JP2007332153A - 筋肉の疾患または障害の治療または予防のための医薬品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】平滑筋の筋細胞上の受容体と結合するかまたは平滑筋の筋細胞の第2のメッセンジーシステムを活性化するポリペプチドまたは化合物を含有してなる、平滑筋の筋細胞の分裂促進、成長、分化または生存を誘導することによって平滑筋障害を治療または予防するための医薬品。
【選択図】なし
Description
WBAZCX
(式中、WBAZCXは図30で示されるポリペプチドセグメント(配列番号132、134、135、137〜139、156)から構成され、式中、WはポリペプチドセグメントFからなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントGからなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる)によって定義されるポリペプチドと筋細胞とを接触させること、および(または)式
YBAZCX
(式中、YBAZCXは図30で示されるポリペプチドセグメント(配列番号133〜135、156、159)から構成され、式中、YはポリペプチドセグメントEからなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントGからなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる)によって定義されるポリペプチドと筋細胞とを接触させることによって達成される。
−MDA−MB231ヒト胸部細胞系(human breast cell line)から単離された30kDのポリペプチド因子、または
−グリア細胞に対する形質転換されたラット、I−EJ線維芽細胞系から単離された35kDのポリペプチド因子、または
−SKBR−3ヒト胸部細胞系から単離された75kDのポリペプチド因子、または
−ラットI−EJ形質転換された線維芽細胞系から単離された44kDのポリペプチド因子、または
−活性化されたマウス腹膜マクロファージから単離された25kDのポリペプチド因子、または
−MDA−MB231ヒト胸部細胞から単離された45kDのポリペプチド因子、または
−グリア細胞に対するATL−2ヒトT細胞系から単離された7〜14kDのポリペプチド因子、または
−ウシ腎臓細胞から単離された25kDのポリペプチド因子、または
−脳から単離された42kD ARIAポリペプチド因子;0〜2Aの前グリア細胞(glial progenitor cells)を刺激する46〜47kDのポリペプチド因子;または
−43〜45kDのポリペプチド因子、GGFIII、175の筋細胞への適用により筋細胞を治療する方法を包含する。
(a)約30kDから約36kDの分子量で、および1つまたはそれより多くの以下のペプチド配列をそのアミノ酸配列中に含む、胎児子ウシ血漿の存在下、グリア細胞分裂促進活性をもつことも知られているベーシックなポリペプチド因子:
FKGDAHTE (配列番号:1)
ASLADEYEYMXK (配列番号:2)
TETSSSGLXLK (配列番号:3)
ASLADEYEYMRK (配列番号:7)
AGYFAEXAR (配列番号:11)
TTEMASEQGA (配列番号:13)
AKEALAALK (配列番号:14)
FVLQAKK (配列番号:15)
ETQPDPGQILKKVPMVIGAYT
(配列番号:165)
EYKCLKFKWFKKATVM
(配列番号:17)
EXKFYVP (配列番号:19)
KLEFLXAK (配列番号:32);および
(b)約55kDから約63kDの分子量をもち、1つまたはそれより多くの以下のペプチド配列をそのアミノ酸配列中に含む、胎児子ウシ血漿の存在下グリア細胞分裂促進を刺激することも知られている筋細胞を治療するのに用いられるベーシックなポリペプチド因子:
VHQVWAAK (配列番号:33)
YIFFMEPEAXSSG(配列番号:34)
LGAWGPPAFPVXY(配列番号:35)
WFVVIEGK (配列番号:36)
ASPVSVGSVQELQR
(配列番号:37)
VCLLTVAALPPT (配列番号:38)
KVHQVWAAK (配列番号:48)
KASLADSGEYMXK(配列番号:49)
DLLLXV (配列番号:39)
を用いる筋細胞の治療方法である。
(a)それぞれ図27A、27Bまたは27C、配列番号129〜131のいずれか1つに示されるDNA配列;
(b)図21、配列番号85に示されるDNA配列;
(c)図27A、配列番号129に示される配列のヌクレオチド281〜557によって示されるDNA配列;または
(d)(a)、(b)または(c)によるDNA配列のいずれか1つとハイブリダイズしうるDNA配列
によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド因子を用いる方法を含む。
(a)ウシ脳下垂体材料からえられたばあい、還元コンディションであってもなくても、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で約30kDから約36kDのみかけ上の(observed)分子量をもち、筋細胞の分裂を刺激することを含む筋細胞分裂促進活性をもち、逆相HPLCを用いて単離されたばあい4℃で0.1%トリフルオロ酢酸における10週間のインキュベーションののち該活性の少なくとも50%を保つベーシックなポリペプチド因子;および
(b)ウシ脳下垂体材料からえられたばあい、非還元コンディション下、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上約55kDから約63kDのみかけ上の分子量をもち、そのヒトの等価物がDNAクローンGGF2HBS5によってコードされ筋細胞分裂促進活性をもち逆相HPLCを用いて単離されたときに4℃ 0.1%トリフルオロ酢酸において4日間インキュベーションしたのち活性の少なくとも50%を保つベーシックなポリペプチド因子。
(a)筋細胞の分裂を刺激することを含む細胞分裂促進活性をもつ一連のヒトおよびウシポリペプチド因子。これらのペプチド配列はそれぞれ図30、31、32および33、配列番号132〜133に示される。
(b)筋細胞の分裂を刺激することを含む細胞分裂促進活性をもち、Lupuら、Science 249:1552(1990);Lupuら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:2287(1992);Holmesら、Science 256:1205(1992);Pelesら、69:205(1992);YardenおよびPeles Biochemistry 30:3543(1991);Dobashiら、Proc.Natl.Acad.Sci.88:8582(1991);Davisら、Biochem.Biophys.Res.Commun.179:1536(1991);Beaumontら、特許出願PCT/US91/03443(1990);Bottenstein、1/4/94に発行された、米国特許第5,276,145号;およびGreeneら、特許出願PCT/US91/02331(1990)に概説された手順にしたがい精製および特徴づけられた一連のポリペプチド因子。
(c)筋細胞の分裂を刺激することを含むグリア細胞分裂促進活性をもつポリペプチド因子(GGFBPP5)。アミノ酸配列は図31、配列番号144に示される。
本発明は、単離され精製されたニューレグリン因子およびこれらの因子をコードするDNA配列、これらの因子の筋肉外濃度を増加する制御化合物、およびインビボおよびインビトロの筋細胞の生存、分化および筋細胞分裂促進を誘導するこれらの因子の擬態(mimetics)である化合物の使用に適している。GGF/p185erbB2と結合するニューレグリンタンパク質をコードする遺伝子は多数の可変的にサイズ化され(variably-sized)、特異的にスプライスされる(differentially-spliced)RNA転写物を産生し、これらにより一連のタンパク質の増加(rise)が与えられるということは明らかである。これらのタンパク質は異なる長さのものであり、いくつかの共通のペプチド配列といくつかの独自のペプチド配列を含む。これらの因子が単一の遺伝子によってコードされるという結論は、ウシ下垂体後葉およびヒト胸部癌細胞(MDA−MB−231))から回収可能な特異的にスプライシングされたRNA配列によって支持される。この結論のさらなる支持は筋組織のための両分裂促進剤(ここに開示されたような)としておよびp185erbB2受容体のリガンド(以下参照)として作用するタンパク質のサイズ範囲から導き出される。
本発明は、筋肉の分裂促進を誘導するためのほかの天然に生じるGGFポリペプチドに加えて図30(配列番号132〜143、156、1576〜147、160、および161)のコーディングセグメントと実質的に相同なタンパク質のいずれかの使用のための方法をも包含する。また対立遺伝子のアレル変異体(allelic variations);天然の突然変異体(mutants);誘導された突然変異体;天然に生じる核酸と高いまたは低いストリンジェンシーコンディション(stringency conditions)の下、ハイブリダイズするDNAによってコードされるタンパク質(高いおよび低いストリンジェンシーの定義については、リファレンスによりここに組込まれる、Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons、New York、1989、6.3.1-6.3.6を参照)の使用;およびGGFポリペプチドに対する抗血清により特異的に結合されるポリぺプチドまたはタンパク質の使用が包含される。用語はまた筋肉の分裂促進の誘導のために図28からの配列からなるGGFポリペプチドを含むキメラポリペプチドの使用も含む。
筋芽細胞に対するrhGGFの分裂促進活性
クローンGGF2HBS5を、実施例14に記載したごとくに、組換えバクロウイルス感染昆虫細胞で発現させ、得られた組換えヒトGGF2を培養(40μl/mlで添加したならし培地)中の筋芽細胞に添加した。筋芽細胞(057A細胞)を24ウェル・ディッシュ中で前密集まで増殖させた。培地を除去し、40μl/mlの濃度にて、GGF2ならし培地と共にあるいはそれ無くして、0.5%胎児子ウシ血清を含有するDMEMで置き換えた。培地を2日後に交換し、細胞を固定し、5日後に染色した。合計核を、筋芽細胞における核数として計数した(表1)。
筋細胞分裂促進に対するrhGGF2の効果
休止初代クローン・ヒト筋芽細胞は前記したごとくに調製した(Sklar, R., Hudson, A., Brown, R., In vitro Cellular and Developmental Biology 1991; 27A:433-434)。休止細胞を、DMEM中の10μM BrdU、0.5%FCSの存在下で、示した試薬(rhGGF2ならし培地、メチルプレドニソロンを含むあるいは含まないPDGF、および対照培地)で処理した。2日後、細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで30分間固定し、70%エタノールで洗浄した。次いで、細胞を抗−BrdU抗体と共にインキュベートし、洗浄し、抗体結合をペルオキシダーゼ反応で可視化した。次いで、染色核の数を領域当たりにつき定量した。結果は、GGF2は対照よりも大きい、領域当たりの標識核の数の増大を誘導することを示す(表2参照)。
筋細胞分化に対するrhGGF2の効果
筋肉培養分化に対する精製rhGGF2(95%純度)の効果を調査した(図2)。培地の血清含量を20%から0.5%まで低下させることによって、密集筋芽細胞培養を誘導して分化させた。テスト培養を、6日間、示した濃度のrhGGF2で処理し、培地を2日毎に新鮮なものとした。次いで、培養を固定し、染色し、核の数を1ミリリットル当たりで計数した。図2におけるデータは、対照に対する、rhGGF2が存在した場合における、筋管中の核数の大きな増加を示す。
分化した筋管の生存に対するrhGGF2の効果
分化した筋管の生存は、rhGGF2処理によって有意に増加した。筋肉培養をrhGGF2の存在下で分化させ、種々の時間において、死んだ筋管の数をヨウ化プロピジウム染色法によって計数した。図3から分かるように、死んだ筋管の数は、分化4、5、6および8日において、rhGGF2処理培養ではより低かった。筋管における核の数は、分化8日後、非処理培養と比較して、GGF2処理によって有意に増加した。特に、ギムザ染色の後に同一プレートで計数した場合、対照は8.6筋核/mm2を示したのに対し、rhGGF2処理培養は57.2筋核/mm2(P=0.035)を示した。
rhGGF2:100ng/ml;ヒト血小板由来成長因子;20ng/ml;ヒト塩基性線維芽細胞成長因子:25ng/ml;ヒト上皮成長因子:30ng/ml;ヒト白血球阻害因子:10ng/ml;ヒト・インスリン様成長因子I:30ng/ml;ヒト・インスリン様成長因子II:25ng/ml。
rhGGF2は、Duchenne型筋ジストロフィー遺伝子座における遺伝欠陥を持つ分化筋管の生存を促進する
筋管生存に対するrhGGF2の陽性効果は、変性障害における可能な効力を反映し得た。筋管生存に対するこれらの効果を、クローン化に由来する初代デュシェーヌ(Duchenne)型筋芽細胞についてテストして、正常な筋肉培養で観察される応答が疾患に対する個体に由来する培養でも示され得るか否かを判断した。図5に示すデータは、正常個体で用いる同一筋肉培養条件(前記実施例4)を用いて得られた。rhGGF2は、対照と比較して、分化したDuchenne型筋肉培養において、死滅した筋管の数を有意に低下させた(p=0.032)。濃度は以下の通りであった:GGF2:100ng/ml;ヒト血小板由来成長因子:20ng/ml;ヒト・インスリン様成長因子I:30ng/ml。
分化プログラムに対するrhGGF2効果:MHC slowおよびジストロフィンタンパク質の誘導
培養溶解物のウェスタン分析によって、筋肉培養分化に対する精製rhGGF2の効果も調べた。筋特異的タンパク質のレベルを、三連処理および未処理培養で測定した。これらの培養を調製し、プレートのサイズを150mmまで増大し、筋肉培養層をSklar, R., およびBrown, R.(J. Neurol. Sci. 101:73-81, 1991)に記載されているごとくにウェスタン分析用に掻き落とした以外は前記したごとくに処理し、テストした。表Aに提示する結果は、rhGGF2処理が、ジストロフィン、ミオシン重鎖(MHC、成人スロー(slow)およびファスト(fast)アイソフォーム)を含めたいくつかの筋肉特異的タンパク質のレベルを増大させるが、HSP72またはMHCネオネイト(neonate)アイソフォームのレベルを、ウェスタンに負荷したタンパク質の量当たり同様のレベルまでは増大させないことを示す。rhGGF2によって誘導された筋肉特異的タンパク質のレベルは、筋核/mm2の数の定量的増加と同様であった(表3)。
rhGGF2を含めたニューレグリンは筋肉におけるアセチルコリン受容体の合成を誘導する
アセチルコリン受容体(AchR)サブユニットタンパク質の発現は筋細胞をニューレグリンに暴露することによって誘導できる。より詳しくは、本発明者らは、筋細胞をrhGGF2と接触させることはAchRサブユニットタンパク質の合成を誘導できることを示した。rhGGF2暴露に続くこの誘導は、2つの方法で観察された:まず、本発明者らは、レポーター遺伝子構築物の産物を介してヒト成長ホルモンの発現の増加を検出し、第2に、本発明者らは、アルファ−ブンガロトキシンの細胞への結合の増加を検出した。
精製されたGGF−IおよびGGF−IIのさらなる分裂促進活性
単一のミクロ培養をDNA合成、細胞形態学、細胞数および細胞抗原の発現について調査されるのを可能とする定量的方法を用いて、GGFIおよびIIを共に含有する高度に精製された試料の分裂促進活性を実験した。この技術はMuir et al.,(Analytical Biochemistry 185, 377-382, 1990)によって従前に報告されている方法を改変した。主な改変は、1)未被覆マイクロタイタープレートの使用、2)ウェル当たりの細胞数、3)10%子ウシ血清(FCS)の代わりの5%子ウシ血漿(FBP)の使用、および4)同時に培養に添加した、分裂促進剤およびブロモデオキシウリジン(BrdU)の存在下におけるインキュベーション時間である。加えて、固定前に細胞単層を洗浄しないで、細胞の喪失を回避し、マウス抗−BrdUモノクローナル抗体およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン(IgG)抗体のインキュベーション時間を2倍にしてアッセイの感度を増大させた。細胞培養条件に対して適当な改変を加えた後、ラット坐骨神経シュワン細胞について最適化したアッセイもいくつかの細胞系で用いた。
第1日目に、精製したシュワン細胞を、5%FBP/ダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)(5,000細胞/ウェル)中の未被覆96ウェルプレートに平板培養した。第2日目に、GGFまたは他のテスト因子、ならびに最終濃度10μmのBrdUを培養に添加した。48時間後(第4日)に、培地にアスピレーターをかけることによってBrdUの取込みを停止させ、室温にて70%エタノールの200μl/ウェルで20分間細胞を固定した。次に、細胞を水で洗浄し、37℃にて2N HCl 100μlで10分間インキュベートすることによってDNAを変性させた。アスピレーションに続き、ウェルに0.1Mホウ酸緩衝液(pH9.0)を満たすことによって残存する酸を中和し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄した。次いで、細胞を50μlのブロッキング緩衝液(0.1%トリトンX 100および2%正常ヤギ血清を含有するPBS)で37℃にて15分間処理した。アスピレーションの後、マウス抗−BrdUモノクローナル抗体(Dako Corp., Santa Barbara, CA)(50μl/ウェル、ブロッキング緩衝液に希釈した1.4μg/ml)を添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.1%トリトンX−100を含有するPBS中で3回洗浄することによって未結合抗体を除去し、ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウスIgG抗体(Dako Corp., Santa Barbara, CA)(50μl/ウェル、ブロッキング緩衝液に希釈した2μg/ml)を添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBS/トリトン中で3回洗浄し、PBS中で最後に濯いだ後、0.05%可溶性クロモゲンo−フェニレンジアミン(OPD)および0.02%H2O2を含有する50mMリン酸/クエン酸緩衝液(pH5.0)の100μl/ウェルをウェルに与えた。各ウェルからの80μlを、2N硫酸の40μl/ウェルを含有する清浄なプレートにピペットで加えることによって、室温にて5〜20分後に反応を停止させた。プレートリーダー(Dynatech Labs)を用い、490nmで吸光度を記録した。細胞単層を含有するアッセイプレートをPBSで2回洗浄し、基質ジアミノベンジジン(DAB)の100μl/ウェルおよび0.02%H2O2を添加して不溶性生成物を生じさせることによってBrdU−DNAについて免疫細胞化学的に染色した。10〜20分後、水で洗浄することによって染色反応を停止させ、倒立顕微鏡を用いてBrdU−陽性核を観察し、計数した。場合によっては、陰性核が0.001%トルイジンブルーでカウンター染色され、前記したごとくに計数した。
スウィス(Swiss) 3T3 線維芽細胞:空気中10%CO2の湿潤雰囲気中、37℃にて、フロー・ラブズ(Flow Labs)からの細胞を、10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補足したDMEM中で維持した。細胞に栄養を与え、2日毎に継代培養した。分裂促進アッセイのために、完全培地中5,000細胞/ウェルの密度にて細胞を平板培養し、細胞が密集し休止するまで1週間インキュベートした。血清含有培地を取り出し、細胞単層を無血清培地で2回洗浄した。分裂促進剤および10μMのBrdUを含有する無血清培地100μlを各ウェルに添加し、48時間インキュベートした。GGFおよび血清またはPDGF(陽性対照として)に対する用量応答を行った。
本実施例に示したすべての実験は、GGF−IおよびGGF−II(GGFs)の混合物を含有するセファロース12クロマトグラフィー精製工程からの高度に精製した試料を用いて行った。
精製したGGF−IおよびGGF−IIのアミノ酸配列
アミノ酸配列分析実験は、高度に精製したウシ下垂体GGF−IおよびGGF−IIを用いて行った。配列を記載するのに通常の一文字コードを用いた。ペプチドは、11%SDS−PAGEの55−65RD領域から流出(前記したマーカーに対するMW)した物質について行ったGGF−IIのリシルエンドペプチダーゼ消化を用い、還元しカルボキシメチル化した試料につき行った、リシルエンドペプチダーゼおよびプロテアーゼV8消化によって得られた。
HMG−1 高移動性群タンパク質−1
HMG−2 高移動性群タンパク質−2
LH−アルファ 黄体形成ホルモンアルファサブユニット
LH−ベータ 黄体形成ホルモンベータサブユニット
GGF−IおよびGGF−IIペプチドを含有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の単離およびクローニング
GGF−IIヌクレオチド配列の単離およびクローニングは、ペプチド配列情報およびライブラリースクリーニングを用い、ここに概略を述べるごとく行い、また、後記するごとくに行った。図10および11のペプチドは、GGF−I配列の単離およびクローニング、続いてのここに記載する技術についての出発点として用いることができるのが認識されよう。事実、図20、配列番号51〜84は、この目的のための可能な変性オリゴヌクレオチドプローブを示し、図22、配列番号86〜115は、可能なPCRプライマーをリストする。DNA配列およびポリペプチド配列はGGF−IIに関しこの手段によって得られるはずであり、また、DNA構築物およびかかるDNA配列を一体化させる発現ベクター、かかる構築物/ベクターを一体化させることによって遺伝的に改変された宿主細胞、およびかかる宿主細胞を培養することによって得られるタンパク質も同様である。本発明はかかる主題にも関する。
変性DNAオリゴマープローブは、(精製GGFタンパク質から生成したペプチドに由来する)アミノ酸配列をヌクレオチド配列に逆翻訳することによって設計した。オリゴマーは、DNA配列のコーディング鎖または非コーディング鎖いずれかを表す。セリン、アルギニンまたはロイシンがオリゴマー設計に含まれる場合、2つの別々の合成物を調製して不明確さを回避した。例えば、セリンは537および538または609および610におけるごとくTCNまたはAGYによってコードされた。同様のコドン分裂がアルギニンまたはロイシンでなされている(例えば、544、545)。DNAオリゴマーは、0.2マクイロモル規模の合成で働くβ−シアノエチル化学を用い、バイオサーチ(Biosearch)8750 4−カラムで合成した。オリゴマーをカラム(500オングストロームCpG樹脂)から切断し、55〜60℃で6〜24時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した。脱保護オリゴマーを真空下(Speedvac)で乾燥し、15%アクリルアミド(20モノ:1ビス)のゲル、7M尿素を含有する50mMトリス−EDTA緩衝液にての電気泳動によって精製した。UVシャドウイングによって、ゲル中にて全長オリゴマーを検出し、次いで、バンドを切り出し、振とうしつつ4〜16時間、DNAオリゴマーを1.5mlずつの水に溶出させた。溶出物を乾燥し、0.1mlの水に再溶解させ、吸光度測定を260nmで行った。
(A260xユニット/ml)(60.6/長さ=xμM)
すべてのオリゴマーを水の添加によって50μM濃度に調整した。
ウシゲノムDNAライブラリーはStratagene(カタログ番号:945701)から購入した。該ライブラリーはベクターラムダDashIIにクローン化した2×106 15〜20kb Sau3Al部分ウシDNA断片を含有するものであった。ウシ全脳cDNAライブラリーはClonetech (カタログ番号:BL10139)から購入した。相補DNAラブラリーは、ウシ全脳、ウシ下垂体およびウシ下垂体後葉から調製したmRNAから構築した(ヴァイトロジェン(Vitrogen)中:ストラタジーン(Stratagene))。Vitrogen調製した2つのcDNAライブラリーにおいて;1のライブラリーはベクターラムダg10におけるものであり、他のライブラリーはベクターpcDNAIにおけるものであった(プラスミドライブラリー)。ストラタジーン(Stratagene)ライブラリーはベクターラムダ ユニザップ(unizap)にて調製した。集合的に、cDNAライブラリーは1400万の一次組換えファージを含有するものであった。
これらの手法は組換えDNA法で記載されている標準的なプロトコルに従うものであった(Maniatis et al 2:60-2:81)。
制限エンドヌクレアーゼ供給業者(New England Biolabs)によって推奨される条件に従い、組換えファージDNA試料(2マイクログラム)を消化した。37℃における4時間のインキュベーションに続き、0.1M酢酸ナトリウムおよび3容量のエタノールの存在下で、反応生成物を沈殿させた。沈殿させたDNAを遠心によって収集し、75%エタノール中で濯ぎ、乾燥した。すべての懸濁した試料をアガロースゲルに負荷した(典型的には、TAE緩衝液;0.04Mトリスアセテート、0.002M EDTA中1%)。1センチメーター当たり1ボルトにて4ないし20時間、ゲルを泳動させた。マーカーはラムダHind III DNA断片および/またはφX174HaeIII DNA(New England Biolabs)を含むものであった。ゲルを0.5マイクログラム/mlの臭化エチジウムで染色し、写真を撮った。サザーンブロッティングについては、0.125N HClでの処理によってDNAをまずゲル中で脱プリン化し、0.5N NaOHで変性し、20×SSC(3M塩化ナトリウム、0.03Mクエン酸ナトリウム)中にて非荷電ナイロン膜に移した。ブロッティングは6時間から24時間まで行い、次いで、0.5トリスHCl pH7.5、0.15M塩化ナトリウム中で中和し、次いで、50mMトリス−ホウ酸EDTA中で簡単に濯いだ。
DNA消化物(例えば、5マイクログラム)を1%アガロースゲルに負荷し、次いで、適当な断片を染色後のゲルから切り出した。ガラスビーズへの吸着および供給業者(Bio 101)によって記載されているプロトコルを用いる溶出によってDNAを精製した。回収したDNA断片(100〜200ng)を、T4リガーゼ(New England Biolabs)を用い、pCU18の誘導体である線状化脱リン酸化ベクター、例えばpT3T7(Ambion)に連結した。このベクターは大腸菌βラクタマーゼを担持し、よって、形質転換体はアンピシリンを含有するプレートで選択できる。また、該ベクターは、β−ガラクトシダーゼ相補性を宿主細胞に供給し、従って、非組換体(ブルー)はイソプロピルチオガラクトシダーゼおよびBluogal(Bethesda Research Labs)を用いて検出できる。連結反応の一部を用いて、大腸菌K12 XLl blueコンピテント細胞(ストラタジーン(Stratagene)カタログ番号:200236)を形質転換し、次いで、アンピシリン1ml当たり50マイクログラムを含有するLBプレートで形質転換体を選択した。白色コロニーを選択し、プラスミドミニプレプ(preps)をDNA消化およびDNA配列分析のために調製した。選択したクローンを再テストして、そのインサートDNAがGGFプローブにハイブリダイズするか否かを判断した。
標準的なプロトコルに従い、5ml培養から二本鎖プラスミドDNA鋳型を調製した。配列決定は、製造業者のプロトコル[Sanger et al. PNAS;USA 74:5463 (1977)]に従い、セクエナーゼ(Sequenase)2.0およびジデオキシヌクレオチド配列決定キット(US Biochemical)を用いてジデオキシ鎖停止法によって行った。別法として、配列決定は、サイクル配列決定キット(New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories)を用いてDNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer, モデル4800)で行い、5’末端標識プライマーを用い、製造業者の指示に従って行った。配列プライマーは配列キットで供給されたものか、あるいはクローンから決定された配列に従って合成したものであった。6%ポリアクリルアミドの0.4mm厚配列決定用ゲルに配列決定反応物を負荷し、解像した。ゲルを乾燥し、X−線フイルムに暴露した。典型的には、標準的な配列決定キットを用いる場合、35Sを取り込み、サイクル配列決定反応のために32P末端標識プライマーを用いた。ゲルの底部から頂部まで(5’方向から3’)の配列をDNA配列エディターに読み込み、ジェネティクス・コンピュータ・グループ(Genetics Computer Group)(GCG、ウィスコンシン大学)によって供給されているプログラムを用いてデータを解析した。
ゲノムDNA中に検出され、かつGGFペプチドをコードする配列を含有するオープンリーディングフレームを下垂体RNAのPCR増幅を介して延長した。RNAは、グアニジン中性−CsCl手法(Chirgwin et al. Biochemistry 18:5294 (1979))に従い凍結ウシ組織(Pelfreeze)から調製した。ポリアデニル化RNAはオリゴ−dTセルロースカラムクロマトグラフィー(Aviv and Leder PNAS (USA) 69:1408 (1972))によって選択した。
断片組立てプログラムを用いてDNA配列を組み立て、GCGプログラム ゲルアセンブル(GelAssemble)、地図およびトランスレート(Translate)によってアミノ酸配列を推定した。推定したタンパク質配列を疑問配列として用いて、ワードサーチ(WordSearch)を使用してタンパク質配列データベースをサーチした。分析は、VMS5.1下で操作するVAX Station 3100 ワークステーションで行った。データベースサーチは、GCGバージョン7.0を用いてスウィスプロット(SwissProt)リリース番号21で行った。
示したごとく、ウシGGF−IIをコードするDNA配列を同定するために、縮重オリゴヌクレオチドプローブをGGF−IIペプチド配列から設計した。GGF−II 12(配列番号44)、すなわち、精製したGGF−II調製のリシルエンドペプチダーゼ消化を介して生成したペプチドは(図16および12参照)、GGF−I 07(配列番号39)、すなわち、精製したGGF−I調製から生成したトリプシンペプチドと強いアミノ酸配列相同性を示した。かくして、GGF−II 12を用いて10の縮重オリゴヌクレオチドプローブを得た(各々、図20中のオリゴ609、610および649ないし656、配列番号66、67、68および75参照)。フィルターの二連セットを、GGF−II 12の2つの重複部分をコードするプローブの2つのセット(セット1=609、610;セット2=649〜5656)でプローブした。ハイブリダイゼーションシグナルは観察されたが、1つのクローンのみが両プローブセットにハイブリダイズした。クローン(GGF2BG1と命名)を精製した。
種々の種におけるGGF配列
GGFタンパク質はタンパク質の新しいスーパーファミリーのメンバーである。他のホ乳動物DNAに関しての高ストリンジェンシイ・クロスハイブリダイゼーション実験(DNAブロッティング実験)において、本発明者らは、このウシ組換え分子からのDNAプローブはテストした種々の試料において特異的配列を容易に検出できることを明らかに示した。また、高度に相同性の配列がヒトゲノムDNAで検出される。オートラジオグラフィーは図28に示す。ラットおよびヒトDNAを含有するレーンにおけるシグナルは、GGF遺伝子のラットおよびヒト同等物を表し、この遺伝子によってコードされるいくつかのcDNAの配列は最近Holems et al.(Science 256: 1205 (1992))およびWen et al.(Cell 69:559 (1992))によって報告されている。
ヒトGGF2をコードするヒト配列の単離
脳幹から調製したヒトcDNAライブラリー(ストラタジーンカタログ番号935206)をスクリーニングすることによって、ウシGGFIIコーディングセグメントEからの配列を含有するいくつかのヒト・クローンを単離した。この戦略は、GGF2ペプチド(GGF2に対してユニーク)のほとんどおよびウシEセグメントを含有するクローンからの予測されるペプチド配列の間の強力なリンクに基づいて追求されたものであった。このライブラリーは、以下にリストするオリゴヌクレオチド914〜919を用いて、実施例8、セクションIIに記載されたごとくにスクリーニングした。
ホ乳動物および昆虫細胞におけるヒト組換えGGF2の発現
(実施例12に記載し、またHBS5として言及した)ヒトGGF2をコードするGGF2HBS5 cDNAクローンをベクター pcDL−SRα296にクローン化し、COS−7細胞をDEAE−デキストラン法によって100mmディッシュにトランスフェクトした。細胞溶解物および一時的に発現するCOS細胞からのならし培地をトランスフェクション後3および4日に収穫した。溶解物を調製するには、細胞単層をPBSで洗浄し、3回の凍結/解凍のサイクルによって溶解したディッシュから0.25Mトリス−HCl、pH8の150μm中に掻き取った。細胞夾雑物をペレット化し、上清を回収した。ならし培地試料(7mls.)を収集し、次いで、濃縮し、製造業者(Amicon, Beverly, MA)によって記載されているごとくセントリプレップ(Centriprep)-10およびセントリコン(Centricon)-10ユニットを用い、緩衝液を10mMトリス、pH7.4と取り替えた。ラット神経シュワン細胞を、前記したごとくに、DNA合成前駆体の取込みについてアッセイした。ならし培地および細胞溶解物試料をMarchionni et al., Nature 362:313 (1993)に記載されているごとくシュワン細胞増殖アッセイでテストした。GGF2をコードするcDNAであるGGF2HBS5は、タンパク質産物の分泌を培地に向けた。細胞溶解物を用いるアッセイによって測定して、最小活性が細胞内部で検出可能であった。GGF2HFB1およびGGFBPP5 cDNAは、産物の分泌を細胞外培地に向けなかった。これらのクローンからのGGF活性は細胞溶解物でのみ検出可能できた。
GGFの機能的エレメントの同定
GGF配列のファミリーの推定構造は、(GGF2BPP4によって表される)最長形態が、細胞外部分が上皮成長因子に似たドメインを含有する膜貫通タンパク質をコードすることを示す(CarpenterおよびWahl, in Peptide Growth FactorsおよびTheir Receptors I, pp. 69-133, Springer-Verlag, NY 1991参照)。コーディングセグメントCおよびC/DまたはC/D’ペプチド配列に存在するシステインの位置は上皮成長因子(EGF)ペプチド配列中の相同残基に関して保存されている(図32、配列番号147〜149参照)。これは、細胞外ドメインが受容体認識部位および生物学的活性化部位として働くことを示す。変異体形態のうちいくつかはH、K、およびLコーディングセグメントを欠き、かくして、分泌される拡散可能な生物学的活性タンパク質として発現され得る。EGF−様ドメイン(EGFL)を含むポリペプチドをコードするGGF DNA配列は、グリア細胞分裂促進活性を刺激する十分な生物学的活性を有し得る。
組換え細胞からのGGFの精製
生物学的活性をアッセイするためにGGFの全長または部分を得るには、クローン化DNAを用いてタンパク質を過剰生産させることができる。いくつかのアプローチを用いることができる。前記配列を含有する組換え大腸菌を構築することができる。pNH8aまたはpHH16a(Stratagene, Inc.)のごとき発現系を以下の製造方法によってこの目的で用いることができる。別法として、これらの配列をホ乳動物発現ベクターに挿入し、過剰生産細胞系を構築することができる。例として、この目的では、GGFをコードするDNA、クローンGGF2BPP5がCOS細胞で発現されており、pMSXND発現ベクター(Lee and Nathans, J. Biol. Chem. 263, 3521-3527, (1981))を用いチャイニーズハムスター卵巣細胞で発現させることができる。GGF DNA配列を含有するこのベクターは確立された手法を用いて宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
N−末端配列分析
hGGF2をコードするcDNAを増幅可能なベクーpcdhfrpolyAにクローン化し、安定な発現のためにCHO−DG44細胞にトランスフェクトした。rhGGF2がならし培地に分泌された。組換えGGF2の分泌される能力は、恐らくは、N−末端疎水性ストレッチ(シグナル配列)により媒介される。一旦粗小胞体を横切って成長するタンパク質の輸送を開始したならば、シグナル配列は特異的部位において成熟タンパク質から切断される。発現され精製されたrhGGF2のN−末端配列分析は後記にて示す切断部位を示す。タンパク質のN−末端における最初の50のアミノ酸残基の配列は、後記するN−末端配列分析によって確認された(表5)。
さらなるスプライシング変異体の単離
ここに引用して本明細書の一部とみなす、1992年10月23日付け出願の米国特許出願07/965,173号に記載されている他のニューレグリンを更新する(updating)方法により、スプライシング変異の結果として生じる4つの密接に関連する配列(ヘレグリンα、β1、β2、β3)が産生されている。Peles et al.(Cell 69:205 (1992))、およびWen et al. (Cell 69:559 (1992))は、p185erbB2に結合するタンパク質に関与する実施例1〜9および11に記載されたものと同様の精製およびクローニングアプローチを用いてもう1つのスプライシング変異体を(ラットから)単離している。cDNAクローンは、(形質転換ラット線維芽細胞系からp185erbB2結合タンパク質を精製し配列決定することにより)以下のようにして得られた。p185erbB2結合タンパク質はならし培地から以下のごとくに精製された。500ローラーボトル(合計120リットル)の3つの収穫物からのプールされたならし培地を0.2μフィルターを通す濾過によって清澄化し、20kd分子量カットオフの膜を用い、ペリコン(Pelicon)限外濾過系にて31倍濃縮した。すべての精製工程は、ファルマシア社製のファストタンパク質液体クロマトグラフィーシステムを用いることによって行った。濃縮した物質をヘパリン−セファロースのカラム(150ml、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で予め平衡化)に直接負荷した。280nm波長での吸光度が検出されなくなるまで、0.2M NaClを含有するPBSでカラムを洗浄した。次いで、結合タンパク質をNaClの連続的グラジエント(0.2Mから1.0M)(250ml)で溶出し、5mlずつの画分を収集した。試料(収集した画分からの0.01ml)をキナーゼ刺激活性の定量アッセイで用いた。3回カラムを流して(合計容量=360ml)活性画分をプールし、YM10限外濾過膜(Amicon, Danvers, MA)を用いることによって濃縮し、硫酸アンモニウムを濃度1.7Mに到達するまで添加した。遠心(10,000×g、15分)によって清澄化した後、プールした物質をフェニル−セファロースカラム(HR10/10、ファルマシア社製)に負荷した。該カラムを0.1M Na2PO4(pH7.4)中の(NH4)2SO4のグラジエント(1.7Mないし無塩)45mlで展開し、2mlずつの画分を収集し、(実施例19に記載した)キナーゼ刺激につきアッセイした(試料当たり0.002ml)。活性の主要ピークをプールし、50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)に対して透析した。モノ−S陽イオン交換カラム(HR5/5、ファルマシア社製)を50mMリン酸ナトリウムで予め平衡化した。活性物質(タンパク質0.884mg;35ml)を負荷した後、カラムを出発緩衝液で洗浄し、次いで、NaClのグラジエントにて、1ml/分の液速で展開した。キナーゼ刺激活性物を0.45〜0.55M塩にて回収し、各2mlずつの4つの画分にわたって展開した。これらをプールし、Cu2+キレート化カラムに直接負荷した(1.6ml、HR2/5キレート化セファロース、ファルマシア社製)。タンパク質のほとんどは樹脂に吸着したが、それらは、塩化アンモニウムの30ml直線グラジエント(0〜1M)で徐々に溶出した。活性は0.05ないし0.2M NH4Clの範囲で、タンパク質の単一ピークにて溶出した。精製の種々の工程からの試料を、ゲル電気泳動、続いてのICNからのキット(Costa Mesa, CA)を用いる銀染色によって分析し、そのタンパク質含量をバイオ−ラド(Bio-Rad)(Richmond, CA)からのキットを用いるクーマシーブルー染料結合アッセイで測定した。
p185 erbB2 受容体に結合する他のタンパク質の精製およびアッセイ
I.gp30およびp70の精製
Lupe et al. (Science 249, 1552 (1990))およびここに引用して本明細書の一部とみなすLippmanおよびLupe(国際出願PCT/US91/03443(1990))は、ヒト胸癌細胞系MDA−MB−231のならし培地からタンパク質を精製している。
また、Pelesら(Cell 69,205(1992))は、ラット細胞から185erbB2刺激リガンドを精製している。Holmesら(Science 256, 1205 (1992))は、p185erbB2に結合しそれを刺激するヒト細胞からヘレグリンαを精製している。Tarakovsky et al., Oncogene 6:218 (1991)は、活性化マクロファージから単離された25kDのポリペプチドのNeu受容体への結合、p185erbB2相同性を示しており、ここに引用して本明細書の一部とみなす。
YardenおよびPeles (Biochemistry 30, 3543 (1991))は185erbB2受容体を刺激する35キロダルトンの糖タンパク質を同定している。
ARIA、アセチルコリン受容体合成を刺激する42kDタンパク質は、ジェラルド・フィッシュバッハ(Gerald Fischbach)(Falls et al., (1993) Cell 72:801-815)の研究所で単離されている。ARIAは185erbB2に類似する185Kda筋肉膜貫通タンパク質のチロシンリン酸化を誘導し、培養した胚性筋管でアセチルコリン受容体合成を刺激する。ARIAはまずはGGF/erbB2リガンド群タンパク質のメンバーであるらしく、これは、グリア細胞分裂促進刺激および本明細書に記載した例えばGGF2の適用で潜在的に有用である。
GGFによって媒介されるタンパク質チロシンリン酸化
増殖を誘導する十分なレベルのグリア成長因子での処理に続き、ラット・シュワン細胞は、タンパク質チロシンリン酸化の刺激を示す。実施例9に概略を示した手法に従い、種々の量の部分的に精製したGGFをラット・シュワン細胞の初代培養に適用した。シュワン細胞は、ポリD−リシン被覆した24ウェルプレート中、DMEM/10%子ウシ血清/5μMフォルスコリン/GGF−CM1mL当たり0.5μg(ウェル当たり0.5mL)で増殖させた。密集したら、DMEM/ウェル当たり0.5mLの10%子ウシ血清を細胞に与え、休止するまでインキュベーター中に一晩放置した。翌日、細胞にDMEM/10%子ウシ血清の0.2mLを与え、インキュベーター中に1時間放置した。次いで、テスト試料を、要求される異なる濃度および異なる時間にて直接培地に添加した。次いで、細胞を、沸騰する溶解緩衝液(リン酸ナトリウム、5mM、pH6.8;SDS,2%,β−メルカプトエタノール,5%;ジチオスレイトール,0.1M;グリセロール,10%;ブロモフェノールブルー,0.4%;バナジン酸ナトリウム,10mM)中で溶解し、沸騰する水浴中で10分間インキュベートし、次いで、直接分析するか、あるいは−70℃で凍結した。7.5%SDS−PAGEゲル上で泳動させ、次いで、Towbin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354によって記載されている標準的な手法を用いてニトロセルロースに電気ブロッティングすることによって、試料を分析した。ブロットしたニトロセルロースを、KampsおよびSelton (1988) Oncogene 2:305-315に記載されている標準的な方法を用いて抗ホスホチロシン抗体でプローブした。プローブしたブロットをオートラジオグラフィーフィルムに一晩暴露し、標準的な実験方法を用いて展開した。デンシトメトリー測定は、ウルトラスキャン(Ultrascan)XL増強レーザーデンシトメーター(LKB)を用いて行った。分子量の測定は、予め染色した高分子量のスタンダード(Sigma)に対して行った。タンパク質リン酸化およびシュワン細胞増殖の用量応答は非常に似ている(図33)。リン酸化バンドの分子量はp185erbB2の分子量に非常に近い。GGF2HBS5クローンでCOS細胞翻訳体から調製したならし培地でシュワン細胞を処理した場合、同様の結果が得られた。これらの結果は、GGFと、185erbB2の活性化との予測される相互作用とよく相関する。
GGFのN−グリコシル化
GGF−II候補クローンGGF2BPP1、2および3のcDNA配列から予測されるタンパク質配列は、多数のコンセンサスN−グリコシル化モチーフを含有する。GGFII02ペプチド配列におけるギャップは、これらのモチーフのうちの1つにおけるアスパラギン残基に合致し、これは、炭水化物は恐らくはこの部位にて結合していることを示す。
また、GGF−Iでの活性溶出実験は、N−グルカナーゼで処理した場合に電気泳動移動度の増大を示し、これは、MW26〜28kDaの活性種を与える。用いた試料におけるバックグラウンド染色のためN−脱グリコシル化バンドは割り当てできないにも拘わらず、銀染色により、移動度のシフトがあることが確認された。
Claims (17)
- 平滑筋の筋細胞上の受容体と結合するかまたは平滑筋の筋細胞の第2のメッセンジーシステムを活性化するポリペプチドまたは化合物を含有してなる、平滑筋の筋細胞の分裂促進、成長、分化または生存を誘導することによって平滑筋障害を治療または予防するための医薬品であって、該ポリペプチドまたは化合物が、
a)配列番号133または159に記載される核酸配列によってコードされるE配列からなるポリペプチド;
b)配列番号132に記載される核酸配列によってコードされるF配列からなるポリペプチド;
c)式
YBAZCX
(式中、YBAZCXは図30に示されるポリペプチドセグメント(配列番号133〜135、137〜143、146、156および159)から構成され、式中、YはポリペプチドセグメントE(配列番号133および159)からなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントG(配列番号137)からなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる;ここで、前記ポリペプチドセグメントは、Aが配列番号135、Bが配列番号134、Cが配列番号156、C/Dが配列番号138、C/D′が配列番号139、Dが配列番号140、D′が配列番号141、Hが配列番号146、Kが配列番号142、Lが配列番号143で示される)によって定義されるポリペプチド;
d)式
WBAZCX
(式中、WBAZCXは図30に示されるポリペプチドセグメント(配列番号132、134、135、137〜143、146および156)から構成され、式中、WはポリペプチドセグメントF(配列番号132)からなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントG(配列番号137)からなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる;ここで、前記ポリペプチドセグメントは、Aが配列番号135、Bが配列番号134、Cが配列番号156、C/Dが配列番号138、C/D′が配列番号139、Dが配列番号140、D′が配列番号141、Hが配列番号146、Kが配列番号142、Lが配列番号143で示される)によって定義されるポリペプチド;
e)筋細胞のp185erbB2受容体と特異的に結合する化合物;
f)上皮成長因子様(EGF−様)ドメインからなるポリペプチドであって、該上皮成長因子様ドメインが
i)配列番号150(EGFL1);
ii)配列番号151(EGFL2);
iii)配列番号152(EGFL3);
iv)配列番号153(EGFL4);
v)配列番号154(EGFL5);および
vi)配列番号155(EGFL6);
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
g)
i)ラットI−EJ形質転換された線維芽細胞系から単離された35kDポリペプチド因子;
ii)SKBR−3 ヒト胸部細胞系から単離された75kDポリペプチド因子;
iii)ラットI−EJ形質転換された線維芽細胞系から単離された44kDポリペプチド因子;
iv)MDA−MB231 ヒト胸部細胞系から単離された45kDポリペプチド因子;
v)ATL−2ヒトT細胞系から単離された7〜14kDポリペプチド因子;
vi)活性化されたマウス腹腔マクロファージから単離された25kDポリペプチド因子;
vii)ウシ腎臓から単離された25kDポリペプチド因子;
viii)ARIAポリペプチド; および
ix)0〜2A前グリア細胞を刺激する46〜47kDポリペプチド因子
からなる群から選択されるポリペプチド;および
h)GGF−IIIからなるポリペプチド;
からなる群から選択される医薬品。 - 前記ポリペプチドが配列番号133または159に記載される核酸配列によってコードされるE配列からなる請求項1記載の医薬品。
- 前記ポリペプチドが配列番号132に記載される核酸配列によってコードされるF配列からなる請求項1記載の医薬品。
- 前記ポリペプチドが、式
YBAZCX
(式中、YBAZCXは図30に示されるポリペプチドセグメント(配列番号132〜143、156、157、159)から構成され、式中、YはポリペプチドセグメントEからなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントGからなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる)によって定義されるポリペプチドからなる請求項1記載の医薬品。 - 前記ポリペプチドが、式
WBAZCX
(式中、WBAZCXは図30に示されるポリペプチドセグメント(配列番号132〜143、156、157、159)から構成され、式中、WはポリペプチドセグメントFからなるかまたは存在せず、式中、ZはポリペプチドセグメントGからなるかまたは存在せず、そして式中、XはポリペプチドセグメントC/D HKL、C/D H、C/D HL、C/D D、C/D′ HL、C/D′ HKL、C/D′ H、C/D′ D、C/D C/D′ HKL、C/D C/D′ H、C/D C/D′ HL、C/D C/D′ D、C/D D′ H、C/D D′ HL、C/D D′ HKL、C/D′ D′ H、C/D′ D′ HL、C/D′ D′ HKL、C/D C/D′ D′ H、C/D C/D′ D′ HL、またはC/D C/D′ D′ HKLからなる)によって定義されるポリペプチドからなる請求項1記載の医薬品。 - 前記化合物が平滑筋の筋細胞のp185erbB2受容体と特異的に結合する化合物からなる請求項1記載の医薬品。
- 前記ポリペプチドが上皮成長因子様(EGF−様)ドメインからなる医薬品であって、該上皮成長因子様ドメインが
i)配列番号150(EGFL1);
ii)配列番号151(EGFL2);
iii)配列番号152(EGFL3);
iv)配列番号153(EGFL4);
v)配列番号154(EGFL5);および
vi)配列番号155(EGFL6);
からなる群から選択される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列からなる請求項1記載の医薬品。 - 前記ポリペプチドが
i)ラットI−EJ形質転換された線維芽細胞系から単離された35kDポリペプチド因子;
ii)SKBR−3 ヒト胸部細胞系から単離された75kDポリペプチド因子;
iii)ラットI−EJ形質転換された線維芽細胞系から単離された44kDポリペプチド因子;
iv)MDA−MB231 ヒト胸部細胞系から単離された45kDポリペプチド因子;
v)ATL−2ヒトT細胞系から単離された7〜14kDポリペプチド因子;
vi)活性化されたマウス腹腔マクロファージから単離された25kDポリペプチド因子;
vii)ウシ腎臓から単離された25kDポリペプチド因子;
viii)ARIAポリペプチド; および
ix)0〜2A前グリア細胞を刺激する46〜47kDポリペプチド因子
からなる群から選択されるポリペプチドからなる請求項1記載の医薬品。 - 前記ポリペプチドがGGF−IIIからなる請求項1記載の医薬品。
- 前記E配列からなるポリペプチドが配列番号185からなる請求項1記載の医薬品。
- 50 N−末端アミノ酸が、前記E配列からなる前記ペプチドから開裂される請求項1または2記載の医薬品。
- 前記F配列からなるポリペプチドが、図30に示されるアミノ酸配列(配列番号132、134、135)を有するFBAポリペプチドセグメント、図30に示されるアミノ酸配列(配列番号132、134、136)を有するFBA′ポリペプチドセグメント、図30に示されるアミノ酸配列(配列番号132、135、159)を有するFEBAポリペプチドセグメント、または図30に示されるポリペプチドセグメントに対応するアミノ酸配列(配列番号132〜134、136、159)を有するFEBA′ポリペプチドセグメントからなる請求項1記載の医薬品。
- 前記ポリペプチドが組換えヒトGGF2である請求項2記載の医薬品。
- 前記ポリペプチドが発現可能な遺伝子構造にあるDNA配列によってコードされる請求項1〜13のいずれか1項記載の医薬品。
- 前記平滑筋障害が動脈硬化、血管障害、または先天性血管疾患もしくは障害である請求項1〜14のいずれか1項記載の医薬品。
- 平滑筋の筋細胞増殖の疾患または障害の治療または予防のための医薬品であって、請求項1〜14のいずれか1項に定義されたポリペプチドまたは化合物と結合する抗体を含有してなる医薬品。
- 前記治療または予防がヒトの治療または予防である請求項1〜16のいずれか1項記載の医薬品。
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