ES2243928T3 - Metodos de tratamiento de enfermedades y problemas musculares. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION E REFIERE A METODOS Y TRATAMIENTOS PARA TRATAR LOS DESORDENES DE TEJIDOS MUSCULARES EN UN VERTEBRADO MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE COMPUESTOS QUE INCLUYEN EL RECEPTOR P185{SUP,ERBB2}. ESTOS COMPUESTOS HAN DEMOSTRADO PROVOCAR UNA DIFERENCIACION Y SUPERVIVENCIA INCREMENTADA DEL MUSCULO LISO ESQUELETAL Y CARDIACO.

Description

Métodos de tratamiento de enfermedades y problemas musculares.

Tratamiento de alteraciones y enfermedades musculares.

La presente invención se refiere al tratamiento profiláctico o afirmativo de enfermedades y anomalías en la musculatura mediante la administración de polipéptidos que se hallan en animales vertebrados, cuyos polipéptidos son factores de crecimiento, de diferenciación y de supervivencia para las células musculares.

Los tejidos musculares en vertebrados adultos se regeneran a partir de mioblastos de reserva llamados células satélite. Las células satélite se distribuyen completamente en el tejido muscular y son mitóticamente quiescentes en ausencia de heridas o enfermedades. Después de heridas musculares o durante la recuperación de enfermedades, las células satélite se reintroducen en el ciclo celular, proliferan y 1) entran en fibras musculares existentes o 2) sufren diferenciación en miotubos multinucleados que forman nuevas fibras musculares. Los mioblastos facilitan al final fibras musculares de sustitución o se fusionan en fibras musculares existentes, incrementando de esta manera las fibras por la síntesis de componentes del aparato de contracción o aparato contráctil. Este proceso queda ilustrado, por ejemplo, por la regeneración prácticamente completa que tiene lugar en mamíferos después de degeneración de fibras musculares inducida; las células progenitoras musculares proliferan y se fusionan junto con las fibras musculares regenerantes.

Se han identificado varios factores de crecimiento que regulan la proliferación y diferenciación de mioblastos adultos (y embriónicos) in vitro. El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) es mitogénico para células musculares y es inhibidor de la diferenciación muscular. El factor de crecimiento de transformación \beta (TGF \beta) no tiene efectos en la proliferación de mioblastos, sino que es un inhibidor de la diferenciación muscular. Los factores de crecimiento parecidos a la insulina (los IGF) se ha demostrado que estimulan la proliferación de mioblastos y la diferenciación en roedores. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es también mitogénico para mioblastos y es un potente inhibidor de diferenciación de las células musculares: ver Florini y Magri, 1989:256:C701-C711).

En especies de vertebrados, tanto los músculos como los tejidos y neuronas son fuentes potenciales de factores que estimulan la proliferación y diferenciación de mioblastos. En enfermedades que afectan el sistema neuromuscular que son neurales de origen, es decir, neurogénicas, los tejidos musculares innervados por el nervio afectado se paralizan y desgastan progresivamente. Durante la regeneración de nervios periféricos y recuperación de enfermedades neurológicas y miopáticas, las neuronas pueden proporcionar una fuente de factores de crecimiento que provocan la regeneración muscular descrita anteriormente y proporcionan un mecanismo para recuperación muscular contra desgaste y atrofia.

Una familia recientemente descrita de factores de crecimiento, las neuregulinas, son sintetizadas por neuronas motrices (Marchioni y otros. Nature 362:313, 1993) y células inflamatorias (Tarakhovsky y otros, Oncogene 6:2187-2196 (1991)). Las neuregulinas y los factores de unión relacionados p185^{erbB2} han sido purificados, clonados y expresados (Benveniste y otros, PNAS 82:3930-3934, 1985; Kimura y otros, Nature 348:257-260, 1990; Davis y Stroobant, J. Cell. Biol. 110:1353-1360, 1990; Wen y otros, Cell 69:559, 1992; Yarden y Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:443, 1988; Holmes y otros, Science 256:1205, 1992; Dobashi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 88:8582, 1991; Lupu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:2287, 1992). Las neuregulinas recombinantes se ha demostrado que son mitogénicas para las glias periféricas (Marchionni y otros, Nature 362:313, 1993) y se ha demostrado que influyen en la formación de la unión neuromuscular (Falls y otros, Cell 72:801, 1993). Por esta razón, la neurona regenerativa y las células inflamatorias asociadas con la recuperación de enfermedades neurogénicas y heridas en los nervios proporcionan una fuente de factores que coordinan la remielinación de neuronas motrices y su capacidad de formar la conexión apropiada con su objetivo. Después de que el músculo ha sido reinnervado, la neuroma motriz puede proporcionar factores al músculo, estimulando el crecimiento y supervivencia del mismo.

Habitualmente, no hay terapia útil para promover la diferenciación y supervivencia de los músculos. Esta terapia sería útil para el tratamiento de una serie de enfermedades y desórdenes neurales y musculares.

Los inventores han descubierto que se puede conseguir un incremento de la diferenciación de mitogénesis y supervivencia de células musculares utilizando proteínas descritas hasta el momento como factores de crecimiento gliales, actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA), heregulinas, factor de diferenciación "neu" y, de manera más general, neuregulinas. Los inventores han descubierto que estos compuestos son capaces de inducir tanto la proliferación de células musculares como la diferenciación y supervivencia de miotubos. Estos fenómenos pueden tener lugar en tejidos cardiacos y musculares lisos, además de tejidos musculares del esqueleto. Por lo tanto, los compuestos anteriormente mencionados, compuestos reguladores que inducen síntesis de estos compuestos y pequeñas moléculas que imitan estos compuestos por unión a los receptores en el músculo o por estimulación a través de otros medios de los segundos sistemas mensajeros activados por el complejo ligando-receptor son todos ellos extremadamente útiles como terapias profilácticas y afirmativas para enfermedades musculares.

Un nuevo aspecto de la invención comporta la utilización de las proteínas antes mencionadas como factores de crecimiento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o desorden de la musculatura, incrementando la mitogénesis, supervivencia, crecimiento y diferenciación de células musculares. El tratamiento de las células musculares para conseguir estos efectos se puede conseguir estableciendo contacto de las células musculares con un polipéptido que se describe. La utilización se puede disponer para lentificar o detener la pérdida muscular neta o para incrementar la cantidad o calidad de músculo presente en el vertebrado.

Estos factores pueden ser utilizados para producir mitogénesis de las células musculares, diferenciación y supervivencia en un vertebrado (preferentemente un mamífero, y más preferentemente un humano) por utilización de una cantidad efectiva de un polipéptido o compuesto relacionado. Los efectos de la neuregulina en los músculos pueden tener lugar, por ejemplo, provocando un incremento del rendimiento muscular al inducir la síntesis de isoformas específicas del aparato contráctil tal como las isoformas lenta y rápida de miocina de cadena larga; promocionando la supervivencia de fibras musculares por la inducción de síntesis de moléculas protectoras tales como, sin que ello sea limitativo, distrofina; y/o incrementando la innervación muscular, por ejemplo, incrementando las moléculas receptoras de acetilcolina en la unión neuromuscular.

El término célula muscular utilizado en esta descripción se refiere a cualquier célula que contribuye a los tejidos musculares. Los mioblastos, célula satélite, miotubos y tejidos miofibrilares, están todos incluidos en el término "células musculares" y todos ellos pueden ser tratados utilizando los métodos de la invención. Los efectos de las células musculares pueden ser inducidos dentro de los músculos del esqueleto, cardiacos y músculos lisos.

La mitogénesis puede ser inducida en células musculares, incluyendo mioblastos o células satélite, o músculos del esqueleto, músculos lisos o músculos cardiacos. La mitogénesis tal como se utiliza en esta descripción se refiere a cualquier división celular que resulta en la producción de nuevas células musculares en el paciente. De manera más específica, la mitogénesis in vitro se define como un incremento del índice mitótico relativo a células no tratadas de 50%, preferentemente 100%, y de manera más preferente 300%, cuando las células son expuestas a un agente de marcado durante un tiempo equivalente a dos tiempos de doblado. El índice mitótico es la fracción de células en el cultivo que han marcado núcleos cuando se cultivan en presencia de un trazador que se incorpora solamente durante la fase S (es decir, BrdU) y el tiempo de doblado es definido como el tiempo promedio requerido para que el número de células del cultivo aumente por un factor de dos.

Un efecto sobre la mitogénesis in vivo se define como un incremento de la activación de las células satélite medido por la aparición de células satélite marcadas en los tejidos musculares de un mamífero expuesto a un trazador que se incorpora solamente durante la fase S (es decir, BrdU). Un agente terapéutico útil se define como un compuesto que, cuando se administra in vivo, incrementa la activación celular satélite relativa a un mamífero de control como mínimo en 10%, más preferentemente por un mínimo de 50%, y de modo todavía más preferente en más de 200%, cuando el mamífero es expuesto al agente de marcado durante un período superior a 15 minutos y se ensayan tejidos entre 10 horas y 24 horas después de la administración del mitógeno a dosis terapéutica. De forma alternativa, la activación in vivo de células satélite se puede detectar controlando la aparición de la vimentina como filamento intermedio por métodos inmunológicos o de análisis de RNA. Cuando se ensaya la vimentina, el mitógeno útil se define como aquel que provoca la expresión de niveles detectables de vimentina en los tejidos musculares cuando se proporciona una dosis útil terapéuticamente.

La miogénesis utilizada en esta descripción se refiere a cualquier fusión de mioblastos para proporcionar miotubos. De manera más preferente, se define un efecto sobre la miogénesis como incremento en la fusión de mioblastos y el posibilitamiento del programa de diferenciación muscular. La terapéutica miogénica útil es definida como polipéptido que confiere cualquier incremento en el índice de fusión in vitro. De manera más preferente, el polipéptido confiere un incremento como mínimo de dos veces y, más preferentemente, el compuesto confiere un incremento de tres veces o superior en el índice de fusión con respecto al control. El índice de fusión se define como la fracción de núcleos presentes en células multinucleadas en el cultivo con respecto al número total de núcleos presentes en el cultivo. Los porcentajes proporcionados anteriormente son para células ensayadas después de seis días de exposición al polipéptido miogénico y se refieren a un control sin tratamiento. La miogénesis también se puede determinar por ensayo del número de núcleos por unidad de área en miotubos o por medición de los niveles de proteína específica muscular por análisis Western. Preferentemente, el polipéptido confiere como mínimo un incremento de dos veces de la densidad de miotubos utilizando el ensayo proporcionado por ejemplo en esta descripción y, más preferentemente, el polipéptido confiere un incremento de tres veces o superior.

El crecimiento muscular puede tener lugar por el incremento de las dimensiones de las fibras y/o por el incremento del número de fibras. El crecimiento del músculo tal como se utiliza en esta descripción se puede medir por A) incremento de peso neto, B) incremento en el contenido de proteínas, C) incremento del número de fibras musculares o D) incremento en el diámetro de fibras musculares. Se puede definir el incremento de crecimiento de las fibras musculares como incremento del diámetro, siendo definido el diámetro como eje menor de la elipse de la sección transversal. El agente terapéutico útil es aquel que incrementa el peso neto, contenido de proteína y/o diámetro en 10% o más, más preferentemente más de 50% y de manera más preferente en más de 100% en un animal cuyos músculos se han degenerado previamente en un mínimo de 10% y relativo a un animal de control tratado de manera similar (es decir, un animal con tejidos musculares degenerados que no ha sido tratado con el compuesto de crecimiento muscular). Un compuesto que incremente el crecimiento al incrementar el número de fibras musculares es útil como agente terapéutico cuando incrementa el número de fibras en los tejidos enfermos de un mínimo de 1%, más preferentemente en un mínimo de 20%, y más preferentemente en un mínimo de 50%. Estos porcentajes están determinados con respecto al nivel basal en un mamífero comparable sin enfermedad, no tratado, o en el músculo sin enfermedad contralateral cuando el polipéptido es administrado y actúa localmente.

El término supervivencia de fibras musculares, tal como se utiliza en esta descripción, se refiere a la prevención de pérdida de masa de músculos o fibras de músculos tal como se pone en evidencia por la necrosis o apoptosis o la prevención de otros mecanismos de pérdidas de fibras musculares. El término supervivencia utilizado en esta descripción indica la disminución en la velocidad de muerte celular como mínimo de 10%, más preferentemente como mínimo 50%, y de modo más preferente como mínimo 300%, con respecto a un control sin tratamiento. La tasa de supervivencia puede ser medida al contar células que pueden ser teñidas con un colorante específico para la células muertas (tales como ioduro de propidio) en cultivo cuando las células se encuentran a 8 días de post-diferenciación (es decir, 8 días después de que el medio ha sido cambiado de 20% a 0,5% de suero).

El término de regeneración muscular, tal como se utiliza en esta descripción, se refiere al proceso por el cual nuevas fibras de músculos se forman a partir de células progenitoras de músculos. La terapéutica útil para regeneración confiere un incremento en el número de nuevas fibras mínimo de 1%, más preferentemente mínimo de 20%, y de modo más preferente como mínimo 50%, tal como se ha definido anteriormente.

La diferenciación de células musculares, tal como se utiliza en esta descripción, se refiere a la inducción de un programa de desarrollo muscular que especifica los componentes de la fibra muscular tal como el aparato contráctil (la miofibrila). El agente terapéuticamente útil para diferenciación incrementa la cantidad de cualquier componente de las fibras musculares en los tejidos enfermos en un mínimo de 10% o más, más preferentemente 50% o más, y de modo más preferente más de 100%, con respecto a los tejidos equivalentes en un animal de control tratado de manera similar.

La atrofia de músculos, tal como se describe en esta descripción, se refiere a una pérdida significativa de periferia de las fibras musculares. Por atrofia significativa se comprende una reducción del diámetro de las fibras musculares en tejidos musculares enfermos, con heridas o no usados de un mínimo de 10% con respecto a tejidos no enfermos, sin heridas o normalmente utilizados.

Los inventores prevén la utilización de los polipéptidos que se describen en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o desórdenes musculares. Se pueden incluir entre los ejemplos de desórdenes musculares que han sido tratados las enfermedades musculares del esqueleto y desórdenes tales como las miopatías, distrofias, enfermedades conductoras mioneuronales, heridas musculares traumáticas y heridas en los nervios. También se pueden tratar utilizando los métodos preconizados por los inventores patologías musculares cardíacas como cardiomiopatías, daños isquémicos, enfermedades congénitas y heridas traumáticas, tal como lo pueden ser las enfermedades y desórdenes de los músculos lisos tales como esclerosis arterial, lesiones vasculares y enfermedades vasculares congénitas. Por ejemplo, la distrofia muscular de Duchennes, distrofia de Beckkers y la Miastenia gravis son solamente tres de las enfermedades que se pueden tratar utilizando los métodos de la presente invención.

También se prevé la profilaxis o tratamiento de un tumor con origen en células musculares tal como rabdomiosarcoma. Este puede incluir la administración de una cantidad efectiva de una sustancia que inhibe la unión de uno o varios de los polipéptidos que se describen e inhibiendo la proliferación de las células que contribuyen al tumor.

Se utilizará el hecho de que las proteínas de neuregulina están codificadas por el mismo gen. Una serie de variantes de unión de RNA mensajeros (y sus proteínas resultantes) se derivan de este gen y muchos de estos productos muestran unión con P185^{erbB2} y activación de la misma. Se han utilizado productos de este gen por los inventores para mostrar la actividad mitogénica de células musculares (ver más adelante los ejemplos 1 y 2), diferenciación (ejemplos 3 y 6) y supervivencia (ejemplos 4 y 15). Los inventores dan a conocer la utilización para productos del gen neuregulina (que se describe y en las referencias indicadas anteriormente) que tiene las actividades que se han indicado como mitógenos de células musculares, factores de diferenciación y factores de supervivencia. Más preferentemente, se utiliza GGF2 (rhGGF2) humano recombinante.

También se prevé la utilización de otras variantes de corte y empalme no aisladas todavía de modo natural del gen neuregulina. La figura 29 muestra las formas conocidas de corte y empalme. Estos modelos se derivan de experimentos de reacción de la cadena de polimerasa (en ARN con transcripción inversa), análisis de clones de cDNA (tal como se presentan) y análisis de secuencias publicadas que codifican neuregulinas (Peles y otros, Cell 69:205 (1992) y Wen y otros, Cell 69:559 (1992)). Estos modelos, así como modelos adicionales que se dan a conocer, representan variantes probables de corte y empalme que existen. Las variantes de corte y empalme se describen por completo en la publicación de Goodearl y otros, USSN 08/036.555, presentada en 24 de marzo de 1993, que se incorpora a la actual como referencia.

De manera más específica, la división celular, supervivencia, diferenciación y crecimiento de células musculares se pueden conseguir estableciendo contacto con las células musculares con un polipéptido definido por la fórmula:

WBAZCX

en la que WBAZCX está compuesta de los segmentos de polipéptido mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132, 134, 135, 137-139, 156); en la que W comprende el segmento de polipéptido F, o se encuentra ausente; en el que Z comprende el segmento de polipéptido G o se encuentra ausente; y en el que X comprende el segmento de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL, ó C/D C/D' D' HKL y/o estableciendo contacto de las células musculares con un polipéptido definido por la fórmula

YBAZCX

en la que YBAZCX está compuesto de los segmentos de polipéptidos mostrados en la figura 30 (números ID de secuencias 133-135, 156, 159); en la que Y comprende un segmento de polipéptido E. o se encuentra ausente; en el que Z comprende el segmento de polipéptido G o se encuentra ausente; o en el que X comprende segmento de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D' HL, C/D' HKL, C/D' H, C/D' D, C/D C/D' HKL, C/D C/D' H, C/D C/D' HL, C/D C/D' D, C/D D' H, C/D D' HL, C/D D' HKL, C/D' D' H, C/D' D' HL, C/D'' D' HKL, C/D C/D' D' H, C/D C/D' D' HL, ó C/D C/D' D' HKL.

De manera general, el término N de los polipéptidos antes descritos empieza con los segmentos de polipéptido F ó E. Cuando el polipéptido F se encuentra presente, puede ser fraccionado después de maduración de la proteína para proporcionar el polipéptido natural. Cuando la secuencia E se encuentra presente, los primeros 50 aminoácidos que representan la secuencia de la señal de terminal N se pueden encontrar ausentes de los polipéptidos.

Además, los inventores prevén la utilización de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o desorden de la musculatura al incrementar la mitogénesis, crecimiento, diferenciación o supervivencia de una célula muscular, de manera que dicho polipéptido une receptores y activa segundos sistemas mensajeros de dicha célula muscular de la que se selecciona el polipéptido.

Factor polipéptido aislado 35 kD de la línea celular de fibroblastos transformada de rata I-EJ a la célula glial; o

factor de polipéptido aislado 75 kD de la línea celular de seno humano SKBR-3; o bien

factor de polipéptido aislado 44 kD de la línea celular de fibroblasto transformada de rata I-EJ; o bien

factor de polipéptido aislado 25 kD de macrófagos peritoneales de ratón activados; o bien

factor de polipéptido aislado 45 kD de la línea celular de seno humano MDA-MB 231; o bien

factor de polipéptido aislado 7 a 14 kD de la línea de células humanas T ATL-2 a la célula glial; o bien

factor de polipéptido de 25 kD aislado de células de riñón bovino; o bien

polipéptido ARIA; o bien

un polipéptido que comprende G6FIII; o bien

factor de polipéptido de 45 kD ARIA aislado del cerebro; factor de polipéptido 46-47 kD que estimula las células progenitoras gliales 0-2A; o bien

factor de polipéptido de 43-45 kD, GGFIII, 175, solicitud de patente U.S.A. número de serie 07/931.041, presentada en 17 de Agosto de 1992, que se incorpora a la actual como referencia.

Los inventores prevén además la utilización de los polipéptidos EGFL1, EGFL2, EGFL3, EGFL4, EGFL5, y EGFL6, figuras 37 a 42, y números de secuencia ID 150 a 155, respectivamente, para el tratamiento de células musculares in vivo e in vitro.

También se incluye la administración del polipéptido GGF2 cuya secuencia se ha mostrado en la figura 44 para el tratamiento de células musculares.

Otro aspecto importante de la invención que se da a conocer es la utilización que se ha definido anteriormente:

(a) una serie de factores de polipéptidos humanos y bovinos que tienen actividad mitogénica celular incluyendo la estimulación de la división de las células musculares. Estas secuencias de péptidos se han mostrado en las figuras 30, 31, 32 y 33, números de secuencia ID 132-133, respectivamente.

La utilización de los polipéptidos en la fabricación de un medicamento para tratamiento de células musculares también se puede conseguir por la utilización de DNA que codifica los compuestos del polipéptido descritos anteriormente en una construcción genética expresable. El DNA que codifica el polipéptido puede ser administrado al paciente utilizando técnicas conocidas en este sector para suministrar DNA a las células. Por ejemplo, vectores retrovirales, electroporación o liposomas se pueden utilizar para suministrar DNA.

\newpage

Los inventores prevén la utilización de la familia antes citada de proteínas, extraída de fuentes naturales (tejidos o líneas celulares) o preparada por medios recombinantes.

Otros péptidos, que pueden unirse específicamente al receptor p185^{erbB2}, pueden también ser utilizados de acuerdo con nuestras investigaciones como mitógenos de células musculares. Un polipéptido candidato puede ser rastreado de manera rutinaria para unión con p185^{erbB2}, y, si efectúa dicha unión, entonces puede ser rastreado para actividad mitogénica de célula glial utilizando los métodos que se describen.

Los inventores también prevén la utilización de cualesquiera modificaciones o equivalentes de los factores de polipéptidos antes nombrados, que no muestran una actividad significativamente reducida. Por ejemplo, las modificaciones en las que se altera el contenido de aminoácidos o la secuencia del mismo sin afectar de una manera sustancialmente adversa la actividad, quedan también incluidas. Las declaraciones de efecto y utilización contenidas en esta descripción se tienen que interpretar por lo tanto de forma correspondiente, de manera que dichas utilizaciones y efectos que utilizan factores modificados o equivalentes forman parte de la invención.

Las secuencias de péptidos humanos que se han descrito anteriormente y que se han presentado en las figuras 30, 31, 32 y 33, números de secuencia ID 132-146, respectivamente, representan una serie de variantes de corte y empalme que se pueden aislar en forma de DNA complementario (cDNA) de longitud completa a partir de fuentes naturales (bibliotecas de cDNA preparadas a partir de los tejidos apropiados) o que se pueden ensamblar como constructores de DNA con exones individuales (por ejemplo, derivados como exones separados) por los técnicos en la materia.

El medicamento de la presente invención está realizado por administración del polipéptido con un portador farmacéuticamente efectivo opcionalmente junto con un diluyente aceptable, portador o excipiente y/o en forma de dosificación unitaria. Al utilizar los factores, se pueden utilizar prácticas farmacéuticas o veterinarias convencionales para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas.

Así, por ejemplo, las formulaciones a utilizar se pueden aplicar a administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracraneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, tópica, intranasal, aerosol, escarificación, y también oral, bucal, rectal o vaginal.

Las formulaciones de la presente invención pueden ser administradas también por el transplante al paciente de células hospedantes que expresan los polipéptidos que codifican el DNA que son eficaces para el objetivo o para utilización de implantes quirúrgicos que liberan las formulaciones de la invención.

Las formulaciones parenterales pueden adoptar forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral las formulaciones pueden adoptar forma de tabletas o cápsulas; y para formulaciones intranasales, pueden adoptar forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Se pueden encontrar métodos bien conocidos en este sector para la preparación de formulaciones, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciencies". Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes, por ejemplo, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados polímeros de lactidas biodegradables, biocompatibles o copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno, para controlar la liberación de los presentes factores. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para dichos factores incluyen las partículas de copolimero de etileno-acetado de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener como excipientes, por ejemplo, lactosa o bien pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polioxietilén-9-lauril-éter, glicocolato y desoxicolato, o bien pueden ser soluciones aceitosas para administración en forma de gotas nasales, o como gel para aplicar por vía intranasal. Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir también glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cítrico para administración vaginal.

Los factores presentes pueden ser utilizados como únicos agentes activos o se pueden utilizar en combinación con otros ingredientes activos, por ejemplo, otros factores de crecimiento que podrían facilitar supervivencia neuronal en enfermedades neurológicas, o inhibidores de peptidasa o proteasa.

La concentración de los presentes factores en las formulaciones de la invención dependerá de una serie de diferentes factores, incluyendo la dosificación a administrar y la ruta de administración.

En términos generales, los factores pueden ser dispuestos en una solución tampón fisiológica acuosa que contenga aproximadamente de 0,1 a 10% peso/volumen del compuesto para administración parenteral. Las dosis oscilan en general desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 1 g/kg de peso corporal por día; una gama de dosificación preferente es desde 0,01 mg/kg aproximadamente hasta 100 mg/kg de peso corporal por día. La dosificación preferente a administrar dependerá probablemente del tipo y extensión del avance del estado patofisiológico que se desea combatir, el estado general de salud del paciente, la constitución de la formulación y la ruta de administración.

Si bien no forman parte de la presente invención, los factores polipéptidos utilizados en los métodos de la invención pueden ser utilizados también como inmunógenos para preparar anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, siguiendo técnicas estándar. Estos anticuerpos pueden ser utilizados, a su vez, para objetivos terapéuticos o diagnósticos. Por lo tanto, los estados asociados con enfermedades musculares resultado de niveles anormales del factor se pueden tratar por la utilización de dichos anticuerpos. Se pueden utilizar técnicas in vitro, empleando ensayos en muestras aisladas utilizando métodos estándar. Métodos de reproducción de imágenes en los que los anticuerpos están. por ejemplo, marcados con isótopos radioactivos que pueden ser objeto de imagen fuera del cuerpo, utilizando técnicas para el sector de formación de imágenes de tumores, pueden ser también utilizados.

La designación "GGF2" se utiliza para todos los clones que han sido previamente aislados con datos de secuencia de péptidos derivados, procedentes de la proteína GGF-II (es decir, GGF2HBS5, GGF2BPP3) y, cuando se encuentra presente sola (es decir, GGF2 ó rhGGF2), para indicar proteína humana recombinante codificada por plásmidos aislados con datos de secuencia de péptidos derivados de la proteína GGF-II (es decir, tales como las producidas en células de insectos a partir del plásmido HBS5). El GGF humano recombinante del clon GGFHBS5 es llamado polipéptido GGF2, rhGGF2 y GG2HBS5.

El tratamiento utilizado en esta descripción significa cualquier administración de los compuestos descritos con el objetivo de incrementar la mitogénesis de células musculares, con su supervivencia y/o diferenciación, y/o disminuir la atrofia y degeneración muscular. Del modo más preferente, el tratamiento es para el objetivo de reducir o disminuir los síntomas o avances de una enfermedad o desorden de las células musculares. El tratamiento tal como se utiliza en esta descripción significa también la administración de los compuestos para incrementar o alterar las células musculares en individuos sanos. El tratamiento puede ser llevado a cabo por contacto de las células musculares que son sensibles o responsables de los compuestos que se describen con una cantidad efectiva del compuesto, tal como se ha definido anteriormente. Los inhibidores de los compuestos descritos pueden también ser utilizados para detener o hacer más lentas las enfermedades de proliferación de células musculares.

En primer lugar, se describirán los dibujos.

La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de rhGGF2 en un ensayo de mitogénesis de mioblasto.

La figura 2 es un gráfico que muestra el efecto de rhGGF2 en la serie de núcleos de miotubos.

La figura 3 es un gráfico de un ensayo de supervivencia que muestra el efecto de rhGGF2 en la supervivencia de miotubos diferenciados.

La figura 4 es un gráfico de ensayos de supervivencia que muestran el efecto de rhGGF2 en miotubos diferenciados con respecto a factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas, factor de crecimiento de fibroblastos humanos, factor de crecimiento epidérmico humano, factor de inhibición de leucocitos humano y factores de crecimiento del tipo de insulina humana I y II.

La figura 5 es un gráfico que muestra la supervivencia creciente en células de distrofia muscular de Duchenne en presencia de rhGGF2. La figura 6 es un gráfico del incremento de la expresión (hGH) de la hormona de crecimiento humano en células C2 a partir de un gen reporter hGH bajo el control de los elementos de control transcripcional de la subunidad AchR delta. Este incremento está unido a la adición de GGF2 al medio.

La figura 7 es un gráfico del incremento de síntesis de hGH reporter y bungarotoxina (BTX) que se une a los AchR después de la adición de cantidades crecientes de GGF2 a células C2.

Las figuras 8, 9, 10 y 11 son secuencias de péptidos derivadas de GGF-I y GGF-II, con números ID de secuencia 1-20, 22-29, 32-50 y 165 (ver ejemplos 11-13).

La figura 9, panel A, muestra las secuencias de péptidos GGF-I utilizadas para diseñar sondas de oligonucléotidos degenerados y cebadores PCR degenerados con listado (números de ID de secuencias 1, 17 y 22-29). Algunas de las secuencias en el panel A se han utilizado también para diseñar péptidos sintéticos. El panel B es un listado de las secuencias de nuevos péptidos que eran demasiado cortos (menos de 6 aminoácidos) para el diseño de sondas degeneradas o cebadores PCR degenerados (números ID de secuencia 17 y 32).

La figura 11, panel A, es un listado de las secuencias de péptidos GGF-II utilizados para diseñar sondas de oligonucléotidos degenerados y cebadores PCR degenerados (números ID de secuencia 42-49). Algunas de las secuencias del panel A fueron utilizados para diseñar péptidos sintéticos. El panel B es un listado del nuevo péptido que era demasiado corto (menos de 6 aminoácidos) para el diseño de sondas degeneradas o cebadores PCR degenerados (número ID de secuencia 50).

Las figuras 12, 13A, 13B, 14, 15, 16, 17, 18 y 19 se refieren al siguiente ejemplo 8, y muestran la actividad mitogénica de los factores.

Las figuras 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 y 27 se refieren al ejemplo 10, y se describen a continuación de manera breve.

La figura 20 es un listado de las sondas de oligonucléotidos degenerados (números ID de secuencia 51-84) diseñados a partir de las nuevas secuencias de péptidos de la figura 7, panel A, y figura 9, panel A.

La figura 21 (número ID de secuencia 85) muestra un tramo de la secuencia del gen GGF-II bovino putativo desde el fago genómico bovino recombinante GGF2BG1, que contiene el lugar de unión de sondas de oligonuclétidos degeneradas 609 y 650 (ver figura 18, número ID de secuencia 66 y 69, respectivamente). La figura es la cadena o hebra de codificación de la secuencia de DNA y la secuencia de aminoácido deducida en el tercer cuadro de lectura. La secuencia de péptido 12 desde factor 2 (negritas) es parte de un cuadro de lectura abierta de 66 aminoácidos (nucleótidos 75272).

La figura 22 muestra los cebadores PCR degenerados (panel A, números ID de secuencia 86-104) y cebadores PCR únicos (panel B, números ID de secuencia 105-115) utilizados en los experimentos para aislar segmentos de la secuencias de codificación GGF-II bovinas presentes en RNA de la pituitaria posterior.

La figura 23 muestra las nueve estructuras de cDNA GGF-II distintas, contiguas, bovinas y secuencias que fueron obtenidas en experimentos de amplificación PCR. La línea superior de la figura es una representación esquemática de las secuencias de codificación que contribuyen a las estructuras cDNA que se caracterizaron.

La figura 24 es un mapa físico de un fago recombinante bovino de GGF2BG1. El fragmento bovino es aproximadamente de una longitud de 20 Kb y contiene dos exones (negritas) del gen bovino GGF-II. Los lugares de restricción para las enzimas Xbal, Spel, Ndel, EcoRI, Kpnl y SstI han sido dispuestos en este mapa físico. Las partes sombreadas corresponden a fragmentos que fueron subclonados para secuenciado.

La figura 25 es una representación esquemática de la estructura de tres productos de genes alternativos del gen putativo bovino GGF-II. Los exones se han indicado A hasta E en el orden de su descubrimiento. Los modelos de corte y empalme alternativos 1, 2 y 3 generan tres estructuras de proteínas deducidas solapadas (GGF2BPP1, 2 y 3), que se han mostrado en las diferentes figuras 27A, 27B, 27C (que se describen más adelante).

La figura 26 (números ID de secuencias 116-128) es una comparación de las secuencias GGF-I y GGF-II identificadas en las secuencias de proteínas deducidas mostradas en las figuras 27A, 27B, 27C (descritas más adelante) con las nuevas secuencias de péptidos indicadas en las figuras 9 y 11. La figura muestra que seis de las nueve secuencias de péptidos nuevas GGF-II se tienen en cuenta en estas secuencias de proteínas deducidas. Dos secuencias de péptidos similares a las secuencias GGF-I han sido también halladas.

La figura 27 (número ID de secuencia 129) es un listado de secuencia DNA de la hebra de codificación y secuencia de aminoácido deducida del cDNA obtenido a partir del número de modelo de corte y empalme 1 de la figura 25. Este cDNA parcial del gen putativo bovino GGF-II codifica una proteína de 206 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negritas fueron los identificados a partir de las listas indicadas en las figuras 9 y 11. Los lugares de glicosilación potencial están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA).

La figura 27 (número ID de secuencia 130) es una lista de la secuencia de cadenas de DNA de codificación y secuencia deducida de aminoácido del cDNA obtenido por el modelo de corte y empalme número 2 de la figura 25. Este cDNA parcial del gen putativo bovino GGF-II codifica una proteína de 281 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negrita son los identificados de las listas presentadas en las figuras 7 y 9. Los lugares de glicosilación potenciales están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA).

La figura 27 (número ID de secuencia 131) es un listado de la secuencia de cadenas de DNA de codificación y secuencia deducida de aminoácido del cDNA obtenido del modelo de corte y empalme número 3 de la figura 25. Este cDNA parcial del gen putativo bovino GGF-II codifica una proteína de 257 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negrita son los identificados en las listas de las figuras 9 y 11. Los lugares de glicosilación potenciales están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA).

La figura 28, que se refiere al siguiente ejemplo 16 es un autoradiograma de un análisis de hibridización cruzada de secuencias del gen bovino putativo GGF-II con respecto a una variedad de DNA de mamíferos en una prueba de transferencia southern. El filtro contiene líneas de DNA digerido por EcoRI (5 \mum por línea) de las especies indicadas en la figura. La sonda detecta una banda fuerte única en cada muestra de DNA, incluyendo un fragmento de 4 kilobases en el DNA bovino, tal como se había anticipado por el mapa físico de la figura 24. Se observan también bandas de intensidad relativamente menor, que podrían representar secuencias relacionadas con DNA. La banda fuerte de hibridización de cada una de las otras muestras de DNA mamíferos representa presumiblemente el homólogo GGF-II de estas especies.

La figura 29 es un diagrama de variantes de corte y empalme representativas. Los segmentos de codificación están representados por F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', H, K y L. La situación de las secuencias de péptidos derivadas de las proteínas purificadas es indicada por "o".

La figura 30 (números ID de secuencia 136-143, 156, 157, 169-178) es una lista de las secuencias de DNA y secuencias de péptidos de predicción de los segmentos de codificación de GGF. La línea 1 es un listado de las secuencias de aminoácidos de predicción de GGF bovino, la línea 2 es una lista de secuencias de nucleótidos de GGF bovino, la línea 3 es una lista de las secuencias de nucleótidos de GGF humano (heregulina) (las equivalencias de bases de nucleótidos se han indicado con una línea vertical), y la línea 4 es una lista de las secuencias de aminoácidos de predicción de GGF humano/heregulina que difiere de la secuencia bovina de predicción. Los segmentos de codificación E, A' y K representan solamente las secuencias bovinas. El segmento de codificación D' representa solamente la secuencia humana (heregulina).

La figura 31 (número ID de secuencia 144) es la secuencia de aminoácido de predicción GGF2 y secuencia de nucleótido de BPP5. La línea superior es la secuencia de nucleótido y la línea inferior es la secuencia de aminoácido de predicción.

La figura 32 (número ID de secuencia 145) es la secuencia de aminoácido de predicción y secuencia de nucleótido GGF2BPP2. La línea superior es la secuencia de nucleótido y la línea inferior es la secuencia de aminoácido de predicción.

La figura 33 (número ID de secuencia 146) es la secuencia de aminoácido de predicción y la secuencia de nucleótido de GGF2BPP4. La línea superior es la secuencia de nucleótido y la línea inferior es la secuencia de aminoácido de predicción.

La figura 34 (número ID de secuencia 147-149) muestra la alineación de dos secuencias de péptido GGF
(GGF2BPP4 y GGF2BPP5) con EGF humano (hEGF). Los asteriscos indican posiciones de las cisteínas conservadas.

La figura 35 muestra el nivel de actividad GGF (ensayo mitogénico de células de Schwann) y fosforilación de tirosina de una proteína de unos 200 kD (intensidad de una banda de 200kD en un autoradiograma de una transferencia Western desarrollada con anticuerpo policlonal antifosfotirosina) como respuesta a cantidades crecientes de
GGF.

La figura 36 es una lista de variantes de corte y empalme derivadas de las secuencias mostradas en la figura 30.

La figura 37 es la secuencia de aminoácidos de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL1 (número ID de secuencia 150).

La figura 38 es la secuencia de aminoácido de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL2 (número ID de secuencia 151).

La figura 39 es la secuencia de aminoácido de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL3 (número ID de secuencia 152).

La figura 40 es la secuencia de aminoácido de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL4 (número ID de secuencia 153).

La figura 41 es la secuencia de aminoácido de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL5 (número ID de secuencia 154).

La figura 42 es la secuencia de aminoácido de predicción, parte inferior, y secuencia nucleica, parte superior, de EGFL6 (número ID de secuencia 159).

La figura 43 es un mapa de segmentos de codificación a escala del clon. T3 hace referencia al promotor bacteriófago utilizado para producir mRNA a partir del clon. R = lugares de enzima de restricción EcoRI lateral. 5' UT se refiere a la región no traducida 5'. E, B, A, C, C/D' y D se refieren a los segmentos de codificación. O = lugar de inicio de traducción. A = al límite 5' de la región homóloga con respecto al segmento bovino E (ver ejemplo 17) y 3' UT se refiere a la región 3' no traducida.

La figura 44 es la secuencia de aminoácido de predicción (intermedia) y secuencia nucleica (superior) de
GGF2HBS5 (número ID de secuencia 21). La secuencia inferior (intermitente) representa secuencias de péptidos derivadas de preparados de GGF-II (ver figuras 8, 9).

La figura 45 (A) es un gráfico que muestra la purificación de rhGGF en una columna de intercambio catiónico por fracción; la figura 45 (B) es una fotografía de una transferencia Western utilizando fracciones tal como se ha mostrado en (A) y un anticuerpo específico GGFII.

La figura 46 es la secuencia de los polipéptidos GGFHBS5, GGFHFB1 y GGFBPP5 (números ID de secuencia 166, 167 y 168).

La figura 47 es un mapa del plásmido pcDHRFpolyA.

Es evidente que el gen que codifica GGF/p185^{erbB2} que une proteínas de neuregulina produce una serie de transcritos de RNA por corte y empalme diferencial, de tamaños diversos, que dan lugar a una serie de proteínas. Estas proteínas son de diferentes longitudes y contienen algunas secuencias de péptidos comunes y algunas secuencias de péptido únicas. La conclusión de que estos factores son codificados por un sólo gen, está soportada por las secuencias de RNA de corte y empalme de forma diferencial que se pueden recuperar de la pituitaria posterior bovina y células cancerosas de seno humano (MDA-MB-231). Otro soporte de esta conclusión se deriva de la gama de dimensiones de proteínas que actúan como mitógenos para tejidos musculares (tal como se da a conocer) y como ligandos para el receptor p185^{erbB2} (ver más adelante).

Otra prueba para soportar el hecho de que los genes que codifican GGF/p185^{erbB2} que se unen a proteínas son homólogos procede de la comparación de secuencias de nucleótidos. Holmes y otros, (Science 256:1205-1210, 1992) demuestran la purificación de proteína humana de 45 kilodaltons (Heregulina-\alpha) que interacciona específicamente con la proteína receptora p185^{erbs2}. Peles y otros (Cell 69:205 (1992)) y Wen y otros (Cell 69:559 (1992)) describen un DNA complementario aislado de células de rata que codifican una proteína llamada "factor de diferenciación neu" (NDF). El producto de traducción del NDF cDNA tiene actividad de unión con p185^{erbB2}. Otros varios grupos han indicado la purificación de proteínas de diferentes pesos moleculares con actividad de unión de p185^{erbB2}. Estos grupos incluyen Lupu y otros ((1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2287); Yarden y Peles ((1991) Biochemistry 30:3543); Lupu y otros ((1990) Science 249:1552)); Dobashi y otros ((1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1536); y Huang y otros ((1992) J. Biol. Chem. 257:11508-11512).

Los inventores han descubierto que las proteínas de unión receptoras de p185^{erbB2} estimulan la mitogénesis de las células musculares y, por lo tanto, estimulan la formación de miotubos (miogénesis). Esta estimulación resulta en una formación incrementada de mioblastos y formación incrementada de miotubos (miogénesis). Los polipéptidos que se describen estimulan también el crecimiento muscular incrementado, la diferenciación y supervivencia de células musculares. Estos ligandos incluyen, sin que estén limitados a las GGF, las neuregulinas, las heregulinas, NDF, y ARIA. Como resultado de esta actividad mitogénica, estas proteínas, ADN que codifica estas proteínas y polipéptidos relacionados pueden ser administrados a pacientes que sufren daños traumáticos o enfermedades de los tejidos musculares. Se comprenderá que todos los métodos dispuestos para la mitogénesis son útiles con el objetivo de miogénesis. Si bien no forman parte de la presente invención, inhibidores de estos ligandos (tales como anticuerpos o fragmentos de péptidos) pueden ser administrados para el tratamiento de tumores derivados de músculos.

Estos polipéptidos pueden ser obtenidos utilizando los protocolos que se describen (ejemplos 9-17) y en Holmes y otros, Science 256:1205 (1992); Peles y otros, Cell 69:205 (1992); Wen y otros, Cell 69:559 (1992); Lupu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2287 (1992); Yarden y Peles, Biochemistry 30:3543 (1991); Lupu y otros, Science 249:1552 (1990); Dobashi y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:1536 (1991); Huang y otros, J. Biol. Chem. 257:11508-11512 (1992); Marchionni y otros, Nature 362:313 (1993); y en la patente de GGF-III, todos los cuales se incorporan a esta descripción a título de referencia. Se proporcionan las secuencias y se describen las características de muchos de estos compuestos. En cuanto a las secuencias, ver figuras 8-11, 20-27, 29-34, 36-44 y 46. En cuanto a las características de las proteínas, ver figuras 12-19, 28 35, 45A y 45B.

Los polipéptidos pueden ser objeto de ensayo en cuanto a su utilidad in vitro, empleando los métodos proporcionados por los ejemplos que se indican más adelante. Las pruebas in vivo pueden ser llevadas a cabo tal como se ha descrito en el ejemplo 1 en la publicación de Sklar y otros, In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A:433-434, 1991.

La invención comprende métodos para la utilización, tal como se ha definido anteriormente, de cualquier proteína que es sustancialmente homóloga de los segmentos de codificación de la figura 30 (números ID de secuencia 132-143, 156, 1576-147) con el objetivo de inducir mitogénesis muscular. Además, se incluye la utilización de: variaciones alélicas; mutantes naturales; mutante inducidos; proteínas codificadas por DNA que hibridizan en condiciones más o menos rigurosas a formación de un ácido nucleico natural (para las definiciones de rigor elevado y reducido ver Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989, 6.3.1-6.3.6, que se incorpora a esta descripción a título de referencia); y la utilización de polipéptidos o proteínas específicamente unidos por antisueros a polipéptidos de GGF. El término comprende también la utilización de polipéptidos quiméricos que incluyen los polipéptidos de GGF que comprenden las secuencias de la figura 28 para la inducción de mitogénesis de músculos.

Tal como se apreciará del ejemplo 8, a continuación, los factores presentes muestran actividad mitogénica en una gama de tipos de células. Las indicaciones generales de la invención, que se han realizado anteriormente con respecto a las formulaciones y/o medicamentos, y su fabricación deben ser interpretadas claramente incluyendo productos y utilizaciones apropiados.

Sigue una serie de experimentos que proporcionan base adicional para lo que se reivindica. Los siguientes ejemplos relativos a la presente invención no deben ser interpretados como específicamente limitativos de la invención, o de las variantes de la misma, no conocidas o desarrolladas más adelante.

Los ejemplos muestran el descubrimiento de los inventores de que el GGF2 (rhGGF2) humano recombinante confiere varios efectos en el cultivo de músculos humanos de tipo primario. El rhGGF2 tiene efectos significativos en tres ensayos de actividad biológica independientes en cultivos de músculos. La mitogénesis incrementada por el polipéptido medida por la proliferación de mioblastos quiescentes subconfluentes, incrementó la diferenciación por mioblastos confluentes en presencia de factor de crecimiento, e incrementó la supervivencia de miotubos diferenciados medidos por la pérdida de exclusión de colorante y por la síntesis incrementada del receptor de acetilcolina. Estas actividades indican eficacia de GGF2 y otras neuregulinas en la inducción de reparación muscular, regeneración y efectos profilácticos en la degeneración muscular.

Ejemplo 1 Actividad mitogénica de rhGGF2 en mioblastos

El clon GGF2HBS5 fue expresado en células de insectos infectadas por Baculovirus recombinante, tal como se describe en el ejemplo 14 más adelante, y el GGF2 humano recombinante resultante fue añadido a los mioblastos en cultivo (medio condicionado añadido a 40 \mul/ml). Se cultivaron mioblastos (células 057A) para preconfluencia en un plato de 24 pocillos. Se retiró el medio y se substituyó por DMEM conteniendo un 0,5% de suero fetal de vaca con o sin medio condicionado por GGF2 con una concentración de 40 \mul/ml. El medio fue cambiado después de dos días y las células fueron fijadas y teñidas después de cinco días. Los núcleos totales fueron contados igual que el número de núcleos en mioblastos (Tabla 1).

TABLA 1

Tratamiento	Número total de núcleos/mm^{2}	Núcleos en miotubos	Índice de fusión
Control	395 \pm 28,3	204 \pm 9,19	0,515 \pm 0,01
GGF 40 \mul/ml	636 \pm 8,5	381 \pm 82,7	0,591 \pm 0,15

Los mioblastos tratados con GGF mostraron un número incrementado de núcleos totales (636 núcleos) con respecto a los controles no tratados (395 núcleos) indicando actividad mitogénica. Los miotubos tratados con rhGGF2 tenían un número mayor de núcleos (381 núcleos) que los controles sin tratar (204 núcleos). Por lo tanto, el rhGGF2 aumenta el número total de núcleos por la proliferación e incremento de la supervivencia de células. El rhGGF2 probablemente aumenta también la formación de miotubos.

La actividad mitogénica de rhGGF2 puede ser medida in vivo proporcionando un suministro continuo de GGF2 y [^{3}H] timidina a músculos de rata mediante una minibomba osmótica. La masa muscular se determina por peso en húmedo después de una y dos semanas de tratamiento. La replicación de DNA es medida por contaje de núcleos marcados en secciones después de recubrimiento para autoradiografía (Sklar y otros, In Vitro Cellular and Developmental Biology 27A:433-434, 1991) en músculos simulados ("sham") y tratados con rhGGF2. También se examinaron músculos desnervados en este modelo de animal de rata mediante estos métodos, y este método permite la evaluación de la función de rhGGF2 en la atrofia y reparación muscular. El diámetro medio de las fibras puede también ser utilizado para evaluar los efectos de FGF en prevención de atrofia.

Ejemplo 2 Efecto de rhGGF2 en la mitogénesis de células musculares

Se prepararon mioblastos humanos clonales primarios quiescentes tal como se ha descrito anteriormente (Sklar, R., Hudson, A., Brown, R. y otros, In Vitro Cellular and Developmental Biology 1991; 27A:433-434). Las células quiescentes fueron tratadas con los agentes indicados (medios acondicionados mediante rhGGF2, PDGF con y sin metilprednisolona, y medio de control) en presencia de 10 \muM BrdU, 0,5% FCS en DMEM. Después de dos días, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos, y se lavaron con etanol al 70%. Las células fueron incubadas a continuación con un anticuerpo anti-BrdU, se lavaron y se visualizó la unión de anticuerpos con una reacción de peroxidasa. El número de núcleos con manchado se cuantificó por área. Los resultados muestran que el
GGF2 induce un incremento en el número de núcleos marcados por área con respecto a los controles (ver Tabla 2).

TABLA 2 Efectos mitogénicos de GGF en mioblastos humanos

Tratamiento	Núcleos marcados/cm^{2}	Prueba T Valor p
Control	120 \pm 22,4
Control infectado	103 \pm 11,9
GGF 5 \mul/ml	223 \pm 33,8	0,019
PDGF 20 ng/ml	418 \pm 45,8	0,0005
IGFI 30 ng/ml	280 \pm 109,6	0,068
Metilprednisolona 1,0 \muM	142 \pm 20,7	0,293

El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFG) fue utilizado como control positivo. Se utilizó también metilprednisolona (un corticosteroide) además de rhGGF2 y no mostró incremento significativo en el marcado de DNA.

El rhGGF2 purificado hasta homogeneidad (pureza > 95%) es también mitogénico para mioblastos humanos (figura 1).

El GGF2 humano recombinante provoca también mitogénesis de mioblastos humanos primarios (ver Tabla 2 y figura 1). El ensayo de mitogénesis es llevado a cabo tal como se ha descrito anteriormente. El índice mitótico es calculado a continuación dividiendo el número de células positivas BrdU por el número total de células.

Ejemplo 3 Efecto de rhGGF2 en la diferenciación de células musculares

Los efectos de rhGGF2 purificado (pureza 95%) en la diferenciación de cultivo muscular fueron sometidos a examen (figura 2). Se indujeron cultivos de mioblastos confluyentes para diferenciar por reducción del contenido de suero del medio de cultivo de 20% a 0,5%. Los cultivos de prueba fueron tratados con la concentración indicada de rhGGF2 durante seis días, renovando el medio de cultivo cada dos días. Los cultivos fueron a continuación fijados y teñidos, y el número de núcleos fue contado por milímetro. Los datos de la figura 2 demuestran un gran incremento en el número de núcleos en miotubos cuando se encuentra presente rhGGF2, con respecto a los controles.

Ejemplo 4 Efecto de rhGGF2 en la supervivencia de miotubos diferenciados

La supervivencia de miotubos diferenciados se incrementó significativamente por tratamiento de rhGGF2. Se diferenciaron cultivos musculares en presencia de rhGGF2 en varios momentos, se contó el número de miotubos muertos mediante teñido por yoduro de propidio. Tal como se puede apreciar en la figura 3, el número de miotubos muertos es menor en el cultivo tratado por rhGGF2 a los 4, 5, 6 y 8 días de diferenciación. El número de núcleos en miotubos se incrementó significativamente por tratamiento de GGF2 en comparación con cultivos no tratados después de 8 días de diferenciación. De manera específica, el control mostró 8,6 mionúcleos/mm^{2}, mientras que los cultivos tratados con rhGGF2 mostraron 57,2 mionúcleos/mm^{2} (p=0,035) contados sobre las mismas placas después de teñido geimsa.

El ensayo de supervivencia fue llevado a cabo también con otros factores de crecimiento que tienen efectos conocidos sobre el cultivo muscular. El efecto de rhGGF2 fue único entre los factores de crecimiento comprobados (figura 4). En este experimento, se trataron cultivos en paralelo con placas tratadas con rhGGF2 con las concentraciones indicadas de los diferentes factores de crecimiento. La supervivencia de miotubos fue medida tal como se ha indicado anteriormente a los 8 días de diferenciación de células de mioblastos 057A. Las concentraciones de factores fueron las siguientes: rhGGF2: 100 ng/ml; factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas: 20 ng/ml; factor de crecimiento de fibroblastos básico humano: 25 ng/ml; factor de crecimiento epidérmico humano: 30 ng/ml; factor inhibitorio de leucocitos humanos: 10 ng/ml; factor I de crecimiento parecido a insulina humana: 30 ng/ml; factor II de crecimiento similar a insulina humana: 25 ng/ml.

La protección observada de miotubos diferenciados contra la muerte indica que el rhGGF2 tiene posibilidades como terapia para intervención de degeneración muscular caracterizada por numerosas enfermedades musculares. Por lo tanto, los agentes que incrementan la concentración extramuscular de neuregulinas pueden tener efecto profiláctico o reducir el avance de desórdenes de degradación muscular y aumentan las tasas de diferenciación muscular, de reparación, acondicionamiento y regeneración.

Ejemplo 5 El rhGGF2 favorece la supervivencia de miotubos diferenciados con efecto genético en el locus de distrofia muscular de Duchenne

Los efectos positivos del rhGGF2 en supervivencia de miotubos pueden reflejar la eficacia potencial en los desórdenes degenerativos. Estos efectos en la supervivencia de miotubos fueron comprobados en un mioblasto de Duchenne primario derivado clonalmente para determinar si la respuesta observada en cultivos musculares normales podía ser también demostrada en cultivos derivados de individuos enfermos. Los datos presentados en la figura 5 fueron obtenidos utilizando las mismas condiciones de cultivo muscular (anterior ejemplo 4) utilizadas para individuos normales. El rhGGF2 disminuyó significativamente el número de miotubos muertos en el cultivo muscular de Duchenne diferenciado, en comparación con los controles (p=0,032). Las concentraciones fueron las siguientes: GGF2: 100 ng/ml; factor de crecimiento derivado de plaquetas humanas: 20 ng/ml; factor I de crecimiento similar a insulina humana: 30 ng/ml.

Este ejemplo demuestra que el rhGGF2 puede ayudar también a la supervivencia de miotubos de Duchenne diferenciados y proporciona una fuerte demostración de que rhGGF2 puede reducir o impedir el curso de la degeneración y pérdida muscular en mamíferos.

Ejemplo 6 Efecto de rhGGF2 en el programa de diferenciación: inducción de proteínas de distrofina y MHC lenta

Los efectos de rhGGF2 purificado en la diferenciación de cultivos musculares fueron examinados también por análisis Western de lisados de cultivo. Los niveles de proteínas específicas de los músculos fueron determinados en cultivos triplicados tratados y no tratados. Estos cultivos fueron preparados y tratados tal como se ha indicado anteriormente, excepto que las dimensiones de la placa se incrementaron a 150 mm y la capa de cultivo muscular fue retirada por análisis Western tal como se describe en Sklar, R., y Brown, R. (J. Neurol. Sci. 101:73-81, 1991). Los resultados presentados en la tabla A indican que el tratamiento con rhGGF2 incrementa los niveles de varias proteínas específicas de los músculos, incluyendo distrofina, cadena pesada de miosina (MHC, isoformas adultas lentas y rápidas), pero no incrementa el nivel de HSP72 o isoforma de MHC de neonato a un nivel similar por la cantidad de proteína cargada en el ensayo Western. Los niveles de proteínas específicas musculares inducidas por rhGGF2 fueron similares a los incrementos cuantitativos en el número de mionúcleos/mm^{2} (tabla 3).

TABLA 3

Valor	Control \pm SD	Tratamiento rhGGF2 \pm SD	p
Proteínas totales (\mug)	554 \pm 38,4	798 \pm 73,6	0,007
Mionúcleos/mm^{2}	29,0 \pm 12,2	106 \pm 24,1	0,008
MHC rápida/\mug proteína	1,22 \pm 0,47	4,00 \pm 0,40	0,001
MHC lenta/\mug proteína	0,17 \pm 0,13	1,66 \pm 0,27	0,001
MHC neonato/\mug proteína	0,30 \pm 0,27	0,55 \pm 0,04	0,199
distrofina/\mug proteína	6,67 \pm 0,37	25,5 \pm 11,0	0,042
HSP 72/\mug proteína	3,30 \pm 0,42	4,54 \pm 0,08	0,008

El incremento dependiente de rhGGF2 en las isoformas de miosina de cadena pesada de adultos (la lenta se encuentra en fibras musculares humanas tipo I; la rápida se encuentra en fibras musculares humanas tipo 2A y 2B) puede representar una maduración de los miotubos, dado que la isoforma neonatal no incrementó significativamente por el tratamiento por rhGGF2. Durante el desarrollo de músculos de rata, las isoformas de MHC cambian de formas fetales a neonatales seguidas de un cambio a isoformas de MHC lentas y rápidas de adulto maduras (Periasamy y otros, J. Biol. Chem. 259:13573-13578, 1984; Periasamy y otros, J. Biol. Chem. 260:15856-15862, 1985; Wieczorek y otros, J. Cell. Biol. 101:618-629, 1985). Si bien los músculos pueden sufrir de manera autónoma una parte de estas transiciones de isoformas en ausencia de células neurales o tejidos, las explantaciones de músculos de ratón expresan la isoforma MHC rápida de adulto solamente cuando se cultivan en presencia de médula de la espina dorsal de ratón (Ecob-Prince y otros, J. Cell Biol. 103:995-1005, 1986). Pruebas adicionales de que las transiciones de isoformas de MHC están influenciadas por los nervios se establecieron por Whalen y otros (Deve. Biol. 141:24-40, 1990); después de regeneración de músculos soleus de rata tratados con notexina, solamente se produjo la isoforma de MHC rápida de adulto en los nuevos músculos desnervados, pero los músculos regenerados inervados realizaron isoformas de MHC de adulto tanto rápidas como lentas. Por lo tanto, la demostración en la tabla 3 de que rhGGF2 incrementa la síntesis de isoformas de MCH de adulto indica que el rhGGF2 puede inducir una maduración de desarrollo de músculos que puede imitar la innervadión neuronal.

Ejemplo 7 Neuregulinas, incluyendo rhGGF2, inducen la síntesis de receptores de acetilcolina en músculos

La expresión de proteínas subunitarias de receptor de acetilcolina (AchR) puede ser inducida al exponer las células musculares a neuregulinas. De manera más específica, los inventores han demostrado que el contacto de las células musculares con rhGGF2 puede inducir la síntesis de las proteínas subunitarias AchR. Esta inducción después de la exposición a rhGGF2 se observó de dos maneras: en primer lugar, los inventores detectaron la expresión incrementada de la hormona de crecimiento humano a través del producto de un constructo de gen indicador ("reporter"), y, en segundo lugar, los inventores detectaron una unión incrementada de la alfa-bungarotoxina a las células.

En el ejemplo siguiente, se utilizó una línea celular C2 de mioblastos de ratón. Las células C2 fueron transfectadas con un transgen que contenía las secuencias regulatorias 5' del gen de la subunidad delta de AchR de ratón enlazada a cDNA de longitud completa de una hormona de crecimiento humano (Baldwin y Burden, 1988. J. Cell Biol. 107:2271-2279). Este constructo indicador permite la medición de la inducción de la expresión del gen delta de AChR al ensayar la cantidad de hormona de crecimiento segregada al medio circundante. La línea puede ser inducida para formar miotubos al reducir la concentración de suero en el medio de 20% a 0,5%.

De manera específica, los mioblastos C2 fueron transfectados con un constructo indicador de la hormona de crecimiento humano-AChR y se ensayaron en cuanto a la expresión de hGH después de tratamiento con rhGGF2. Los resultados de dos experimentos separados se resumen en la tabla 4 y en las figuras 6 (expresión hGH) y 7 (expresión hGH y unión alfa-bungarotoxina). Se muestran las curvas de respuesta a la dosis para la hormona de crecimiento humano segregada y para la unión de bungarotoxina a partir de cultivos de músculos tratados con rhGGF2.

TABLA 4 Efectos de rhGGF2 en la expresión de la subunidad delta de AChR/transgen hGH y la síntesis de AChR

	Exp 1	Exp 2
GGF (ul)	hGH (ng/ml)	hGH (ng/ml)	AChR (cpm/mg proteína)
0	9,3 + 2,1	5,7 + 2,1	822 + 170
0,1	--	6,8 + 1,5	891 + 134
0,5	--	12,0 + 0,9	993 + 35
1,0	--	9,7 + 2,3	818 + 67
5,0	17,5 + 2,8	14,7 + 3,5	1300 + 177
10,0	14,3 + 3,2	14,1 + 3,3	1388 + 137
15,0	22,0 + 1,4	--	--

Se trataron miotubos de C2 con \alpha-BTX (20 nM) en frío durante 1 hora a 37ºC, se lavó con medio de cultivo dos veces y luego se trató con GGF2. El medio de cultivo fue ajustado con albúmina de suero bovino a una concentración de 1 mg/ml. 24 horas más tarde, el medio de cultivo fue retirado y guardado para ensayo de hGH. Se trataron cultivos musculares con ^{125}I-\alpha-BTX (20 nM) durante 1 hora a 37ºC, se lavaron y se recogieron en PBS conteniendo 1% de SDS. Se determinó la unión no específica en presencia de \alpha-BTX (40 nM) en frío. El homogeneizado de células fue sometido al contaje en cuanto a radioactividad y ensayado en cuanto a cantidad total de proteínas.

La presencia de rhGGF2 condujo a un incremento superior al doble en la expresión del gen hGH, indicando de esta manera que rhGGF2 inducía la síntesis de la subunidad delta del receptor de acetilcolina. Además, la unión incrementada de bungarotoxina se corresponde con el acoplamiento de estas proteínas subunitarias en receptores de acetilcolina funcionales. Para reforzar la interpretación de estos datos, se repitió el análisis en cultivos que tenían el hGH indicador asociado a un promotor metalotieno, que no debe tener respuesta a rhGGF2. Los resultados de dicho experimento de control demostraron que la respuesta de hGH estaba intermediada por la activación transcripcional de elementos de control del gen subunitario delta AchR.

Estos resultados indican que el rhGGF2 podría ser útil en la renovación de AchR como parte de la terapia de la enfermedad autoinmune Miastenia gravis. Esta actividad puede ser también beneficiosa en el tratamiento de regeneración nerviosa periférica y neuropatía al estimular una etapa clave en la reinervación de los músculos.

Ejemplo 8 Actividades mitogénicas adicionales de GGF-I y GGF-II purificados

Se estudió la actividad mitogénica de muestras altamente purificadas comprendiendo GGF I y II utilizando un método cuantitativo, que permite el examen de un microcultivo único para síntesis de DNA, morfología celular, número de células y expresión de antígenos de células. Esta técnica ha sido modificada a partir del método anteriormente indicado por Muir y otros, Analytical Biochemistry 185, 377-382, 1990. Las modificaciones principales son: 1) utilización de placas de microtitulación sin recubrimiento, 2) número de células por pocillo, 3) utilización de 5% de plasma fetal bovino (FBP) en vez de 10% de suero fetal de vaca (FCS) y 4) tiempo de incubación en presencia de mitógenos y bromodeoxiuridina (BrdU), añadido simultáneamente a los cultivos. Además, la monocapa de células no fue lavada antes de fijación para evitar pérdida de células, y el tiempo de incubación de anticuerpo anti-BrdU de ratón monoclonal y anticuerpo de inmunoglobulina (IgG) de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa se doblaron para incrementar la sensibilidad del ensayo. El ensayo, optimizado para células Schwann del nervio ciático de rata, ha sido utilizado también para varias líneas celulares, después de modificaciones apropiadas en las condiciones de cultivo celular.

I. Métodos de pruebas de mitogenesis

En el día 1, se aplicaron a una placa células Schwann purificadas sobre placas de 96 pocillos sin recubrimiento en medio de Eagle (DMEM) modificado por 5% de FBP/Dulbecco (5.000 células/pocillo). En el día 2, se añadieron GGF u otros factores de prueba a los cultivos, así como BrdU con una concentración final de 10 gm. Después de 48 horas (día 4), se terminó la incorporación de BrdU por aspiración del medio y las células fueron fijadas con 200 \mul/pocillo de 70% de etanol durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, las células fueron lavadas con agua y el DNA fue desnaturalizado por incubación con 100 \mul 2N HCl durante 10 minutos a 37ºC. Después de aspiración, el ácido residual fue neutralizado por llenado de los pocillos con tampón borato 0,1 M, pH 9,0 y las células fueron lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células fueron tratadas a continuación con 50 \mul de tampón bloqueante (PBS conteniendo 0,1% Triton x 100 y 2% de suero de cabra normal) durante 15 minutos a 37ºC. Después de aspiración, el anticuerpo anti-BrdU monoclonal de rata (Dako Corp., Santa Bárbara, CA) (50 \mul/pocillo, 1,4 \mug/ml diluido en tampón bloqueante) se añadió y se incubó durante dos horas a 37ºC. Se retiraron los anticuerpos no unidos mediante tres lavados en PBS conteniendo 0,1% de Triton X-100 y el anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa (Dako Corp., Santa Bárbara, CA) (50 \mul/pocillo, 2 \mug/ml diluido en tampón de bloqueo) se añadió y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Después de tres lavados en PBS/Triton y aclarado final en PBS, los pocillos recibieron 100 \mul/pocillo de tampón fosfato/citrato 50 mM, pH 5,0, conteniendo 0,05% del cromógeno soluble o-fenilendiamina (OPD) y 0,02% de H_{2}O_{2}. La reacción fue interrumpida después de 5-20 minutos a temperatura ambiente, por pipeteado de 80 \mul de cada pocillo a una placa limpia que contenía 40 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2N. Se registró la absorbancia a 490 nm utilizando un lector de placas (Dynatech Labs). Las placas de ensayo conteniendo las monocapas de células fueron lavadas dos veces con PBS y se tiñeron inmunocitoquímicamente para BrdU-DNA por adición de 100 \mul/pocillo del sustrato diaminobencidina (DAB) y 0,02% de H_{2}O_{2} para generar un producto insoluble. Después de 10-20 minutos, la reacción de tinción fue interrumpida por lavado con agua, y se observaron los núcleos positivos BrdU y se contaron utilizando un microscopio invertido. Ocasionalmente, se contratiñeron núcleos negativos con 0,001% de azul de Toluidina y se contaron igual que antes.

II. Líneas celulares utilizadas para ensayos de mitogénesis

Fibroblastos Swiss 3T3: células, procedentes de Flow Labs, se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FCS, penicilina y estreptomicina, a 37ºC en una atmósfera humidificada de 10% de CO_{2} en aire. Se alimentaron células o se subcultivaron cada dos días. Para ensayo mitogénico, las células se aplicaron en placas con una densidad de 5.000 células/pocillo en medio completo y se incubaron durante una semana hasta que las células fueron confluentes y quiescentes. El medio que contiene el suero fue retirado y la monocapa de células fue lavada dos veces con un medio libre de suero. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de medio libre de suero conteniendo mitógenos y 10 \muM de BrdU, y se incubó durante 48 horas. Se llevaron a cabo respuestas de dosis a GGF y suero o PDGF (como control positivo).

Fibroblastos 21 C13 de BHK (Riñón de Hamster de poca edad): se mantuvieron en Medio Eagle Modificado Glasgow (GMEM) células procedentes de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (ECACC), suplementando el medio con 5% de caldo de triptosa fosfato, 5% de FCS, penicilina y estreptomicina, a 37ºC en atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} en aire. Se alimentaron células o se subcultivaron cada dos a tres días. Para ensayo mitogénico, las células fueron aplicadas en placas con una densidad de 2.000 células/pocillo en medio completo durante 24 horas. El medio que contenía suero fue retirado a continuación y después de lavado con medio libre de suero fue sustituido con 100 \mul de 0,1% de FCS conteniendo GMEM ó GMEM solo. Se añadieron GGF y FCS ó bFGF como controles positivos, coincidentes con 10 \muM BrdU, y se incubó durante 48 horas. Los cultivos celulares se procesaron a continuación tal como se describe para las células Schwann.

Línea celular de Glioma de Rata C6: células obtenidas en la etapa 39 fueron mantenidas en medio DMEM conteniendo 5% de FCS, 5% de suero de caballo (HS), penicilina y estreptomicina, a 37ºC en una atmósfera humidificada de 10% de CO_{2} en aire. Se alimentaron células o se subcultivaron cada tres días. Para ensayos mitogénicos, se aplicaron células en placas con una densidad de 2.000 células/pocillo en medio completo y se incubaron durante 24 horas. A continuación, el medio fue sustituido con una mezcla de 1:1 medio DMEM y medio F12 conteniendo 0,1% FCS, después de lavar en medio libre de suero. A continuación se llevaron a cabo las respuestas de dosis a GGF, FCS y \alphaFGF, y las células fueron procesadas mediante ensayo ELISA tal como se ha descrito anteriormente para los otros tipos de células.

PC12 (Células de Feocromocitoma Adrenal de Rata): se mantuvieron células de ECACC en RPMI 1640 suplementado con 10% de HS, 5% de FCS, penicilina y estreptomicina, en frascos recubiertos de colágeno, a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} en aire. Se alimentaron células cada tres días sustituyendo 80% del medio. Para ensayo mitogénico, se aplicaron células de placa con una densidad de 3.000 células/pocillo en medio completo, sobre placas recubiertas de colágeno (50 \mul/pocillo de colágeno, Vitrogen Collagen Corp., diluido 1:50, 30 minutos a 37ºC) y fueron incubadas durante 24 horas. El medio fue colocado a continuación con RPMI reciente sólo o conteniendo insulina 1 mM o 1% de FCS. Se llevaron a cabo igual que antes respuestas a dosis de FCS/HS (1:2) como control positivo y a GGF. Después de 48 horas, las células fueron fijadas y se llevó a cabo ensayo ELISA tal como se ha descrito anteriormente.

\newpage

III. Resultados de los ensayos de mitogénesis

Todos los experimentos presentados en este ejemplo fueron llevados a cabo utilizando una muestra altamente purificada procedente de la etapa de purificación por cromatografía de Sefarosa 12 conteniendo una mezcla de GGF-I y GGF-II (GGFs).

En primer lugar, los resultados obtenidos con el ensayo de incorporación de BrdU fueron comparados con el ensayo mitogénico clásico para células Schwann basado en la incorporación de [125]I-UdR en DNA de células divisoras, descrito por J. P. Brockes (Methods Enzymol. 147:217, 1987).

La figura 12 muestra la comparación de datos obtenidos con los dos ensayos, llevados a cabo en las mismas condiciones de cultivo de células (5.000 células/pocillo, en 5% de FBP/DMEM, incubado en presencia de GGF durante 48 horas). Tal como se observa con claridad, los resultados son comparables, pero el ensayo de incorporación de BrdU parece ser ligeramente más sensible, tal como es sugerido por el desplazamiento de la curva hacia la izquierda del gráfico, es decir, a concentraciones más bajas de GGFS.

Tal como se ha descrito en la sección "Métodos de pruebas de mitogénesis", después de que el BrdU-DNA inmunorreactivo ha sido cuantificado por lectura de la intensidad del producto soluble de la reacción de OPD peroxidasa, las placas de ensayo originales conteniendo monocapas celulares pueden someterse a la segunda reacción resultando en el producto DAB insoluble, que efectúa la tinción de los núcleos positivos BrdU. Los microcultivos pueden ser examinados a continuación en un microscopio invertido, y se puede observar la morfología celular y los números de núcleos positivos y negativos BrdU.

En las figuras 13A y 13B, la inmunorreactividad BrdU-DNA, evaluada por lectura de la absorbancia a 490 nm, es comparada con el número de núcleos positivos BrdU y al porcentaje de núcleos positivos BrdU sobre el número total de células por pocillo, contadas en los mismos cultivos. Las desviaciones estándar fueron menos de 10%. En los dos métodos de evaluación, se muestra una correlación muy buena y la discrepancia entre los valores para la dosis mayor de GGF se puede explicar por la diferente extensión de síntesis de DNA en células detectadas como positivas BrdU.

El ensayo de incorporación de BrdU puede proporcionar por lo tanto información adicional útil sobre la actividad biológica de los polipéptidos en células Schwann en comparación con el ensayo de incorporación de (125) I-UdR. Por ejemplo, los datos indicados en la figura 15 muestran que las GGF pueden actuar sobre células Schwann para inducir síntesis de DNA, pero a menores dosis para incrementar el número de células negativas presentes en el microcultivo después de 48 horas.

El ensayo ha sido utilizado entonces sobre varias líneas celulares de origen distinto. En la figura 15 se han comparado las respuestas mitogénicas de células Schwann y fibroblastos Swiss 3T3 con respecto a GGF; a pesar de la débil respuesta obtenida en fibroblastos 3T3, se detectaron algunos núcleos claramente positivos a BrdU en estos cultivos. Los cultivos de control se trataron en paralelo en presencia de varias dosis de FCS o PDGF recombinante humano, mostrando que las células podían responder a estímulos apropiados (no mostrado).

La habilidad de los fibroblastos en responder a GGF se investigó adicionalmente utilizando la línea celular BHK 21 C13. Estos fibroblastos, derivados del riñón, no muestran inhibición de contacto o alcanzan estado quiescente cuando son confluentes. Por lo tanto, las condiciones experimentales fueron diseñadas para tener una proliferación de fondo muy baja sin comprometer la viabilidad celular. Las GGF tienen una actividad mitogénica significativa en células BHK21 C13, tal como se ha mostrado en las figuras 16 y 17. La figura 16 muestra la incorporación de BrdU en DNA por células BHK 21 C13 estimuladas por GGFS en presencia de 0,1% de FCS. La buena respuesta mitogénica a FCS indica que las condiciones de cultivo celular no eran limitativas. En la figura 17, el efecto mitogénico de las GGF se expresa como número de células positivas BrdU y negativas BrdU y como el número total de células contadas por pocillo. Los datos son representativos de dos experimentos llevados a cabo en duplicado; como mínimo se contaron tres campos por pocillo. Igual que lo observado para células Schwann en adición al efecto proliferativo a bajas dosis, las GGF incrementan también los números de células supervivientes que no responden. El porcentaje de células positivas BrdU es proporcional a las cantidades crecientes de GGF añadidas a los cultivos. El número total de células después de 48 horas en presencia de dosis más elevadas de GGF se dobla como mínimo, confirmando que las GGF inducen síntesis de DNA y proliferación en células BHK21 C13. Bajo las mismas condiciones las células mantenidas durante 48 horas en presencia de 2% de FCS mostraron un incremento aproximado de seis veces (no mostrado).

Las células de glioma C6 han proporcionado un modelo útil para estudiar las características de células gliales. El fenotipo expresado parece ser dependiente del paso de las células, pareciéndose las células más íntimamente a un fenotipo astrocito en una etapa previa, y a un fenotipo oligodendrocito en etapas posteriores (más allá de la etapa 70). Las células C6 utilizadas en estos experimentos procedían de las etapas 39 a 52. Las células C6 son una población ampliamente proliferante, por lo tanto las condiciones experimentales fueron optimizadas para tener un fondo muy bajo de incorporación de BrdU. La presencia de 0,1% de suero fue necesaria para mantener viabilidad en las células sin afectar significativamente las respuestas mitogénicas, tal como se muestra por la respuesta a dosis FCS (figura 18).

En la figura 19, las respuestas mitogénicas a aFGF (factor de crecimiento de fibroblastos ácido) y GGF se expresan como porcentajes de incorporación máxima de BrdU obtenidos en presencia de FCS (8%). Los valores son promedios de dos experimentos, llevados a cabo en duplicado. El efecto de las GGF era comparable al de un preparado puro de aFGF. El aFGF ha sido descrito como factor de crecimiento específico para células C6 (Lim R. y otros, Cell Regulation 1:741-746, 1990), y por esta razón fue utilizado como control positivo. El contaje directo de células positivas y negativas BrdU no fue posible a causa de la elevada densidad celular en los microcultivos. Como contraste a las líneas celulares que se han indicado hasta el momento, las células PC12 no muestran ninguna respuesta evidente a las GGFS, cuando se tratan en condiciones de cultivo en las que PC12 podría responder a los sueros (mezcla de FCS y HS tal como se utiliza de manera rutinaria para mantenimiento de células). No obstante, el número de células aplicadas en placas por pocillo parece afectar el comportamiento de las células PC12, y por lo tanto se requieren más experimentos.

Ejemplo 9 Secuencias de aminoácidos de GGF-I y GGF-II purificados

Se llevaron a cabo estudios de análisis de secuencias de aminoácidos utilizando GGF-I y GGF-II de pituitaria bovina altamente purificada. Se utilizó la letra de código única convencional para describir las secuencias. Se obtuvieron péptidos por digestos de lisil endopeptidasa y proteasa V8, llevados a cabo sobre muestras reducidas y carboximetiladas, con el digesto de lisil endopeptidasa de GGF-II llevado a cabo sobre un material eluído de la región 55-65 RD de un 11% SDS-PAGE (peso molecular correspondiente a los marcadores antes indicados).

Un total de 21 secuencias de péptidos (ver figura 8, números ID de secuencia 1-20, 165) fueron obtenidos para GGF-I, de los cuales doce péptidos (ver figura 9, números ID de secuencia 1, 22-29, 17, 19 y 32) no se encuentran presentes en bases de datos de proteínas actuales y por lo tanto representan secuencias únicas. Un total de doce secuencias de péptidos (ver figura 10, números ID de secuencia 42-50 y 161-163) se obtuvieron para GGF-II, de los cuales 10 péptidos (ver figura 11, números ID de secuencia 42-50) no se encuentran presentes en bases de datos de proteínas actuales y por lo tanto representan secuencias únicas (una excepción es el péptido GGF-II 06 que muestra secuencias idénticas en muchas proteínas que probablemente no son significativas dado el número reducido de residuos). Estas nuevas secuencias es extremadamente probable que correspondan a partes de las verdaderas secuencias de aminoácidos de GGF I y II.

Se puede dedicar especial atención a las secuencias de GGF-I 07 y GGF-II 12, que están claramente muy relacionadas. Las similitudes indican que las secuencias de estos péptidos son casi de manera cierta las de las especies de GGF asignadas, y son más improbablemente derivadas de proteínas contaminantes.

Además, en el péptido GGF-II 02, la secuencia X S S es coherente con la presencia de una fracción de carbohidrato con enlace N en la asparagina en la posición indicada por X.

En general, en las figuras 8 y 10, X representa un residuo desconocido que denota un ciclo de secuenciado en el que una posición única no podría ser designada con certidumbre porque existe más de una señal de iguales dimensiones en el ciclo o porque no hay señal presente. Un asterisco indica los péptidos en los que el último aminoácido designado corresponde al último aminoácido presente en dicho péptido. En los péptidos restantes, la intensidad de la señal después del último aminoácido designado fue insuficiente para continuar la designación de la secuencia al final de dicho péptido. La columna de la derecha indica los resultados de una búsqueda en base de datos de ordenador utilizando los programas FASTA y TFASTA del paquete GCG para analizar las bases de datos de secuencias NBRF y EMBL. El nombre de una proteína de esta columna indica identidad de una parte de su secuencia con la secuencia del aminoácido del péptido designada, permitiendo un máximo de dos desacoplamientos. Una indicación de interrogante indica que se permiten tres desacoplamientos. Las abreviaturas utilizadas son las siguientes:

HMG-1

Proteína 1 del Grupo de Alta Morbilidad

HMG-2

Proteína 2 del Grupo de Alta Morbilidad

LH-alfa

Subunidad alfa de la hormona de luteinización

LH-beta

Subunidad beta de la hormona de luteinización

Ejemplo 10 Aislamiento y clonado de secuencias de nucleótidos que codifican proteínas que contienen péptidos GGF-I y GGF-II

El aislamiento y clonado de las secuencias de nucleótidos GGF-II se llevaron a cabo tal como se ha indicado anteriormente, utilizando información de secuencia de péptidos y rastreo de biblioteca, y se llevó a cabo tal como se indica a continuación. Se apreciará que los péptidos de las figuras 10 y 11 se pueden utilizar como punto de inicio para aislamiento y clonado de secuencias GGF-I al seguir las técnicas que se describen. Ciertamente, la figura 20 (números ID de secuencia 51-84) muestra posibles sondas degeneradas de oligonucleótidos para este objetivo, y la figura 22 (números ID de secuencia 86-115) indica posibles cebadores PCR. La secuencia de DNA y la secuencia del polipéptido se deben poder obtener por este medio igual que con GGF-II, y también constructos de DNA y vectores de expresión que incorporan dicha secuencia de DNA, células hospedantes genéticamente alteradas por incorporación de dichos constructos/vectores, y proteínas obtenibles por cultivo de dichas células hospedantes. La invención se refiere a esta materia.

I. Diseño y síntesis de sondas de oligonucleótidos y cebadores

Se diseñaron sondas de oligómeros de DNA degenerado por traducción inversa ("backtranslating") de las secuencias de aminoácidos (derivadas de los péptidos generados por las proteínas GGF purificadas) en secuencias de nucleótidos. Los oligómeros representaban la cadena de codificación o la cadena de no codificación de la secuencia de DNA. Cuando se incluyeron en el diseño del oligómero serina, arginina o leucina, entonces se prepararon dos síntesis separadas para evitar ambigüedades. Por ejemplo, se codificó serina por TCN ó AGY igual que en 537 y 538 ó 609 y 610. Se realizó una partición similar del codón para la arginina o leucina (por ejemplo, 544, 545). Los oligómeros de DNA fueron sintetizados en un sintetizador de DNA de cuatro columnas Biosearch 8750, utilizando química de \beta-cianoetilo funcionando con una síntesis de escala 0,2 micromolar. Los oligómeros fueron fraccionados en la columna (resinas CpG de 500 angstroms) y desprotegidos en hidróxido amónico concentrado durante 6-24 horas a una temperatura de 55-60ºC. Los oligómeros desprotegidos fueron secados en vacío (Speedvac) y purificados por electroforesis en geles de 15% de acrilamida (20 mono: 1 bis), tampón Tris-borato-EDTA 50 mM conteniendo urea 7M. Se detectaron oligómeros de longitud completa en los geles por sombrado mediante UV, a continuación las bandas fueron sometidas a escisión y los oligómeros de DNA fueron eluidos en 1,5 ml de H_{2}O durante 4-16 horas con agitación. El eluido fue secado, redisuelto en 0,1 ml de H_{2}O y se tomaron mediciones de absorbancia a 260 nm.

Se determinaron las concentraciones de acuerdo con la siguiente fórmula:

(A \ 260 \ x \ unidades/ml) \ (60,6/longitud = \ X \ \mu M)

Todos los oligómeros fueron ajustados a concentración de 50 \muM por adición de H_{2}O.

Se muestran sondas degeneradas diseñadas de la forma mencionada anteriormente en la figura 20, números ID de secuencia 54-88.

Se prepararon cebadores PCR esencialmente por los mismos procedimientos utilizados para sondas con las siguientes modificaciones. Se incluyeron en los extremos 5' de los oligómeros degenerados para su utilización en el clonado en vectores enlazadores de trece nucleótidos conteniendo lugares de restricción. Se llevó a cabo síntesis de DNA a la escala de 1 micromol utilizando resinas CpG de 1.000 angstroms y se utilizó inosina en posiciones en las que los cuatro nucleótidos fueron incorporados normalmente en sondas degeneradas. Las purificaciones de los cebadores PCR incluían precipitación en etanol seguida de purificación por electroforesis de gel.

II. Construcción de biblioteca y rastreo

Se adquirió una biblioteca de DNA genómico bovino de Stratagene (Número de Catálogo: 945701). La biblioteca contenía fragmentos de DNA bovino parcial 2 x 10^{6} 15-20 kb Sau3A1 clonados en el vector lambda Dashll. Se adquirió una biblioteca de cDNA de cerebro total bovino de Clonetech (Número de catálogo: BL 10139). Se construyeron bibliotecas complementarias de DNA (en Vitrogen; Stratagene) a partir de mRNA preparado en base a cerebro total bovino, a partir de pituitaria bovina y pituitaria posterior bovina. En Vitrogen se prepararon dos bibliotecas de cDNA: una biblioteca se encontraba en el vector lambda g10, la otra en el vector pcDNAI (una biblioteca de plásmido). Las bibliotecas Stratagene fueron preparadas en el vector lambda unizap. Colectivamente, las bibliotecas de cDNA contenían 14 millones de fagos recombinantes primarios.

La biblioteca genómica bovina fue aplicada en forma de placa sobre la cepa hospedante de E. coli K12 LE392 sobre platos 23 x 23 cm (Nunc) a una proporción de 150.000 a 200.000 placas de fago por plato. Cada plato representaba aproximadamente un equivalente de genoma bovino. Después de incubación durante una noche a 37ºC, los platos fueron enfriados, y se prepararon filtros réplica de acuerdo con los procedimientos de Maniatis y otros (2:60-81). Se prepararon cuatro extracciones de placas de cada plato sobre membranas de nylon sin carga (Pall Biodyne A ó MSI Nitropure). El DNA fue inmovilizado sobre membranas por entrecruzamiento con luz UV durante 5 minutos o, por cocción a 80ºC en vacío durante 2 horas. Las sondas de DNA fueron marcadas utilizando quinasa de polinucleótido T4 (New England Biolabs) con gamma 32P ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mmol) de acuerdo con las especificaciones de los suministradores. De modo breve, se incubaron 50 pmoles de oligómero de DNA degenerado incubado en presencia de 600 \muCi gamma ^{32}p-ATP y 5 unidades de quinasa de polinucleótido T4 durante 30 minutos a 37ºC. Una vez terminadas las reacciones, se añadió tampón de carga de electroforesis de gel y a continuación se purificaron sondas radiomarcadas por electroforesis. Se separaron por escisión sondas marcadas 32P de cortes de gel y se eluyeron en agua. De forma alternativa, se marcaron sondas de DNA con intermedio de amplificación PCR por incorporación de \alpha-32P-dATP ó \alpha-32P-dCTP de acuerdo con el protocolo de Schowalter y Sommer, Anal. Biochem 177:90-94 (1989). Las sondas marcadas en reacciones PCR fueron purificadas por desalación sobre columnas de Sephadex G-150.

Se llevaron a cabo la prehibridación y la hibridación en tampón GMC (0,52 M NaPi, 7% SDS, 1% BSA, 1,5 mM EDTA, 0,1 M NaCl 10 mg/ml tRNA). El lavado fue llevado a cabo en oligolavado (160 ml 1 M Na_{2}HPO_{4} 200 ml 20% SDS, 8,0 ml 0,5 M EDTA, 100 ml 5M NaCl, 3632 ml H_{2}O). De manera típica, se incubaron 20 filtros (cada uno de ellos de 400 cm^{2}) representando copias réplica de diez equivalentes de genoma bovino, en 200 ml de solución de hibridación con 100 pmoles de sonda de oligonucleótido degenerado (128-512 veces degenerado). La hibridación se dejó que tuviera lugar durante una noche a 5ºC por debajo de la temperatura mínima de fusión calculada para la sonda degenerada. El cálculo de la temperatura mínima de fusión supone 2ºC para un par AT y 4ºC para un par GC.

Los filtros fueron lavados en cambios repetidos de oligolavado a las temperaturas de hibridación de 4 a 5 horas y finalmente en cloruro de tetrametilamonio 3,2 M, dos veces en SDS al 1% durante 30 minutos a una temperatura que depende de la longitud de la sonda de DNA. Para 20 mers, la temperatura de lavado final era de 60ºC. Se montaron los filtros, a continuación se sometieron a una película de rayos X (Kodak XAR5) utilizando pantallas intensificadoras (Dupont Cronex Lightening Plus). Usualmente, era suficiente una exposición de tres a cinco días a menos de 80ºC para detectar señales duplicadas en estas pantallas de biblioteca. Siguiendo el análisis de los resultados, los filtros pudieron ser extraídos y re-sondados. Los filtros fueron extraídos por incubación mediante dos ciclos sucesivos de 15 minutos en una estufa de microondas a plena potencia en una solución de SDS a 1% conteniendo 10 mM EDTA pH8. Los filtros fueron sometidos como mínimo a tres o cuatro ciclos de extracción y re-sondado con diferentes sondas.

III. Aislamiento de fagos recombinantes, crecimiento y preparación de DNA

Estos procedimientos siguieron un protocolo estándar tal como se describe en Recombinant DNA (Maniatis y otros 2:60-2:81).

IV. Análisis de clones aislados utilizando digestión de DNA y ensayos Southern

Se sometieron a digestión muestras de DNA de fagos recombinante (2 microgramos) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el suministrador de endonucleasa de restricción (New England Biolabs). Después de cuatro horas de incubación a 37ºC, los productos de reacción fueron precipitados en presencia de acetato sódico 0,1 M y tres volúmenes de etanol. El DNA precipitado fue recogido por centrifugación, lavado en etanol al 75% y secado. Todas las muestras resuspendidas fueron cargadas en geles de agarosa (típicamente 1% en tampón TAE; Tris acetato 0,04M, 0,002M EDTA). Las pasadas del gel tuvieron lugar a 1 voltio por centímetro durante un tiempo de 4 a 20 horas. Los marcadores incluyeron fragmentos de lambda Hind III DNA y/o fragmentos de \diameterX174HaeIII DNA (New England Biolabs). Los geles fueron sometidos a tinción con 0,5 microgramos/ml de bromuro de etidio y se fotografiaron. Para el ensayo Southern, el DNA fue en primer lugar despurinado en el gel por tratamiento con 0,125 N NaCl, desnaturalizado en 0,5 N NaOH y transferido en 20x SSC (cloruro sódico 3M, citrato sódico 0,03 M) a membrana de nylon sin carga. El ensayo fue llevado a cabo durante 6 horas hasta 24 horas, a continuación los filtros fueron neutralizados en 0,5 Tris HCl pH 7,5, cloruro sódico 0,15 M, y a continuación aclarados brevemente en 50 mM de Tris-borato EDTA.

Para el entrecruzado o reticulación, los filtros fueron envueltos en primer lugar en una envoltura de plástico transparente, a continuación el lado del DNA fue expuesto durante 5 minutos a luz ultravioleta. Se llevó a cabo hibridación y lavado tal como se describe para rastreo de biblioteca (ver sección 2 de este ejemplo). Para análisis de hibridación para determinar si existen genes similares en otras especies, se llevaron a cabo ligeras modificaciones. El filtro de DNA fue adquirido de Clonetech (Número de catálogo 7753-1) y contiene 5 microgramos de DNA sometidos a digestión EcoRI procedentes de varias especies por línea. La sonda fue marcada por reacciones de amplificación PCR tal como se describe en la anterior sección 2, y las hibridaciones fueron realizadas en tampón B al 80% (2 g de polivinilpirrolidona, 2 g de Ficoll-400, 2 g de suero albúmina bovina, 50 ml de Tris-HCl a 1M (pH 7,5), 58 g de NaCl, 1 g de pirofosfato sódico, 10 g de dodecilsulfato sódico y 950 ml de H_{2}O) conteniendo sulfato de dextrano al 10%. Las sondas fueron desnaturalizadas por ebullición durante 10 minutos y a continuación sometidas a enfriamiento rápido en agua helada. La sonda fue añadida al tampón de hibridación a 10^{6} dpm ^{32}p por ml e incubada durante una noche a 60ºC. Los filtros fueron lavados a 60ºC, en primer lugar, en tampón B seguido de 2X SSC, 0,1% SDS, a continuación en 1X SSC, 0,1% SDS. Para experimentos de alto rigor, se realizaron lavados finales en 0,1 x SSC, 1% SDS y la temperatura se aumentó a 65ºC.

Los datos del análisis Southern fueron utilizados para preparar un mapa de restricción del clon genómico y para indicar que subfragmentos se hibridizaron a las sondas GGF (candidatos para subclonado).

V. Subclonado de segmentos de homólogos de DNA a sondas de hibridación

Digestos de DNA (por ejemplo, 5 microgramos) fueron cargados en geles de agarosa a 1% y a continuación se separaron por escisión fragmentos apropiados de los geles después de tinción. El DNA fue purificado por adsorción sobre gránulos de cristal seguido de elusión utilizando el protocolo descrito por el suministrador (Bio 101). Los fragmentos de DNA recuperado (100-200 ng) fueron ligados en vectores defosforilados linealizados, por ejemplo, pT3T7 (Ambion), que es un derivado de pUC18, utilizando ligasa T4 (New England Biolabs). Este vector lleva el gen E. Coli \beta lactamasa, por lo tanto, los transformantes pueden ser seleccionados sobre placas que contienen ampicilina. El vector suministra también complementación de \beta galactosidasa a la célula hospedante, por lo que se pueden detectar los no recombinantes (azul) utilizando isopropiltiogalactósido y Bluogal (Bethesda Research Labs). Una parte de las reacciones de ligado fue utilizada para transformar células competentes azules E. coli K12 XL1 (número de catálogo Stratagene: 200236) y a continuación los transformantes fueron seleccionados sobre placas LB conteniendo 50 microgramos por ml de ampicilina. Se seleccionaron colonias blancas y se prepararon minipreparaciones de plásmidos para digestión de DNA y para análisis de secuencia de DNA. Los clones seleccionados fueron sometidos nuevamente a prueba para determinar si su DNA insertado hibridizaba con las sondas GGF.

VI. Secuenciado de DNA

Se prepararon moldes ("templates") de DNA de plásmido de doble cadena a partir de cultivos de 5 ml según protocolos estándar. El secuenciado se llevó a cabo por el método de terminación de cadena didesoxi utilizando Sequenase 2.0 y un equipo de secuenciado de didesoxinucleótido (US Biochemical) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes (modificación de Sanger y otros PNAS; USA 74:5463 (1977)). Alternativamente, el secuenciado fue realizado en un ciclador térmico de DNA (Perkin Elmer, modelo 4800) utilizando un equipo de secuenciado de ciclo (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) y fue llevado a cabo de acuerdo con las intrucciones del fabricante utilizando un cebador marcado en el extremo 5'. Los cebadores de secuencia fueron o bien los suministrados con los equipos de secuenciado o se sintetizaron de acuerdo con la secuencia determinada a partir de los clones. Las reacciones de secuenciado fueron objeto de carga y resolución sobre genes de secuenciado con un grosor de 0,4 mm de poliacrilamida al 6%. Los geles fueron secados y expuestos a película de rayos X. De manera típica, 35S fue incorporado cuando se utilizaron equipos de secuenciado estándar y se utilizó un cebador marcado en el extremo 32P para reacciones de secuenciado de ciclo. Las secuencias fueron leídas en un editor de secuencia de DNA desde el fondo del gel a la parte superior (dirección 5' a 3') y se analizaron los datos utilizando programas suministrados por Genetics Computer Group (GCG, Universidad de Wisconsin).

VII. Preparación de RNA y amplificación PCR

Las imágenes de lectura abierta detectadas en el DNA genómico y que contenía péptidos GGF de codificación de secuencia se extendieron vía amplificación PCR de RNA de pituitaria. El RNA fue preparado a partir de tejidos bovinos congelados (Pelfreeze) de acuerdo con el procedimiento de guanidina neutra-CsCl (Chirgwin y otros, Biochemistry 18:5294 (1979)). Se seleccionó RNA poliadenilado por cromatografía de columna de oligo-dT celulosa (Aviv y Leder PNAS (USA) 69:1408 (1972)).

Secuencias específicas objetivo de DNA fueron amplificadas empezando con muestras totales de RNA o RNA poliadenilado que se habían convertido en cDNA utilizando el dispositivo Perkin Elmer PCR/RNA Número de equipo: N808-0017. Las reacciones de transcripción inversa de la primera cadena utilizaron 1 \mug de RNA modelo y cebadores de oligo-dT con enlazadores de lugar de reconocimiento de enzima de restricción acoplados o cebadores antisentido específicos determinados a partir de secuencias clonadas con lugares de restricción acoplados. Para producir esta segunda cadena, los cebadores eran o bien secuencias únicas de cadena adicional ("plus strand") tal como se utilizan en reacciones 3'RACE (Frohman y otros, PNAS (USA) 85:8998 (1988)) o fueron cebadores oligo-dT con lugares de restricción acoplados si el segundo lugar objetivo había sido añadido por la prolongación de transferasa terminal de los productos de reacción de la primera cadena con dATP (por ejemplo, reacciones 5'RACE, Frohman y otros, ver cita anterior). De manera alternativa, tal como en reacciones PCR ancladas, los cebadores de la segunda cadena eran degenerados, por lo tanto, representando secuencias de péptidos específicas.

Los perfiles de amplificación siguieron el esquema general siguiente: 1) etapa de inmersión de cinco minutos a 95ºC; 2) etapa de ciclo términco de 1 minuto a 95ºC; disminución progresiva durante 1 minuto a temperatura de tratamiento de 45ºC, 50ºC ó 55ºC; mantener la temperatura de tratamiento durante 1 minuto; subir progresivamente a 72ºC a lo largo de 1 minuto; prolongar permanencia a 72ºC durante 1 minuto o durante 1 minuto además de una autoprolongación de 10 segundos; 3) ciclo de prolongación a 72ºC, 5 minutos; y 4) etapa de inmersión a 4ºC durante tiempo indefinido. Las etapas de ciclo térmico (#2) se realizaron usualmente durante 30 ciclos. Una muestra de 16 \mul de cada 100 \mul de reacción de amplificación fue analizada por electroforesis en geles con 1% de agarosa 2% Nusieve en tampón TAE a 4 voltios por centímetro durante 3 horas. Los geles fueron objeto de tinción, y a continuación ensayados en membranas de nylon sin cargas, que recibieron sondas de DNA marcadas que eran internas con respecto a los cebadores.

Conjuntos específicos de productos de amplificación de DNA pudieron ser identificados en los experimentos de transferencia y se utilizaron sus posiciones como guía para purificación, y reamplificación. En caso apropiado, las partes restantes de las muestras seleccionadas fueron cargadas en geles de preparación y a continuación después de electroforesis se tomaron 4 ó 5 secciones con grosores de 0,5 mm del gel (señalando la posición esperada del producto específico). La agarosa fue triturada, y luego sumergida en 0,5 ml de tampón de electroforesis de 2-16 horas a 40ºC. La agarosa triturada fue centrifugada durante 2 minutos y la fase acuosa fue transferida a tubos recientes.

La reamplificación fue realizada en 5 microlitros (aproximadamente 1% del producto) del material eluido utilizando los mismos juegos de cebadores y perfiles de reacción tal como en las reacciones originales. Cuando se hubieron terminado las reacciones de reamplificación, se extrajeron muestras con cloroformo y se transfirieron a tubos recientes. Se añadieron tampones de enzimas de restricción concentradas y enzimas a las reacciones a efectos de fraccionamiento en los lugares de restricción presentes en los enlazadores. Los productos PCR objeto de digestión fueron purificados por electroforesis de gel, a continuación subclonados en vectores tal como se ha descrito en la sección anterior de subclonado. El secuenciado de DNA fue realizado tal como se ha descrito anteriormente.

VIII. Análisis de la secuencia de DNA

Se reunieron secuencias de DNA utilizando un programa de reunión de fragmentos y las secuencias de animoácidos fueron deducidas por los programas GCG GelAssemble, Map and Translate. Las secuencias de proteínas deducidas fueron utilizadas como secuencia interrogadora para buscar bases de datos de secuencias de proteínas utilizando WordSearch. El análisis se llevó a cabo en una estación de trabajo VAX Station 3100 funcionando según VMS 5.1. La búsqueda de bases de datos fue realizada en el número 21 de SwissProt utilizando la versión GCG 7.0.

IX. Resultados de clonado y secuenciado de genes codificando GGF-I y GGF-II

Tal como se ha indicado anteriormente, para identificar la secuencia de DNA que codifica GGF-II bovina, se diseñaron sondas de oligonucleótidos degenerados a partir de secuencias de péptidos GGF-II. El GGF-II 12 (número ID de secuencia 44), un péptido generado mediante digestión de lisil endopeptidasa de un preparado purificado de GGF-II (ver figuras 16 y 12) mostró una fuerte homología de secuencia de aminoácido con GGF-I 07 (número ID de secuencia 39), un péptido tríptico generado a partir de un preparado purificado de GGF-I. El GGF-II 12 fue utilizado por lo tanto para crear diez sondas de oligonucleótido degenerado (ver oligos 609, 610 y 649 a 656 en la figura 20, número ID de secuencia 66, 67, 68 y 75, respectivamente). Se efectuó el sondado de un juego duplicado de filtros con dos juegos (juego 1=609, 610: juego 2 = 649-5656) de sondas que codificaban dos porciones solapadas de GGF-II 12. Se observaron señales de hibridación, pero solamente un clon hibridizó a ambos juegos de sonda. El clon (designado GGF2BG1) fue purificado.

El análisis de transferencia Southern de DNA procedente del clon fago GGF2BG1 confirmó que ambos juegos de sondas hibridizaban con dicha secuencia de DNA bovino, y mostraron además que ambas sondas reaccionaban con el mismo juego de fragmentos de DNA dentro del clon. Basándose en estos experimentos, se identificó un subfragmento de 4 kb Eco RI del clon original, fue subclonado y parcialmente secuenciado. La figura 21 muestra la secuencia de nucleótido (número ID de secuencia 89) y la secuencia de aminoácido deducida de las lecturas de secuencias de DNA inicial que incluyen los lugares de hibridación de las sondas 609 y 650, y confirmó que una parte de este DNA genómico bovino codificaba el péptido 12 (KASLADSGEYM).

Otros análisis de secuencia demostraron que GGF-II 12 residía en un cuadro de lectura abierto de 66 aminoácidos (ver más adelante) que ha resultado el punto inicial para el aislamiento de secuencias solapadas que representan un gen GGF-II bovino putativo y un cDNA.

Se utilizaron varios procedimientos PCR para obtener secuencias de codificación adicionales para el gen GGF-II bovino putativo. Se prepararon muestras de RNA total y de RNA seleccionado por oligo-dT (conteniendo poli A) a partir de pituitaria total bovina, pituitaria anterior, pituitaria posterior e hipotálamo. Utilizando cebadores de la lista mostrada en la figura 22, números ID de secuencia 109-119, se utilizaron reacciones PCR unilaterales (RACE) para amplificar los extremos de cDNA en ambas direcciones 3' y 5', y se llevaron a cabo reacciones PCR ancladas con cebadores oligonucleótidos degenerados representando péptidos GGF-II adicionales. La figura 29 resume las estructuras de DNA continuas y secuencias obtenidas en estos experimentos. De las reacciones 3' RACE, se produjeron tres secuencias cDNA alternativamente de corte y empalme, que se habían clonado y secuenciado. Una reacción 5' RACE condujo al descubrimiento de un exón adicional conteniendo secuencia de codificación para un mínimo de 52 aminoácidos. El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida reveló péptidos GGF-II-6 y una secuencia similar a GGF-I-18 (ver más adelante). Las reacciones de PCR ancladas condujeron a la identificación de secuencias de codificación de (cDNA) de péptidos GGF-II-1, 2, 3 y 10 contenidos dentro de un segmento adicional de cDNA de 300 bp. El límite 5' de este segmento (es decir, el segmento E, ver la figura 30) se define por el oligonucleótido que codifica el péptido GGF-II-1 y que fue utilizado en la reacción PCR (existen datos de secuencia 5' adicional tal como se ha descrito para el clon humano en el ejemplo 11). Por lo tanto, este clon contiene secuencias de nucleótido que codifican seis del total de nueve secuencias de péptidos GGF-II nuevas totales existentes.

El gen clonado fue caracterizado en el primer lugar por construcción de un mapa físico de GGF2BG1 que permitió a los inventores posicionar las secuencias codificantes a medida que se iban encontrando (ver más adelante figura 30). Se han utilizado sondas de DNA de las secuencias de codificación descritas anteriormente para identificar otros fragmentos de DNA que contenían los exones de este clon fago y para identificar clones que se solapan en ambas direcciones. El gen GGF-II bovino putativo es dividido como mínimo en cinco segmentos codificantes. Los segmentos codificantes son definidos como tramos discretos de la secuencia de DNA que se puede traducir en secuencias de polipéptido utilizando el código genético universal. Los segmentos codificantes descritos en la figura 36 y a los que se hace referencia en esta solicitud son: 1) exones específicos presentes dentro el gen GGF (por ejemplo, segmento codificante a), o bien 2) derivados de conjuntos de dos o más exones que aparecen en subgrupos específicos de mRNA, de manera que cada conjunto puede ser traducido en segmentos específicos de polipéptido tal como en los productos de genes mostrados. Los segmentos de polipéptido a los que se hace referencia en las reivindicaciones son los productos de traducción de los segmentos de codificación de DNA análogos. Solamente los segmentos codificantes A y B han sido definidos como exones y han sido secuenciados y trazados hasta el momento. El resumen de las secuencias codificantes contiguas identificadas se muestra en la figura 31. Los exones han sido listados (alfabéticamente) según el orden de su descubrimiento. Es evidente de los límites intrón/exón que el exón B puede ser incluido en los cDNA que conectan el segmento codificante E y el segmento codificante A. Es decir, el exón B no puede ser sometido a corte y empalme sin comprometer la imagen de lectura. Por lo tanto, los inventores sugieren que tres modelos de corte y empalme alternativos puedan producir las secuencias 1, 2 y 3 de cDNA de GGF-II bovino putativo. Las secuencias codificantes de éstas, designadas GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS y GGF2BPP3.CDS, respectivamente, se indican en las figuras 27A (número ID de secuencia 129), 27B (número ID de secuencia 130), y 27C (número ID de secuencia 131), respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas de los tres cDNA se indican también en las figuras 27A (número ID de secuencia 129), 27B (número ID de secuencia 130), y 27C (número ID de secuencia 131).

Las tres estructuras deducidas codifican proteínas de longitudes de 206, 281 y 257 aminoácidos. Los primeros 183 residuos de la secuencia de proteína deducida son idénticos en los tres productos de gen. En la posición 184 los clones difieren significativamente. Un codón para GGT de glicina en GGF2BPP1 sirve también como donante de corte y empalme para GGF2BPP2 y GGF2BPP3, que alternativamente se añaden en los exones C, C/D, C/D' y D ó C, C/D y D, respectivamente, y se han mostrado en la figura 32, número ID de secuencia 145. GGFIIBPP1 es un producto de gen truncado que es generado por la lectura de la unión de corte y empalme A del segmento codificante en la secuencia interviniente siguiente (intron). Esto representa el segmento de codificación A' en la figura 30 (número ID de secuencia 136). El transcripto finaliza adyacente a una secuencia de poliadenilación AATAAA canónica, y los inventores sugieren que este producto de gen truncado representa un transcripto maduro auténtico ("bona fide"). Los otros dos productos de gen más largos comparten la misma de secuencia no traducida 3' y el lugar de poliadenilación.

Todas estas tres moléculas contienen seis de las nueve secuencias de péptido nuevas GGF-II (ver figura 11) y otro péptido es altamente homólogo con respecto a GGF-I-18 (ver figura 26). Este descubrimiento proporciona una elevada probabilidad de que esta molécula recombinante codifique como mínimo una parte de GGF-II bovino. Además, los puntos isoeléctricos calculados para los tres péptidos son coherentes con las características físicas de GGF-I y II. Dado que la dimensión molecular de GGF-II es aproximadamente 60kD, el más largo de los tres cDNA debe codificar una proteína que tiene casi la mitad del número previsto de aminoácidos.

Una sonda que comprenda los exones A y B fue marcada con intermedio de amplificación PCR y utilizada para rastrear una biblioteca de cDNA constituida a partir de RNA aislado de pituitaria posterior bovina. Un clon (GGF2BPP5) mostró el modelo indicado en la figura 29 y contenía un segmento de codificación adicional de DNA (G) entre los segmentos codificantes A y C. La secuencia de ácido nucleico completa se muestra en la figura 31 (número ID de secuencia 144). El producto de traducción previsto del marco de lectura abierto más largo es de 241 aminoácidos. Una parte de un segundo cDNA (GGF2BPP4) fue aislado también de la biblioteca de pituitaria posterior bovina utilizando la sonda anteriormente descrita. Este clon mostró el dibujo indicado en la figura 29. Este clon es incompleto en el extremo 5', pero es una variante de corte y empalme en el sentido de que carece de segmentos de codificación G y D. El BPP4 muestra también un nuevo extremo 3' con regiones H, K y L más allá de la región C/D. La secuencia de BPP4 se muestra en la figura 33 (número ID de secuencia 146).

Ejemplo 11 Secuencias GGF en varias especies

Las proteínas GGF son los miembros de una nueva superfamilia de proteínas. En estudios de hibridación cruzada de alto rigor (experimentos de transferencia de DNA) con DNA de otros mamíferos, los inventores han demostrado, con claridad, que las sondas de DNA de esta molécula recombinante bovina puede detectar fácilmente secuencias específicas en una serie de muestras comprobadas. También se detectó una secuencia altamente homóloga en DNA genómico humano. El autoradiograma se ha mostrado en la figura 28. Las señales en las líneas que contienen DNA de rata y humano representan los equivalentes de rata y humano del gen GGF, habiéndose informado recientemente de las secuencias de varios cDNA codificados por este gen por Holmes y otros (Science 256:1205 (1992)) y Wen y otros (Cell 69:559 (1992)).

Ejemplo 12 Aislamiento de GGF2 humano que codifica una secuencia humana

Se aislaron varios clones humanos conteniendo secuencias del segmento E codificante de GGF-II bovino por rastreo de una biblioteca de cDNA humano preparado a partir de tallo cerebral ("brain stem") (Stratagene número de catálogo 935206). Esta estrategia fue seguida basándose en el fuerte enlace entre la mayor parte de los péptidos GGF2 (único con respecto a GGF2) y la secuencia de péptido prevista a partir de clones que contienen este segmento E bovino. Esta biblioteca fue rastreada tal como se ha descrito en el ejemplo 8, sección II, utilizando las sondas de oligonucleótidos 914-919 indicadas a continuación.

914TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA

(número ID de secuencia: 179)

915TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT

(número ID de secuencia: 180)

916ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA

(número ID de secuencia: 181)

917TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA

(número ID de secuencia: 182)

918AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA

(número ID de secuencia: 183)

919ATGARGTGTGGGCGGCGAAA

(número ID de secuencia: 184)

Los clones detectados con estas sondas fueron analizados adicionalmente por hibridación. Una sonda derivada del segmento codificante A (ver figura 30), que fue producida por marcado de un producto de reacción de cadena de polimerasa (PCR) a partir del segmento A, fue utilizada también para el rastreo de la biblioteca primaria. Varios clones que hibridizaron tanto con las sondas derivadas A y E fueron seleccionados y un clon en particular, GGF2HBS5, fue seleccionado para otros análisis. Este clon está representado por el modelo de segmentos de codificación (EBACC/D'D tal como se ha mostrado en la figura 30). El segmento E de este clon es el equivalente humano de la versión bovina truncada de E mostrada en la figura 30. GGF2HBS5 es el candidato más probable para codificar GGF-II de la totalidad de candidatos GGF-II "putativos" descritos. La longitud del segmento E de la secuencia codificante es de 786 nucleótidos además de 264 bases de secuencia no traducida. La dimensión prevista de la proteína codificada por GGF2HBS5 es aproximadamente de 423 aminoácidos (aproximadamente 45 kilodaltons, ver figura 44, número ID de secuencia 21), que es similar a las dimensiones de la forma deglicosilada de GGF-II (ver ejemplo 20). Además, siete de los péptidos GGF-II indicados en la figura 26 tienen secuencias equivalentes que se encuentran dentro de la secuencia de proteína de predicción a partir de la región E. Los péptidos II-6 y II-12 son excepciones, que quedan comprendidos en el segmento codificante B y el segmento codificante A, respectivamente. El RNA que codifica la proteína GGF2HBS5 fue producido en un sistema de trascripción in vitro activado por el promotor T7 bacteriófago residente en el vector (Bluescript SK [Stratagene Inc.] ver figura 47) que contiene el inserto GGF2HBS5. Este RNA fue traducido en un sistema de traducción libre de células (reticulocito de conejo) y las dimensiones del producto de la proteína fueron de 45 Kd. Además, el producto libre de células ha sido ensayado en un ensayo mitogénico de células Schwann para confirmar actividad biológica. Las células Schwann tratadas con medio acondicionado muestran tanto una proliferación incrementada medida por la incorporación de ^{125}I-Uridina como fosforilación sobre tirosina de una proteína en la gama de los 185 kilodaltons.

Por lo tanto, las dimensiones del producto codificado por GGF2HBS5 y la presencia de secuencias de DNA que codifican péptidos humanos altamente homólogos con respecto a los péptidos bovinos mostrados en la figura 11 confirman que GGF2HBS5 codifica el equivalente humano del GGF2 bovino. El hecho de que los medios acondicionados preparados a partir de células transformadas con este clon elicitan actividad mitogénica de Schwann confirma que el producto de gen GGFIIHBS5 (a diferencia del producto de gen BPP5) es segregado. Además, el producto de gen GGFIIBPP5 parece mediar la respuesta de proliferación de células Schwann con intermedio de un receptor de tirosina quinasa tal como p185^{erbB2} o un receptor íntimamente relacionado (ver ejemplo 19).

Ejemplo 13 Expresión de GGF2 recombinante humano en células de mamíferos e insectos

El clon de cDNA GGF2HBS5 que codifica GGF2 humano (tal como se describe en el ejemplo 12 y al que se hace referencia también en esta descripción como HBS5) fue clonado en el vector pcDL-SR\alpha296 y se transfectaron células COS-7 en platos 100 mm por el método de DEAE-dextrano. Se recogieron lisados celulares o medios acondicionados procedentes de células COS con expresión transitoria a los tres o cuatro días post-transfección. Para preparar los lisados, se lavaron monocapas de células con PBS, se retiraron de los platos lisados mediante tres ciclos de congelación/descongelación en 150 \mum de 0,25 M Tris-HCl, pH 8. Los residuos celulares fueron reducidos a gránulos y se recuperó el sobrenadante. Se recogieron muestras de medios acondicionados (7 ml), a continuación se concentraron y se intercambiaron con tampón con 10 mm Tris, pH 7,4 utilizando unidades Centiprep-10 y Centricon-10 tal como se describe por los fabricantes (Amicon, Beverly, MA). Se ensayaron células Schwann de nervios de ratas para incorporación de precursores de síntesis de DNA, tal como se ha descrito. Se comprobaron muestras de lisados de células o medios acondicionados en el ensayo de proliferación de células Schwann tal como se describe por Marchionni y otros, Nature 362:313 (1993). El cDNA, GGF2HBS5, que codifica GGF2 dirigió la segregación del producto de proteína al medio. Fue detectable una actividad mínima dentro de las células determinadas por ensayos utilizando lisados de células. Los cDNA de GGF2HFB1 y GGFBPP5 no consiguieron dirigir la segregación del producto al medio extracelular. La actividad GGF de estos clones era detectable solamente en lisados de células.

También se expresó el recombinante GGF2 en células CHO. El cDNA GGF2HBS5 codificante de GGF2 fue clonado en el lugar EcoRI del vector pcdhfrpoliA y transfectado a la línea celular CHO negativa DHFR (GG44) por el método de co-precipitación de fosfato cálcico. Se seleccionaron clones en nucléotido y medio a (Gibco) libre de nucleósidos en platos de 96 pocillos. Después de tres semanas, las muestras de medios acondicionados procedentes de clones individuales fueron rastreadas para expresión de GGF por el ensayo de proliferación de células de Schwann, tal como se describe por Marchionni y otros, Nature 362:313 (1993). Se identificaron clones estables que segregaban niveles significativos de actividad GGF en el medio. Se utilizaron datos de actividad de proliferación de células Schwann procedentes de cantidades alícuotas de volúmenes distintos de medio condicionado con células CHO para producir la curva de respuesta a la dosis mostrada en la figura 46 (Graham y Van Der Eb, Virology 52:456, 1973). Este material fue analizado en un ensayo de transferencia Western con sonda de antisuero policlonal cultivado contra un péptido específico de GGF2. Una banda de aproximadamente 65 Kd (dimensión esperada de GGF2 extraída de la pituitaria) es marcada de manera específica (figura 48, línea 12).

El GGF2 recombinante fue también expresado en células de insectos utilizando la expresión de Baculovirus. Células de insecto Sf9 fueron infectadas con Baculovirus conteniendo el clon de cDNA GGF2HBS5 con una multiplicidad de 3-5 (10^{6} células/ml) y cultivadas en medio Sf900-II. La actividad mitogénica de células Schwann fue segregada en medio extracelular. Se comprobaron diferentes volúmenes de medio condicionado de células de insectos en el ensayo de proliferación de células Schwann en ausencia de forskolina y los datos se utilizaron para producir una curva de respuesta a la dosis.

Este material fue también analizado en un análisis de transferencia Western (figura 45B) con sonda del anticuerpo específico GGFII anteriormente descrito.

Los métodos utilizados en este ejemplo fueron los siguientes:

Se determinó de la manera siguiente la actividad mitogénica de células Schwann de factores de crecimiento glial humano y bovino recombinante: se midieron las respuestas mitogénicas de células Schwann cultivadas en presencia de forskolina 5 \muM utilizando preparados recombinantes en crudo GGF obtenidos a partir de experimentos temporales de expresión de mamíferos. La incorporación de [^{125}I]-Urd fue determinada siguiendo una exposición de 18-24 horas a materiales obtenidos a partir de células cos transfectadas o falsamente transfectadas tal como se describe en la parte de Métodos. Se han mostrado las desviaciones media y estándar de cuatro conjuntos de datos. La respuesta mitogénica a GGF de pituitaria bovina nativa purificada parcialmente (fracción de carboximetilcelulosa; Goodearl y otros, presentada) se ha mostrado (GGF) como estándar de una actividad de 100%.

Los cDNA (figura 46, números ID de secuencia 166-168) fueron clonados en pcDL-SR\alpha296 (Takebe y otros, Mol. Cell Biol. 8:466-472 (1988)), y se transfectaron células COS-7 en platos de 100 mm por el método de DEAE-dextrano (Sambrook y otros, In Molecular Cloning. A Laboratory Manual; 2ª edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). Se recogieron lisados de células o medios acondicionados a los tres o cuatro días después de la transfección. Para preparar lisados, se lavaron monocapas de células con PBS, se recogieron en los platos, y se lisaron por tres ciclos de congelación/descongelación en 150 \mul de 0,25 M Tris-HCl, pH 8. Los residuos celulares fueron granulados y se recuperó el sobrenadante. A continuación, se recogieron muestras de medios acondicionados (7 ml), y se concentraron y se intercambiaron con tampón 10 mM Tris, pH 7,4, utilizando unidades Centriprep-10 y Centricon-10 tal como se describen por los fabricantes (Amicon, Beverly, MA). Se ensayaron células Schwann de nervio ciático de rata para la incorporación de precursores de síntesis de DNA, tal como se ha descrito (Davis y Stroobant, J. Cell Biol. 110:1353-1360 {1990); Brockes y otros, Brain Res. 165:105-118 (1979)).

Se llevó a cabo ensayo de transferencia Western de medio acondicionado con células CHO recombinantes de la forma siguiente: se cultivó un clon de CHO recombinante en MCDB302 libre de proteínas durante tres días. Se recogieron 2 ml de medio acondicionado, se concentró, se intercambió con tampón contra 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 y se liofilizó a estado seco. La pastilla fue resuspendida en un tampón de muestra SDS-PAGE, se sometió a electroforesis reductora de gel SDS y se analizó mediante ensayo de transferencia Western con un anticuerpo de péptido GGF. Se realizó un control de CHO utilizando un medio acondicionado a partir de células hospedantes CHO-DG44 no transfectadas y se ensayaron los niveles de CHO HBS5 utilizando medio acondicionado procedente de un clon recombinante.

Ejemplo 14 Identificación de elementos funcionales de GGF

Las estructuras deducidas de la familia de secuencias GGF indican que las formas más largas (representadas por GGF2BPP4) codifican proteínas transmembrana de manera que la parte extracelular contiene un dominio que se parece al factor de crecimiento epidérmico (ver Carpenter y Wahl en Peptide Growth Factors and Their Receptors I pp. 69-133, Springer-Verlag, NY 1991). Las posiciones de los residuos de cisteína de la secuencia de péptidos en los segmentos codificantes C y C/D ó C/D' se conservan con respeto a los residuos análogos de la secuencia de péptido de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (ver figura 32, números ID de secuencia 147-149). Esto sugiere que el campo extracelular funciona como lugares de reconocimiento de receptor y de activación biológica. Varias de las formas variantes carecen de los segmentos codificantes H, K y L, y por lo tanto pueden ser expresadas como proteínas difundibles biológicamente activas, segregadas. Las secuencias de DNA de GGF que codifican polipéptidos que comprenden el dominio similar a EGF (EGFL) pueden tener actividad biológica completa para estimular la actividad mitogénica de células gliales.

Las versiones unidas a membrana de esta proteína pueden inducir proliferación de células Schwann si se expresan en la superficie de neuronas durante la embriogénesis o durante la regeneración de nervios (de la que las superficies de las neuronas están íntimamente asociadas con las superficies de células de Schwann proliferantes).

Los GGF segregados (no unidos a la membrana) puede actuar como factores difundibles clásicamente que pueden interaccionar con células de Schwann a una cierta distancia de su punto de segregación. Otras formas pueden ser liberadas de intracélulas por fuentes con procedencia de heridas de tejidos y alteraciones celulares. Un ejemplo de GGF segregado es la proteína codificada por GGF2HBS5; éste es el único GGF conocido que se ha observado que está dirigido al exterior de la célula. Se segregación está probablemente mediada con intermedio de una secuencia hidrofóbica de terminal N que se encuentra solamente en la región E, que es el dominio del terminal N contenido dentro del GGF2 recombinante codificado por GGF2HBS5.

Otros GGF parecen no segregados. Estos GGF pueden ser formas de respuesta a heridas que son liberados como consecuencia de daños en tejidos.

Otras regiones de la estructura de la proteína prevista de GGF2 (codificado por GGF2HBS5) y otras proteínas que contienen regiones B y A, muestran similitudes a la proteína del núcleo proteoglicano de sulfato de heparán de la membrana base humana. El péptido ADSGEY, que está situado adjunto a la segunda cisteína del pliego de inmunoglobulina C2 en estos GGF, tiene lugar en nueve de las veintidós repeticiones C2 halladas en dicha proteína de lámina basal. Esta evidencia sugiere fuertemente que estas proteínas se pueden asociar con proteínas matriz tales como las asociadas con neuronas y glia, y pueden sugerir un método para secuestrar factores de crecimiento gliales en lugares objetivo.

Ejemplo 15 Purificación de GGF a partir de células recombinantes

A efectos de obtener tramos completos o partes de GGF para ensayar la actividad biológica, las proteínas pueden ser sobreproducidas utilizando DNA clonado. Se pueden utilizar varios enfoques. Se puede construir una célula de E. coli recombinante que contiene las secuencias descritas anteriormente. Se pueden utilizar sistemas de expresión tales como pNH8a ó pHH16a (Stratagene, Inc.) para este objetivo, siguiendo procedimientos del fabricante. De manera alternativa, estas secuencias pueden ser insertadas en un vector de expresión de mamífero y se puede construir una línea celular sobreproductiva. Por ejemplo, para este objetivo, DNA que codifica un GGF, el clon GGF2BPP5 ha sido expresado en células COS y puede ser expresado en células de ovario de hámsters chinos utilizando el vector de expresión pMSXND (Lee y Nathans, J. Biol. Chem. 263, 3521-3527, (1981)). Este vector que contiene secuencias de DNA de GGF puede ser transfectado en células hospedantes utilizando procedimientos establecidos.

La expresión transitoria puede ser examinada o se pueden cultivar clones resistentes a G418 en presencia de metotrexato para seleccionar células que amplifican el gen dhfr (contenido en el vector pMSXND) y, en el proceso, coamplificar la secuencia adyacente que codifica la proteína de GGF. Dado que las células CHO pueden ser mantenidas en un medio totalmente libre de proteínas (Hamilton y Ham, In vitro 13, 537-547 (1977)), la proteína deseada puede ser purificada del medio. El análisis Western utilizando los antisueros producidos en el ejemplo 17 puede ser utilizado para detectar la presencia de la proteína deseada en el medio acondicionado de las células sobreproductoras.

La proteína deseada (rGGF2) fue purificada a partir del medio acondicionado al expresar de manera transitoria células cos de la manera que se indica a continuación. El rGGF II fue recogido del medio acondicionado y parcialmente purificado utilizando Cromatografía de Intercambio Catiónico (POROS-HS). La columna fue equilibrada con 33,3 mM MES pH 6,0. El medio acondicionado fue cargado con un caudal de 10 ml/minuto. El pico que contenía actividad de proliferación de células Schwann e inmunoreactividad (utilizando antisueros policlonales contra un péptido de GGF2 descrito anteriormente) fue eluido con 50 mM Tris, 1 mM NaCl pH 8,0.

El rhGGF2 es expresado también utilizando una línea celular de ovario de hámster chino estable. Un rGGF2 del medio condicionado recogido fue purificado parcialmente utilizando un Cromatógrafo de Intercambio Catiónico (POROS-HS). La columna fue equilibrada con PBS pH 7,4. El medio condicionado fue cargado a un caudal de 10 ml/minuto. El pico conteniendo la actividad proliferativa de células Schwann e inmunoreactividad (utilizando antisueros policlonales GGF2) fue eluido con 50 mM Hepes, 500 mM NaCl pH 8,0. Se observó un pico adicional en 50 mM Hepes, 1 M NaCl pH 8,0 presentando proliferación y también inmunoreactividad (figura 45).

El rhGGF2 puede ser purificado además utilizando Cromatografía de Interacción Hidrofóbica como etapa de alta resolución; Cromatografía de intercambio catiónico/fase inversa (si es necesario como segunda etapa de alta resolución); una etapa de inactivación viral y etapa de retirada de DNA tal como cromatografía de intercambio aniónico.

La Actividad de Proliferación del Células Schwann del pico de GGF2 eluido de la columna de Intercambio Catiónico se determinó del modo siguiente: se midieron las respuestas mitogénicas de las células Schwann cultivadas en presencia de 5M Forskolina utilizando el pico eluido por 50 mM Tris 1 M NaCl pH 8, 0. El pico fue añadido a 20 1, 10 1 (1:10) 10 1 y (1:100) 10 1. La incorporación de ^{125}I-Uridina fue determinada y expresada como (CPM) después de una exposición de 18-24 horas.

Un ensayo de inmunotransferencia utilizando anticuerpo policlonal cultivado contra un péptido de GGF2 fue llevado a cabo de la manera siguiente: 10 1 de diferentes fracciones se hicieron funcionar sobre geles con gradiente 4-12%. Los geles fueron transferidos a un papel de nitrocelulosa, y las marcas de nitrocelulosas fueron bloqueadas con BSA al 5% y sometidas a sonda de anticuerpo específico de GGF2 (dilución 1:250). Se utilizó como anticuerpo secundario ^{125}I proteína A (dilución 1:500, Actividad Específica = 9,0/Ci/g). Las inmunotransferencias fueron expuestas a películas de rayos X Kodax durante 6 horas. Las fracciones pico eluidas con 1 M NaCl mostraron una banda inmunoreactiva en 69K.

La purificación de GGF2 sobre columnas de intercambio catiónico se llevó a cabo del modo siguiente: medio acondicionado con células CHO expresando rGGFII fue cargado en la columna de intercambio catiónico a un caudal de 10 ml/minuto. La columna fue equilibrada con PBS pH 7,4. La elución fue conseguida con 50 mM Hepes 500 mM NaCl pH 8,0 y 50 mM Hepes 1M NaCl pH 8,0, respectivamente. Todas las fracciones fueron analizadas utilizando el ensayo de proliferación de células de Schwann (CPM) que se ha descrito. La concentración de proteínas (mg/ml) fue determinada por el ensayo Bradford utilizando BSA como estándar.

Se llevó a cabo un ensayo de transferencia Western utilizando 10 1 de cada fracción y se observó que la inmunorreactividad y la actividad de las células Schwann co-emigraban.

La proteína puede ser sometida a ensayo en diferentes puntos del procedimiento utilizando un ensayo de transferencia Western. De manera alternativa, el ensayo mitogénico de células Schwann que se ha descrito puede ser utilizado para ensayar el producto expresado del clon de longitud completa o cualesquiera partes biológicamente activas del mismo. El clon GGF2BPP5 de longitud completa ha sido expresado de forma transitoria en células COS. Extractos intracelulares de células COS transfectadas muestran actividad biológica cuando se ensayan en el ensayo de proliferación de células Schwann descrito en el ejemplo 8. Además, el GGF2HBS5 íntimamente codificante de longitud completa ha sido expresado transitoriamente en células COS. En este caso, tanto el extracto celular como el medio condicionado muestran actividad biológica en el ensayo de proliferación de células Schwann descrito en el ejemplo 8. Cualquier miembro de la familia de la variante de corte y empalme del DNA complementario derivado del gen de GGF (incluyendo las Heregulinas) puede ser expresado de esta manera y ensayado en el ensayo de proliferación de células Schwann por cualquier experto en la materia.

De manera alternativa, se puede aislar material recombinante de otras variantes de acuerdo con Wen y otros (Cell 69:559 (1992)) que expresaron el factor de diferenciación Neu (NDF) en la variante de corte y empalme en células COS-7. Los clones de cDNA insertados en el vector plásmido eucariótico pJT-2 se encuentran bajo control del promotor inicial SV40, y están flanqueados en 3' con la terminación SV40 y señales de poliadenilación. Las células COS-7 fueron transfectadas con el DNA de plásmido pJT-2 por electroporación de la manera siguiente: 6 x 10^{6} células (en 0,8 ml de DMEM y 10% FEBS) fueron tranferidas a una cubeta de 0,4 cm y mezcladas con 20 \mug de DNA de plásmido en 10 \mul de solución TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA). La electroporación fue llevada a cabo a temperatura ambiente a 1600 V y 25 \muF utilizando un aparato Bio-Rad Gene Pulser con la unidad controladora de impulsos ajustada a 200 ohmios. Las células fueron diluidas a continuación en 20 ml de DMEM, 10% de FBS y se tranfirieron a un frasco T75 (Falcon). Después de 14 horas de incubación a 37ºC, el medio fue sustituido por DMEM, 1% FBS, y la incubación continuó durante otras 48 horas. El medio acondicionado conteniendo proteína recombinante, que fue recogida de las células, mostró actividad biológica en una línea celular expresando el receptor para esta proteína. Esta línea celular (línea celular AU 565 de carcinoma de seno humano cultivado) fue tratado con material recombinante. Las células tratadas mostraron un cambio de morfología que es característico de la activación del receptor erbB2. El medio acondicionado de este tipo puede ser comprobado también en el ensayo de proliferación de célula Schwann.

Ejemplo 16 Análisis de la secuencia de terminal N

El hGGF2 codificante de cDNA fue clonado en el vector amplificable pcdhfrpoliA y transfectado en células CHO-DG44 para expresión estable. El rhGGF2 es segregado en el medio acondicionado. La capacidad del GGF2 recombinante de ser segregado está intermediada previsiblemente a través del tramo hidrofóbico del terminal N (secuencia de señal). Una secuencia de señal, después de haber iniciado la exportación de una cadena de proteína creciente a través del retículo endoplásmico grosero, es fraccionada de la proteína madura en un lugar específico. El análisis de la secuencia de terminal N del rhGGF2 expresado y purificado indica el lugar de fraccionamiento tal como se ha mostrado a continuación. La secuencia de los primeros 50 residuos de aminoácidos en el terminal N de la proteína se confirmó por análisis de secuencia del terminal N (tabla 5), que se indica a continuación.

TABLA 5 Análisis de secuencia del terminal N de rhGGF2

Ciclo #	Secuencia primaria	pMoles
1	Gly (G)	210,6
2	Asn (N)	163
3	GLU (E)	149
4	Ala (A)	220
5	Ala (A)	180
6	Pro (P)	173
7	Ala (A)	177
8	Gly (G)	154,9
9	Ala (A)	162,4
10	Ser (S)	65,4
11	Val (V)	132,7
12	Val (V) *(Cys)	11,7

TABLA 5 (continuación)

Ciclo #	Secuencia primaria	pMoles
13	Tyr (Y)	112,7
14	Ser (S)	47,6
15	Ser (S)	27,1

El análisis de la secuencia del terminal N se lleva a cabo por el Proceso de Degradación Edman.

* Los residuos Cys son destruidos por el Proceso de Degradación Edman y no se pueden detectar.

La siguiente secuencia (número ID de secuencia 185) representa la secuencia de aminoácidos de hGGF2. La zona sombreada indica la secuencia de señal fraccionada.

2

El área sombreada representa los residuos de 15 aminoácidos determinados experimentalmente en el terminal N de rhGGF2, indicando que la unión A_{50}-G_{51} es el lugar de fraccionamiento para la secuencia de señal.

Ejemplo 17 Aislamiento de otra variante de corte y empalme

Los métodos para actualización de otras neuregulinas que se describen en la solicitud de patente USA número de serie 07/965.173, presentada en 23 de Octubre de 1992, que se incorpora a la actual a título de referencia, produjeron cuatro secuencias íntimamente relacionadas (heregulina \alpha, \beta1, \beta2, \beta3) que se producen como resultado de una variación del corte y empalme. Peles y otros (Cell 69:205 (1992)), y Wen y otros (Cell 69:559 (1992)) han aislado otra variante de corte y empalme (procedente de rata) utilizando un enfoque de purificación y clonado similar al descrito en los ejemplos 1-9 y 11 que comporta una proteína que se une a p185^{erbB2}. El clon sDNA fue obtenido de la manera siguiente (mediante purificación y secuenciado de una proteína de unión p185^{erbB2} procedente de la línea celular de fibroblastos de rata transformados). Una proteína de unión p185^{erbB2} fue purificada a partir de medio condicionado de la forma siguiente. Se aclaró por filtrado medio acondicionado acumulado de tres recogidas de 500 botellas (total 120 litros) a través de filtros de 0,2 \mu y se concentró 31 veces con un sistema de ultrafiltrado Pelicon utilizando membranas con corte dimensional molecular de 20 kd. Todas las etapas de purificación fueron llevadas a cabo utilizando un sistema de cromatografía líquida de proteínas, rápido de Pharmacia. El material concentrado fue cargado directamente en una columna de heparina-sefarosa (150 ml, preequilibrada con solución salina con tampón fosfato (PBS)). La columna fue lavada con PBS conteniendo 0,2 M NaCl hasta que no se pudo apreciar absorbancia alguna a una longitud de onda de 280 nm. Las proteínas unidas fueron eluidas entonces con un gradiente continuo (250 ml) de NaCl (de 0,2 M a 1,0 M), y se recogieron fracciones de 5 ml. Se utilizaron muestras (0,01 ml de las fracciones recogidas) para el ensayo cuantitativo de la actividad estimulatoria de quinasa. Se reunieron las fracciones activas de tres pasadas de columna (volumen total = 360 ml), se concentraron a 25 ml por utilización de membrana de ultrafiltración YM10 (Amicon, Danvers, MA), y se añadió sulfato amónico para conseguir una concentración de 1,7 M. Después de someter a centrifugación (10.000 x g, 15 minutos), el material recogido fue cargado en una columna de fenil-superosa (HR10/10, Pharmacia). La columna fue revelada con un gradiente de 45 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} (de 1,7 M hasta desaparición sal) en 0,1 M Na_{2}PO_{4} (pH 7,4), y se recogieron fracciones de 2 ml y se ensayaron (0,002 ml por muestra) para estimulación de quinasa (tal como se ha descrito en el ejemplo 19). El pico principal de actividad fue reunido y dializado contra tampón de fosfato sódico 50 mM (pH 7,3). Se preequilibró una columna de intercambio catiónico mono-S (HR5/5, Pharmacia) con fosfato sódico 50 mM. Después de cargar el material activo (0,884 mg de proteína; 35 ml), la columna fue lavada con el tampón inicial y luego fue revelada a un caudal de 1 ml/minuto con un gradiente de NaCl. La actividad estimuladora de quinasa fue recuperada a una sal 0,45-0,55 M y fue extendida sobre cuatro fracciones, cada una de ellas de 2 ml. Éstas fueron reunidas y cargadas directamente en columnas de Cu^{+2} quelatado (1,6 ml, HR2/5 Superosa quelatante, Pharmacia). La mayor parte de las proteínas se absorbieron en la resina, pero gradualmente se eluyeron con 30 ml de gradiente lineal de cloruro amónico (0-1 M). La actividad se eluyó en un pico único de proteína en una gama de 0,05 a 0,2 M NH_{4}Cl. Se analizaron muestras de varias etapas de purificación por electroforesis de gel seguido de tinción de plata utilizando un equipo de ICN (Costa Mesa, CA), y su contenido de proteína fue determinado con un ensayo de unión de colorante azul Coomassie utilizando un equipo de Bio-Rad (Richmond, CA).

La proteína p44 (10 \mug) fue reconstituida en 200 \mul de bicarbonato amónico tampón 0,1 M (pH 7,8). La digestión fue realizada con tripsina (Serva) tratada con L-1-tosil-amida 2-feniletil clorometil acetona a 37ºC durante 18 horas con una proporción de enzima a sustrato de 1:10. La mezcla de péptido resultante fue separada por HPLC de fase inversa y se controló a 215 nm utilizando una microcolumna Vydac C4 (diámetro interno 2,1 mm x 15 cm, 300 \ring{A}) y un sistema cromatográfico líquido HP 1090 equipado con un detector mediante conjunto de diodos y una estación de trabajo. La columna fue equilibrida con ácido trifluoracético al 0,1% (fase móvil A), y se efectuó elusión con un gradiente lineal de fase móvil B 0%-55% (90% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético) en 70 minutos. El caudal fue de 0,2 ml/minuto y la temperatura de la columna se controló a 25ºC. Se recogieron manualmente partes alícuotas de un tercio de los picos del péptido del sistema de HPLC que se caracterizaron por análisis de secuencia de terminal N por degradación Edman. La fracción eluida después de 27,7 minutos (T27,7) contenía secuencias de aminoácidos mixtas y se recromatografió adicionalmente después de reducción del modo siguiente: una parte alícuota de 70% de la fracción del péptido fue secada en vacío y reconstituida en 100 \mul de tampón de bicarbonato amónico 0,2 M (pH 7,8). Se añadió DTT (concentración final 2 mM) a la solución, que se incubó a continuación a 37ºC durante 30 minutos. La mezcla de péptidos reducida fue separada a continuación por HPLC de fase inversa utilizando una columna Vydac (diámetro interno 2,1 mm x 15 cm). Las condiciones de elusión y caudal fueron idénticas a las descritas anteriormente. El análisis de la secuencia de aminoácidos del péptido se llevó a cabo con un secuenciador de proteína Modelo 477 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipado con un analizador de aminoácido de feniltiohidantoína en línea (PTH) y un sistema de análisis de datos Modelo 900 (Hunkapiller y otros, (1986) en Methods of Protein Microcharaterization, J.E. Shively, ed. (Clifton, New Jersey: Humana Press p. 223-247)). La proteína fue cargada en un disco de fibra de vidrio tratada al ácido trifluoroacético preciclado con polibreno y NaCl. El análisis de PTH-aminoácido fue llevado a cabo con un sistema de cromatografía líquida micro (Modelo 120) utilizando bombas de jeringa dual y columnas de diámetro reducido de fase inversa (C-18) (Applied Biosystems, 2,1 mm x 250 mm). Se aisló RNA a partir de células Ratl-EJ por procedimientos estándar (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York, 1982) y se seleccionó poli (A)^{+} utilizando un equipo separador de mRNA (Clontech Lab, Inc., Palo Alto, CA). El cDNA fue sintetizado con el equipo Superscript (de la firma BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD). Se efectuó el ligado de cDNA de doble cadena fraccionado en columna en un vector plásmido pJT-2 digerido en Sall y Notl, derivado del vector pCD-X (Okayama y Berg, Mol. Cell Biol. 3:280 (1983)) y transformado en células DH10B E. Coli por electroporación (Dower y otros, Nucl. Acids Res. 16:6127 (1988)). Se rastrearon aproximadamente 5 x 10^{5} transformantes primarios con sondas de dos oligonucleótidos que se derivaron de las secuencias de proteínas del terminal N de NDF (residuos 5-24) y el péptido tríptico T40.4 (residuos 7-12). Sus respectivas secuencias fueron las siguientes (N indica los 4 nt):

\vskip1.000000\baselineskip

200

(1: número ID de secuencia 163; 2: número ID de secuencia 164).

Los oligonucleótidos sintéticos fueron marcados en el extremo con [\gamma-^{32}P]ATP con polinucleótido quinasa T4 y se utilizaron para rastrear juegos replicados de filtros de nitrocelulosa. La solución de hibridación contenía 6 x SSC, fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 2 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón 50 \mug/ml, y formamida al 20% (para sonda 1) o sin formamida (para sonda 2). Los filtros fueron lavados a 50ºC con 0,5 x SSC, 0,2% SDS, EDTA 2 mM (para sonda 1) y a 37ºC con 2 x SSC, 0,2% SDS, EDTA 2 mM (para sonda 2). La autoradiografía de los filtros proporcionó 10 clones que hibridaron con ambas sondas. Estos clones fueron purificados por nueva colocación en placas e hibridación de la sonda tal como se ha descrito anteriormente. Los clones de cDNA fueron secuenciados utilizando un secuenciador de DNA automatizado Applied Biosystems 373A y equipos secuenciadores de ciclo Applied Biosystems Taq DyeDeoxy^{TM} Terminator siguiendo las instrucciones del fabricante. En algunos casos, se obtuvieron secuencias utilizando equipos [^{35}S]dATP (Amersham) y Sequenase^{TM} de U.S. Biochemicals siguiendo las instrucciones del fabricante. Ambas marcas del clon 44 de cDNA fueron secuenciadas utilizando oligonucleótidos sintéticos como cebadores. La secuencia de la mayor parte de 5' 350 nt fue determinada en siete clones de cDNA independientes. El clon resultante demostró el modelo que se indica en la figura 27 (NDF).

Ejemplo 19 Purificación y ensayo de otras proteínas que unen el receptor p185^{erbB2} I. Purificación de gp30 y p70

Lupu y otros (Science 249, 1552 (1990)) y Lippman y Lupu (solicitud de patente Nº PCT/US91/03443 (1990)), que se han incorporado a esta descripción como referencia, han purificado una proteína de medio acondicionado de una línea celular de cáncer de seno humano MDA-MB-231.

Lupu y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2287 (1992)) purificaron otra proteína que une al receptor p185^{erbB2}. Esta proteína específica, p75, fue purificada a partir de medio condicionado utilizado para el crecimiento de SKBr-3 (línea celular de cáncer de seno humano) propagada en Medio de Eagle mejorado (IMEM:GIBCO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO).

II. Otros lingandos de p185^{erbB2}

Peles y otros (Cell 69, 205 (1992)) han purificado también células de rata un ligando estimulante de 185^{erbB2}. Holmes y otros (Science 256, 1205 (1992)) han purificado Heregulina \alpha procedentes de células humanas que se une y estimula 185^{erbB2} (ver ejemplo 5). Tarakovsky y otros, Oncogene 6:218 (1991), han demostrado unión de un polipéptido de 25 kD aislado a partir de macrófagos activados al receptor Neu, una homología p185^{erbB2}, incorporada a la actual como referencia.

III. Aislamiento de NDF

Yarden y Peles (Biochemistry 30, 3543 (1991)) han identificado una glicoproteína de 35 kilodaltons que estimulará el receptor 185^{erbB2}.

En otras publicaciones, Davis y otros (Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1536 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 8582 (1991) así como Greene y otros, solicitud de patente PCT/US91/02331 (1990) describen la purificación de una proteína a partir de medio acondicionado de una línea celular de células T humanas (ATL-2).

Huang y otros (1992, J. Biol. Chem. 257:11508-11512), que se incorporan como referencia, han aislado un factor de crecimiento ligando adicional neu/erb B2 a partir de riñón bovino. El factor polipéptido de 25 kD fue aislado por un procedimiento de fraccionamiento de columna, seguido de cromatografía de columna secuencial con DEAE/celulosa (DE52), Sulfadex (Sefadex G-50 sulfatado), heparina-Sefarosa 4B, y Superdex 75 (cromatografía rápida de proteínas líquidas). El factor, NEL-GF, estimula la autofosforilización específica de tirosina del producto de gen neu/erb B2.

IV. Purificación del receptor de acetilcolina que induce actividad (ARIA)

ARIA, una proteína de 42 kD que estimula la síntesis del receptor de acetilcolina, ha sido aislada en el laboratorio de Gerald Fischbach (Falls y otros, (1993) Cell 72:801-815). ARIA induce fosforilación de tirosina de una proteína de transmembrana muscular de 185 Kda que se parece a p185^{erbB2}, y estimula la síntesis del receptor de acetilcolina en miotubinos embriónicos cultivados. ARIA es muy probablemente un miembro del grupo de proteínas ligando GGF/erbB2, y esto es potencialmente útil en la estimulación de mitogénesis de células gliales y otras aplicaciones, por ejemplo, del factor GGF2 que se ha descrito.

Ejemplo 19 Fosforilación de tirosina de proteína mediada por GGF

Células de rata Schwann después de tratamiento con niveles suficientes de Factor de Crecimiento Glial para inducir proliferación, muestran estimulación de la fosforilación de la tirosina de proteínas. Se aplicaron cantidades variables de GGF parcialmente purificado a un cultivo primario de células Schwann de rata según el procedimiento indicado en el ejemplo 9. Se cultivaron células Schwann en suero fetal de vaca DMEM/10% /5 \muM forskolina/0,5 \mug por mL GGF-CM (0,5 mL por pocillo) en placas de 24 pocillos recubiertas con poli D-lisina. En caso de confluencia, las células fueron alimentadas con DMEM/10% suero fetal de vaca a 0,5 mL por pocillo y se dejaron en el incubador una noche hasta quiescencia. Al día siguiente, las células fueron alimentadas con 0,2 mL de DMEM/10% de suero fetal de vaca y se dejó en la incubadora durante 1 hora. A continuación, se añadieron muestras de pruebas directamente al medio a diferentes concentraciones y para diferentes períodos de tiempo según necesidad. Las células fueron sometidas a lisis en tampón de lisis hirviendo (fosfato sódico, 5 mM, pH 6,8; SDS, 2%, \beta-mercapteotanol, 5%; ditiotreitol, 0,1 M; glicerol, 10%; Azul de Bromofenol, 0,4%; vanadato sódico, 10 mM), se incubó en baño de agua hirviendo durante 10 minutos y a continuación se analizó directamente o se congeló a -70ºC. Se analizaron muestras por paso sobre geles de 7,5% SDS-PAGE y a continuación se hizo electrotransferencia sobre nitrocelulosa utilizando procesos estándar tal como se describen por Towbin y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354. La nitrocelulosa transferida fue sometida a sonda con anticuerpos de antifosfotirosina utilizando métodos estándar tal como se describen en Kamps y Selton (1988) Oncogene 2:305-315. Las muestras sometidas a sondas fueron expuestas a película de autoradiografía durante una noche y reveladas utilizando un procesador de laboratorio estándar. Se llevaron a cabo mediciones densitométricas utilizando un densitómetro (LKB) láser Ultrascan XL amplificado. Las asignaciones de peso molecular se hicieron con respecto a estándares de alto peso molecular con tinción previa (Sigma). Las respuestas a dosis de fosforilación de proteína y proliferación de células Schwann son muy similares (figura 33). El peso molecular de la banda fosforilada es muy próximo al peso molecular de p185^{erbB2}. Se obtuvieron resultados similares cuando se trataron células Schwann con medio acondicionado preparado a partir de células COS traducidas con clon GGF2HBS5. Estos resultados se correlacionan bien con la interacción esperada de los GGF con 185^{erbB2} y su activación.

Este experimento ha sido repetido con GGF2 recombinante. Medio condicionado derivado de línea celular CHO transformado de manera estable con el clon GGF2 (GGF2HBS5) estimula la fosforilación de tirosina de proteína utilizando el ensayo anteriormente descrito. Las células CHO falsamente transfectadas no estimulan esta actividad.

Ejemplo 20 N-glicosilación de GGF

La secuencia de proteína prevista a partir de cDNA de los clones candidato de GGF-II GGF2BPP1, 2 y 3 contiene una serie de motivos de consenso de N-glicosilación. Un intersticio en la secuencia de péptido GGFIIO2 coincide con el residuo de asparagina en uno de estos motivos, indicando que el carbohidrato está probablemente unido en este lugar.

La N-glicosilación de los GGF fue estudiada al observar cambios de movilidad en SDS-PAGE después de incubación con N-glicanasa, una enzima que fracciona los enlaces covalentes entre carbohidrato y residuos de asparagina en proteínas.

El tratamiento de N-glicanasa de GGF-II dio lugar a una banda principal de peso molecular 40-42 kDa y una banda menor de 45-48 kDa. Especies deglicosiladas activas únicas de actividad aproximadamente a 45-50 kDa.

Los experimentos de elución de actividad con GGF-I demostraron también un incremento en la movilidad electroforética cuando se hizo tratamiento con N-glicanasa, dando lugar a una especie activa de peso molecular 26-28 kDa. La tinción con plata confirmó que había desplazamiento de movilidad, si bien no se pudo asignar banda N-deglicosilada por la tinción de fondo en la muestra utilizada.

(2) Información por número de identificación de secuencia: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tir Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 10 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu Xaa Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Lys Leu Gly Glu Met Trp Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Gly Glu Lys Arg Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ile Lys Ser Glu His Ala Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Met Ser Glu Tyr Ala Phe Phe Val Gin Thr Xaa Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 8 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Xaa Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 7 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Lys Leu Glu Phe Leu Xaa Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gln Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Phe Val Leu Gln Ala Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Gly Glu Met Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Val Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 8 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ala Lys Tyr Phe Ser Lys Xaa Asp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 2 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Xaa Lys Phe Tyr Val Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 26

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Ser Phe Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val}

\sac{Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 2003

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: N en posición 31 y 32 pueden ser tanto A como G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 21:

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 11 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 9 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu Xaa Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 7 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Xaa Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 10

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gln Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Leu Gln Ala Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Gln Pro Asp Pro Gly Gln Ile Leu Lys Lys Val Pro Met Val}

\sac{Ile Gly Ala Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en las posiciones 1, 3, 17 y 19 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Glu Lys Lys Lys Glu}

\sac{Xaa Gly Xaa Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 6 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Glu Phe Leu Xaa Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 11 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 13 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Trp Phe Val Val Ile Glu Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Ser Pro Val Ser Val Gly Ser Val Gln Glu Leu Val Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Val Cys Leu Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 1 significa Lisina o Arginina; Xaa en posición 6 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Leu Leu Leu Xaa Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 40:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Thr}

\sac{Thr Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 10 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 8

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Phe Val Val Ile Glu Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 15

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Pro Val Ser Val Gly Ser Val Gln Glu Leu Val Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Cys Leu Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 9

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otras informaciones: Xaa en posición 5 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Leu Leu Xaa Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYAARGGNG AYGCNCAYAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATRTAYTCR TAYTCRTCNG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGYTCNGANG CCATYTCNGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGYTCRCTNG CCATYTCNGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCDATNACCA TNGGNACYTT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCCCANA CYTGRTGNAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCYTANGGYT CCATRAARAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCYTCDATNA CNACRAACCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCNGCRAART ANCCNGC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCNAGNG CYTCYTTNGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCYAANG CYTCYTTNGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYTTNGCYT GNAGNACRAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYTTNGCYT GYAANACRAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGNACNAGYT CYTGNAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 17

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGNACYAAYT CYTGNAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATRTAYTCN CCNGARTCNG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATRTAYTCN CCRCTRTCNG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGARTCNGCY AANGANGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGARTCNGCN AGNGANGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTRTCNGCY AANGANGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTRTCNGCN AGNGANGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGARTCNGCY AARCTNGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGARTCNGCN AGRCTNGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTRTCNGCY AARCTNGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RCTRCTNGCN AGRCTNGCYT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACNACNGARA TGGCTCNNGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACNACNGARA TGGCAGYNGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAYCARGTNT GGGCNGCNAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTYGTNGTNA THGARGGNAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARGGNGAYG CNCAYACNGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GARGCNYTNG CNGCNYTNAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNGGNTCNG TNCARGARYT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTNGGNAGYG TNCARGARYT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NACYTTYTTN ARDATYTGNC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 417

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posiciones 14, 23, 90, 100, 126 y 135 es un codón de tope.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 85:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 19, 25, y 31 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGGARACNC ARCCNGAYCC NGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 14, 20, 23, 29 y 35 significa Inosina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGNGTRTAN GCNCCDATNA CCATNGG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 16, 21 y 24 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGGCNGAYT CNGGNGARTA YATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 16 y 25 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGGCNGAYA GYGGNGARTA YAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 14, 15, 16, 26 Y 29 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGNNNCATR TAYTCNCCNG ARTC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 14, 15, 16 y 26 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGNNNCATR TAYTCNCCRC TRTC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 21, 28, y 31 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGCAYCARG TNTGGGCNGC NAA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 35

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 31 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGATHTTYT TYATGGARCC NGARG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 35

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 18, 21, 24, 27 y 33 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGGGGGNCC NCCNGCNTTY CCNGT

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 21 y 24 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGTGGTTYG TNGTNATHGA RGG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 17, 21, y 26 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGYTTNGCN GCCCANACYT GRTG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 19 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGGCYTCNG GYTCCATRAA RAA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 16, 22, 25, 28 y 31 significa Inosina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGACNGGRA ANGCNGGNGG NCC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 35

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 17, 26, y 29 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGYTTNCCY TCDATNACNA CRAAC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 18 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATRTAYTCR TAYTCTCNGC AAGGATCCTG CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 19, 25, y 31 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGAARGGNG AYGCNCAYAC NGA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 3 y 18 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCYAANG CYTCYTTNGC AAGGATCCTG CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 3, 6, 9 y 18 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCNGCNAGNG CYTCYTTNGC AAGGATCCTG CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 30

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 3, 12 y 15 significa Inosina. Y puede ser citidina o timidina.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCNGCRAART ANCCNGCAAG GATCCTGCAG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 38

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCGATCTG CAGGCTGATT CTGGAGAATA TATGTGCA

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGCCACATC TCGAGTCGAC ATCGATT

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGTGATCAG CAAACTAGGA AATGACA

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCGATCTG CAGCCTAGTT TGCTGATCAC TTTGCAC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 37

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGTATATTC TCCAGAATCA GCCAGTG

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 34

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGGCACGCA GTAGGCATCT CTTA

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 35

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 111:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAATTCTG CAGCAGAACT TCGCATTAGC AAAGC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 112:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCCGGGA TGAAGAGTCA GGAGTCTGTG GCA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 113:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACCCGGGC TGCAGACAAT GAGATTTCAC ACACCTGCG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 114:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCTG CAGTTTGGAA CCTGCCACAG ACTCCT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 39

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACCCGGGC TGCAGATGAG ATTTCACACA CCTGCGTGA

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 116:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Val Trp Ala Ala Lys Ala Ala Gly Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 117:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 117:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Leu Lys Lys Asp Ser Leu Leu Thr Val Arg Leu Gly Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 118:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 119:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Thr Val Arg Leu Gly Ala Trp Gly His Pro Ala Phe Pro Ser}

\sac{Cys Gly Arg Leu Lys Glu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posición 10 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 121:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Glu Asp Ser Arg Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Asn Ser}

\sac{Ser Gly Gly Pro Gly Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 14

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 122:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ala Gly Ser Lys Leu Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 16

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 123:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Val Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 26

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 124:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys}

\sac{Asn Gly Ser Glu Leu Ser Arg Lys Asn Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 125:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 13

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posición 12 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 125:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 126:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 126:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Arg Ile Ser Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met}

\sac{Cys Lys Val Ile Ser Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 127:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 127:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 128:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 128:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Ser Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys}

\sac{Lys Val Ile Ser Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 129:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 744

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 129:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 130:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1193

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 130:

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 131:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1108

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 131:

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 132:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 559

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 214 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 132:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 133:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 252

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Características:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 8 podría ser tanto A como G.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 133:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 134:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 178

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 134:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 135:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 122

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 135:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 136:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 417

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 136:

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 137:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 102

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 137:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 138:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 69

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 138:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 139:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 60

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 139:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 140:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 140:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 141:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 27

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 141:

201

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 142:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 569

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 142:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 143:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 735

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 143:

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 144:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1654

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 144:

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 145:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1140

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 145:

30

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 146:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 1764

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia:146:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 147:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 50

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 147:

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 148:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 50

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 148:

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 149:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 46

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 149:

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 150:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 198

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 150:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 151:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 192

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 151:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 152:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 183

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 152:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 153:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 210

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 153:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 154:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 267

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 154:

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 155:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 252

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 155:

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 156:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 128

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 156:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 157:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 141

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 157:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 158:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 24

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posiciones 15 y 22 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 158:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Xaa Phe}

\sac{Met Val Lys Asp Leu Xaa Asn Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 159:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 745

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 159:

49

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 160:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 12

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posición 1 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 160:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 161:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 5

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posición 1 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 161:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Val Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 162:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 11

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: Xaa en posiciones 1, 2 y 3 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 162:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 163:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 60

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Características:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posiciones 25 y 36 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 163:

700

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 164:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 18

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

Característica:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Otra información: N en posición 16 es desconocido.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 164:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTACACATA TATTCNCC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 165:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 21

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 165:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Gln Pro Asp Pro Gly Gln Ile Leu Lys Lys Val Pro Met Val}

\sac{Ile Gly Ala Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 166:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 422

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 166:

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 167:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 69

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 167:

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 168:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 19

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 168:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Gly Asp Val Pro Gly Pro Arg Val Lys Ser Ser Arg Ser Thr}

\sac{Thr Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 169:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 231

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 169:

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 170:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 178

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 170:

56

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 171:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 121

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 171:

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 172:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 102

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 172:

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 173:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 128

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 173:

59

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 174:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 69

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 174:

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 175:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 60

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 175:

701

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 176:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 176:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTACGTCCA CTCCCTTTCT GTCTCTGCCT GAATAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 177:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 569

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 177:

61

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 178:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 730

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 178:

62

63

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 179:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 179:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGGGCTCCA TGAAGAAGAT GTA

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 180:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 180:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCATGAAGA AGATGTACCT GCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 181:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 181:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTACCTGC TGTCCTCCTT GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 182:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 182:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAAGAAGG ACTCGCTGCT CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 183:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 183:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGCCGGGG GCTTGGAGAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 184:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas: únicas

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 184:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGATGTGTG GGCGGCGAAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) Información por número de identificación de secuencia: 185:

\vskip0.800000\baselineskip

(1)

Características de la secuencia:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

Longitud: 422

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

Tipo: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

Cadenas:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

Topología: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

Descripción de secuencia: Número ID de secuencia: 185:

64

65

Claims (31)

1. Utilización de un polipéptido para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o desorden de la musculatura por incremento de la mitogénesis, crecimiento, diferenciación o supervivencia de una célula muscular, en la que dicho polipéptido o compuesto une receptores o activa sistemas de segundos mensajeros de dicha célula muscular, y en la que dicho polipéptido o compuesto es seleccionado entre el grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende la secuencia E codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada con los números ID de secuencia 133 ó 159;

b) un polipéptido que comprende la secuencia F codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en número ID de secuencia 132;

c) un polipéptido definido por la fórmula YBAZCX,

en la que YBAZCX está compuesta por los segmentos de polipéptidos mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132-143, 156, 157, 159); en la que Y comprende el segmento E de polipéptido, o no existe; en la que Z comprende el segmento G de polipéptido, o no existe; y en la que X comprende los segmentos de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D'HL, C/D'HKL, C/D'H, C/D'D, C/D C/D' HKL, C/D C/D'H, C/D C/D'HL, C/D C/D'D, C/D D'H, C/D D'HL, C/D D'HKL, C/D'D'H, C/D'D'HL, C/D' D'HKL, C/D C/D'D'H, C/D C/D'D'HL ó C/D C/D'D'HKL;

d) un polipéptido definido por la fórmula WBAZCX,

en la que WBAZCX está compuesta por los segmentos de polipéptido mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132-143, 156, 157, 159); en la que W comprende un segmento de polipéptido F, o no existe; en la que Z comprende un segmento de polipéptido G, o no existe; y en la que X comprende los segmentos de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D'HL, C/D''HKL, C/D'H, C/D'D, C/D C/D' HKL, C/D C/D'H, C/D C/D'HL, C/D C/D'D, C/D D'H, C/D D'HL, C/D D'HKL, C/D'D'H, C/D'D'HL, C/D'D'HKL, C/D C/D'D'H, C/D C/D'D'HL ó C/D C/D'D'HKL;

e) un polipéptido que específicamente une el receptor p185^{erbB2} de células musculares y activa segundos sistemas mensajeros de dichas células musculares;

f) un polipéptido que comprende un dominio similar a factor de crecimiento epidérmico (similar a EGF), en el que dicho dominio de factor de crecimiento epidérmico comprende una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en:

i)

número ID de secuencia 150 (EGFL1);

ii)

número ID de secuencia 151 (EGFL2);

iii)

número ID de secuencia 152 (EGFL3);

iv)

número ID de secuencia 153 (EGFL4);

v)

número ID de secuencia 154 (EGFL5); y

vi)

número ID de secuencia 155 (EGFL6);

g) un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

i)

un factor de polipéptido de 35 kD aislado de la línea celular de fibroblastos transformada I-EJ de rata;

ii)

un factor de polipéptido de 75 kD aislado de la línea celular de seno humano SKBR-3;

iii)

un factor de polipéptido de 44 kD aislado de la línea celular de fibroblastos transformada I-EJ de rata;

iv)

un factor de polipéptido de 45 kD aislado de la línea celular de seno humano MDA-MB 231;

v)

un factor de polipéptido de 7 a 14 kD aislado de la línea de células T humanas ATL-2;

vi)

un factor de polipéptido de 25 kD aislado de macrófagos peritoneales de ratón activados;

vii)

un factor de polipéptido de 25 kD aislado de riñón bovino;

viii)

un polipéptido ARIA; y

ix)

un factor de polipéptido de 46 a 47 kD que estimula células progenitoras gliales 0-2A; y

h) un polipéptido que comprende GGFIII.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia E codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en los números ID de secuencia 133 ó 159.

3. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende la secuencia F codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en número ID de secuencia 132.

4. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido definido por la fórmula YBAZCX,

en la que YBAZCX está compuesta por los segmentos de polipéptido mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132-143, 156, 157, 159); en la que Y comprende el segmento E de polipéptido, o no existe; en la que Z comprende el segmento G de polipéptido, o no existe; y en la que X comprende los segmentos de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D'HL, C/D'HKL, C/D'H, C/D'D, C/D C/D' HKL, C/D C/D'H, C/D C/D'HL, C/D C/D'D, C/D D'H, C/D D'HL, C/D D'HKL, C/D'D'H, C/D'D'HL, C/D' D'HKL, C/D C/D'D'H, C/D C/D'D'HL ó C/D C/D'D'HKL.

5. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido definido por la fórmula WBAZCX,

en la que WBAZCX está compuesta por los segmentos de polipéptido mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132-143, 156, 157, 159); en la que W comprende el segmento F de polipéptido, o no existe; en la que Z comprende el segmento G de polipéptido, o no existe; y en la que X comprende los segmentos de polipéptido C/D HKL, C/D H, C/D HL, C/D D, C/D'HL, C/D'HKL, C/D'H, C/D'D, C/D C/D' HKL, C/D C/D'H, C/D C/D'HL, C/D C/D'D, C/D D'H, C/D D'HL, C/D D'HKL, C/D'D'H, C/D'D'HL, C/D' D'HKL, C/D C/D'D'H, C/D C/D'D'HL ó C/D C/D'D'HKL.

6. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido que específicamente une el receptor p185^{erbB2} de células musculares y activa segundos sistemas mensajeros de dichas células musculares.

7. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un dominio de factor similar al de crecimiento epidérmico (similar a EGF), en la que dicho dominio de factor de crecimiento epidérmico comprende una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en:

i)

número ID de secuencia 150 (EGFL1);

ii)

número ID de secuencia 151 (EGFL2);

iii)

número ID de secuencia 152 (EGFL3);

iv)

número ID de secuencia 153 (EGFL4);

v)

número ID de secuencia 154 (EGFL5); y

vi)

número ID de secuencia 155 (EGFL6).

8. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

i)

un factor de polipéptido de 35 kD aislado de la línea celular de fibroblastos transformada I-EJ de rata;

ii)

un factor de polipéptido de 75 kD aislado de la línea celular de seno humano SKBR-3;

iii)

un factor de polipéptido de 44 kD aislado de la línea celular de fibroblastos transformada I-EJ de rata;

iv)

un factor de polipéptido de 45 kD aislado de la línea celular de seno humano MDA-MB 231;

v)

un factor de polipéptido de 7 a 14 kD aislado de la línea de células T humanas ATL-2;

vi)

un factor de polipéptido de 25 kD aislado de macrófagos peritoneales de ratón activados;

vii)

un factor de polipéptido de 25 kD aislado de riñón bovino;

viii)

un polipéptido ARIA; y

ix)

un factor de polipéptido de 46 a 47 kD que estimula células progenitoras gliales 0-2A.

9. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende GGFIII.

10. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido que comprende la secuencia E comprende el número ID de secuencia 185.

11. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido que comprende la secuencia E comprende además como mínimo una parte del péptido codificado por las secuencias 5' y 3' de DNA a la secuencia de codificación E o el clon pGGF2HBS5, depositado en A.T.C.C. 6 de noviembre de 1992 (Número de depósito A.T.C.C. 75347).

12. Utilización de dicho polipéptido que comprende la secuencia E, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que los 50 aminoácidos de terminal N son fraccionados de dicho péptido que comprende dicha secuencia de E.

13. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido que comprende la secuencia F comprende los segmentos de polipéptido FBA que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 30 (números ID de secuencia 132, 134, 135), los segmentos de polipéptido FBA' que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 30 (números ID de secuencia 132, 134, 136), los segmentos de polipéptido FEBA que tienen las secuencias de aminoácidos mostradas en la figura 30 (números ID de secuencia 132, 135, 159) o los segmentos de polipéptidos FEBA' que tiene las secuencias de aminoácidos que corresponden a los segmentos de polipéptidos mostrados en la figura 30 (números ID de secuencia 132-134, 136, 159).

14. Utilización, según la reivindicación 2, en la que dicho polipéptido es GGF2 humano recombinante.

15. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 7 a 14, en la que dicho polipéptido es codificado por una secuencia de DNA en un constructo genético expresable.

16. Utilización, según las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tratamiento o profilaxis es de un estado patofisiológico de la musculatura en un mamífero, en el que dicho estado comporta un tipo de célula muscular que es sensible o que responde a dicho polipéptido.

17. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tratamiento o profilaxis es de un estado que comporta daños musculares en un mamífero.

18. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tratamiento o profilaxis está destinada a reducir la atrofia de dichas células musculares.

19. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tratamiento o profilaxis está destinada a incrementar las fibras musculares presentes en dicho mamífero.

20. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicho tratamiento o profilaxis está destinada a incrementar la regeneración muscular en dicho mamífero.

21. Utilización, según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido que une específicamente el receptor p185^{erbB2} de células musculares y activa segundos sistemas mensajeros de dichas células musculares es un factor de crecimiento glial.

22. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha célula muscular es un mioblasto, una célula satélite, una célula muscular de músculos del esqueleto, una célula muscular de músculos cardíacos, o una célula muscular de músculos lisos.

23. Utilización, según las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha enfermedad o desorden es una enfermedad o desorden de músculos del esqueleto.

24. Utilización, según la reivindicación 23, en la que dicha enfermedad o desorden de músculos del esqueleto es una miopatía o distrofia.

25. Utilización, según la reivindicación 24, en la que dicha distrofia es distrofia muscular Duchennes o distrofia de Becker.

26. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha enfermedad o desorden es un desorden muscular cardíaco.

27. Utilización, según la reivindicación 26, en la que dicho desorden muscular cardíaco es cardiomiopatía, daños isquémicos, enfermedad muscular congénita o trauma cardíaco.

\newpage

28. Utilización, según cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha enfermedad o desorden es un desorden de los músculos lisos.

29. Utilización, según la reivindicación 28, en la que dicho desorden de los músculos lisos es esclerosis arterial, una lesión vascular, o una enfermedad o desorden vascular congénito.

30. Utilización, según las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha célula muscular tiene insuficientes receptores funcionales de acetilcolina y es una célula muscular en un paciente afectado de miastenia gravis o en un paciente con un estado que comporta daños musculares.

31. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el tratamiento o profilaxis es de un humano.