KR100262867B1

KR100262867B1 - 인간과립구콜로니자극인자의 제조방법

Info

Publication number: KR100262867B1
Application number: KR1019970061203A
Authority: KR
Inventors: 하석훈; 고형곤; 오명석; 김현수; 정근택; 이현수; 목헌
Original assignee: 손경식; 제일제당주식회사
Priority date: 1997-11-19
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2000-08-01
Also published as: KR19990040732A

Abstract

본 발명은 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자의 제조 방법에 관한 것으로서, 이러한 제조 방법은 발현을 조절하는 프로모터로서 T7 프로모터를 사용하고 불필요한 아미노산의 도입이 없이 N-말단부위의 A+T 함량을 높임으로써 대장균에서 rHuG-CSF의 유전자의 높은 발현을 가능케 한다.

Description

인간 과립구 콜로니 자극인자의 제조방법

본 발명은 인간 과립구 콜로니 자극인자(이하, hG-CSF라 함)의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세히는 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균 내에서 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자 (이하, rHuG-CSF라 함)의 높은 발현이 가능케 하는 플라스미드의 제조 방법에 관한 것이다.

일반적으로 CSF(colony stimulating factor)라 총칭되는 인자들 (참조 : interleukins, EPO, M-CSF, GM-CSF, G-CSF 등)은 전구 간세포(progenitor stem cell)로부터 혈구 세포의 증식과 분화를 조절하는 역할을 하는데[참조 : Nicola, N. A. Annu. Rev. Biochem. 58, 45-77(1989)], 그 중 G-CSF(granulocyte colony stimulating factor)는 거식세포(macrophage), 활성화 T세포, 섬유아세포, 내피세포에 의해 주로 생산되며 호중구 콜로니의 증식, 전구 세포로부터의 호중구 세포로의 분화 및 성숙 호중구 세포의 활성 자극 등의 역할을 한다고 알려져 있다(참조 : Nagata, S. in Handbook of Experimental Pharmacology :Vol 95, Springer-Verlag, New York, pp699-722).

또한, hG-CSF 유전자의 제조 방법은 인간 혈관 내피세포의 cDNA 라이브러리(CLONTECK Cat. No. HL1164b)로 부터 hG-CSF 유전자의 염기 서열을 갖는 두 종류의 합성 DNA (Primer I : 5'-CTGCATATGACCCCCCTGGGCCCT-3'와 Primer II : 5'-CTGGGATCCTTATCAGGGCTG-3')를 사용하여 PCR에 의해 rHuG-CSF를 코딩하는 유전자를 합성하였고, 합성된 DNA의 양말단을NdeI과BamHI으로 절단하여NdeI과BamHI으로 절단한 pET-21b 플라스미드(참조 : Novagen Cat. No. 69762-1)에 접합하는 것이 었다. 이처럼 종래에는 상기의 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)(참조 : Stratagene Cat. No. 200131)을 형질전환하여 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(이하, IPTG라 함)에 의해 발현을 유도하였으나 발현된 rHuG-CSF를 관찰할 수 없었다. 이는 단백질의 N-말단 부분을 코딩하는 구조 유전자의 G+C 비율이 높아 유전자의 발현이 불가능한 것으로 추정하고 있었다[참조 : Devlin et al., Gene 65:13(1988)]. 이에 따라, 발현된 rHuG-CSF를 쉽게 관찰할 수 있을 정도로 발현율이 높은 플라스미드의 제조 방법이 요구되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 재조합 기술에 의하여 대장균으로부터 rHuG-CSF를 제조함에 있어서, 전사 능력이 강한 T7 프로모터를 사용하여 불필요한 아미노산의 도입이 없이 rHuG-CSF 유전자 N-말단의 A+T함량을 높임으로써 rHuG-CSF를 높은 발현율로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드 pT7GCSF의 제작도이고,

도 2는 본 발명에 의해 제조된 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자의 염기 서열을 나타낸 것이며,

도 3은 본 발명에 의해 제조된 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자의 염기 서열을 해독한 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 4는 본 발명에 의해 제조된 인간 과립구 콜로니 자극인자 단백질의 SDS-PAGE 상에서의 웨스턴블롯 양상을 나타낸 것이고,

도 5는 본 발명에 의해 제조된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 최종 정제액의 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.

상기 목적은, 본 발명에 따라, 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자의 제조 방법에 있어서, T7 프로모터에 의해 발현이 조절되는 플라스미드 벡터를 사용하여 대장균으로부터 제조하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자의 제조 방법에 의하여 달성된다.

여기서, 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자를 코딩하는 유전자의 N-말단부위의 염기서열이 5'-ATGACACCTTTAGGACCT-3' 인 것이 바람직하다.

본 발명은 상술한 종래의 문제점을 고려하여 아미노산의 변화가 없이 5' 말단의 A+T 함량을 높이고자 새로운 프라이머의 합성 방법을 개발하는 과정에서, 새로 합성한 프라이머 I-a( 5'-CTGCATATGACACCTTTAGGACCT-3')와 프라이머 II로부터 PCR에 의해 본 발명의 유전자의 합성 방법을 개발하게 되었고, 상기의 방법으로 유전자를 클로닝하여 발현을 유도한 결과 rHuG-CSF의 발현을 확인할 수 있었다.

본 발명에 사용된 플라스미드의 프로모터로는 T7 박테리오파지로부터 유래된 T7 프로모터와 이 프로모터의 하부에 T7 프로모터를 조절할 수 있는 lac 작동자(operator)가 존재하는 pET-21b 플라스미드 벡터를 사용하였다.

조금 더 자세히 설명하면, 박테리오파아지의 RNA 중합 효소는 T7 프로모터 염기 서열에 특이성을 갖으며 이 서열은 대장균에서는 거의 나타나지 않는다. 또한 T7 프로모터 염기 서열은 대장균의 RNA 중합 효소에 의해서는 인식되지 않으므로 발현을 유도하면 박테리오파아지의 RNA 중합 효소에 의해 전사되는 목적 유전자만이 전사된다. 그러나 T7 RNA 중합 효소의 T7 프로모터에 대한 선택성에도 불구하고 목적 단백질이 부분적으로 낮게 발현되는 경우가 많다. 이러한 문제점을 해결하고 발현을 보다 정교하게 조절할 수 있게 하기 위해 lac 작동자를 도입하고 T7 RNA 중합 효소의 효과적인 차단을 위해 lac I^q유전자가 도입된 숙주 세포를 사용하였다. 이때 IPTG에 의해 발현을 유도시키면 숙주 세포의 T7 RNA 중합 효소가 대량으로 발현되고 목적 유전자의 발현이 이루어지게 된다.

이하, 본 발명은 하기의 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다.

실시예 1 (hG-CSF 유전자의 제조)

인간의 혈관 내피 세포의 cDNA 라이브러리(CLONTECH Cat. No. HL1164b)로부터 hG-CSF 유전자의 염기 서열을 변형한 두종류의 합성 DNA 프라이머(Primer I-a : 5'-CTGCATATGACACCTTTAGGACCT-3' 과 Primer II : 5'-CTGGGATCCTTATCAGGGCTG-3')를 사용한 PCR에 의해 rHuG-CSF을 코딩하는 유전자인 hG-CSF 유전자를 합성하였다. 합성된 hG-CSF 유전자를 순수하게 정제한 후 pET-21b의 T7 프로모터와 접합이 가능하도록 하기 위해 제한효소NdeI과BamHI을 사용하여 유전자의 양말단을 절단하여 양말단에NdeI과BamHI 절단부위를 갖는 hG-CSF 유전자 DNA 단편을 조제하였다.

실시예 2 (pT7GCSF 플라스미드의 제조)

플라스미드 pET-21b (Novagen 사에서 구입)를 제한 효소NdeI과BamHI으로 절단한 후, 절단된 벡터와 실시예 1에서 만든NdeI과BamHI 절단 부위를 갖는 hG-CSF 유전자 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 접합시켰다. 접합이 완료된 DNA 혼합물을 대장균 NM522 컴펜턴트(competent) 균에 형질전환시키고 앰피실린을 포함하는 LB 고체 배지에서 배양하였다. 형성된 대장균 콜로니로부터 플라스미드를 정제하여 제한 효소 절단 등의 방법으로 확인하여 클로닝된 균주를 선별하였고, 선별된 균주를 앰피실린을 포함하는 LB 액체배지에서 배양하여 다량의 클로닝된 플라스미드를 얻었다. 이 클로닝된 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)(Stratagene사)콤펜턴트 균에 형질전환시켰다. 이로써 hG-CSF 유전자는 플라스미드 pET-21b의 T7 프로모터의 조절을 받게 되었고 전사종결 부위를 포함하는 발현벡터인 플라스미드 pT7GCSF가 구성되었다. 도1에 플라스미드 pT7GCSF의 제작도를 나타내었다.

실시예 3 (hG-CSF 유전자의 염기 서열 확인)

위자드 플러스 미니프렙스 키트(Wizard Plus Minipreps kit ; Promega Cat# A7510)를 사용하여 정제한 pT7GCSF를 디데옥시 사슬 종결방법으로 반응시켜 클로닝된 hG-CSF 유전자의 염기 서열을 분석하였다. 얻어진 hG-CSF 유전자의 염기 서열은 슈자, 엘. 엠.(참조 : Souza, L. M. et al., 1986, Science 232 : 61-65 ; Nagata, S. et al., 1986, Nature 319:415-418 ) 등에 의해 보고된 hG-CSF 유전자의 염기 서열과 비교할 때, N-말단에서 아미노산에는 변화가 없으면서 생성된 mRNA의 어닐링정도를 낮추도록 염기가 변화되었다. hG-CSF 유전자의 전체 염기 서열은 도2에 나타내었고, 그 염기 서열을 해독한 아미노산 서열은 도3에 나타내었다.

실시예 4 (hG-CSF 유전자의 발현 및 확인)

상기의 실시예 2에서 제조된 플라스미드 pT7GCSF로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환하고, 이 균주를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함한 2X YT 배지 (16 g의 박토트립톱, 10 g의 이스트 추출물, 5 g의 NaCl / 1 리터)로 37℃에서 OD_600nm=0.6 까지 배양한 후 최종 농도가 1 mM되게 IPTG를 넣고난 다음 4시간 배양함으로써 rHuG-CSF의 발현을 유도하였다. 배양한 박테리아를 원심 분리하여 균체를 회수한 뒤에 이 균체를 파쇄하여 SDS-PAGE [참조 : Lammli, Nature 227, 680-685(1970)]로 단백질의 발현을 확인하였고, rHuG-CSF에 대한 항체를 사용하여 발현 단백질이 rHuG-CSF임을 확인하였으며 그 결과를 도4에 나타내었다.

덴시토미터(densitometer)를 사용하여 SDS-PAGE 겔상에서의 rHuG-CSF의 발현율을 측정한 결과 발현율(대장균 총단백질에 대한 발현된 rHuG-CSF의 비율)이 36%임을 알 수 있었으며, 균체를 파쇄하고 원심분리했을 때 침전물에서 발현된 rHuG-CSF가 발견되는 것으로 보아 rHuG-CSF는 봉입체(inclusion body)로 존재함을 확인하였다.

실시예 5 (플라스미드 pT7GCSF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 배양 및 rHuG-CSF의 정제)

균주를 50 ㎍/㎖ 앰피실린을 포함한 2X YT 배지 (16 g의 박토트립톤, 10 g의 이스트 추출물, 5 g의 NaCl / 1 리터) 50 ㎖에 접종하여, 37^oC의 250 rpm 진탕 배양기에서 16시간 동안 배양하여 종균을 준비하였다.

한편, 기본 배지가 들어있는 5L 발효조를 설치하였는데 이때의 온도는 37^oC, 교반은 400 rpm, 공기의 유입양은 1 vvm으로 하고, 암모니아수로 pH를 6.75 - 6.85 유지시켰다. 첨가 배지를 연결한 다음, 준비된 종균 50 ㎖을 무균적으로 접종하였다. 배양기간중 일정한 간격으로 OD₆₀₀과 포도당 농도를 점검함으로써 성장을 조사하였으며 거품 발생시 소포제를 첨가하였다. 배양중에 포도당 농도가 20 ㎎/L 이하가 되면 첨가 배지를 첨가하기 시작하고, 이때에 포도당 농도는 10 - 30 ㎎/L로 유지되도록 하며, OD₆₀₀= 30 - 40에서 IPTG를 최종 1 mM로 넣어 발현을 유도한 후 포도당의 소모가 중지되고, 더 이상 생산 균주의 성장이 일어나지 않을 때까지 배양하였다.

발효액을 모아서 마이크로 여과기로 농축한 다음 호모게나이저로 배양한 균체를 파쇄하고 파쇄액을 원심 분리하여(10,000 x g, 30 min) 상등액을 제거함으로써 봉입체를 회수하였다. 회수한 봉입체를 증류수 1.5 L에 현탁시킨 후 2 - 3 시간 방치한 다음 원심분리를 하여 침전물을 회수하므로써 세척하였다.

봉입체를 8 M의 요소(urea)와 50 mM의 글리신 완충용액(pH 11, 수산화나트륨 용액으로 pH를 조정) 1 L에 완전히 용해시켰다. 원심분리 (10,000 x g, 30 min)후 상등액을 취하고 단백질 정량법(Bradford method)으로 봉입체의 양을 확인하였다. 용해된 단백질의 농도가 최종 0.1 - 0.5 ㎎/㎖ 되고 우레아 농도가 2 M이 되도록 봉입체 용해액에 50 mM의 글리신용액을 첨가한 다음 수산화나트륨 용액으로 pH를 9.0 되게 조정하였다.

pH가 조정된 용해액을 상온에서 15 시간 동안 서서히 교반시켜 단백질 재구성(refolding)을 수행하였다. 단백질 재구성(refolding)이 완료된 용액을 pH 5.5로 조정하여 단백질의 침전물을 확인하였다. 0.22 ㎛ 필터로 여과하거나 원심분리로 침전물을 제거하고, 염산으로 pH를 3.0으로 조정한 다음, 다시 분자량 10 kD를 분획하는 필터를 사용하여 단백질 농도가 1 - 5 ㎎/㎖ 되게 농축하였다. 농축된 용액을 양이온 교환 수지를 사용하여 정제하였다. 용출된 단백질은 역상 HPLC로 분석하여 하나의 시료로 모은 다음 염산을 사용하여 pH를 3.0으로 조정하였다.

이온 교환 수지로 정제된 단백질은 정제 역상 HPLC(부틸실란화된 실리카겔 : C4)를 사용하여 정제를 수행하였다. 분획한 단백질은 역상 HPLC로 분석한 후, 하나의 시료로 모아 분자량 10 kD를 분획하는 멤브레인를 사용하여 최종 단백질 농도가 5 - 10 ㎎/㎖ 되게 농축하였다. 농축된 단백질은 겔여과 크로마토그래피로 최종 정제하였다. 정제된 최종 단백질은 역상 HPLC와 스펙트로포토미터로 단백질 정량(280 nm에서의 흡광도)을 하였다. 최종 정제된 rHuG-CSF의 역상 HPLC 크로마토그램은 도5에 나타내었다.

실시예 6 (생체외의 바이오어세이에 의한 rHuG-CSF의 생물학적 활성확인)

시험 동물은 6-15 주령의 건강한 웅성 마우스를 사용하였다.

배양 배지는 증류수 100 ㎖에 McCoy 5A 분말 배지 2.4 g에 탄산수소나트륨 0.44 g, 최소필수배지용 아미노산용액(Sigma Cat. No. M7020) 1.6 ㎖, 100 mM 피루빈산나트륨 용액 2 ㎖, 최소필수배지용 비필수 아미노산용액(Sigma Cat. No. M7145) 0.8 ㎖, 7.5% 탄산수소나트륨 1.2 ㎖, 최소 필수배지용 비타민용액(Sigma Cat. No. M6895) 0.8 ㎖, 20 mM 글루타민 용액 2 ㎖, 4.2 ㎍/㎖ 세린 용액 0.4 ㎖, 8 ㎍/㎖ 아스파라긴 용액 0.4 ㎖ 및 50 ㎎/㎖ 겐타마이신 용액 0.2 ㎖을 각각 가하고 증류수를 넣어 최종 부피를 200 ㎖로 하고 제균 여과하였다.

hG-CSF 표준품[National Institute of Biological Standards and Control (NIBSC : 영국) 제공 국제표준품(1.0 x 10⁸IU/㎎)]에 배양배지를 가하여 1 ㎖ 중에 200 활성 단위를 포함하는 용액을 조제하고 이를 96 평저 마이크로 플레이트를 사용하여 2배 계단희석을 수행하여 표준액열을 조제하였으며, 정제 hG-CSF 시료(250 ㎍/㎖)에 배양배지를 가하여 정확히 67,500 배 희석하고 이를 96 평저 마이크로 플레이트를 사용하여 2배 계단희석을 수행하여 검액열을 조제하였다.

시험동물에서 대퇴골을 채취하고 대퇴골에 묻은 근육을 잘 닦은 후, 한쪽 끝을 가위로 절개하였다. 주사기를 사용해 배양배지로 골수를 씻어낸 다음 1,000 RPM으로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하고 이를 0.5 ㎖의 배양 배지에 부유시킨 다음 미리 준비된 퍼콜(Percoll)용 밀도구배 용액상에 중층하고 2,500 RPM으로 30분간 원심분리하였다. 비중 1.06과 1.074 g/㎖ 퍼콜(Percoll)용 밀도 마커비드(marker bead)의 위치를 지표로 하여 두 마커비드(marker bead) 사이의 분획을 4등분하고 중간의 2개 분획을 회수하였다. 회수한 세포를 인산염 완충 생리식염수로 1,200 RPM에서 6분간 2회 원심분리하여 세척하고 세척한 세포를 배양배지에 현탁시킨 후 75 ㎠T-프라스크 당 약 1 - 3 x 10⁷개씩 소분하여 37℃ 배양기에서 2시간 동안 정치시켰다. 배양 후 비부착성 세포를 피펫으로 취하고 1,200 RPM으로 6분간 원심분리하여 세포를 회수한 다음, 1 ㎖중에 세포수가 약 1.6x10⁶개가 되도록 배양배지에 현탁시키고 이것을 골수세포 부유액으로 하였다.

얻어진 골수세포 부유액 50 ㎕를 평저 마이크로 플레이트의 각 구멍에 가한 다음 미리 준비한 표준액과 정제 시료 희석액 50 ㎕ 씩을 각 해당 구멍에 가하였다. 탄산가스 농도 5%의 37℃ 배양기 내에서 44 ± 4시간 동안 배양하고, 피펫으로 세포들을 잘 현탁시킨 다음³H-티미딘용액 20 ㎕씩을 각 구멍에 분주하고 같은 조건으로 다시 4시간 배양한 다음, 각 구멍의 세포를 셀하베스터(cell harvester)로 유리여과지에 모으고 인산염 완충 생리식염수로 3회 세척한 다음, 유리여과지를 바이알에 넣고 신틸레이션(scintillation)액 3 ㎖씩을 가하여 세포에 흡수된³H-티미딘의 방사능(dpm)을 측정하였다.

이상의 실험결과 표준액에서 얻은 방사능(dpm)과 활성 단위로부터 검량식을 구하고 표준액의 방사능(dpm) 범위에 들어가는 정제 시료 희석액의 방사능(dpm)으로부터 활성 단위를 구하고 그것들의 평균값과 희석 배율을 곱해 정제 시료의 활성 단위를 계산하였다.

단백질량에 대비한 생물학적 활성(비활성도)을 다음 수학식 1에 따라 계산할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 정제한 시료의 비활성도 결과는 하기표 1에 나타내었다.

시료명	생체외의 생물학적 비활성도 (1.0 x 10⁸IU/mg)(95% 신뢰도치 영역)
정제된 rHuG-CSF	1.10(87 ∼ 139)

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 유전자 재조합 기술에 의하여 대장균으로부터 rHuG-CSF를 제조함에 있어서, 전사 능력이 강한 T7 프로모터를 사용하여 불필요한 아미노산의 도입이 없이 rHuG-CSF 유전자 N-말단의 A+T 함량을 높임으로써 rHuG-CSF의 높은 발현율로 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

Claims

인간 과립구 콜로니 자극인자(HuG-CSF)를 코드화하는 hG-CSF 유전자 단편이 포함되어 있고 T7 프로모터에 의해 발현이 조절되는 플라스미드 pT7GCSF 벡터를 사용하여 E. coli로부터 제조합 인간 과립구 콜로니 자극인자( rHuG-CSF)를 제조 방법에 있어서;

인간 과립구 콜로니 자극인자(HuG-CSF)를코딩하는 유전자의 N-말단 부위의 염기 서열이 5'-ATGACACCTTTAGGACCT-3' 인 것을 특징으로 하는 재조합 인간 과립구 콜로니 자극인자( rHuG-CSF)의 제조 방법.