KR100192000B1

KR100192000B1 - 생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자 변형체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100192000B1
Application number: KR1019950050299A
Authority: KR
Inventors: 정현호; 문경덕; 유정권; 김동명; 조중명
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1995-12-15
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 1999-06-15
Also published as: KR970043043A

Abstract

본 발명은 안정하고 높은 생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자의 변형체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 천연형 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 위치의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킨 유전자를 함유하는 벡터를 제조하고 이로 형질전환된 균주를 배양하여 생산된 섬유신경세포 성장인자 변형체를 정제함으로써 안정되고 생물학적 활성이 높은 섬유신경세포 성장인자 변형체를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 섬유신경세포 성장인자 변형체는 말초신경 장애의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자 변형체 및 이의 제조방법

제1도는 인간 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 돌연변이시키는 과정 및 인간 섬유신경세포 성장인자를 유비퀴틴과 융합시켜 효모에서 발현시키기 위한 벡터의 제작 과정을 도시한 것이고,

제2도는 효모에서 발현된 인간섬유신경세포 성장인자 변형체(Cys17→Ser17)를 포함한 효모 세포 분쇄액을 변성 폴리아크릴 아마이드 젤(SDS-PAGE)상에서 전기영동한 결과를 나타낸 것이며,

제3도는 재조합 효모로부터 정제된 인간 섬유신경 성장인자(rhCNTF) 및 본 발명의 Ser17 변형체의 산화성 차이를 비환원성 SDS-PAGE로 확인한 결과이며,

제4도는 토끼의 rhCNTF에 대한 다클론성 항체를 이용하여, 재조합 효모에서 발현된 rhCNTF의 사이징 칼럼에서의 각 분획을 웨스턴-블럿팅하여 효모 재조합 rhCNTF의 이중체 형성여부를 정성 확인한 결과이며,

제5도는 재조합 효모로부터 분리 정제된 rhCNTF의 처리 농도에 따른 닭의 DRG 신경 세포에서의 활성도를 측정한 결과이고;

제6도는 rhCNTF 및 rhCNTF Ser17 변형체의 활성도 측정결과이다.

본 발명은 안정하고 높은 생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자의 변형체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 인간 섬유신경세포 성장인자(ciliary neurotrophic factor, rhCNTF)의 아미노 말단으로부터 17번째 아미노산인 시스테인이 구조적으로 유사한 세린 잔기로 치환되어, 분자수준에서 단일하며 단위 활성도가 우수한 rhCNTF 변형체(이하, 'Ser17 rhCNTF 변형체'라 한다) 및 이를 효모에서 제조 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

신경계의 신경세포나 신경교세포의 손상과 죽음은 인체에 정신적 및 육체적으로 심각한 불구를 야기하게 된다. 이러한 손상의 대표적인 예로는 신경퇴행성 질환인 알쯔하이머 병, 파킨슨 병과 복합성 경화증 등을 들 수 있는데, 뇌허혈, 외상, 자연적 노화에 의한 신경세포 및 교세포의 손실이 그 원인으로 알려져 있다.

신경영양성 인자는 신경세포나 신경교세포의 생존과 기능에 있어서 그 활성을 촉진하는 물질로서, 이러한 인자들이 신경세포 및 신경교세포의 손실이나 기능부진을 방지하기 위한 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다는 가능성이 제시되었다(아펠, Ann, Neurobiology, 10, 449(1991)). 특히 1979년 애들러 등(Adler et al., Science, 204, 1434(1979))에 의해 병아리의 배아로부터 섬유성 신경세포의 성장을 촉진하는 인자로 동정된 섬유신경세포 성장인자(CNTF)는 말초신경계에서 가장 많이 발현되며(Williams et al., Dev. Neurosci, 2, 177(1984)), 상해를 받은 세포에서 분비되어 교감(Saadat et al., J. Cell Biol., 108, 1807(1989)), 부교감, 감각신경(Barbin et al., J. Neurochem., 43, 1468(1984)) 등 말초신경계의 성장과 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 또한 중추신경계에서도 CNTF와 면역반응을 갖는 신경세포들이 확인되어(헨더슨 등, Brain-Res. Mol-Brain-Res, 22:151(1994)) 중추신경세포에도 영향을 주는 것으로 알려졌다. 이외에도 CNTF는 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)와 함께 생체내에서 희돌기교세포(oligodendrocyte)의 발생, 성장 및 생존력을 증진시키는 것으로 알려져 있다(메이어 등, Development, 120, 143(1994); Louis et al., Science, 259, 689(1993)). 최근 CNTF는 워블 마우스(Wobble mice)를 사용한 동물 모델에서 또 하나의 신경성장인자인 BDNF(brain-drived neurotrophic factor)와 상경적으로 작용하여 운동성 신경질환에 탁월한 치료효과가 있는 것으로 보고되었다(Mitsumoto et al., Science, 265, 1107(1994)).

이와 같이 유용한 CNTF를 치료제로 응용하기 위해 최근 재조합 유전자 기술을 이용한 CNTF의 발현 및 정제, 그의 생물활성 등에 대한 많은 연구가 시행되어 왔다. 린 등은 토끼의 좌골신경으로부터 분리 정제된 CNTF를 기초로 하여 Cos-7 세포로부터 CNTF를 발현시켜 그 활성을 보고한 바 있으며(Lin et al., Science, 246, 1023(1989); JBC, 265, 8942(1990)), CNTF의 단백질 일차구조 정보를 기초로 대장균으로부터 재조합 CNTF의 발현 및 정제가 수행되기도 하였다(Negro et al., J. Neurosci. Res., 29, 251(1991); Gupta et al., J. Neurobiol., 13, 481(1992)). 특히 네그로 등(Fidia 사)은 인간 섬유신경세포 성장인자를 암호화하는 유전자의 일차구조를 확인한 후 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포 및 대장균에서 발현시켜 그 활성을 확인한 바 있고(Eur. J. Biochem., 201, 289(1991); J. Neurosci. REs., 29, 251(1991)), 맥도널드 등(Synergen사)과 마시아코우스키 등(Regeneron 사)도 인간 섬유신경세포 성장인자를 대장균에서 발현, 정제하여 활성을 보고하였으며(McDonald et al., Biochim, Biophys, Acta., 1090, 70(1991); Masiakowski et al., J. Neurochem., 57, 1003(1991)), 본 출원인의 대한민국 특허 출원 제94-648호에는 인간 섬유신경세포 성장인자를 재조합 효모에서 발현, 정제하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 천연형 인간 섬유신경세포 성장인자는 단백질 일차구조에서 아미노 말단으로부터 17번째의 시스테인 잔기로 인해 환원형의 불안정한 단백질을 생성하고, 산화됨에 따라 단백질 이중체를 형성하게 되어 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다는 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 개선하여 안정되고 높은 생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자를 생산하기 위해 연구를 계속한 결과, 천연형 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단에서 17번째 아미노산인 시스테인을 세린 잔기로 치환하여 효모 균주에서 발현시키게 되면, 분자수준에서 단위활성도가 높은 rhCNTF 변형체가 생성될 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 생물활성을 갖는 섬유신경세포 성장인자 변형체, 이를 코드하는 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 이 벡터로 형질전환된 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 균주를 이용하여 안정하고 생물학적 활성이 높은 섬유신경세포 성장인자 변형체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 섬유신경세포 성장인자 변형체를 함유하는 말초신경장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 천연형 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 섬유신경세포 성장인자 변형체, 이를 코드하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 형질전환된 미생물을 섬유신경세포 성장인자 변형체의 발현에 적절한 배지에서 배양하고, 생산된 섬유신경세포 성장인자 변형체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 섬유신경세포 성장인자의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 또한 섬유신경세포 성장인자 변형체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 말초신경장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체를 위한 유전자는 플라스미드 M13mp18(Boeringer Mannheim No. 1013092)의 XbaⅠ와 SaⅠ 제한효소 인지부위를 이용하여 다음과 같이 제작한다:인간 신경세포 성장인자 유전자의 5'-말단 부위의 올리고머와 3'-말단부위의 올리고머를 고체상 포스포아미다이트 화학 합성방법을 이용하여 DNA합성기(Applied Biosystem Inc. 사, Model 381A)로 합성한다. 대한민국 특허출원 94-648호에서 제조된 하기 염기서열을 갖는 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자를 주형으로 하고, 상기에서 합성한 올리고머들을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 인간 섬유신경세포 성장인자 DNA를 얻은 후, 이를 XbaⅠ와 Sa/Ⅰ 제한효소로 동시절단한다.

M13mp18 벡터를 제한효소 XbaⅠ와 Sa/Ⅰ로 절단한 후, 상기 절편을 접합하여 M13mp18-CNTF를 얻고, 이의 한가닥 DNA를 매니아티스의 방법(Maniatis, Molecular Cloning)에 따라 정제하여 돌연변이 방법의 주형으로 사용한다.

다음에는, 인간 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 치환시키기 위해서, DNA합성기(Amersham 사, 미국)로 돌연변이용 올리고머를 합성하고, '스컬프터(Sculptor)' 방법에 따라 돌연변이를 수행한다. 이어서 효모에서 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체를 발현하기 위해서 유비퀴틴 유전자에 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자 서열을 융합시킨다. 즉, 유비퀴틴 서열의 3'-말단으로부터 10개의 염기쌍이 떨어진 곳에 위치한 SacⅡ 제한효소 인지부위를 포함하는 10개 염기와 인간 섬유신경세포 성장인자의 유전자 염기 서열 5'-말단의 18개 염기를 연결한 올리고머와, 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자의 3'-말단의 종료코돈을 포함하는 올리고머를 DNA 합성기로 합성한 후, 이 두 개의 올리고머와 앞에서 제조한 돌연변이된 인간 섬유신경세포 성장인자 DNA를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여, 증폭된 유비퀴틴 유전자의 일부와 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체의 유전자가 연결된 DNA 절편을 얻는다. 이 절편을 제한효소 SacⅡ와 Sa/Ⅰ로 처리하고 잘려진 절편을 올리고머로부터 분리하여 변형된 섬유신경세포 성장인자 유전자 절편을 수득한다.

이어서, 대한민국 특허출원 94-648호에서 제조된 플라스미드 pYLBC A/G UB CNTF를 제한효소 PstⅠ와 Sa/Ⅰ로 절단하여 GapDH의 종료코돈 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 절편을 얻고, 한편으로 상기 벡터를 PstⅠ와 SacⅡ 제한효소로 동시절단하여 ADH2/GapDH 구성 작동 유전자서열 및 유비퀴틴 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 절편을 얻어, 이들 절편과 상기에서 합성한 유전자를 접합(ligation)시킴으로써 섬유신경세포 성장인자 변형체 발현벡터 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser을 제조한다.

제조된 섬유신경세포 성장인자 변형체 발현 벡터 pYLBC A/G Ub CNTF Cys17→Ser은 적당한 숙주 미생물, 예를들면 효모 균주 DCO4를 형질전환시킨다.

이렇게 형질전환된 대장균 균주는, 섬유신경세포 성장인자 변형체의 발현을 위해 적당한 배지, 예를들면 루이신 결핍 효모 배양액을 이용하여 종배양을 하고 YEPD 배지 YEPDU 배지를 이용하여 30℃로 대량배양한다.

상기와 같이 대량으로 얻어진 봉입체 형태의 섬유신경세포 성장인자 변형체를 함유한 미생물, 예를들면 효모 균주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) DOC4(yeast genetic stock center, U. of Califormia, 미국 캘리포니아 버클리)를 원심분리하여 상층액의 배지 성분을 제거한 후, 침전물은 완충 용액에 섞어 비드 비이터로 파쇄한다. 세포 파쇄액은 다시 원심분리하여 상층액을 버리고 섬유신경세포 성장인자 변형체의 봉입체를 침전물로 회수한 후, 1% 트리톤(Triton) X-100을 함유하는 용해 완충용액에 용해시킨다.

이어서, 용해된 섬유신경세포 성장인자 변형체 용액을 QAE-세파로즈 칼럼, 사이징(sizing)컬럼 및 페닐 세파로즈 칼럼을 이용하여 차례로 크로마토그래피하여 정제한다.

이와 같이 얻어진 섬유신경세포 성장인자 변형체는 신경세포 활성화 작용이 있어 말초신경장애의 예상되는 치료 효과가 있으며, 이러한 본 발명의 섬유신경세포 성장인자 변형체는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 약학 조성물로서 말초신경장애의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 섬유신경세포 성장인자 변형체와 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물은 비경구적으로 투여될 수 있으며, 통상적인 부형체, 예를들면 용해보조제, pH 조정제, 현탁화제, 유화제, 안정제, 보존제, 등장화제, 완충제 등과 함께 배합될 수 있으며, 배합은 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명은 섬유신경세포 성장인자 변형체는 총 일일용량을 체중 1kg 당 5 내지 300㎍으로 하여 한번에 또는 수회에 걸쳐 투여할 수 있으며, 특정 환자에 대한 특이 용량 수준은 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설을, 약제혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

아미노 말단으로부터 17번째 시스테인 잔기가 세린잔기로 돌연변이된 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자의 합성.

먼저 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자의 5'-말단 부위의 28량체 올리고머 #1:5'-GGCC TCT AGA ATG GCT TTC ACT GAA CAC-3'와 3'-말단부위의 31량체 올리고머 #2:5'-GCGC GTC GAC TTA CAT CTT CTT GTT GTT AGC-3'를 고체상 포스포아미다이트 화학 합성방법을 이용하는 DNA 합성기(Applied Biosystem Inc. Model 381A)로 합성한 후, OPC(Oligonucleotide Purification Cartridge)를 사용하여 분리, 정제하고, 259nm에서 흡광도를 측정하여 260nm에서 5.0의 OD값을 갖도록 적당량을 취하여 물에 녹였다. 대한민국 특허출원 94-648호에서 제조된 하기 염기서열을 갖는 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자를 주형으로 하고, 상기 올리고머 #1 및 #2를 이용, 중합효소 연쇄반응을 수행하여 인간 섬유신경세포로 성장인자 DNA를 얻었다.

이를 제한효소 XbaⅠ와 Sa/Ⅰ로 동시 절단하고 정제한 다음, M13mp18벡터를 제한효소 XbaⅠ와 Sa/Ⅰ로 절단하여 얻은 절편과 접합하여 벡터 M13mp18-CNTF를 얻었다.

M13mp18-CNTF벡터의 한가닥 DNA를 매니아티스의 방법(Maniatis, Molecular Cloning)에 따라 정제한 후, 이를 1㎍/㎕가 되도록 농도를 맞춘 후 돌연변이 공정에 주형으로 사용하였다.

다음으로, 인간 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 돌연변이시키기 위해서 DNA 합성기로 올리고머 #3:3'-CCT AGC CAA CCA GAT AGA TCT GGA AGA CAA GTC TCT TCT GTG TGG-3'을 합성하고, 'Sculptor'방법(Amersham 사, 미국)에 따라 돌연변이를 수행한 후, 염기 서열 분석에 의해 돌연변이된 것을 확인하였다.

이어서, 효모에서 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체를 발현시키기 위해 다음과 같이 유비퀴틴 유전자 서열 다음에 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자 서열을 연결시켰다. 먼저, SacⅡ 인지부위를 포함하는 10개 염기와 인간 섬유신경세포 성장인자의 유전자 염기 서열 5'-말단의 18개 염기를 연결한 32량체 올리고머 #4:5'GAGC CCG CGG TGGT ATG GCT TTC ACT GAA CAC-3'와 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자의 3'-말단의 종료 코돈을 포함하는 31량체 올리고머 #5:5'GCGC GTC GAC TTA CAT CTT CTT GTT GTT AGC-3'를 DNA 합성기로 합성한 후, 순수 정제하여 260nm에서의 OD값이 5.0이 되도록 물에 녹였다. 그런다음, 앞에서 제조한 돌연변이된 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체의 DNA를 주형으로 하고 올리고머 #4 및 #5를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭된 유비퀴틴 유전자의 일부와 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체의 유전자가 연결된 DNA 절편을 얻었다. 이를 통상적인 페놀 클로로포름 방법으로 정제한 후, 제한효소 SacⅡ와 Sa/Ⅰ로 처리하고 절단된 절편을 올리고머로부터 분리하여 최종 올리고뉴클레오티드 절편을 20㎖ TE(100mM 트리스, 1mM EDTA)에 녹여 다음 과정에 이용하였다.

[실시예 2]

인간 섬유신경세포 성장인자 변형체의 효모에서의 발현벡터제조.

대한민국 특허출원 94-648호에서 제조된 플라스미드 pYLBC A/G UB CNTF를 제한효소 PstⅠ와 Sa/Ⅰ로 절단하고 전기영동을 통한 통상의 정제방법을 사용하여 GapDH의 종료코돈 서열을 포함하는 9750 염기쌍의 올리고뉴클레오티드 절편을 얻고, 한편으로는 동일한 벡터를 PstⅠ와 SacⅡ 제한효소로 동시절단하여 ADH2/GapDH 구성 작동 유전자 서열 및 유비퀴틴 서열을 포함하는 4620 염기쌍의 올리고뉴클레오티드 절편을 얻었다. 실시예 1에서 정제된 시스테인이 세린으로 돌연변이되고 SacⅡ와 Sa/Ⅰ 제한효소 인지부위를 포함하는 인간 섬유신경세포 성장인자 유전자와의 이들 절편을 각각 동일한 몰비로 10배 농도의 1㎕ 접합완충액(0.6M 트리스, pH 7.5, 10mM DTT, 0.1M MgCl₂), 1㎕의 10mM ATP, 1단위의 T4 DNA 라이게이즈(N.E.B.)에 넣은 다음 물을 10㎕가 되도록 가하고 14℃에서 밤새 반응시켰다. 이 접합 반응액을 이 콜리(E. coli) HB101(ATCC 33694) 컴피턴트 세포에 첨가하여 하나한의 방법(Hanahan, J. Mol. Biol., 116, 557(83))에 따라 형질전환시킨 후, 앰피실린 평판상에서 선별하고 선별한 클론의 플라스미드를 추출하여 제한효소 및 염기서열 분석에 의해 섬유신경세포 성장인자 변형체 유전자를 함유하는 벡터 pYBC A/G UB DNTF Cys→Ser이 제조된 것을 확인하였다. 제1도는 인간 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 아미노산인 시스테인을 세린으로 돌연변이시키는 과정 및 인간 섬유신경세포 성장인자를 유비퀴틴과 융합시켜 효모에서 발현시키기 위한 벡터의 제작 과정을 도시한 것이다.

[실시예 3]

섬유신경세포 성장인자 변형체 발현 벡터에 의한 효모 균주의 형질전환.

효모균주 사카로마이세스 세레비지애 DCO4(yeast genetic stock center, U. of California, 미국 캘리포니아 버클리)를 한넨(Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 79, 1929(1978))의 방법에 따라 뮤레이네이즈(U.S.B.사, 미국)를 이용해 스페로플라스트로 만든 후, 실시예 2에서 제조한 발현벡터 pYBC A/G UB CNTF Cys→Ser로 형질전환시키고 루이신 결핍 아가 플레이트(아미노산 결핍 효모질소 기질 6.7g, 솔비톨 182g, 2% 글루코즈, 0.25% 루이신 보충제, 20% 박토아가)에 도포하여 30℃에서 3내지 5일간 배양하고 상기벡터로 형질전환된 균체를 선별하였다. 상기 발현 벡터를 함유하는 균주 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae)pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소의 유전자 은행에 1995년 11월 3일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8697P).

발현벡터 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser로 형질전환된 효모 세포를 10㎖의 YEPD 배양액(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코즈)에 접종하여 30℃에서 3일간 배양하였다. 배양액 1㎖를 원심분리하여 세포를 침전시킨 후 500㎕의 완충용액(10mM 트리스-Cl, pH 7.5, 1mM PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드), 8M 우레아)에 현탁시키고, 직경 0.4mM의 유리 비드 500㎕를 첨가하여 비드 비터로 5분 동안 진탄시켜 세포를 파괴하고 효모 추출물을 얻었다. 여기서 2배 농도의 람리시료 완충용액(Lammli, D.K., Nature, 227, 680(1970))을 가하고 100℃에서 3분간 끓인 후 15% 변성 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동하여 그 결과를 제2도에서 도시하였다. 제2도는 효모에서 발현된 인간 섬유신경세포 성장인자 변형체(Cys17→Ser17)를 포함한 효모 분쇄액을 변형 폴리아크릴아마이드 젤(SDS-PAGE)상에서 전기영동한 결과로서, 여기에서 제1레인은 형질전환되지 않은 효모 분쇄액이고, 제2레인은 표준 단백질 분자량 표지이며, 제3레인은 본 발명에 따른 벡터 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser로 형질전환된 효모 분쇄액이며, 제4레인은 벡터 pYLBC A/G UB CNTF에 의해 효모로부터 발현되어 정제된 형태의 CNTF이다. 여기에서 보듯이, 본 발명에 따라 제작된 벡터 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser는 효모에서 CNTF와 거의 동일한 분자량을 갖는 CNTF 변형체를 발현시킴을 알 수 있다.

[실시예 4]

섬유신경세포 성장인자 변형체 발현벡터 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser로 형질전환된 효모 균주의 배양 및 섬유신경세포 성장인자 변형체의 정제.

[단계 1]

[효모 세포 배양]

먼저 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 hCNTF 유전자를 포함한 효모 사카로마이세스 세레비지애 DCO4 세포(ADH/GAP 프로모터에 유비퀴틴과 융합되어 있는 형태로 발현됨)를 플레이트에서 긁어내어 루이신 결핍 효모 배양액(아데닌, 유리딘, 트립토판, 히스티딘, 아르지닌, 메티오닌, 타이로신, 라이신, 페닐알라닌을 각각 ℓ당 0.1 내지 0.2g, 아미노산 결핍 효모 질소 염기, 숙신산 및 염화나트륨을 각각 ℓ당 2.672g, 10g 및 1g, 그리고 1% 글루코즈를 함유) 50㎖에서 24시간 동안 30℃로 OD값이 2 내지 3이 될 때까지 배양하였다.

상기 배양액 5㎖를 YEPD 배지(효모 추출액, 펩톤 및 글로코즈를 각각 1%, 2% 및 8% 함유) 100㎖에 옮기고 15시간 동안 글루코즈 함량이 2% 정도로 될 때까지 30℃에서 배양한 다음, 배양액 50㎖을 YEPDU 배지(YEP 배지에 2% 클루코즈, 0.1% 우라실을 첨가한 배지) 1ℓ에 옮겨 배양하였다. 이 배양액을 30℃에서 48 내지 72시간 동안 배양한 다음 5,000rpm으로 10분 동안 고속원심분리하여 배양액은 버리고 침전물로서 봉입체 형태의 섬유신경세포 성장인자 변형체를 함유하는 효모 세포만을 얻었다.

[단계 2]

[세포 파쇄 및 봉입체 획득]

단계 1에서 배양하여 얻은 효모 세포 30g을 200㎖의 파쇄 완충용액(트리스 50mM, EDTA 1mM/DTT 1mM/PMSF 1mM, Ph 8.0)으로 완전히 녹인 후 비드비이터(효모세포 파쇄기)에 넣었다. 여기에 유리비드 150㎖를 가한 다음 5분씩 3번, 10분 간격으로 얼음을 계속 채워주면서 4℃에서 파쇄하였다. 이하 모든 과정은 4℃에서 수행하였다.

상기 세포 파쇄액을 와트만 여과종이로 여과한 뒤 비드에 묻어있는 파쇄액을 100㎖의 파쇄 완충용액으로 씻어 주었다. 여기에 200㎖의 파쇄 완충용액을 첨가하여 총 500㎖의 세포파쇄액을 만든 다음, 11,000rpm으로 25분 동안 고속원심분리하여 상충액과 침전물을 분리하였다. 상충액을 버린 후 침전물에 세척용액(트리스 200mM, 염화나트륨 150mM, pH8.0)을 가하고 잘 녹인 후 1분씩 3번, 1분 간격으로 초음파 처리하여 완전히 부유상태(suspension)로 만들었다. 이 부유용액을 11,000rpm에서 25분동안 고속원심분리한 다음 상층액은 버리고 침전물에 300㎖의 세척용액을 가하고 초음파 분해-고속원심분리 과정을 반복하여 침전물로서 봉입체를 얻었다.

[단계 3]

[섬유신경세포 성장인자 변형체 봉입체의 용해]

상기 단계 2에서 최종적으로 얻은 침전물에 1% 트리톤 X-100을 함유하는 용해 완충용액(200mM 트리스/1mM EDTA/1mM DTT/1% 트리톤 X-100)300㎖를 가하고 1분씩 3번, 1분 간격으로 초음파 처리하여 완전히 용해시켰다. 여기에 용해 완충용액 200㎖를 더 첨가하여 총 부피를 500㎖로 만든 뒤, 11,000rpm에서 25분간 원심분리하여 상층액을 취하였다.

[단계 4]

[QAE-세파로즈 칼럼 크로마토그래피]

단계 3에서 얻은 상층액 500㎖를 미리, Q 완충용액(트리스 20mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, pH8)으로 평형화된 QAE 세파로즈 칼럼(2.5X20cm=100㎖)에 시간당 100㎖의 유속으로 충적(loading)시켰다. 1ℓ의 Q완충용액으로 OD값이 거의 0이 될 때까지 QAE수지를 씻어준 뒤, 0M에서부터 1M NaCl까지의 선형구배로 총 1ℓ의 Q완충용액을 걸어주었다. QAE수지로부터 떨어져 나온 단백질 용액 10㎖의 분획을 전기영동(SDS-PAGE)하고 hCNTF 돌연변이체가 나온 분획물을 모았다. 모아진 약 150㎖의 분획물을 아미콘(YM10 필터)으로 5㎖까지 농축하였다. 제3도는 재조합 효모로부터 정제된 인간 섬유신경 성장인자(rhCNTF) 및 Ser17 변형체의 산화성 차이를 비환원성 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 여기에서 A 레인 10㎍의 천연형 rhCNTF이고, B레인은 10㎍의 rhCNTF Ser17변형체이며, M은 표준 단백질 분자량 표지를 가리키는데, A레인에서 화살표는 Cys 잔기의 산화 과정을 통해 형성된 rhCNTF의 이중체를 나타낸다. 여기에서 변형체 rhCNTF는 이중체를 형성하지 않음을 알 수 있다.

[단계 5]

[사이징(sizing) 칼럼 크로마토그래피]

단계 4에서 얻은 농충액을, 미리 Q완충용액으로 평형화시킨 사이징(sizing) 칼럼(상품명 S-100, Pharmacia사)에 충적시켰다. 사이징 칼럼은 직경 2.5cm, 높이 100cm, 용적 500㎖의 것을 사용하였으며, 각 분획당 6㎖씩 100개의 튜브로 받았다. 이 분획물 각각을 전기영동한 뒤, Ser17 rhCNTF 돌연변이체가 나온 분획들을 모아 이중체 형성여부를 조사하였다. 제4도는 rhCNTF Ser17 변형체의 이중체 형성 여부를 알아보기 위해 토끼의 rhCNTF에 대한 다클론성 항체를 이용하여, 사이징 칼럼에서의 각 분획을 웨스턴-블럿팅한 결과로, A레인은 산화되어 다이설파이드 결합으로 된, 이중체 rhCNTF분획이고, B레인은 단일체 rhCNTF분획이며, M은 표준 단백질 분자량 표지이다. 여기에서 이중체 rhCNTF분획은 천연형 rhCNTF으로부터 형성된 것이다.

[단계 6]

[패닐 세파로즈 칼럼 크로마토그래피]

사이진 칼럼을 거쳐 나온 Ser17 rhCNTF 돌연변이체 용액을 완전히 순수하게 정제하기 위하여, 미리 P 완충용액(Q 완충용액+1M 염화나트륨)으로 평형화시킨 페닐 세파로즈 칼럼(2.5cm×6cm-30㎖)에 충적시켰다. P 완충용액으로OD 값이 0이 될 때까지 페닐 수지를 씻어준 뒤, 염화나트륨을 함유하지 않은 Q 완충용액으로 용출시킨 다음, Q 완충용액으로 용출되지 않는 것들은 순수한 물만으로 용출시켰다. 이때 각 분획에는 미리 10배 농도의 Q 완충용액 500㎖씩을 가하고 5㎖씩 용출액을 받았다. 전기영동으로 hCNTF의 양과 순도를 확인한 뒤, 완전히 순수한 hCNTF 돌연변이체 분획들만을 모았다. 이후의 실험 및 분석을 위해 순수 정제된 hCNTF 돌연변이체 용액에 글리세롤이 40%되게 넣어준 뒤, 영하 20℃에서 보관하였다.

[참조예 1]

[rhCNTF의 활성도 측정]

[단계 1]

[DRG(dorsal root ganglion, 배근신경절) 신경세포 분리 및 배양]

해부 현미경하에서 발생 11일째인 닭(오골계)의 수정란으로부터 DRG를 무균상태로 끄집어 내어 칼슘 및 마그네슘이 결핍된 HBSS(Gibco #310-4180 0.7%, 중탄산나트륨 0.035% 첨가)에 넣었다. 여기에 트립신을 0.09% 농도로 37℃ 수용중에서 30분간 처리한 후, 5% 말 혈청을 함유한 MEM(Gibco #12800-017)(Eagle's) 배지(2mM 글루타민 첨가)를 첨가하여 트립신을 억제하고 100xg에서 5분간 원심분리하여 침전된 세포만을 동일한 MEM 배지에 넣었다. 그런 다음 끝을 불로광택을 낸 파스테르 파이펫을 사용하여 7 내지 8회 천천히 스트로킹하여 세포집단을 낱개의 세포단위로 잘게 부순 뒤, 100rpm에서 10초 동안 원심분리하여 상층부위의 날개의 세포들만을 따로 모아 코팅이 되지 않는 페트리 디쉬에 옮겨 37℃, 5% CO₂배양기내에서 3.5시간 보관하였다. 이 과정에서 디쉬 표면에 붙은 섬유아세포(fibroblast, 쉬반(Schwann) 세포)를 제거하고 붙지 않은 신경세포만을 모아서 폴리-L-라이신으로 코팅된 24-웰 플레이트 상에 웰당 20,000개씩 500㎖의 동일한 MEM 배지에서 평판배양하여 5% CO₂배양기에 넣었다.

[단계 2]

[rhCNTF의 처리 및 활성 측정]

rhCNTF는 신경세포를 배양 디쉬에 도포한 후 0.1 내지 100ng/㎖의 농도구간에서 3회(30분간, 15시간 및 30시간후) 처리하고, 최종처리후 15시간 뒤에 5% 포름알데하이드 용액으로 세포를 고정하여 신경돌기를 뻗은 세포의 수를 현미경상에서 세어 활성도를 측정하였다.

제5도 및 제6도는 재조합 효모로부터 분리 정제된 rhCNTF 및 rhCNTF Ser17 변형체의 활성측정 결과를 나타낸 것이다. 제5도는 rhCNTF의 처리농도에 따른 닭의 DRG 신경 세포에서의 활성도를 측정한 것으로, 신겨 세포체와 신경 돌기의 길이의 비에 따라 A; 1:5 이하, B; 1:5에서 1:10 사이, C; 1:10 이상의 3분류로 나누어 측정하였으며, 제6도는 재조합 효모로부터 분리 정제된 rhCNTF 및 rhCNTF Ser17 변형체의 활성도를 측정한 것으로, 제6도(a)는 rhCNTF를 처리하지 않은 경우, 제6도(b )는 rhCNTF로 처리한 경우, 그리고 rhCNTF Ser17 변형체로 처리한 경우이다. 여기에서 첫 번째 막대는 신경 세포체와 신경 돌기의 길이의 비가 1:5 이하인 경우, 두 번째 막대는 상기 비가 1:5에서 1:10 사이인 경우, 그리고 세 번째 막대는 상기 비가 1:10 이상인 경우를 나타낸 것이다. 제5도 및 제6도에서 보듯이 rhCNTF 및 변형체는 그 농도에 비례하여 신경세포 활성화 효과가 있으며, 특히 rhCNTF 변형체는 천연형의 rhCNTF보다 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 공지된 천연형 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 위치의 시스테인 잔기를 세린 잔기로 치환시킨 섬유신경세포 성장인자 변형체 유전자를 함유하는 벡터로 효모 균주를 형질전환시키고, 이를 배양하여 생산된 섬유신경세포 성장인자 변형체를 정제함으로써 안정되고 생물학적 활성이 높은 섬유신경세포 성장인자 변형체가 제조되며, 제조된 섬유신경세포 성장인자 변형체는 말초신경장애의 예방 또는 치료 효과를 가짐을 알 수 있다.

Claims

천연형 섬유신경세포 성장인자의 아미노 말단으로부터 17번째 위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 섬유신경세포 성장인자 변형체.
제1항의 섬유신경세포 성장인자 변형체를 코드하는 유전자.
제2항의 섬유신경세포 성장인자 변형체를 코드하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
제3항에 있어서, 플라스미드 pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser.
제3항의 발현 벡터로 형질전환된 효모.
제5항에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae pYLBC A/G UB CNTF Cys17→Ser(KCTC 8697P).
제5항 또는 제6항의 미생물을 섬유신경세포 성장인자 변형체의 발현에 적절한 배지에서 배양하고, 생산된 섬유신경세포 성장인자 변형체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 섬유신경세포 성장인자의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 배양물에 포함된 세포를 파쇄하여 섬유신경세포 성장인자 변형체 봉입체를 수득하고, 상기 봉입체의 용액을 QAE-세파로즈 칼럼, 사이징 칼럼 및 페닐 세파로즈 칼럼을 이용하여 차례로 크로마토그래피하여 섬유신경세포 성장인자 변형체를 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 섬유신경세포 성장인자 변형체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 말초신경장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.