 혼입에 의한 PCR 증폭에 의해 표지하였다. PCR 반응에 의해 표지된 프로브를 Sephadex G-150 컬럼상에서 탈염하여 정제하였다.

예비혼성화 및 혼성화를 GMC 버퍼(0.52M NaPi, 7% SDS, 1% BSA, 1.5 mM EDTA, 0.1M NaCl 10㎎/㎖ tRNA)로 실시하였다. oligowash(160㎖ 1M Na₂HPO₄, 200㎖ 20% SDS, 8.0㎖ 0.5M EDTA, 100㎖ 5M NaCl, 3632㎖ H₂O)로 세정하였다. 전형적으로, 10개의 소 지놈 균등물의 복제물인 20 필터(각각 400 제곱 센티미터)를 100pmol의 변성 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 200㎖ 혼성화 용액내에서항온배양하였다(128-512 fold degenerate). 변성 프로브에 대해서 계산된 최소 용융온도 5℃ 아래에서 밤새 혼성화시켰다. 상기 최소 용융온도의 계산은 AT쌍에 대해서는 2℃ 및 GC쌍에 대해서는 4℃로 나타났다.

4-5 시간 동안 혼성화 온도에서 oligowash의 반복적 교체로, 최종적으로 DNA 프로브의 길이에 따른 온도에서 30분간 3.2M 테트라메틸암모니움 클로라이드, 1% SDS로 2회 필터를 세정하였다. 20mers의 경우, 최종 세정 온도는 60℃이었다. 필터를 안착하고나서 감도증강 스크린(Dupont Cronex Lightening Plus)을 이용하여 X-선 필름(Kodak XAR5)에 노출시켰다. 통상적으로 -80℃에서 3일 내지 5일간의 필름 노출이면 이러한 라이브러리 검색에서 중복 신호를 검출하기에 충분하였다. 결과분석 후에, 필터를 벗겨내어 재프로빙할 수 있다. 필터들은 10mM EDTA(pH8)를 포함하는 1% SDS 용액내에서 최대 전력의 마이크로파 오븐으로 15분씩 2회 연속 항온배양함으로써 벗겨질 수 있다. 필터를 적어도 3 내지 4회 이상 벗기고 및 다양한 프로브로 재프로빙하였다.

Ⅲ. 재조합 파아지의 분리, 성장 및 DNA 제조

제조

이 과정은재조합 DNA(Maniatis 등, Recombinant DNA2: 60-62:81)에 기술된 표준적인 프로토콜에 따라 실시하였다.

Ⅳ. DNA 분해 및 서던 블로팅을 이용한 분리된 클론의 분석

재조합 파아지 DNA 시료(2 micrograms)를 제한 엔도뉴클레아제 공급자(NewEngland Biolabs)에 의해 권장되는 조건에 따라 분해하였다. 37℃에서 4시간 동안 항온배양한 후, 반응생성물을 0.1M 아세트산 나트륨 및 3 용량의 에탄올의 존재하에서 침전시켰다. 침전된 DNA를 원심분리에 의해 회수하여 75% 에탄올로 수세하여 건조하였다. 모든 재현탁된 시료들을 아가로스 겔(전형적으로, 1% in TAE 버퍼; 0.04M Tris 아세테이트 0.002M EDTA)상에 로딩하였다. 4 시간 부터 20 시간 까지 1V/㎝로 겔을 주행시켰다. 마커는 람다 Hind Ⅲ DNA 분획 및/또는 ψX174HaeⅢ DNA 분획(New England Biolabs)를 포함하였다. 겔을 0.5㎍/㎖의 에티디움 브로마이드로 염색하여 사진촬영하였다. 서던블로팅을 위해, 우선 DNA를 겔 내에서 0.125N HCl을 처리하여 탈퓨린화하고, 0.5N NaOH로 변성시킨 후 20×SSC (3M 염화나트륨, 0.03M 시트르산 나트륨)로 비하전 나이론 막에 전이하였다. 6 시간 내지 24시간 동안 블로팅한다음, 필터를 0.5M Tris HCl(pH 7.5), 0.15M NaCl로 중화하고 50mM Tris-붕산염 EDTA로 간단하게 수세하였다.

가교(cross-linking)를 위해, 필터를 투명한 플라스틱 랩에 감고나서 DNA쪽을 5분간 자외선에 노출시켰다. 라이브러리 검색(본 실시예의 섹션 2 참고)에 대해서 기술된 것과 같은 방법으로 혼성화 및 세정을 실시하였다. 다른 종에도 유사한 유전자가 존재하는지 알아보기 위해 혼성화 분석을 약간 변형하여 실시하였다. DNA 필터를 Clonetech(카탈로그 번호 7753-1)로부터 구입하였는데, 이것은 레인 마다 다양한 종으로부터 유래된 5㎍의 EcoRⅠ 분해된 DNA를 포함한다. 프로브를 상기 섹션 2에 기술된 바와 같은 방법으로 PCR 증폭에 의해 표지하고, 10% 덱스트란 설페이트를 함유하는 80% 버퍼 B(2g 폴리비닐피롤리딘, 2g Ficoll-400, 2gBSA, 50㎖ 1M Tris-HCl(pH 7.5), 58g NaCl, 1g 소디움 피로포스페이트, 10g SDS, 950㎖ H₂O)로 혼성화하였다. 프로브를 10분간 끓여 변성시킨다음 신속하게 얼음물로 냉각하였다. 상기 프로브를 10⁶dpm³²P/㎖로 혼성화 버퍼에 첨가하여 60℃에서 밤새 항온배양하였다. 60℃에서 상기 필터를 일차로 버퍼 B로 세정하고, 이어서 2×SSC, 0.1% SDS로 세정한다음 1×SSC, 0.1% SDS로 세정하였다. 높은 엄격성 실험으로, 최종 세정은 0.1×SSC, 1% SDS로 하고 온도를 65℃로 승온시켰다.

서던 블로팅의 데이타를 지놈 클론의 제한지도를 작성하는데 이용하였고, 어느 소단편(subfragments)이 GGF 프로브(2차 클로닝을 위한 후보)에 혼성화되는지를 파악하는데 이용하였다.

Ⅴ. 혼성화 프로브에 대해 상동성인 DNA 분절의 2차 클로닝

DNA 분해물(예컨대, 5㎍)을 1% 아가로스 겔상에 로딩하고나서 염색한 후에 적당한 분획들을 겔로부터 절제해내었다. 상기 DNA를 유리구슬에 흡착시킨 후 공급자(Bio 101)에 의해 설명된 프로토콜을 이용하여 용출함으로써 정제하였다. 회수된 DNA 분획들(100-200 ng)을 T4 리가제(New England Biolabs)를 이용하여 선형 디포스포릴레이티드 벡터, 예컨대, pUC18의 유도체인 pT3T7(Ambion)에 연결하였다. 이러한 벡터들은 E.coliβ 락타마제 유전자를 갖고 있기 때문에, 형질전환체들은 암피실린을 함유하는 플레이트 상에서 선별될 수 있다. 상기 벡터는 또한 숙주에 대해 β-갈락토시다아제 상보성을 제공하므로, 비-재조합체(청색)들은 이소프로필티오갈락토시드 및 Bluogal(Bethesda Research Labs)을 이용하여 검출될 수 있다. 일부의 연결반응을 이용하여 E . coli K2 XL1 청색 컴피턴트 세포(Stratagene 카탈로그 번호 200236)를 형질전환시킨 후, 50㎍/㎖ 암피실린을 포함하는 LB 플레이트상에서 형질전환체를 선별하였다. 백색 콜로니들을 선택하여 DNA 분해 및 DNA 서열 분석을 위해 플라스미드 미니 조제를 제조하였다. 선택된 콜로니들을 그들의 삽입된 DNA가 GGF 프로브와 혼성화되는지를 확인하기 위해 재실험하였다.

Ⅵ. DNA 서열 결정

표준적인 프로토콜에 따라 5㎖ 컬처로부터 이중가닥 플라스미드 DNA 주형을 제조하였다. Sequenase 2.0 및 디데옥시뉴클레오티드 서열 결정 키트(US Biochemical)를 이용하여 제조자의 프로토콜(Sanger 등의 PNAS의 변형: USA74: 5463 (1977))에 따라 디데옥시 사슬 종결방법에 의해 염기서열을 결정하였다. 대안으로, 서열결정은 사이클 서열 결정 키트(New England Biolabs ; Bethesda Research Labs)를 이용하여 DNA 열 사이클러(DNA thermal cycler)(Perkin Elmer, model 4800)로 행하되, 제조자의 지시에 따라 5'-말단 표지된 프라이머를 이용하여 서열결정하였다. 서열결정 프라이머는 서열결정 키트와 함께 공급되는 것이거나 또는 클론으로부터 결정된 서열에 따라 합성된 것들이었다. 서열결정 반응물을 0.4mm 두께의 6% 폴리아크릴아마이드 서열결정 겔상에 로딩하여 용해시켰다. 겔을 건조하고나서 X-선 필름에 노출시켰다. 전형적으로, 표준 서열결정 키트가 사용되는 경우에는 35S가 혼입되었고, 사이클 서열결정 반응에는³²P말단 표지된 프라이머가 이용되었다. 겔의 하단으로부터 겔의 상단까지(5'→ 3' 방향) DNA 서열 에디터로 서열을 판독하고 Genetics Computer Group(GCG, University of Wisconsin)에 의해 제공된 프로그램을 이용하여 상기 데이타를 분석하였다.

Ⅶ. RNA 제조 및 PCR 증폭

지놈 DNA에서 검출되고 GGF 펩타이드를 코드화하는 서열을 포함하는 개방 해독틀을 뇌하수체 RNA의 PCR 증폭에 의해 증량하였다. RNA는 구아니딘 중성-CsCl 방법(Chirgwin등, Biochemistry18: 5294 (1979))에 따라 냉동된 소 조직(Pelfreeze)으로부터 준비하였다. 폴리아데닐화된 RNA를 oligo-dT 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피(Aviv 및 Leder. PNAS (USA)69: 1408 (1972))에 의해 선택하였다.

특이적인 DNA 표적 서열을 Perkin Elmer PCR/RNA Kit Number: N808-0017를 이용하여 cDNA로 전환된 전체 RNA 또는 폴리아데닐화된 RNA 시료중의 하나를 시작으로 증폭하였다. 1㎍ 주형 RNA 및 부착된 제한효소 인식부위 링커를 갖는 oligo-dT 프라이머 또는 제한부위가 부착되어 있는 클로닝된 서열로부터 결정된 특이적인 안티센스 프라이머를 최초의 가닥 역전사 반응(first strand reverse transcription)에 이용하였다. 2번째 가닥을 생성하기 위한, 프라이머는 3?? RACE 반응(Frohman 등, PNAS (USA)85: 8998 (1988))에서 사용되는 것과 같은 플러스 가닥 유일 서열(unique sequence)이거나 또는 2번째 표적부위가 첫번째 가닥 반응 생성물에 dATP로 말단 트랜스페라제 테일링(예컨대, 5' race 반응, Frohman 등, 동일문헌)에 의해 부착되면 제한부위가 부착된 올리고-dT 프라이머이다. 대안으로, 고정 PCR 반응에서와 같이 2번째 가닥 프라이머는 변성되어, 특정한 펩타이드 서열을 나타낸다.

증폭 프로파일은 다음의 일반적인 스킴을 따랐다: 1) 95℃에서 5분간 침지 파일(soak file); 2) 95℃에서 1분간 열 사이클 파일(thermal cycle file); 1분간 어닐링 온도인 45℃, 50℃ 또는 55℃까지 서서히 감온한다; 1분간 어닐링 온도를 유지; 1분에 걸쳐서 72℃까지 서서히 승온시킨다; 72℃에서 1분간 또는 1분 10초간 자동 증량 ; 3) 72℃에서 5분간 증량 사이클 및; 4)제한시간 동안 40℃에서 침지 파일. 열 사이클 파일(#2)은 통상 30 사이클 진행된다. 각각의 100㎕ 증폭반응물 중에서 16㎕ 시료를 취하여 3시간 동안 4V/cm로 TAE 버퍼내에서 주행된 2% Nusieve 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석하였다. 겔을 염색하고, 이어서 비하전 나이론 막에 블로팅 한 후 프라이머 내부에 있는 표지된 DNA 프로브에 의해 프로밍된 하였다.

특정한 한벌의 DNA 증폭 생성물은 블로팅 실험에 의해 확인될 수 있고, 그들의 위치는 정제 및 재증폭을 위한 가이드로서 이용될 수 있다. 적당한 경우, 선택된 시료의 나머지 부분을 정제 겔에 로딩하고나서 전기영동한 후에 겔로부터 0.5mm 두께의 4 내지 5 슬라이스(특정 생성물의 예상 위치를 포괄하는)를 취하였다. 아가로스를 파쇄하여 40℃에서 2-16 시간 동안 0.5㎖ 전기영동 버퍼에 침지하였다. 파쇄된 아가로스를 2분간 원심분리하여 상층액을 새 튜브로 옮겼다.

용출된 재료 5㎕(생성물의 약 1% )로 최초의 증폭반응에서와 동일한 한벌의 프라이머 및 반응 프로파일을 이용하여 재증폭을 행하였다. 재증폭반응이 종결된 후 시료들을 클로로포름으로 추출하여 새 튜브로 옮겼다. 반응물에 농축 제한효소 버퍼 및 효소를 첨가하여 링커내의 제한 부위를 절단하였다. 분해된 PCR 생성물을 겔 전기영동에 의하여 정제하고나서 위의 2차 클로닝 섹션에서 설명된 바와 같은 방법으로 벡터내에 2차클로닝하였다. 상술한 대로 DNA 서열결정을 행하였다.

Ⅷ. DNA 서열 분석

DNA 서열은 분획 조립 프로그램(fragment assembly program)을 이용하여 조립되었고, 아미노산 서열들은 GCG 프로그램 겔 조립, 지도작성 및 해독에 의해 추론되었다. 상기 추론된 단백질 서열은 WordSearch를 이용하여 단백질 서열 데이타베이스를 검색하기 위한 탐색 서열(query sequence)로 이용되었다. VMS 5.1 하에서 작동하는 VAX 스테이션 3100 워크스테이션에 의해 분석하였다. 데이타베이스 검색은 GCG 버젼 7.0을 이용하여 SwissProt 출고 번호 21로 수행하였다.

Ⅸ. GGF-Ⅰ 및 GGF-Ⅱ를 코드화하는 유전자의 클로닝 및 서열결정 결과위에서 지적된 바와 같이, 소의 GGF-Ⅱ를 코드화하는 DNA 서열을 동정하기 위해 변성 올리고뉴클레오티드 프로브는 GGF-Ⅱ 펩타이드 서열로부터 설계되었다. 정제된 GGF-Ⅱ 조제로부터 리실 엔도펩티다아제 분해에 의해 생성된 펩타이드인 GGF-Ⅱ 12(서열 44)(도 16 및 도 12 참고)는 정제된 GGF-Ⅰ 조제로부터 생성된 트립신 펩타이드인 GGF-Ⅰ 07(서열 39)와 강한 아미노산 서열 상동성을 시현하였다. 따라서, 상기 GGF-Ⅱ 12는 10 개의 변성 올리고뉴클레오티드 프로브(도 20의 oligos 609, 610 및 649 내지 656, 서열 66, 67, 18 및 75 각각 참고)를 제조하는데 이용되었다. 필터의 두 세트를 GGF-Ⅱ 12 두 개의 중첩부분을 코드화하는 두 세트(세트 Ⅰ=609, 세트 Ⅱ=649-5656)의 프로브로 프로빙하였다. 혼성화 시그날이 관찰되었으나 단지 하나의 클론만이 두 프로브 세트에 혼성화되었다. 상기 클론(이하 GGF2BG1으로 표기)을 정제하였다.

파아지 클론 GGF2BG1으로부터의 DNA의 서던블롯 분석은 두 세트의 프로브가 모두 그러한 소 DNA 서열과 혼성화한다는 것을 입증해 주고, 두 프로브들이 클론내에 있는 동일한 세트의 DNA 분획들과 반응한다는 것을 증명해준다. 이러한 실험에 기초하여 최초 클론의 4kb의 Eco RI 2차-분획을 동정하고 2차 클로닝하여 부분적으로 서열결정하였다. 도 21는 프로브 609 및 650의 혼성화 부위를 포함하는 최초 DNA 서열의 뉴클레오티드 서열(서열 89)과 추론된 아미노산 서열을 도시한 것으로, 이러한 소 지놈 DNA의 일부가 펩타이드 12(KASLADSGEYM)를 코드화한다는 것을 증명해준다.

다른 서열 분석은 GGF-Ⅱ 12(이하 참조)가 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자 및 cDNA를 나타내는 중첩서열 분리의 시발점이 된 66 아미노산 개방 해독틀상에 존재한다는 것을 증명해준다.

몇몇 PCR 방법이 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자에 대한 추가의 암호 서열을 수득하기 위해 이용되었다. 전체 RNA 및 올리고 dT-선택된 (폴리A를 포함하는) RNA 시료들을 소의 전체 뇌하수체, 뇌하수체 전엽, 뇌하수체 후엽 및 시상하부로부터 준비하였다. 도 22, 서열 109-119에 도시된 리스트상의 프라이머를 이용하는 일방(one-sided) PCR 반응(RACE)을 이용하여 3' 및 5' 방향 모두로 cDNA 말단을 증폭하였고, 추가의 GGF-Ⅱ 펩타이드를 나타내는 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 고정(anchored) PCR 반응을 수행하었다. 도 29는 이 실험들에 의해 수득된 인접한 DNA 구조물 및 서열을 정리한 것이다. 3' RACE 반응으로부터, 3 가지의 상이하게 접속된 cDNA 서열들이 생성되었는데, 이것을 클로닝하고 서열결정하였다. 5' RACE 반응에 의해 52 아미노산 이상의 암호서열을 포함하는 추가의 엑손이 발견되었다. 그와 같은 추론된 아미노산 서열 분석에 의해서 펩타이드 GGF-Ⅱ-6 서열 및 GGF-Ⅰ-18에 유사한 서열이 밝혀졌다(이하 참조). 고정 PCR 반응에 의해 300 bp의 추가 cDNA 분절내에 포함되어 있는 펩타이드 GGF-Ⅱ-1, 2, 3, 및 10의 암호 서열(cDNA)이 확인되었다. 이 분절(즉, 분절 E, 도 30의 참고)의 5' 경계는 펩타이드 GGF-Ⅱ-1를 코드화하고 PCR 반응에 이용된 올리고뉴클레오티드로 규정된다(실시예 11에서 사람 클론에 대해서 기술된 대로 추가의 5' 서열 데이타가 존재한다.). 따라서 이 클론은 기존의 총 9 개의 신규한 GGF-Ⅱ 펩타이드 서열 중 6 개를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

클로닝된 유전자는 일차로 그들이 발견되었을 때 암호서열의 위치결정을 가능케 하는 GGF2BG1의 물리적 지도를 작성함에 의하여 특성화되었다(이하 참조, 도30). 상술된 암호서열로부터의 DNA 프로브는 이 파아지 클론상의 엑손을 포함하는 다른 DNA 분획을 동정하는데 및 양 방향으로 중첩되는 클론을 동정하는데 이용되었다. 추정 소 GGF-Ⅱ 유전자는 적어도 5 개의 암호분절로 분할된다. 암호분절은 보편 유전암호를 이용하여 폴리펩타이드 서열로 해독될 수 있는 서로 다른 길이의 DNA 서열로 정의된다. 도 36에 기술되고 본원에 인용된 암호분절들은 1) GGF 유전자내에 존재하는 특수한 엑손(예컨대, 암호분절 a)이거나, 또는 2) 특수한 mRNA 서브-그룹에 나타나는 두 개 이상의 엑손의 세트로부터 유래되는데, 여기서 각 세트는 유전자 산물에서 보여진 바와 같이 특수한 폴리펩타이드 분절로 해독될 수 있다. 특허청구범위에서 언급된 폴리펩타이드 분절들은 유사 DNA 암호분절의 해독산물들이다. 현재까지 단지 암호가닥 A 및 B 만이 엑손으로 규정되었고 서열결정 및 지도작성되었다. 확인된 인접한 암호서열의 개요를 도 31에 나타내었다. 엑손들은 그들이 발견된 순서 대로 알파벳순으로 열거하였다. 인트론/엑손 경계로부터 엑손 B가 암호분절 E 및 암호분절 A를 연결하는 cDNA내에 포함될 수 있다는 것이 자명해진다. 즉, 엑손 B는 해독틀을 손상시키지 않고 접속될 수 없다. 따라서, 우리는 3 가지의 대안적인 접속양식이 추정 GGF-Ⅱ cDNA 서열 1, 2 및 3을 생성할 수 있다는 것을 제안한다. 각각 GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS 및 GGF2BPP3.CDS으로 표기되는 이들의 암호서열은 각각 도 27A(서열 129 및 188), 도 27B(서열 130 및 189) 및 도 27C(서열 131 및 190)에 나타내었다. 상기 3 cDNA의 추론된 아미노산 서열도 도 27A(서열 129), 도 27B(서열 130) 및 도 27C(서열 131)에 나타내었다.

상기 3 가지의 추론된 구조물들은 206, 281 및 257 아미노산 길이의 단백질들을 코드화한다. 추론된 단백질 서열의 처음 183 잔기들은 3 가지 유전자 생성물에서 모두 동일하다. 184 위치에서 클론들은 매우 다르다. GGF2BPP1에 있는 글리신 GGT에 대한 코돈은 각각 양자택일로 엑손 C, C/D, C/D' 및 D 또는 C, C/D 및 D에 부가하고, 도 32, 서열 145 및 204에 도시된 GGF2BPP2 및 GGF2BPP3에 대한 접속 공여자(splice donor)로 기능한다. GGF2BPP1는 암호분절 A 접속 접점을 지나서 다음 간섭서열(인트론)로 해독하여 생성된 불완전한 유전자 생성물이다. 이것은 도 30에서 암호분절 A'를 나타낸다(서열 136 및 195). 전사체는 정규의 AATAAA 폴리아데닐화 서열에 인접하여 끝나고, 우리는 이러한 절두된 유전자 생성물이 진실한 성숙 전사체라고 제안한다. 다른 두 가지의 보다 긴 생성물은 동일한 3' 비해독 서열 및 폴리아데닐화 부위를 공유한다.

이들 세 분자들 모두는 9 개의 신규한 GGF-Ⅱ 펩타이드 서열(도 11 참고) 중에서 6개를 포함하고 다른 펩타이드는 GGF-Ⅰ-18(도 26 참고)과 매우 유사하다. 이러한 발견은 이 재조합 분자가 소 GGF-Ⅱ의 적어도 일부분을 코드화할 높은 가능성을 제공해준다. 더우기, 상기 3 단백질에 대해 계산된 등전점은 GGF-Ⅱ 및 GGF-Ⅰ의 물리적 특성과 일치한다. GGF-Ⅱ의 분자 크기가 대략 60kd이므로, 상기 3 cDNA 중에서 가장 긴 것은 예상된 아미노산 수의 1/2을 갖는 단백질을 코드화해야만 한다.

엑손 B 및 A를 포괄하는 프로브를 PCR 증폭을 통해서 표지하여, 소의 뇌하수체 전엽으로부터 분리된 RNA로부터 제조된 cDNA 라이브러리를 검색하는데 이용하였다. 하나의 클론(GGF2BPP5)은 도 29에 도시된 양식을 나타내었고, 암호분절 A 및 C 사이에 추가의 DNA 암호 분절(G)을 포함하였다. 전체 핵산 서열은 도 31(서열 144)에 도시하였다. 가장 긴 개방 해독틀로부터 추론된 해독 생성물은 241 아미노산이다. 약간의 2 차 cDNA(GGF2BPP4)는 상술한 프로브를 이용하여 소의 뇌하수체 전엽 라이브러리으로부터 분리되었다. 이 클론은 도 29에 도시된 양식을 나타내었다. 이 클론은 5' 말단이 불완전하나 암호분절 G 및 D가 없는 점에서 접속변이체에 해당한다. BPP4 역시 C/D 부위 외에 H, K, 및 L 부위를 갖는 신규한 3' 말단을 갖는다. BPP4의 서열은 제33도에 도시하였다(서열 146).

실시예 11

다양한 종에서의 GGF 서열

GGF 단백질은 신규한 초과(superfamily)의 구성원이다. 다른 포유동물 DNA들을 이용한 매우 엄격한 교차 혼성화 연구(DNA 블로팅 실험)을 통해서 우리는 이러한 소의 재조합 분자들로부터 유래된 DNA 프로브들이 용이하게 다양한 시험 시료내에 있는 특정한 서열을 검출해낼 수 있다는 것을 분명하게 확인하였다. 상동성 높은 서열이 사람 지놈 DNA에서도 발견되었다. 그 방사성 자동사진을 도 28에 도시하였다. 쥐 및 사람 DNA를 포함하는 레인에 있는 시그날은 GGF의 쥐 및 사람 균등물을 나타내고, 이 유전자에 의해 코드화되는 몇몇 cDNA's의 서열은 최근에 Holmes등(Science256: 1205 (1992)) 및 Wen 등(Cell69: 559 (1992))에 의해 보고되었다.

실시예 12

사람 GGF2를 코드화하는 사람 서열의 분리

소의 GGF-Ⅱ 암호 분절 E로부터의 서열을 포함하는 몇몇 사람 클론을 뇌조직으로부터 제조된 사람 cDNA 라이브러리(Stratagene 카탈로그 번호 #935206)을 검색하여 분리하였다. 이러한 전략은 대부분의 GGF2 펩타이드(GGF2에 유일)와 소의 E 분절을 포함하는 클론으로부터 예측 서열 사이의 강한 연관성에 근거하여 수행되었다. 이 라이브러리를 후술하는 올리고뉴클레오티드 프로브 914-919를 이용하여 실시예 8, 섹션 Ⅱ에 기술된 바와 같이 검색하였다.

914TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA (서열: 179)

915TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT (서열: 180)

916ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA (서열: 181)

917TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA (서열: 182)

918AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA (서열: 183)

919ATGARGTGTGGGCGGCGAAA (서열: 184)

이러한 프로브에 의해 검출된 클론들을 혼성화에 의하여 더욱 더 분석하였다. 암호분절 A로부터의 PCR 생성물을 표지하여 제조된, 암호분절 A로부터 유래된 프로브(도 30 참고)도 일차 라이브러리를 검색하는데 이용되었다. A 및 B 유래 프로브 모두와 혼성화하는 몇몇 클론들을 선택하고, 하나의 특수한 클론 GGF2HBS5를 추가 분석을 위해 선택하였다. 이 클론은 암호분절(도 30에 도시된 바와 같은 EBACC/D'D)의 양식에 의해 표현된다. 이 클론에 있는 상기 E 분절은도 30에 도시된 E의 절두된소의 변형체의 사람 균등물이다. GGF2HBS5는 기술된 모든 '추정' GGFⅡ 후보 가운데 GGFⅡ를 코드화할 것같은 가장 유력한 후보이다. 암호화 서열 분절 E의 길이는 786 뉴클레오티드와 비해독 서열 264 염기의 합이다. GGF2HBS5에 의해서 코드화되는 단백질의 예상 크기는 대략 423 아미노산(약 45kD, 도 44, 서열 21 및 186 참조)인데, 이것은 GGF의 디글리코실화된 형태의 크기와 유사하다(실시예 20 참고). 또한, 도 26에 열거된 GGFⅡ 펩타이드 중 7 개는 E 부위로부터 예상되는 단백질 서열에 속하는 서열과 동일한 서열을 갖는다. 펩타이드 Ⅱ-6 및 Ⅱ-12는 예외로서, 각각 암호분절 B 및 암호분절 A에 속한다. GGF2HBS5 단백질을 코드화하는 RNA를 GGF2HBS5 삽입물을 포함하는 벡터(Bluescript SK[Stratagene Inc.] 도 47 참고)내에 있는 박테리오파아지 T7 프로모터에 의해 구동되는생체외전사 시스템에 의해서 제조하였다. 이 RNA를 무세포(토끼 망상적혈구) 해독 시스템내에서 해독시켰는데, 단백질 생성물의 크기는 45kD이었다. 또한, 무세포 생성물은 생물학적 활성을 확인하기 위해 쉬반세포 유사분열촉진성 분석법에 의해 분석되었다. 조정 배지로 처리된 쉬반세포는¹²⁵I-유리딘 혼입으로 측정할 때 증식 증가 및 185kD 범위내

단백질의 티로신 상의 인산화 증가를 모두 나타내었다.

따라서, GGF2HBS5에 의해서 코드화되는 생성물의 크기 및 도 11에 도시된 소 펩타이드와 매우 유사한 사람 펩타이드를 코드화하는 DNA 서열의 존재는 GGF2HBS5가 소 GGF2의 사람 균등물을 코드화함을 증명해준다. 이러한 세포로 형질전환된세포로부터 제조된 조정 배지가 쉬반세포 유사분열촉진 활성을 유도한다는 사실은 GGF2HBS5 유전자 생성물(BPP5 유전자 생성물과 비유사)이 분비되었다는 것을 증명해준다. 또한 GGFⅡBPP5 유전자 생성물은 p185^erbB2와 같은 수용체 티로신 키나제 또는 밀접하게 관련된 수용체를 통해서 쉬반세포 증식반응을 매개하는 것으로 보인다(실시예 19 참고).

실시예 13

포유동물 및 곤충 세포에서 사람 재조합 GGF2의 발현

사람 GGF2를 코드화하는 GGF2HBS5 cDNA 클론(실시예 12에서 기술되고 본원에서 HBS5로 언급된 바와 같은 )을 벡터 pcDL-SRα296내로 클로닝하였고 COS-7 세포를 DEAE-덱스트란 방법에 의해 100㎜ 디쉬내에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 경과후 3일 또는 4일 후에 일시적으로 발현하는 COS 세포로부터 세포 용해물 또는 조정배지를 회수하였다. 용해물을 만들기 위해, 세포 단층을 PBS로 세정하고, 디쉬로부터 떼어내어 150㎛의 0.25M Tris-HCl(pH 8)내에서 3회 냉동/해빙 사이클에 의해 용해시켰다. 세포 잔해를 가라 앉혀 펠렛으로 만들고 상층액을 회수하였다. 조정배지 시료(7 mls.)를 모은다음 농축시키고 제조자(Amicon, Beverly, MA)에 의해 설명된 대로 Centiprep-10 및 Centicon-10 단위를 이용하여 버퍼를 10㎜ Tris, pH 7로 교환하였다. 상술한 대로 쥐의 신경 쉬반세포를 DNA 합성 전구체의 혼입에 대해 분석하였다. 조정배지 또는 세포 용해물 시료를 Marchionni et al.,Nature362:313 (1993)에 기술된 바와 같은 쉬반세포 증식 분석법으로 시험하였다.

GGF2를 코드화하는 cDNA, GGF2HBS5는 배지에 대한 단백질 생성물의 분비를 명령하였다. 세포 용해물을 이용하여 분석할 때 세포내에서 최소한의 활성이 검출가능하였다. GGF2HFB1 및 GGFBPP5 cDNA's는 세포외 배지에 대한 생성물의 분비를 명령하지 못하였다. 이들 클론들의 GGF 활성은 세포 용해물에서만 검출가능하였다.

재조합 GGF2는 또한 CHO 세포내에서도 발현되었다. GGF2를 코드화하는 GGF2HBS5 cDNA를 벡터 pcdhfropolyA의 EcoRⅠ 부위내에 클로닝하고, 인산칼슘 공침전 방법(calcium phosphate coprecipitatipn method)에 의해 DHFR 음성 CHO 세포주(GG44)에 트랜스펙션하였다. 96-웰 플레이트상에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 없는 α 배지(Gibco)내에 클론들을 선택하였다. 3주 경과 후, 개개의 클론으로부터의 조정배지 시료를 Marchionni et al.,Nature362:313 (1993)에 기술된 바와 같은 쉬반세포 증식 분석법으로 GGF의 발현에 대해 시험하였다. 상당한 수준의 GGF 활성을 배지내에 분비한 안정한 클론들이 확인되었다. 서로 다른 용적 분취량의 CHO 세포 조정배지로부터 수득한 쉬반세포 증식 활성 데이타를 이용하여 도 46에 도시된 투여량 반응곡선(Graham and Van Der Eb, Virology 52:456, 1973)을 제작하였다. 이 재료를 GGF2 특이성 단백질에 대하여 형성된 다클론성 항혈청으로 프로빙된 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 약 65kD(뇌하수체로부터 추출된 GGF2의 예상 크기)의 하나의 밴드가 특이적으로 표지되었다(도 48, 레인 12).

재조합 GGF2는 버큘로바이러스 발현을 이용하여 곤충 세포내에서도 발현되었다. GGF2HBS5 cDNA 클론을 포함하는 버큘로바이러스로 Sf9 곤충 세포를 증식수(multiplicity) 3-5(10⁶세포/㎖)로 감염시켜 Sf900-Ⅱ 배지에서 배양하였다. 쉬반세포 유사분열촉진 활성이 세포외 배지에 분비되었다. 상이한 용적의 곤충 세포 조정배지를 포스콜린의 부재하에서 쉬반세포 증식 분석법으로 시험하고, 그 데이타를 이용하여 투여량 반응곡선을 제작하였다.

이 재료들도 전술한 GGF Ⅱ 특이성 단백질로 프로빙된 웨스턴 블롯(제 45B도)으로 분석하였다.

본 실시예에서 이용된 방법들은 다음과 같다: 재조합 사람 및 소 글리아 성장인자의 쉬반세포 유사분열촉진 활성은 다음과 같이 측정되었다: 배양된 쉬반세포의 유사분열촉진 반응을 일시적 포유동물 발현 실험으로부터 수득된 조제(crude) 재조합 GGF 제품을 이용하여 5μM 포스콜린의 존재하에서 측정하였다. 상기 '방법'에서 기술된 바와 같이 트렌스펙션된 또는 가짜 트렌스펙션된 COS 세포로부터 수득된 물질에 18-24시간 노출시킨 후 [¹²⁵I]-Urd의 혼입을 측정하였다. 4 세트의 데이타의 평균 및 표준편차를 나타내었다. 부분적으로 정제된 천연 소 뇌하수체 GGF(카복시메틸 셀룰로오스 분획; Goodearl et al., 제출)에 대한 유사분열촉진반응은 100% 활성의 기준으로 나타내었다(GGF).

cDNA(도 46, 서열 166-168)를 pcDL-SRα296내로 클로닝하였고(Takebe et al., Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)), COS-7 세포를 DEAE-덱스트란방법(Sambrook et al.,In Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd, ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)) 에 의해 100㎜ 디쉬내에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 경과후 3일 또는 4일 후에 세포 용해물 또는 조정배지를 회수하였다. 용해물을 만들기 위해, 세포 단층을 PBS로 세정하고, 디쉬로부터 떼어내어 150㎕의 0.25M Tris-HCl(pH 8)내에서 3회 냉동/해빙 사이클에 의해 용해시켰다. 세포 잔해를 가라 앉혀 펠렛으로 만들고 상층액을 회수하였다. 조정배지 시료(7 mls.)를 모은다음 농축시키고 제조자(Amicon, Beverly, MA)에 의해 설명된 대로 Centiprep-10 및 Centicon-10 단위를 이용하여 버퍼를 10mM Tris, pH 7로 교환하였다. 상술한 대로 쥐의 죄골 신경 쉬반세포를 DNA 합성 전구체의 혼입에 대해 분석하였다(Davis and Stroobant, J. Cell Biol. 110:1353-1360 (1990); Brockes et al., Brain Res. 165:105-118 (1979)).

재조합 CHO 세포 조정배지의 웨스턴 블롯을 다음과 같이 수행하였다: 재조합 CHO 클론을 3일간 단백질이 없는 MCDB302에서 배양하였다. 2㎖의 조정배지를 회수하여 농축하고, 버퍼를 10mM Tris-HCl, pH 7.4로 교환하여 동결건조하였다. 펠렛을 SDS-PAGE 시료 버퍼에 재현탁시켜 환원 SDS 전기영동하고 GGF 펩타이드 항체로 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다. CHO 대조군은 트렌스펙션되지 않은 CHO-DG44 숙주의 조정배지에 의해 수행되었고 재조합 클론의 조정배지를 이용하여 CHO HBS5 수준을 분석하였다.

실시예 14

GGF의 기능 요소(Functional Elements)의 확인

GGF 서열군의 추론된 구조는 GGF2BPP4로 표현되는 가장 긴 형태가 그 세포외 부분이 표피성장인자와 닮은 도메인을 포함하는 막간 단백질(transmembrane prorein)을 코드화하는 것을 암시해준다(Carpenter and Wahl in Peptide Growth Factors and Their Receptors Ⅰ pp. 69-133, Springer-Verlag, NY 1991 참고). 암호분절 C 및 C/D 또는 C/D' 펩타이드 서열내 시스테인 잔기의 위치는 표피성장인자(EFG) 펩타이드 서열에 있는 유사체 잔기에 대해 보존되어 있다(도 32, 서열 147-149). 이것은 세포외 부분이 수용체 인식 및 생물학적 활성 부위로 기능한다는 것을 암시해준다. 몇몇 변이체 형태는 H, K, 및 L 암호분절이 없으므로 분비성, 확산성 생물활성 단백질로 발현될 수 있을 것이다. EGF 유사 도메인(EGFL)을 포함하는 폴리펩타이드를 코드화하는 GGF DNA 서열은 글리아 세포 유사분열촉진활성을 자극하는 모든 생물학적 활성을 구비할 수 있다.

이러한 단백질의 막 결합 변형물은 만약 배발생중 또는 신경재생 중에 뉴론의 표면에서 발현된다면 쉬반세포 증식을 유발할 수 있다(뉴론의 표면은 증식하는 쉬반세포의 표면과 매우 가깝게 결합되어 있다).

분비된(막에 결합되지 않은) GFF는 그들의 분비 지점으로부터 다소 떨어져 있는 쉬반세포와 상호작용할 수 있는 전형적인 확산가능한 인자로 작용한다. 다른 형태들은 조직 손상 및 세포파괴를 통한 공급원에 의해 세포내로부터 방출될 수 있다. 분비된 GGF의 일례로는 GGF2HBS5에 의해 코드화된 단백질이 있다; 이것은 세포 밖으로 향하게 되는 것으로 밝혀진 유일한 GGF이다. 분비는 부위 E에서만발견되고, GGF2HBS5에 의해 코드화되는 재조합 GGF2내에 포함되어 있는 N-말단 도메인인 N-말단 소수성 서열에 의해 중재될 것이다.

다른 GGF들은 비분비성인 것으로 보인다. 이들 GGF들은 조직 손상의 결과로 방출되는 상해반응 형태(insury response from)일 수 있다.

GGF2의 예상된 단백질 구조물(GGF2HBS5에 의해 코드화되는)의 다른 부위들 및 부위 B 및 A를 포함하는 기타 단백질들은 사람 기저막(basement membrane) 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 코어 단백질과의 유사성을 시현한다. 이들 GGF's에서 폴딩된 C2 면역글로부린의 두 번째 시스테인 다음에 위치되는 펩타이드 ADSGEY는 기저 라미나 단백질내에서 발견된 22 개의 C-2 반복부위 중 9개꼴로 나타난다. 이 증거는 이들 단백질들이 뉴론 및 글리아와 결합된 것과 같은 매트릭스 단백질들과 결합할 수 있다는 것을 강력하게 암시해주고, 표적부위에서의 글리아 성장인자 추방방법을 암시해준다.

실시예 15

재조합 세포로부터의 GGFs의 정제

생물활성을 분석하기 위해 전체 길이의 GGFs 또는 그 일부를 수득하기 위하여 클로닝된 DNA를 이용하여 단백질을 과량으로 생산할 수 있다. 몇 가지 접근방법이 이용될 수 있다. 위에서 기술된 서열을 포함하는 재조합 E . coli 세포를 구성할 수 있다. 이러한 목적을 위해 제조자의 지시에 따라 pNH8a 또는 pHH16a(Sratagene, Inc.)와 같은 발현 시스템이 이용될 수 있다. 대안으로, 이들서열들은 포유동물 발현 벡터에 삽입되어 과잉생산 세포주가 구성될 수 있다. 예를들어, 이러한 목적을 위해서 GGF2을 코드화하는 DNA, 클론 GGF2BPP5가 COS 세포내에서 발현될 수 있고 또 pMSXND 발현 벡터(Lee 및 Nathans, J. Biol. Chem.263: 3521-3527, (1981))를 이용하여 중국산 헴스터 난소 세포내에서 발현될 수 있다. 이런 GGF DNA 서열을 포함하는 벡터는 확립된 방법에 따라 숙주 세포내로 트렌스펙션될 수 있다.

일시적 발현이 조사될 수 있거나 G418-내성 클론이 dhfr 유전자(pMSXND 벡터에 포함된)를 증폭시키고, 그 과정에서 인접한 단백질을 코드화하는 서열을 동시-증폭시키는 세포를 선택하기 위해 메토트랙세이트 존재하에서 성장될 수 있다. CHO 세포들은 단백질이 전혀 없는 배지(Hamilton 및 Ham, In Vitro13; 537-547 (1977))에서 유지될 수 있기 때문에, 목적 단백질은 이 배지로부터 정제될 수 있다. 실시예 17에서 생산된 항혈청을 이용하는 웨스턴 분석이 과잉생산된 세포의 조정배지내에서 목적 단백질의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다.

목적 단백질(rGGF2)을 다음과 같이 임시로 발현하는 COS 세포에 의해 조정된 배지로부터 정제하였다. rGGFⅡ를 조정배지로부터 회수하여 양이온 교환 크로마토그래피(POROS-HS)를 이용하여 부분적으로 정제하였다. 컬럼은 33.3 mM MES(pH 6.0)로 평형화하였다. 조정배지는 10㎖/min의 유량으로 로딩하였다. 쉬반세포증식활성 및 면역반응성(전술한 GGF2 펩타이드에 대한 다클론성 항혈청을 이용)을 갖는 피크를 50mM Tris, 1M NaCl, pH 8.0으로 용출하였다.

rhGGF2를 안정한 중국산 헴스터 난소 세포주를 이용하여 발현시켰다. 조정배지로부터 회수된 rGGF2를 양이온 교환 크로마토그래피(POROS-HS)를 이용하여 부분적으로 정제하였다. 컬럼은 PBS, pH 7.4로 평형화하였다. 조정배지는 10㎖/min의 유량으로 로딩하였다. 쉬반세포증식활성 및 면역반응성(GGF2 다클론성 항혈청을 이용)을 갖는 피크를 50mM Hepes, 500mM NaCl, pH 8.0으로 용출하였다. 부가적인 피크들은 50mM Hepes, 1M NaCl, pH 8.0에서 면역반응성은 물론 증식 모두에 대해 관찰되었다(도 45).

rhGGF2를 추가로 고해상도 단계로서 소수성 상호작용 크로마토그래피; 양이온 교환/역상 크로마토그래피(제 2의 고해상도 단계가 필요한 경우); 바이러스 불활성화 단계 및 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 DNA 제거 단계를 이용하여 정제하였다.

양이온 교환 컬럼으로부터 용출된 재조합 GGF2 피크의 쉬반세포증식활성을 다음과 같이 측정하였다: 배양된 쉬반세포의 유사분열촉진반응은 5M 포스콜린의 존재하에서 50mM Tris, 1M NaCl, pH 8.0에 의해 용출된 피크를 이용하여 측정되었다. 상기 피크는 20 l,. 10 l(1:10) 10 l 및 (1:100) 10 l로 첨가되었다. 노출 후 18-24 시간 후에¹²⁵I-유리딘의 혼입을 측정하여 (CPM)으로 표현하였다.

GGF2의 펩타이드에 대해 만들어진 다클론성 항체를 이용한 면역블롯을 다음과 같이 실시하였다: 10 l의 상이한 분획들을 4-12% 경사 겔상에서 주행시켰다. 겔을 니트로셀룰로오스 페이퍼로전이하고, 상기 니트로셀룰로오스 블롯을 5% BSA으로 블록하고 GGF2-특이성 항체(1:360 희석)로 프로빙하였다.¹²⁵I 단백질 A(1:500희석, 고유활성도=9.0Ci/g) 2차 항체로 이용하였다. 면역블롯을 6시간 동안 Kodax X-ray 필름에 노출시켰다. IM Nacl에 의해 용출된 피크 분획들은 69K에서 면역반응성 밴드를 보였다.

양이온 컬럼에 의한 GGF2 정제는 다음과 같이 수행되었다: rGGFⅡ를 발현하는 CHO 세포 조정배지를 양이온 교환 컬럼에 10㎖/min의 유량으로 로딩하였다. 컬럼은 PBS, pH 7.4로 평형화하였다. 용출은 각각 50mM Hepes, 500mM NaCl, pH 8.0 및 50mM Hepes, 1M NaCl, pH 8로 행하였다. 모든 분획들을 본원에 기술된 쉬반세포증식분석법(CPM)을 이용하여 분석하였다. 단백질 농도(㎎/㎖)는 표준대로 BSA를 이용한 Bradford 분석법에 의해 측정하였다.

10 l의 각 분획을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하고 면역반응성 및 쉬반세포활성을 관찰하였다.

단백질들은 웨스턴 블롯 분석법을 이용한 방법으로 다방면으로 분석될 수 있다. 대안으로, 본원에 개시된 쉬반세포 유사분열촉진성 분석법이 클론의 전체 길이 또는 그들의 생물활성 부분들의 발현 산물을 분석하는데 이용될 수 있다. 전체 길이 클론 GGF2BPP5는 COS 세포내에서 일시적으로 발현되었다. 트랜스펙션된 COS 세포의 세포내 추출물은 실시예 8에 기술된 쉬반세포 유사분열촉진성 분석법에 의해 분석될 때 생물활성을 나타낸다. 또한 GGF2HBS5를 코드화하는 전체 길이의 클론도 COS 세포내에서 일시적으로 발현되었다. 이 경우에 세포 추출물 및 조정배지 모두는 실시예 8에 기술된 쉬반세포 유사분열촉진성 분석시 생물활성을 나타낸다. GGF 유전자로부터 유래된 접속 변이체 상보성 DNA's 군의 모든 구성원들(헤레귤린 포함)은 이러한 방법으로 발현되고 당업자에 의해 쉬반세포증식 분석법에 의해 분석될 수 있다.

대안으로, 재조합 재료는 접속 변이체 Neu 분화 인자(NDF)를 COS-7 세포내에서 발현시킨 Wen 등((1992) Cell69: 559)에 따라 다른 변이체들로부터 분리될 수 있다. pJT-2 진핵세포 플라스미드 벡터에 삽입된 cDNA 클론은 SV40 초기 프로모터의 지배하에 있고, SV40 종결 및 폴리아데닐화 신호와 3'-측정하고 있다. COS-7 세포들을 다음과 같이 일렉트로포레이션에 의해 pJT-2 플라스미드 DNA로 트랜스펙션하였다: 6×10⁶세포(0.8㎖의 DMEM 및 10% FEBS내)들을 0.4㎝의 큐벳에 넣고 10㎕의 TE 용액(10mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA)내 20㎍의 플라스미드 DNA와 혼합하였다. 일렉트로포레이션은 200Ω로 설정된 펄스 조절 장치를 구비하는 Bio-Rad Gene Pulser 장치를 이용하여 실온에서 1600V 및 15μF에서 수행하였다. 이어서 세포를 20㎖ DMEM, 10% FBS로 희석하고 T75 플라스크(Falcon)로 옮겼다. 37℃에서 14시간 동안 항온배양한 후에, 배지를 DMEM, 1% FBS로 교환하고 추가로 48시간 동안 항온배양하였다. 세포로부터 회수된 재조합 단백질을 포함하는 조정배지는 이 단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포주내에서 생물활성을 나타내었다. 이러한 세포주(배양된 사람 유방암 세포주 AU 565)를 재조합 재료로 처리하였다. 처리된 세포들은 erbB2 수용체의 활성화의 특징인 모르폴러지 변화를 시현하였다. 이러한 유형의 조정배지에 대해 쉬반세포 증식분석을 행하였다.

실시예 16

N-말단 서열 분석

hGGF2를 코드화하는 cDNA를 증폭가능한 벡터 pcdhfrypolyA내에 클로닝하여 안정한 발현을 위해 CHO-DG44 세포로 트랜스펙션하였다. rhGGF2는 조정배지에 분비되었다. 재조합 GGF2의 분비되는 능력은 아마도 N-말단 소수성 스트레치(신호 서열)를 통해서 중재될 것이다. 일단 조면소포체를 횡단하여 성장하고 있는 단백질 사슬이 방출되기 시작하면, 신호서열은 특정한 부위에서 성숙한 단백질로부터 절단된다. 발현 및 정제된 rhGGF2의 N-말단 서열분석에 의해 아래와 같은 절단부위를 알 수 있다. 단백질의 N-말단의 처음 50개의 아미노산 잔기들은 아래의 N-말단 서열분석에 의해 확인되었다(표 5).

rhGGF2의 N-말단 서열분석

사이클	일차 서열	pMoles
1	Gly(G)	210.6
2	Asn(N)	163
3	Glu(E)	149
4	Ala(A)	220
5	Ala(A)	180
6	Pro(P)	173
7	Ala(A)	177
8	Gly(G)	154.9
9	Ala(A)	162.4
10	Ser(S)	65.4
11	Val(V)	132.7
12	Val(V) *(Cys)	11.7
13	Tyr(Y)	113.7
14	Ser(S)	47.6
15	Ser(S)	27.1

N-말단 서열분석은 Edman Degradation Process에 의해 수행하였다.

*Cys 잔기는 Edman Degradation Process에 의해 파괴되어 검출될 수 없다.

아래의 서열(서열: 185)은 hGGF2의 아미노산 서열을 나타낸다. 음영을 준 부분은 절단된 신호서열을 가리킨다.

음영을 준 부분은 rhGGF2의 N-말단에 있는 실험적으로 결정된 15 아미노산들을 나타내는데, 이것은 신호서열에 대한 절단부위로 되는 A₅₀-G₅₁결합을 가리킨다.

실시예 17

다른 접속 변이체의 분리

1992년 10월 23일자로 출원된 미국특허출원 제 07/965,173호(본원에 참고자료로 첨부)에 기술된 다른 뉴레귤린의 갱신방법은 접속 변이(splicing rariatim)의 결과로 생성된 네 개의 밀접하게 연관된 서열(헤레귤린 α, β1, β2, β3)을 생산하였다. Peles 등 (Cell69: 205 (1992)) 및 Wen 등(Cell69: 559 (1992))은 p185^erbB2에 결합하는 단백질을 관련시키는 실시예 1-9 및 11에 기술된 것과 유사한 정제 및 클로닝 접근방법을 이용해서 쥐로부터 다른 접속변이체를 분리하였다.상기 cDNA 클론은 다음과 같이 하여 수득하였다(형질전환된 쥐 섬유아세포 세포주로부터의 p185^erbB2결합 단백질의 정제 및 서열결정에 의해서).

p185^erbB2결합 단백질을 조정된 배지로부터 다음과 같이 정제하였다. 500 롤러 병(총 120ℓ)의 3 가지 회수물이 담지된 조정된 배지를 0.2μ 필터를 통해 여과하여 세정하고 20kD 분자 크기 커트오프를 갖는 막을 이용하는 Pelicon 초원심분리 시스템을 이용하여 31배로 농축하였다. 모든 정제 단계는 Pharmacia의 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템을 이용하여 수행하였다. 상기 농축된 재료를 바로 헤파린- Sepharose 컬럼(150㎖의 PBS로 예비평형된)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 280nm 파장에서 흡광이 나타나지 않을 때까지 0.2M NaCl을 포함하는 PBS로 세정하였다. 이어서 결합된 단백질들을 연속적인 NaCl(250㎖) 경사(0.2M 부터 1.0M까지)를 이용하여 용출하고 5㎖ 분획들을 회수하였다. 시료들(0.01㎖의 회수된 분획들)은 키나제 자극 활성의 정량분석을 위해 이용되었다. 3 컬럼주행으로부터의 활성 분획들(총용량=360㎖))을 담지하여, YM10 한외여과 막(Amicon, Danvers, MA)에 의해 25㎖로 농축한다음 농도가 1.7M이 되도록 황산암모니움을 첨가하였다. 원심분리(10,000×g, 15분)하여 세정한 후에, 담지된 재료를 페닐-Superose 컬럼(HR10/10, Pharmacia)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 0.1M Na₂PO₄(pH 7.4)내 (NH₄)₂SO₄의 45㎖ 경사(1.7M 부터 무염까지)를 이용하여 용출하여 2㎖ 분획들을 회수하고 키나제 자극 활성에 대하여 분석하였다(시료당 0.002㎖)(실시예 19에 기술된방법대로). 활성의 주 피크를 담지하여 50mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.3)에 대해 투석하였다. Mono-S 양이온 교환 컬럼(HR5/5, Pharmacia)을 50mM 인산나트륨으로 예비평형시켰다. 활성물질(0.884mg 단백질; 35㎖)을 로딩한 후에, 컬럼을 출발 버퍼로 세정한다음 NaCl 경사를 이용하여 1㎖/분의 속도로 용출하였다. 키나제 자극 활성은 0.45-0.55M 염에서 나타났고, 2㎖씩의 4 개의 분획에 걸쳐서 광범위하게 나타났다. 이들을 담지하여 곧바로 Cu²⁺킬레이팅 컬럼(1.6㎖, HR2/5, 킬레이팅 Superose, Pharmacia)에 곧바로 로딩하였다. 대부분의 단백질들은 수지에 흡착하였는데, 염화암모니움의 30㎖ 선형 경사(0-1M)에 의해 점진적으로 용출되었다. 상기 활성은 0.05 내지 0.2M NH₄Cl 범위내 하나의 단백질 피크에서 용출되었다. 여러 정제 단계로부터의 시료들을 겔 전기영동에 의해 분석한다음 ICN(Costa Mesa, CA)으로부터의 키트를 이용하여 은염색하고, Bio-rad(Richmond, CA)로부터의 키트를 이용하여 코마시 블루 염료 결합 분석에 의해 그들의 단백질 함량을 측정하였다.

p44 단백질(10㎍)을 200㎕의 0.1M 중탄산암모니움 버퍼(pH 7.8)에 재구성하였다. L-1-토실-아미드 2-페닐에틸 클로로메틸 케톤-처리된 트립신(Serva)으로 37℃에서 18시간 동안 효소-대-기질 비율이 1: 10이 되도록 하여 분해하였다. 그 결과 펩타이드 혼합물을 역상 HPLC에 의해 분리하고 Vydac C4 마이크로 컬럼 (2.1mm i.d. × 15 cm, 300Å) 및 다이오드-어레이 감지기 및 워크스테이션이 장착된 HP 1090 액체 크로마토그래피 시스템을 이용하여 215nm에서 모니터하였다. 상기 컬럼을 0.1% 트리플루오로아세트산 (이동상 A)으로 평형시키고 70분에 걸쳐서 0% ∼55% 이동상 B(90% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산)으로부터의 선형 경사를 이용하여 용출하였다. 유량은 0.2㎖/분이었고 컬럼온도는 25℃로 조절되었다. HPLC 시스템으로부터 수조작에 의해 회수된 펩타이드 피크의 ⅓ 분취량을 Edman 분해에 의한 N-말단 서열 분석에 의해 특성화하였다. 27.7분 후에 용출된 분획(T27.7)은 혼합된 아미노산 서열을 포함하였고 다음과 같이 환원시킨 후에 추가로 재크로마토그래피하였다: 펩타이드 분획의 70% 분취량을 진공건조하여 100㎕의 0.2M 중탄산암모니움 버퍼(pH 7.8)에 재구성하였다. 상기 용액에 DTT(최종 농도 2mM)를 가하여 37℃에서 30분간 항온배양하였다. 이어서 환원된 펩타이드 혼합물을 Vydac C4 마이크로 컬럼 (2.1mm i.d. × 15 cm)을 이용하여 역상 HPLC에 의해 분리하였다. 용출조건 및 유량은 상술한 것과 동일하게 하였다. 상기 펩타이드의 아미노산 서열 분석은 온라인 페닐티오힌단토인(PTH) 아미노산 어낼라이저 및 모델 900 데이타 분석 시스템(Hunkapiller등, (1986)In Methods of Protein Microcharacterization, J.E. Shively, ed (Clifton, New Jersey: Humana Press p. 223-247)이 장착된 모델 477 단백질 서열결정기(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)를 이용하여 실시하였다. 상기 단백질을 폴리브렌 및 NaCl로 예비순환된 트리플루오로아세트산-처리된 유리섬유 디스크상에 로딩하였다. 상기 PTH-아미노산 분석은 이중 시린쥐 펌프 및 역상(C-18) 협내경 컬럼(Applied Biosystems, 2.1mm ×250mm)을 이용하는 마이크로 액체 크로마토그래피 시스템(모델 120)에 의해 수행되었다.

RNA는 표준방법(Maniatis 등, Moleculer Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Habor, New York (1982))에 따라 Rat1-EJ 세포로부터 분리되었고, 폴리(A)⁺는 mRNA 분리기 키트(Clontech Lab, Inc., Palo, Alto, CA)를 이용하여 선별되었다. cDNA는 Superscript 키트(BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD)에 의해 합성되었다. 컬럼-분획된 이중가닥 cDNA를 pCD-X 벡터(Okayama 및 Berg, Mol. Cell Biol.3: 280 (1983))의 유도체인, SalI- 및 Not1-분해된 pJT-2 플라스미드 벡터내에 연결하여 일렉트로포레이션에 의해 DH10B E . coli .세포내로 형질전환시켰다(Dower 등, Nucl. Acids Res.16: 6127 (1988)). NDF의 N-말단(잔기 5-24) 및 T40.4 트립신 펩타이드(잔기 7-12)의 단백질 서열로부터 유래된 두 개의 올리고뉴클레오티드 프로브로 약 5×10⁵일차 형질전환체를 검색하였다. 이들 프로브 각각의 서열은 다음과 같다(N은 모든 4 가지 뉴클레오티드를 의미한다):

⑴ 5'-ATA GGG AAG GGC GGG GGA AGG GTC NCC CTC NGC

A T

AGG GCC GGG CTT GCC TCT GGA GCC TCT-3'

⑵ 5'-TTT ACA CAT ATA TTC NCC-3'

C G G C

(1: 서열 163; 2: 서열 164)

T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 합성 올리고뉴클레오티드의 말단을 [γ-³²P]ATP로 표지하여 니트로셀룰로오스 필터 복제물 세트의 검색에 이용하였다. 혼성화 용액은 6×SSC, 50 mM 소디움 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소디움 피로포스페이트, 2× Denhardt 용액, 50㎍/㎖ 연어 정자 DNA를 포함하고, 20% 포름아미드를(프로브 1의 경우) 포함하거나 포름아미드를 포함하지 않았다(프로브 2의 경우). 상기 필터를 50℃에서 0.5×SSC, 0.2% SDS, 2mM EDTA로 세정하거나(프로브 1의 경우) 또는 37℃에서 2×SSC, 0.2% SDS, 2mM EDTA로 세정하였다(프로브 2의 경우). 필터를 자동방사성사진 촬영해본 결과 10 개의 클론이 두 개의 프로브 모두와 혼성화하는 것으로 나타났다. 이 클론들을 재플레이팅 및 프로브 혼성화에 의해 상술한 방법대로 정제하였다.

상기 cDNA 클론들을 Applied Biosystems 373A 자동 DNA 서열결정기 및 Applied Biosystems Taq DyeDeoxy^TMTerminator cycle 서열결정 키트를 이용하여 제조자의 사용지시에 따라 서열결정하였다. 몇몇의 경우에는 [³⁵S]dATP(Amersham) 및 미국 Biochemical사로부터 수득한Sequenase^TM키트를 이용하여 제조자의 사용지시에 따라 서열결정하였다. cDNA 클론 44의 양 가닥을 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 서열결정하였다. 대부분의 5' 350 뉴클레오티드의 서열은 7 개의 독립된 cDNA 클론으로부터 결정하였다. 그 결과로서 생긴 클론은 도 27에 도시된 양식을 취하는 것으로 확인되었다(NDF).

실시예 9

p185 ^erbB2 수용체와 결합하는 기타 단백질의 정제 및 분석

Ⅰ. gp30 및 p70의 정제

Lupu 등, (Science249: 1552 (1990)) 및 Lippman 및 Lupu(특허출원 PCT/US91/03443 (1990))[본원에 참고자료로 첨부]는 사람 유방암 세포주 MDA-MB-231의 조정배지로부터 단백질을 정제해 내었다.

Lupu 등(Proc. Natl. Acad. Sci.89: 2287(1992))은 p185^erbB2수용체에 결합하는 다른 단백질을 정제하였다. 이러한 특수한 단백질, p75는 10% FBS(Fetal Bovine Serum; GIBCO)이 보충된 개량된 Eagle's 배지(DMEM:GIBCO)내에서 증식된 SKBr-3(사람 유방암 세포주)의 성장을 위해 이용된 조정배지로부터 정제하였다.

Ⅱ. 기타 p185 ^erbB2 리간드

Peles등 (Cell69:205 (1992))은 쥐 세포로부터 p185^erbB2자극 리간드도 정제해내었다. Holmes등 (Science256: 1205 (1992)) 사람 세포로부터 p185^erbB2에 결합하여 자극하는 헤레귤린 α를 정제해 내었다(실시예 5 참조). Tarakovsky등 (Oncogene 6:218 (1991))은 마크로파아지로부터 분리된 25kD 폴리펩타이드의 Neu 수용체, p185^erbB2유사체로의 벤딩을 증명하였다(본원에 참고자료로 첨부).

Ⅲ. NDF 분리

Yarden 및 Peles (Biochemistry30: 3543(1991))는 p185^erbB2수용체를 자극하는 35kD 당단백질을 확인하였다.

다른 간행물에서 Davis등(Biochem. Biophys. Res. Commun.179: 1536(1991), Proc. Natl. Acad. Sci.88: 8582(1991)), 및 Greene등(PCT 특허출원 PCT/US91/02331 (1990))은 사람 T-세포(ALT-2) 세포주의 조정배지로부터의 단백질의 정제를 기술하고 있다.

Huang 등(1992, J. Biol. Chem. 257:11508-11512)[본원에 참고자료로 첨부된]은 소의 신장으로부터 부가적인 neu/erb B2 리간드 성장인자를 분리하였다. 25kD 폴리펩타이드 인자를 컬럼 분획화 방법에 의해 분리해낸 후 DEAE/셀룰로오스(DE52), Sulfadex(sulphated Sephadex G-50), heparin-Sepharose 4B, 및 Superdex 75(고속 단백질 액체 크로마토그래피)상에서 연속적인 컬럼 크로마토그래피하였다. 인자, NEL-GF는 neu/erb B2 유전자 생성물의 티로신-특이성 자기인산화(autophosphorylation)를 자극한다.

Ⅳ. 아세틸콜린 수용체 유도 활성(ARIA)의 정제

아세틸콜린 수용체 합성을 자극하는 45kD 단백질인 ARIA는 Gerald Fischbach(Fall et al., (1993) Cell 72:801-815)의 실험실에서 분리되었다. ARIA는 p185^erbB2를 닮은 185kDa 막간 단백질의 티로신 인산화를 유발하고, 배양된 태아 근관에서 아세틸콜린 수용체 합성을 자극한다. ARIA는 GGF/erbB2 리간드 그룹 단백질의 구성원일 가능성이 높고, 이것은 글리아 세포 유사분열촉진 자극 및예컨대 본원에 개시된 GGF2의 기타의 적용에 유용할 가능성이 있다.

실시예 19

GGF에 의해 매개되는 단백질 티로신 인산화

증식을 유발하기 위해 충분한 수준의 글리아 성장인자로 처리한 후, 쥐 쉬반세포는 단백질 티로신 인산화의 자극을 나타내었다. 실시예 9에 개괄된 방법에 따라 쥐의 쉬반세포의 1차 컬처에 다양한 양의 부분적으로 정제된 GGF를 적용하였다. 쉬반세포들을 폴리D-리신 코팅된 24웰 플레이트에 담긴 DMEM/10% FCS(Fetal Calf Serum/5μM 포르스콜린/GGF-CM㎖ 당 0.5㎍(0.5㎖/웰)에서 성장시켰다. 융합될 때, 세포들에게 웰당 0.5㎖의 DMEM/10% FCS(Fetal Calf Serum)를 공급하여 밤새 항온배양기내에 무활동상태로 방치하였다. 다음 날, 세포들에게 0.2㎖의 DMEM/10% FCS(Fetal Calf Serum)을 공급하고 항온배양기내에 1시간 동안 넣어두었다. 이어서 시험 시료들을 서로 다른 농도로 및 요구되는 서로 다른 기간동안 직접 배지에 첨가하였다. 그 다음으로 세포들을 비등 용해 버퍼(인산나트륨, 5mM, pH 6.8; SDS, 2%, β-멀캅토에탄올, 5%; 디티오트레이톨, 0.1M; 글리세롤, 10%; 브로모페놀 블루, 0.4%; 소디움 바나데이트 10mM)로 용해시켜, 10분간 비등수 중탕에서 인큐베이션한 후 직접 분석하거나 또는 -70℃로 냉동하였다. 시료들을 7.5% SDS-PAGE 겔 전기영동하여 분석하고 Towbin등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979))에 의해 기술된 표준방법을 이용하여 니트로셀룰로오스상에 전기블로팅하였다. 블로팅된 니트로셀룰로오스를 Kamps 및 Selton((1988) Oncogene2:305-315)에 의해 기술된 표준방법을 이용하여 항포스포티로신 항체로 프로빙하였다. 프로빙된 블롯을 밤새 자동방사성사진 필름에 노출시키고 표준 실험실 프로세서를 이용하여 현상하였다. Ultrascan XL 증강 레이저 농도계(LKB)를 이용하여 농도 측정을 행하였다. 분자량 측정은 예비염색된 고분자량 표준(Sigma)과 비교하여 측정되었다. 단백질 인산화 및 쉬반세포 증식의 투여량 반응은 매우 유사하다(도 33). 인산화된 밴드의 분자량은 p185^erbB2의 분자량과 매우 유사하다. 쉬반세포를 GGF2HBS5 클론으로 형질전환된 COS 세포로부터 제조된 조정배지로 처리했을 때에도 유사한 결과가 수득되었다. 이러한 결과는 GGF의 p185^erbB2와의 예상된 상호작옹 및 p185^erbB2활성화와 잘 연관된다.

이 실험을 재조합 GGF2에 대해서 반복하였다. GGF 클론(GGF2HBS5)으로 안정하게 형질전환된 COS 세포주로부터 유래된 조정배지는 상술한 분석 방법에 의할 때 단백질 티로신 인산화를 자극한다. 가짜로 트랜스펙션된 COS 세포는 이러한 활성을 자극하지 못한다.

실시예 20

GGF의 N-글리코실레이션

GGF-Ⅱ 후보 클론 GGF2BPP1, 2, 및 3의 cDNA로부터 예상된 단백질 서열은 다수의 공통 N-글리코실레이션 모티프를 포함한다. GFFⅡ02 펩타이드 서열내에 있는 갭은 이들 모티프의 펩타이드 서열내에 있는 아스파라긴 잔기와 일치하는데, 이와 같은 사실은 탄수화물이 이 부위에 결합될 가능성이 있다는 것을 가리킨다.

GGF의 N-글리코실레이션은 탄수화물과 단백질내 아스파라긴 잔기 사이의 공유결합을 절단하는 효소인 N-글리카나제와 함께 항온배양한 후에 SDS-PAGE상에서의 운동성을 관찰함으로써 연구되었다.

GGF-Ⅱ의 N-글리카나제 처리에서는 분자량 40-42kDa의 주 밴드와 45-48kDa의 보조 밴드가 나타난다.

활성 하나의 활성 디글리코실레이티드 종이 약 50kD에 나타난다.

GGF-Ⅰ을 이용한 활성 용출 실험도 N-글리카나제 처리될 때 전기영동적 운동성이 증가되어, 분자량 26-28kDa의 활성 종(active species)이 제공된다는 것을 증명해준다. 은염색은 사용된 시료내에서 배경 염색 때문에 N-글리코실레이티드 밴드를 선정할 수는 없다고 하더라도 운동성 쉬프트(mobility shift)가 있다는 것을 확증해준다.

본 발명의 조성물은 근육질병을 앓는 환자의 치료에 매우 유용하다.

Claims (16)

1. 약제 담체내에 E 서열(서열 133 및 서열 159)로부터 절단된 50 N-말단 아미노산들을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
2. 약제 담체내에 도 30에 도시된 C-C/D 서열(서열 156 및 138)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
3. 약제 담체내에 도 30에 도시된 C-C/D' 서열(서열 156 및 139)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
4. 약제 담체내에 도 30에 도시된 B-A 서열(서열 134 및 135)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
5. 도 37, 서열 150에 도시된 아미노산 서열을 갖는 EGFL1을 포함하는 폴리펩타이드와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
6. 도 38, 서열 151에 도시된 아미노산 서열을 갖는 EGFL2를 포함하는 폴리펩타이드와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
7. 도 46, 서열 166에 도시된 아미노산 서열을 갖는 GGFHBS5 폴리펩타이드와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
8. 도 46, 서열 166에 도시된 아미노산 서열중 아미노산 362-411와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
9. 도 31, 서열 144에 도시된 아미노산 서열을 갖는 GGFBPP4 폴리펩타이드와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
10. 도 33, 서열 146에 도시된 아미노산 서열을 갖는 GGFBPP4 폴리펩타이드와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.
11. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 근질환, 디스트로피, 뒤시엔느형(Duchennes) 근육 디스트로피, 베커 디스트로피(Beckkers' dystrophy), 신경 이환상태, 신경 손상, 신경장애, 또는 외상을 포함하는 그룹중에서 선택된 골격근 질병을 앓는 환자의 근세포를 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 심근장애, 허혈성 손상, 선천성 질병, 또는 외상성 질병을 포함하는 심근 병변을 갖는 환자의 근세포를 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조성물이 평활근 질병, 동맥경화증, 혈관병변 또는 선천성 혈관질병에 걸린 환자의 근세포 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항의 폴리펩타이드의 그의 수용체에 대한 결합을 억제하는 유효량의 항체 또는 펩타이드 단편과 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 환자의 근종양 예방 또는 치료용 약제 조성물.
15. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 하나의 항의 폴리펩타이드에 결합하는 항체인 억제제와 제약학상 허용가능한 담체를 포함하는 근세포 증식 질환을 앓고 있는 포유동물을 치료하기 위한 약제 조성물.
16. 약제 담체내에 GGFHBS5 폴리펩타이드로부터 절단된 50 N-말단 아미노산들을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 포유동물의 근세포 치료용 약제 조성물.