KR100235367B1 - 메로시아닌 단백오차 지시제를 함유하는 시험 스트립을 사용한 단백질 검출방법 - Google Patents

메로시아닌 단백오차 지시제를 함유하는 시험 스트립을 사용한 단백질 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메로시아닌 단백오차 지시제 화합물을 제공한다. 메로시아닌 화합물은 신규한 부류의 단백오차 지시제이며 샘플 중의 단백질을 검출하는데 유용한 분석적 수단을 제공한다.

Description

메로시아닌 단백오차 지시제를 함유하는 시험 스트립을 사용한 단백질 검출방법{Method for the detection of protein using a test strip containing merocyanine protein error indicators}
본 발명은 일반적으로 단백질 검출에 관한 것이고, 보다 상세하게는 신규한 단백오차 지시제 부류에 관한 것이다.
단백질 검출은 질병의 진단, 의학 연구 및 산업에서 중요하다. 샘플 중의 단백질을 검출하기 위한 여러가지 방법이 있다. 단백오차 지시제를 사용하는 방법을 제외한 모든 단백질 검출 방법은 종종 대단히 복잡한 장비와 완료시까지 수시간을 필요로 하는 다단계 방법이다.
샘플 중의 단백질을 측정하기 위해 사용되는 한가지 일반적인 방법은 뷰렛 방법(Biuret method)이다. 이 방법에 따르면, 먼저 샘플을 산성화시켜 샘플 중에 존재하는 임의의 단백질을 침전시킨다. 이어서, 침전시킨 단백질을 적절한 알칼리성 매질 중에서 재용해시키고 구리 이온을 함유하는 용액으로 처리한다. 단백질의 펩타이드 결합과 구리 이온이 반응하여 착색된 킬레이트를 형성한다. 이어서, 처리된 용액의 흡광도를 분광광도계를 사용하여 측정한다. 이 데이터로부터, 보정한 분광 분석 흡광곡선을 사용하여 샘플 중의 단백질 양을 계산한다. 이 방법은 일반적으로 완료시까지 1 내지 3시간이 소요된다.
뷰렛 방법을 변형시킨 것이 라우리 방법(Lowry method)이다. 이 라우리 방법에 따르면, 침전시킨 단백질을 재용해시킨 후, 알칼리 조건하에 이 용액에 포스포텅스토몰리브드산 시약을 가하여 용액 중의 모든 페놀 화합물을 산화시킨다. 실질적으로 거의 모든 단백질이 약간의 페놀 화합물(예를 들어, 티로신)을 함유하는 한 이 방법으로 샘플 중의 단백질을 측정할 수 있다. 이어서, 처리된 용액의 흡광도를 분광광도계로 측정한다. 보정한 분광 분석 곡선을 사용하여 측정한 흡광도를 샘플 중의 단백질의 양을 측정하는 데 사용한다. 그러나, 다수의 완충액 및 다른 화합물이 아민 그룹, 예를 들어, 트리스(TRIS), 글리신 및 아미드 완충액을 함유하기 때문에 이 시험을 방해한다.
샘플 중의 단백질의 존재를 측정하는 다른 방법은 샘플을 산성화시킨 후 혼탁도를 측정하는 것이다. 이 방법에 따르면, 샘플의 혼탁도는 단백질 침전제, 일반적으로 산성화제를 샘플에 가한 후 분광광도계를 사용하여 측정한다. 샘플의 계산된 혼탁도를 분광광도계로 측정한 표준 곡선과 비교하여 샘플 중의 단백질의 존재를 측정한다. 이 방법에 사용되는 일반적인 침전제로는 설포살리실산, 트리클로로아세트산 및 탄닌산이 포함된다.
단백오차 지시제를 사용하는 방법론은 샘플 중의 단백질의 존재를 측정하는데 광범위하게 사용된다. 단백오차 지시제를 사용하는 방법은 저렴하고, 신속, 간단하며 편리하다. 페놀설폰프탈레인 화합물(예: 브로모페놀 블루, 브로모크레졸 그린 및 쿠마시 블루)이 아마도 가장 광범위하게 사용되는 단백오차 지시제이다. 종종 단백오차 지시제를 사용하는 방법론은 단백오차 지시제로 함침된 시약 스트립을 포함한다. 이 방법에 따르면, 시약 시험 스트립을 소량의 샘플과 접촉시킨다. 만일 단백질이 샘플 중에 존재한다면 스트립이 단순히 색상이 변화되어 단백질의 존재를 나타낸다. 관찰되는 색은 샘플 중의 단백질 농도에 따라 다양할 수 있다. 이러한 다양한 색상 변화는 샘플 중의 단백질을 정량하는데 사용된다. 상기 타입의 시약 스트립은 정확하게 사용하는데 최소의 트레이닝을 필요로 한다. 이러한 시약 시험 스트립은 단백질 즉석측정용으로 정확하고 편리하며 신속한 비히클을 제공한다. 상기와 같은 시험지는 산업, 연구 및 임상실험 분야의 기술자들에 의해 광범위하게 사용된다.
보다 상세하게, 단백오차 지시제는 단백질의 존재에 의해 대체되는 pKa 값을 갖는 이온화 가능 그룹을 포함하는 pH 지시제이다. 페놀설폰프탈레인의 경우, 이온화 가능 그룹은 페놀계 하이드록실이다. 페놀계 하이드록실로부터 양성자의 방출은 관찰가능한 색상 변화를 유발시키며, 이러한 색상 변화는 시험되는 샘플 중의 단백질을 지시한다. 일반적으로 샘플 중의 단백질의 분석적 측정에 유용한 것으로 간주되는 단백오차 지시제는 미합중국 특허 제4,013,416호에 기재되어 있다.
본 발명은 메로시아닌 단백오차 지시제를 제공한다. 메로시아닌 단백오차 지시제는 신규한 부류의 단백오차 지시제이다. 본 발명 이전까지, 메로시아닌 염료는 단백오차 지시제로서 공지된 바 없다. 메로시아닌 단백오차 지시제는 단백질의 검출에 유용하다. 본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제는 화학식 1로 나타낼 수 있다:
위의 화학식 1에서,
Q는 -Cl, -Br 또는 -I이고,
m은 1 내지 6의 정수이며,
R은 S, Se, O 또는 C(CnH2n+1)2(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이다)이고,
T는 -SO3 또는 -H이다.
본 발명의 한 양태에서, m은 3 또는 4이고, R은 C(CH3)2이며 T는 -SO3 이다.
본 발명의 다른 중요한 측면은 액체 샘플 중의 단백질 검출을 위한 메로시아닌 단백오차 지시제를 포함한 분석용 시약 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 액체 샘플 중의 단백질 검출 방법에 관한 것이다. 이 방법은 분석용 시약 스트립을 액체 샘플로 적시는 단계를 포함한다. 이 시험 스트립은 적어도 하나의 상기 기술한 메로시아닌 단백오차 지시제로 함침된 흡수성 담체로 구성되어 있다. 이어서 시험 스트립을 관찰하여 색상 변화를 검출한다. 색상 변화는 액체 샘플 중의 단백질을 지시한다.
도 1 내지 도 6은 메로시아닌 단백오차 지시제 합성 방법의 모식도이다.
도 7은 pH 2.5에서 0.3mM SPDIB(1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인)으로 함침시킨 분석용 시험 스트립의 알부민에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다.
본 발명은 단백오차 지시제로서 유용한 신규한 부류의 화합물의 발견에 관한 것이다. 본 발명의 한 측면에 따르면, 본 발명의 메로시아닌 화합물은 단백질과 반응하여 메로시아닌 화합물에서 관찰가능한 색상 변화를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, 액체 중의 단백질 검출을 위한 분석용 시약 스트립은 흡수성 페이퍼 시험 스트립을 본 발명의 신규한 단백오차 지시제로 함침시켜 수득할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명의 신규한 단백오차 지시제는 수성 액체 분석에 유용한 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실은 선행 기술의 단백오차 지시제, 예를 들어, 브로모페놀 블루가 시험되어야 할 샘플 중의 단백질과 불리하게 반응할 수 있는 유기 용매를 필요로 한다는 점에 비해 특히 유리한 것이다. 본 발명의 단백오차 지시제는 pKa 값이 3.5 이상이다. 이는 본 발명의 지시제를 포함하는 액체 또는 침지용 스틱형(dip-stick) 시약을 제조하는데 다양한 완충액이 사용될 수 있기 때문에 유리하다.
하기 기술하는 신규한 단백오차 지시제는 오렌지색이며, 단백질을 함유하는 샘플과 접촉함에 따라 점차 진한 핑크색을 낸다. 색깔의 농도는 샘플 중의 단백질의 농도를 반영하는 것이다. 생성되는 핑크색은 음성 시험의 오렌지색과는 뚜렷이 구분된다. 본 발명의 단백오차 지시제는 양성적으로 샘플 중의 단백질 범위가 약 15 내지 약 500mg/dl인 것을 검출한다.
오렌지색에서 핑크색으로의 관찰가능한 색상 변화를 참조하여, 본 발명에 따라 제조한 시험 스트립은, 음성 시험의 오렌지색과는 뚜렷하게 구별되는, 단백질 존재하에 상이하고 분명한 색을 생성시킴으로써, 생물학적 체액 중의 단백질의 검출을 위한 진단도구가 된다. 이같은 점은 알부민 존재하에 한가지 색조에서 다른 색조로 약간 변화되는(예를 들어, 황색에서 황록색으로 변화) 다른 시험 스트립과는 구별되는 것이다. 음성 시험에 대한 오렌지색과 양성 시험에서의 핑크색의 특성은 액체 샘플 중의 단백질을 검출하기 위해 사용한 선행 방법 및 선행 지시제와는 구별되는 현저한 발전으로 보인다. 보다 상세하게는, 본 발명은 임상학자들에게 샘플 중의 단백질의 검출을 위한 신뢰성 있는 방법을 제공한다. 오렌지색에서부터 핑크색으로의 변화는 결과의 해석을 단순화시켜 준다. 이것은 그릇된 판단의 소지를 줄여주며, 이에 따라 사용자가 비용을 절감하게 한다.
본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제는 화학식 1의 화합물이다:
화학식 1
위의 화학식 1에서,
Q는 -Cl, -Br 또는 -I이고,
m은 1 내지 6의 정수이며,
R은 S, O, Se 또는 C(CnH2n+1)2(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이다)이고,
T는 -SO3 또는 -H이다.
보다 바람직하게는, Q는 -Br 또는 -I이고, m은 2 내지 4의 정수이며, R은 C(CH3)2이고 T는 -SO3 이다. 가장 바람직하게는, Q는 -I이고, m은 3이다.
본 발명은 발색제의 메로시아닌 부류의 단백오차 지시제로서의 제1 용도를 기술하고 있으므로, 다양한 치환된 유도체를 포괄한다는 것을 명심해야 한다. 상기 일반식에서의 방향족 환은 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않고 다양한 치환체 그룹을 지닐 수 있음은 자명한 것이다. 이러한 치환체 그룹은 본 발명의 단백오차 지시제 특성을 갖는 안정한 화합물을 제조하고자 하는 당해 분야에서 통상의 기술을 가진 자의 능력에 의해서만 제한될 수가 있으며, 여기에는 치환되지 않거나 치환된 알킬, 치환되지 않거나 치환된 아릴, 알콕시, 아릴옥시, 할로(예: 플루오로, 클로로, 브로모), 니트로 및 치환된 아미노 그룹(예: 디알킬아미노)이 포함된다.
본 발명의 내용에서, '알킬'은 일반식 -CnH2n+1의 치환되지 않은 탄화수소 잔기의 직쇄 및 측쇄 형태, 바람직하게는 n이 6 이하인 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 3급-부틸, n-헥실 등과 '저급 알킬' 지방족 형태 및 이의 치환된 형태를 포함한다.
또한, 본 발명의 내용에서 '아릴'은 수소원자를 제거하여 방향족 탄화수소 환 또는 환 시스템으로부터 유래된 유기 잔기를 포함하며, 페닐 및 나프틸과 같은 치환되지 않은 탄화수소 환 잔기 및 이의 치환된 형태를 포함한다. 본 발명의 목적상 아릴 잔기에는 당해 분야의 숙련가에 의해 본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제를 제공하도록 선택될 수 있는 하나 이상의 동일하거나 상이한 작용성 그룹 또는 치환체를 함유하는 것들이 포함된다.
보다 상세하게는, '아릴' 및 '알킬'이 치환되는 경우, 이러한 치환은 실질적으로 본 발명 화합물의 유용한 특성을 손상시키지 않는 작용성 그룹에 의해 일치환되거나 다치환되는 상기의 그룹 또는 치환체를 포함한다. 이러한 작용성 그룹에는 합성적으로 도입될 수 있으며 본 발명의 안정하고 유용한 메로시아닌 단백오차 지시제 화합물을 제공하는 화학적 그룹이 포함된다. 이러한 작용성 그룹의 비제한적 예로는 할로(예: 플루오로, 클로로, 브로모), 치환된 아미노(예: 디알킬아미노), 니트로, 알콕시, 아릴옥시, 알킬 및 아릴이 있다.
본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제의 예로는 1-(ω-설포프로필)-2-(4'하이드록시-3',5'-디브로모스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인; 1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-벤조티아졸륨 베타인; 1-(ω-설포에틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인; 1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인; 1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인 및 1-(n-부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 요오다이드가 있다. 상기 나열한 메로시아닌 단백오차 지시제의 제조를 위한 상세한 내용은 다음의 실시예에 나타낸다.
도 1 내지 도 6은 일반적으로 본 발명의 각종 메로시아닌 단백질 지시제 화합물의 합성을 나타낸다. 이러한 화학적 방법은 간단한 것이며 일반적으로 염기성 반응 조건하에서 방향족 하이드록시알데히드와 헤테로사이클릭 4급 염을 커플링시킴을 포함한다. 본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제는 수용성이다. 이같은 점은 이들 지시제가, 예를 들어, 소변, 혈액, 혈청, 수성 겔(전기영동용 겔), 수성용액과 같은, 단백질을 검출하기 위한 수성 시스템에 바로 가할 수 있기 때문에 유리하다. 메로시아닌 단백오차 지시제 제조에 사용되는 일반적인 방법은 도 1 내지 도 6에 나타내었으며 하기 실시예에서 상세히 논의된다.
본 발명의 한가지 측면은, 상기 기술한 메로시아닌 단백오차 지시제 화합물의 하나로 함침된 흡수성 담체를 포함하는, 액체 샘플 또는 겔 중의 단백질 검출용 분석 시험 스트립에 관한 것이다. 시험 스트립의 흡수성 담체는 바람직하게는 여과지이다. 흡수성 담체로서 유용한 다른 물질로는 펠트, 다공성 세라믹 스트립 및 미국 특허 제3,846,247호에 기재되어 있는 직포 또는 매트형 유리 섬유가 포함된다. 또한 제안될 수 있는 것으로는 목재, 옷감, 스펀지 물질 및 미국 특허 제3,552,928호에 기재되어 있는 점토물질이다. 또는, 흡수성 담체는 다양한 중합체 필름, 유리 등과 같은 비다공성 물질일 수도 있다. 이들 모든 흡수성 담체 물질들은 다른 것과 마찬가지로 본 발명에 사용하기에 적합하다. 그러나, 여과지가 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.
흡수성 스트립은 바람직하게는 완충액에 함침시킨다. 약 1.5 내지 약 4.5의 pH로 조정될 수 있는 임의의 완충액 시스템이 본 발명의 실제 적용시 유용하다. 바람직하게는, 완충액 시스템은 pH 약 2.0 내지 약 4.0으로, 가장 바람직하게는 pH약 3.5로 조정한다. 본 발명에 따라, 분석용 시험 스트립을 액체 샘플 또는 겔 샘플과 접촉시킨다. 이어서, 스트립의 색상 변화를 관찰한다. 색상 변화는 샘플 중의 단백질을 지시한다.
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태 및 유용성을 기술하기 위한 것이며 본원에 첨부한 청구범위내에서 달리 언급하지 않는 한 본 발명을 제한하지는 않는다.
실시예 1
1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디브로모스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인
EtOH(30ml) 중의 3,5-디브로모-4-하이드록시벤즈알데히드(2.0g, 7.14mmol)[미국 뉴 햄프셔주 윈드햄 소재의 랭카스터 신테시스, 리미티드(Lancaster Synthesis, Ltd.)제조], 1-(ω-설포프로필)-2,3,3-트리메틸인돌레니늄 베타인(2.0g, 7.11mmol)[참조: Belg. 726,639; CA 73: P82538a] 및 피페리딘(0.4ml)의 용액을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 50분 동안 환류시키고 빙욕 중에서 냉각시킨다. 반응 혼합물을 진공 중에서 무수물로 증발시키고 최소량의 메탄올(MeOH)에 용해시킨다. 이어서, 용액을 MeOH/CHCl3(1:4 v/v) 전개액을 사용하여 실리카 겔(600g)상에서 크로마토그래피한다. 주된 자주색 생성물 밴드를 함유하는 분획을 모으고 2-프로판올(i-PrOH) 중에서 과량의 HCl로 산성화시켜 자주색에서 황금색으로의 색상 변화를 생성시킨다. 진공 중에서 용액을 무수물로 증발시킨다. 잔사를 뜨거운 EtOH(약 25ml)에 용해시키고 냉각시켜 결정화한다. 분리된 고형물을 여과하여 수거하고 빙냉시킨 EtOH/헥산(3:1 v/v)으로 세척하며 진공 건조시켜 분석적으로 순수한 화합물 1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디브로모스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인(0.96g, 25%)을 황금색 결정으로서 수득한다. 당해 화합물은 일정한 융점이 없으며 200℃ 이상의 온도에서는 색깔이 짙어진다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 제1도로 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과 같다.
C21H21Br2NO4S½EtOH에 대한 원소분석
계산치: C, 46.65; H, 4.27; N, 2.47
실측치: C, 46.48; H, 4.50; N, 2.33.
실시예 2
1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-벤조티아졸륨 베타인
EtOH(30ml) 중의 3,5-디요오도-4-하이드록시벤즈알데히드(3.74g, 10mmol)(미국 뉴 햄프셔주 윈드햄 소재의 랭카스터 신테시스, 리미티드 제조), 3-(ω-설포부틸)-2-메틸벤조티아졸륨 베타인(3.71g, 13mmol)[참조: Brit. 742, 112; CA 50: P11149c] 및 피페리딘(0.8ml)의 혼합물을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 1시간 동안 환류시킨 후 주변 온도까지 냉각시킨다. 반응 혼합물을 i-PrOH 중의 충분량의 1.93M 염산을 가하여 자주색에서 황색으로의 색상 변화를 일으키도록 하고 이렇게 하여 용액으로부터 고형물을 분리시킨다. 여과하여 고형물을 수거하고, EtOH로 세척한 다음, 건조시킨다. 이어서, 고형물을 2M 수성 수산화나트륨(5.2ml)을 함유하는 따뜻한(55℃) EtOH/MeOH/H2O(3:2:1 v/v/v)(300ml)에 용해시키고, 셀라이트[미국 콜로라도주 덴버 소재의 죤즈-맨빌 코포레이션(Johns-Manville Corp.) 제조]를 통해 여과한 다음, 3M 수성 염산((6ml)을 가하여 침전시킨다. 빙욕 중에서 냉각시킨 후, 고형물을 여과하여 수거하고, EtOH로 세척한 다음, 진공 중에서 건조시킨다. 이어서, 고형물을 아세트산(HOAc)(600ml) 중에서 비등시키고, 여과한 다음, 115℃ 진공하에 건조시켜 분석적으로 순수한 화합물 1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-벤조티아졸륨 베타인(5.10g, 79%)을 황색 분말로서 수득한다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 도 2로 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과 같다.
C19H17I2NS2O4에 대한 원소분석
계산치: C, 35.58; H, 2.67; N, 2.18
실측치: C, 35.52; H, 2.75; N, 2.06.
실시예 3
1-(ω-설포에틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인
EtOH/MeOH(2:1 v/v)(60ml) 중의 3,5-디요오도-4-하이드록시벤즈알데히드 (3.73g, 10mmol), 1-(ω-설포에틸)-2,3,3-트리메틸-인돌레니늄 브로마이드(6.61g; 19mmol)[참조: 미국 특허 제2,503,776호 및 CA 44; P5738i] 및 피페리딘(2.0ml)의 혼합물을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 4시간 동안 환류시키고, 주변 온도까지 냉각시킨 후, 진공 중에서 무수물로 증발시켜 갈색 잔사를 잔류시킨다. 갈색 잔사를 MeOH(2∼3ml)에 용해시킨다. 용액을 트리에틸아민(NEt3)(2ml)으로 처리하고 MeOH/CHCl3(1:4 v/v) 전개액을 사용하여 실리카 겔 상에서 크로마토그래피한다. 자주색 생성물 밴드를 함유하는 분획을 수거하고 진공하에서 무수물로 증발시킨다. 조 생성물을 EtOH(10ml)에 용해시키고, i-PrOH 중의 충분량의 1.93M HCl로 산성화시켜 자주색에서 황색으로의 색상 변화를 유발시킨다. 용액을 무수물로 증발시킨다. 잔사를 EtOH/헥산(3:1 v/v)에 용해시키고 용액이 결정화될때까지 냉동시킨다. 분리된 결정성 고형물을 여과하여 수거한다. 이들 고형물을 빙냉시킨 EtOH로 세척한 후 EtOH/헥산으로 세척한다. 잔류 고형물을 진공건조시켜 화합물 1-(ω-설포에틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인(0.80g; 12.8%)을 수득한다. EtOH/HOAc로부터 재결정화하여 분석적으로 순수한 화합물을 짙은 적갈색 분말로서 수득한다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 도 3으로 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과같다.
C20H19I2NO4S½EtOH에 대한 원소분석
계산치: C, 39.02; H, 3.43; N, 2.16
실측치: C, 39.25; H, 3.47; N, 2.25.
실시예 4
1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인(SPDIB)
EtOH(약 50ml) 중의 3,5-디요오도-4-하이드록시벤즈알데히드(3.73g, 10mmol), 1-(ω-설포프로필)-2,3,3-트리메틸인돌레니늄 베타인(3.65g, 13mmol) 및 피페리딘(0.8ml)의 혼합물을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 2.75시간 동안 환류시키고 빙욕 중에서 냉각시킨다. 용액을 i-PrOH(5.0ml) 중의 1.93M HCl로 산성화시킨다. 짙은 타르를 분리시키고 여과하여 수거하며 비등시킨 HOAc로 연마한다. 혼합된 연마물을 진공 중에서 무수물로 증발시키고, HOAc(20ml)에 용해시킨 다음, 결정화한다. 분리된 고형물을 여과하여 수거하고, HOAc로 세척한 다음, 진공건조시켜 화합물 1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인(4.37g, 68%)을 오렌지색 분말로서 수득한다. 당해 화합물을 HOAc로부터 재결정화하여 분석적으로 순수한 화합물을 수득한다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 도 4에 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과 같다.
C21H21I2NO4S½H2O에 대한 원소분석:
계산치: C, 39.02; H, 3.43; N, 2.17
실측치: C, 39.01; H, 3.46; N, 1.94.
실시예 5
1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인
EtOH(35ml) 중의 3,5-디요오도-4-하이드록시벤즈알데히드(1.87g, 5mmol), 1-(ω-설포부틸)-2,3,3-트리메틸인돌레니늄 베타인(2.36g, 8mmol)[참조: R.B. Mujumdar et al., Cytometry 10, 11-9(1989)] 및 피페리딘(0.4ml)의 혼합물을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 2.5시간 동안 환류시킨 후 주변 온도까지 냉각시킨다. 반응 혼합물을 i-PrOH 중의 과량의 1.93M HCl로 산성화시키고 진공 중에서 건조물로 증발시켜 잔사를 잔류시킨다. 잔사를 EtOH(10ml)에 용해시킨다. 냉장고내에 정치시켜 두면 혼합물로부터 고형물이 분리된다. 여과하여 고형물을 수거하고, 빙냉시킨 EtOH/헥산(3:1 v/v)으로 세척한 다음, 진공건조시켜 오렌지색 고체(3.36g)를 수득한다. 조 생성물을 비등 EtOH(약 30ml)에 용해시키고 신속히 침전시킨다. 추가로 비등시킨 EtOH를 가하나(약 220ml) 고형물이 재용해되진 않는다. 얼음 중에서 냉각시키고, 고형물을 여과하여 수거한 다음, EtOH로 세척하며 진공건조시켜 분석적으로 순수한 화합물 1-(ω-설포부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인(1.54g, 47%)을 오렌지색 분말로서 수득한다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 도 5에 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과 같다.
C22H23I2NO4S에 대한 원소분석
계산치: C, 40.57; H, 3.56; N, 2.15
실측치: C, 40.59; H, 3.50; N, 1.99.
실시예 6
1-(n-부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 요오다이드
EtOH(40ml) 중의 3,5-디요오도-4-하이드록시벤즈알데히드(3.73g, 10mmol), 1-(n-부틸)-2,3,3-트리메틸인돌레니늄 요오다이드(4.46g, 13mmol)[참조: D.P. Maisuradze et al., Soobschch. Akad. Nauk Gruz, SSR 50, 77-82(1968); CA 69: 106526r) 및 피페리딘(0.8ml)의 혼합물을 불활성 가스 대기하에 유지시킨다. 용액을 1시간 동안 환류시키고 주변 온도까지 냉각시킨다. 용액을 진공 중에서 건조물로 증발시켜 잔사를 잔류시킨다. 잔사를 EtOH(10ml)에 용해시키고 i-PrOH(3.0ml) 중의 1.93M HCl로 처리한다. 이어서, 용액을 다시 진공 중에서 건조물로 증발시켜 잔사를 잔류시킨다. 잔사를 EtOH(4ml)에 용해시킨다. 용액을 냉동시키면 결정체가 자연적으로 형성된다. 분리된 결정성 고형물을 여과하여 수거하고, 빙냉시킨 EtOH로 세척한 다음, 진공건조시켜 1-(n-부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 요오다이드(4.90g, 80.7%)를 수득한다. 조 화합물을 뜨거운 EtOH(60ml)에 용해시키고 여과지를 통해 여과하며 진공 중에서 약 30ml까지 농축시킨다. 용액이 결정화되게 한다. 분리된 결정성 고형물을 상기와 같이 수거하고 세척하며 건조시켜 분석적으로 순수한 화합물 1-(n-부틸)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 요오다이드(3.90g, 56%)를 밝은 오렌지색 분말로서 수득한다. 당해 화합물을 제조하기 위한 상기한 방법을 일반적으로 도 6에 나타내었다. 당해 화합물을 동정하는 분광 분석 데이터는 다음과 같다.
C22H24I3NOEtOH에 대한 원소분석
계산치: C, 38.68; H, 4.06; N, 1.89
실측치: C, 38.55; H, 3.96; N, 1.91.
실시예 7
사람 혈청 알부민에 대한 분석 성능
액체 시험 샘플 중의 단백질의 농도를 측정하기 위한 액체 분석에서 본 발명의 메로시아닌 단백오차 지시제의 유용성을 하기 표에서 설명한다. 화합물의 pKa 보다 적어도 0.5단위 아래인 pH에서, 200 내지 250mM Na+ 또는 K+ 시트레이트 완충액 중의 당해 화합물의 용액을 제조하고 이의 흡광도를 하기 나열한 파장에서 측정한다. 이어서, 용액을 충분량의 사람 혈청 알부민으로 처리하여 알부민 농도가 100mg/dl이 되도록 하고 흡광도를 다시 측정한다. 보고된 흡광도 증가분(△ABS)은 존재하는 알부민의 양에 비례하며 이는 단백질 측정용 염료의 상대적인 감도를 지시한다.
실시예 8
시약 스트립의 제조
본원에 기재한 분석용 단백질 시약 스트립의 제조방법 중의 하나를 다음에 설명한다. 기재한 방법은 단백질 시약 시험 시트립의 대량 생산을 위한 연속 방법이다.
이 방법에 따르면, 얇은 흡착성 페이퍼 스트립을 약 4ft/min의 적절한 속도로 라인을 따라 이동시킨다. 한가지 바람직한 페이퍼는 E & D 237[참조: Ahlstrom Filtration, Inc., Mount Holley Springs, PA, U.S.A.]이다. 페이퍼를 에탄올에 용해시킨 메로시아닌 단백오차 지시제 SPDIB를 함유하는 pH 2.5의 완충 욕 중에 담근다. 한가지 바람직한 방법에 따르면, 당해 욕은 약 0.03 내지 약 0.08mM SPDIB, 0.5M 칼륨 시트레이트 완충액(pH 2.5) 및 20% 에탄올을 함유한다. 이어서, 시험 스트립을 물 1인치의 공기압 및 60℃의 온도 조건의 건조기를 통해 약 4ft/min의 속도로 통과시킨다. 이어서, 시험 스트립을 절단하고 포장한다.
실시예 9
SPDIB를 함유하는 시약 스트립의 용량 반응
면역분석으로 알부민이 없는 것으로 밝혀진 완충시킨 액체 샘플(50mM 칼륨 시트레이트 pH 2.5)을 PentexR사람 혈청 알부민[HSA; 미국 인디애나주 엘카트 소재의 마일즈인코포레이티드(Miles Inc.) 제조]을 사용하여 임상적으로 유의성이 있는 다양한 수준으로 스파이킹시킨다. Clinitek 200 장치(마일즈인코포레이티드 제조)를 사용하여 0.3mM SPDIB를 함유하는 분석용 시험 스트립을 사용하여 단백질 측정을 수행한다.
결과는 도 7에 나타낸 바와 같이, 알부민 농도간의 △ K/S로 정량적으로 나타낸다. K/S는 수학식 1로 계산한다:
위의 수학식 1에서,
R은 시험 장치로부터의 반사분률이고,
K는 상수이며,
S는 특정 반사 매질의 광산란 계수이다.
위의 수학식 1은 널리 공지된 Kubelka-Munk식[참조: Gustav Kortum, 'Reflectance Spectroscopy', pp. 106-11, Springer Verlas, New York(1969)]을 단순화시킨 것이다. K/S는 25초에 측정한다.
상기한 시약 스트립을 상이한 단백질 농도에 대한 이들의 반응에 대해 분석한다. 이 조사의 결과는 도 7에 요약하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, 본 발명의 스트립은 광범위한 단백질 농도에 대해 민감하다. 또한, 본 발명에서 단백질 농도간의 현저한 분석을 볼 수 있다.
물론 본 발명은 여러가지 변형과 다른 형태를 가질 수 있으나 이들의 특정 양태는 실시예로서 나타내었고 본원에서 상세히 기술하였다. 그러나, 이것은 본 발명이 기술된 특정의 형태에 제한되는 것이 아니라, 이와 반대로 첨부한 특허청구의 범위로 한정하는 바와 같은 본 발명의 정신과 범주에 포함되는 모든 변형, 등가물 및 변경물 모두를 포함하고자 함을 이해해야만 한다.

Claims (2)

  1. a) 화학식 1의 메로시아닌 단백오차 지시제 화합물로 합침된 흡수성 담체를 포함하는 분석 시험 스트립을 액체 샘플로 습윤시키는 단계 및
    b) 액체 샘플 중의 단백질의 존재를 나타내는 시험 시트립의 색상 변화를 관찰하여 기록하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 액체 샘플 중의 단백질 검출방법.
    화학식 1
    위의 화학식 1에서,
    m은 1 내지 6의 정수이고,
    Q는 -Br, -I 또는 Cl이며,
    R은 S, Se, O 또는 C(CnH2n+1)2(여기에서, n은 1 내지 6의 정수이다)이고,
    T는 -SO3 또는 -H이다.
  2. 제1항에 있어서, 메로시아닌 단백오차 지시제 화합물이 1-(ω-설포프로필)-2-(4'-하이드록시-3',5'-디요오도스티릴)-3,3-디메틸인돌레니늄 베타인인 방법.
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