JP3157607B2 - 生体試料中の蛋白質指示薬としてのニトロ又はニトロソ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタレイン - Google Patents
生体試料中の蛋白質指示薬としてのニトロ又はニトロソ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタレインInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には生体試料中
の蛋白質の検出に関し、より具体的には、新規な蛋白誤
差指示薬を用いた、生体試料中の蛋白質を測定するため
の新規な方法に関する。
の蛋白質の検出に関し、より具体的には、新規な蛋白誤
差指示薬を用いた、生体試料中の蛋白質を測定するため
の新規な方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中の蛋白質の存在を測定するこ
とは、腎臓、循環系及び中枢神経系に影響を及ぼすいく
つかの病態の診断に極めて重要である。尿中の蛋白質
（アルブミン）の定性的又は定量的測定を必要とするこ
とがしばしばある。糖尿病、尿管の感染及び腎疾患の診
断には特にこれが重要である。糖尿病及び腎疾患で重要
な蛋白質はアルブミンであり、それゆえ、蛋白質につい
ての尿検査の標準的方式は、アルブミンに関するもので
ある。
とは、腎臓、循環系及び中枢神経系に影響を及ぼすいく
つかの病態の診断に極めて重要である。尿中の蛋白質
（アルブミン）の定性的又は定量的測定を必要とするこ
とがしばしばある。糖尿病、尿管の感染及び腎疾患の診
断には特にこれが重要である。糖尿病及び腎疾患で重要
な蛋白質はアルブミンであり、それゆえ、蛋白質につい
ての尿検査の標準的方式は、アルブミンに関するもので
ある。
【０００３】尿中のアルブミンの存在を測定する方法は
良く知られている。アルブミン測定のための最も費用が
少なく、かつ簡便な方法は、紙製の試験片を少量の尿で
湿らすことである。試験片は蛋白誤差指示薬が含浸され
ている。試料中にアルブミンが存在するならば、試験片
は単に変色するだけでこれを示すであろう。観察される
色は、試料中のアルブミンの濃度に応じて変化するもの
と思われる。この可変的変色が試料中のアルブミンの定
量に用いられる。上記形式の試験紙は、正しく使用する
ための最小限の訓練を必要とする。これらの試験片は、
現場での蛋白質の測定のための正確、簡便かつ迅速な手
段を提供する。このような試験紙は、技師によって臨床
検査室で、更には内科医によって彼らの医務室でも広く
用いられる。
良く知られている。アルブミン測定のための最も費用が
少なく、かつ簡便な方法は、紙製の試験片を少量の尿で
湿らすことである。試験片は蛋白誤差指示薬が含浸され
ている。試料中にアルブミンが存在するならば、試験片
は単に変色するだけでこれを示すであろう。観察される
色は、試料中のアルブミンの濃度に応じて変化するもの
と思われる。この可変的変色が試料中のアルブミンの定
量に用いられる。上記形式の試験紙は、正しく使用する
ための最小限の訓練を必要とする。これらの試験片は、
現場での蛋白質の測定のための正確、簡便かつ迅速な手
段を提供する。このような試験紙は、技師によって臨床
検査室で、更には内科医によって彼らの医務室でも広く
用いられる。
【０００４】より詳細に述べると、これらの試験片は、
吸収性担体片、すなわち緩衝液、ポリマー／界面活性剤
（安定性及び濡れやすさを得るため、又は緩衝液の浸出
を防止するために必要とされる）及び蛋白誤差指示薬で
含浸した紙を含有している。商業的な乾式検査に用いら
れる蛋白誤差指示薬は実質的にすべて、下記の基本構造
吸収性担体片、すなわち緩衝液、ポリマー／界面活性剤
（安定性及び濡れやすさを得るため、又は緩衝液の浸出
を防止するために必要とされる）及び蛋白誤差指示薬で
含浸した紙を含有している。商業的な乾式検査に用いら
れる蛋白誤差指示薬は実質的にすべて、下記の基本構造
【化１０】 を共有するトリフェニルメタン誘導体である。
【０００５】構造Ａは、プロトン性溶媒（水、アルコー
ルなど）の中でのトリフェニルメタン誘導体の一般的構
造を表すが、構造Ｂは、乾燥状態又は非プロトン性溶媒
（エーテル類、アセトニトリルなど）の中での支配的な
形態を表す。一般的には、トリフェニルメタンから誘導
される蛋白誤差指示薬（フェノールスルホンフタレイン
類）は構造Ｂとして表される。統一のため、本発明の蛋
白誤差指示薬は構造Ｂを用いて表すことにする。しか
し、本発明の蛋白誤差指示薬は構造Ａとして存在するこ
とも可能である。
ルなど）の中でのトリフェニルメタン誘導体の一般的構
造を表すが、構造Ｂは、乾燥状態又は非プロトン性溶媒
（エーテル類、アセトニトリルなど）の中での支配的な
形態を表す。一般的には、トリフェニルメタンから誘導
される蛋白誤差指示薬（フェノールスルホンフタレイン
類）は構造Ｂとして表される。統一のため、本発明の蛋
白誤差指示薬は構造Ｂを用いて表すことにする。しか
し、本発明の蛋白誤差指示薬は構造Ａとして存在するこ
とも可能である。
【０００６】蛋白誤差指示薬は、蛋白質の存在によって
置換されるpKa 値をもつ電離可能な基を有するpH指示薬
である。フェノールスルホンフタレイン類の場合、電離
可能基は、上記構造Ａ又はＢ中のＣ環のフェノール性ヒ
ドロキシル基である。あるフェノールスルホンフタレイ
ン指示薬のpKa 値は、該指示薬分子の半数が脱プロトン
化されたＣ環フェノール性ヒドロキシル基を有するpH値
である。
置換されるpKa 値をもつ電離可能な基を有するpH指示薬
である。フェノールスルホンフタレイン類の場合、電離
可能基は、上記構造Ａ又はＢ中のＣ環のフェノール性ヒ
ドロキシル基である。あるフェノールスルホンフタレイ
ン指示薬のpKa 値は、該指示薬分子の半数が脱プロトン
化されたＣ環フェノール性ヒドロキシル基を有するpH値
である。
【０００７】上記のフェノールスルホンフタレインによ
る蛋白誤差指示薬に関しては、観察可能な変色が生じる
ためには、２回の脱プロトン化現象が発生する。第一の
脱プロトン化によって、アリールスルホン酸からプロト
ンが除去されて下式
る蛋白誤差指示薬に関しては、観察可能な変色が生じる
ためには、２回の脱プロトン化現象が発生する。第一の
脱プロトン化によって、アリールスルホン酸からプロト
ンが除去されて下式
【化１１】 で示される化合物が形成される。このプロトンのpKa は
１より小さい。したがって、この部分はすべての実用的
なpH値で電離する。この電離した基は、これらの化合物
が水溶性であることの原因でもある。
１より小さい。したがって、この部分はすべての実用的
なpH値で電離する。この電離した基は、これらの化合物
が水溶性であることの原因でもある。
【０００８】第二の脱プロトン化では、Ｃ環フェノール
性ヒドロキシル基からプロトンが放出されて、下式
性ヒドロキシル基からプロトンが放出されて、下式
【化１２】 で示されるジアニオンが形成される。蛋白誤差指示薬に
おいては、第二の脱プロトン化が、検査しようとする試
料中の蛋白質を示す観察可能な変色を起す。
おいては、第二の脱プロトン化が、検査しようとする試
料中の蛋白質を示す観察可能な変色を起す。
【０００９】緩衝液は、指示薬が機能する一定のpH環境
を供与する。そのため、緩衝化された環境とはpHが著し
く異なることの多い生体体液中に試験片を浸したとき
も、指示薬は該生体体液のpHに影響されることがない。
このことが、指示薬におけるその後のいかなる変色も、
指示薬のpKa 値の変動の結果であって、検査しようとす
る試料のpHの結果ではないことを裏付ける。
を供与する。そのため、緩衝化された環境とはpHが著し
く異なることの多い生体体液中に試験片を浸したとき
も、指示薬は該生体体液のpHに影響されることがない。
このことが、指示薬におけるその後のいかなる変色も、
指示薬のpKa 値の変動の結果であって、検査しようとす
る試料のpHの結果ではないことを裏付ける。
【００１０】生体試料中の蛋白質の分析的測定に役立つ
と一般的に考えられている試験片が米国特許第２，９８
６，４５３号、同第３，０９５，２７７号、同第３，４
８５，５８７号及び同第４，０１３，４１６号各明細書
に記載されている。それらに記載された試験片は、水と
混和しないポリプロピレングリコール、緩衝液及びオク
タハロスルホフタレイン群のpH指示薬で含浸した吸収性
担体を含んでいる。オクタハロスルホフタレイン指示薬
は、３´、３″、５´、５″、３、４、５及び６位がハ
ロゲン化されたトリフェニルメタン誘導体である。該特
許によれば、オクタハロスルホフタレイン、及び水と混
和しないポリプロピレングリコールを含有する試験片
は、検査試料中の干渉性窒素含有化合物に妨害されるこ
とが、他のフェノールスルホンフタレイン指示薬及び表
面活性剤を含有する試験片よりも少ない。
と一般的に考えられている試験片が米国特許第２，９８
６，４５３号、同第３，０９５，２７７号、同第３，４
８５，５８７号及び同第４，０１３，４１６号各明細書
に記載されている。それらに記載された試験片は、水と
混和しないポリプロピレングリコール、緩衝液及びオク
タハロスルホフタレイン群のpH指示薬で含浸した吸収性
担体を含んでいる。オクタハロスルホフタレイン指示薬
は、３´、３″、５´、５″、３、４、５及び６位がハ
ロゲン化されたトリフェニルメタン誘導体である。該特
許によれば、オクタハロスルホフタレイン、及び水と混
和しないポリプロピレングリコールを含有する試験片
は、検査試料中の干渉性窒素含有化合物に妨害されるこ
とが、他のフェノールスルホンフタレイン指示薬及び表
面活性剤を含有する試験片よりも少ない。
【００１１】上記の試験片は、試料中の窒素含有化合物
に妨害されることがより少ないとはいえ、それら及び他
の現在利用可能な試験片は、いくつかの共通する重大な
短所を有している。現在利用可能な試験片は、検査結果
が陰性の状態で強いバックグラウンド色を有する。例え
ば、オクタハロスルホフタレイン群の指示薬は、アルブ
ミンの不在下で黄色を呈する。その結果、アルブミンが
試料に加えられると、その色は、試料中のアルブミンの
濃度に応じて黄から黄緑ないし緑へと変化する。このバ
ックグラウンド色は、最も頻繁に検査される生体体液
が、通常は黄色を呈する尿であることを考慮すると特に
厄介である。この場合、尿中の痕跡量の、すなわち約１
０〜３０mg/dl （ミリグラム／デシリットル）のアルブ
ミンによって生ずる試験片の色の僅かな変化は、試料自
体の色によって容易に隠され、不検出となる可能性があ
る。これらの試験片は、観察結果の解釈により困難を経
験すると思われる、最小限の訓練を受けただけの技師も
用いることから、この問題は一層複雑化する。
に妨害されることがより少ないとはいえ、それら及び他
の現在利用可能な試験片は、いくつかの共通する重大な
短所を有している。現在利用可能な試験片は、検査結果
が陰性の状態で強いバックグラウンド色を有する。例え
ば、オクタハロスルホフタレイン群の指示薬は、アルブ
ミンの不在下で黄色を呈する。その結果、アルブミンが
試料に加えられると、その色は、試料中のアルブミンの
濃度に応じて黄から黄緑ないし緑へと変化する。このバ
ックグラウンド色は、最も頻繁に検査される生体体液
が、通常は黄色を呈する尿であることを考慮すると特に
厄介である。この場合、尿中の痕跡量の、すなわち約１
０〜３０mg/dl （ミリグラム／デシリットル）のアルブ
ミンによって生ずる試験片の色の僅かな変化は、試料自
体の色によって容易に隠され、不検出となる可能性があ
る。これらの試験片は、観察結果の解釈により困難を経
験すると思われる、最小限の訓練を受けただけの技師も
用いることから、この問題は一層複雑化する。
【００１２】医療処置はこれらの検査の結果に基づいて
開始されることが多いので、結果の適確な解釈は絶対的
に必要である。更に、現在利用可能な試験片は、非常に
低レベルの蛋白質を検出するのに充分な程鋭敏ではな
い。約３〜約１０mg/dl の尿アルブミンレベルは生命に
脅威となるいくつかの病態、例えば糖尿病及び腎疾患を
診断する際に重要である。ところが、現在利用可能な試
験片は、約１０〜１５mg/dl を下回るアルブミンを必ず
しも正確に検出できるとは限らない。
開始されることが多いので、結果の適確な解釈は絶対的
に必要である。更に、現在利用可能な試験片は、非常に
低レベルの蛋白質を検出するのに充分な程鋭敏ではな
い。約３〜約１０mg/dl の尿アルブミンレベルは生命に
脅威となるいくつかの病態、例えば糖尿病及び腎疾患を
診断する際に重要である。ところが、現在利用可能な試
験片は、約１０〜１５mg/dl を下回るアルブミンを必ず
しも正確に検出できるとは限らない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】したがって、上記に述
べた欠点を克服するために、アルブミンの存在下で無色
から有色へと変化する蛋白誤差指示薬を提供すること
は、極めて好都合であろう。もし蛋白誤差指示薬が、現
時点で検出可能な濃度を下回る濃度のアルブミンが存在
するか否かを正確かつ明瞭に示すならば、より一層好都
合であろうと思われる。そのような蛋白誤差指示薬を含
有する試験片を提供することによって、更に一層の利点
が実現されるであろうと思われる。
べた欠点を克服するために、アルブミンの存在下で無色
から有色へと変化する蛋白誤差指示薬を提供すること
は、極めて好都合であろう。もし蛋白誤差指示薬が、現
時点で検出可能な濃度を下回る濃度のアルブミンが存在
するか否かを正確かつ明瞭に示すならば、より一層好都
合であろうと思われる。そのような蛋白誤差指示薬を含
有する試験片を提供することによって、更に一層の利点
が実現されるであろうと思われる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、一般式（Ｉ）
【化１３】 （式中、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素の各原子、Ｙはニト
ロ基又はニトロソ基、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の
各原子である）で示される蛋白誤差指示薬となる化合物
を提供することによって、上記の利点を実現する。好適
な一実施態様によれば、Ｘはヨウ素又は臭素原子、Ｙは
ニトロ基、かつＺは臭素又は塩素原子である。
ロ基又はニトロソ基、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の
各原子である）で示される蛋白誤差指示薬となる化合物
を提供することによって、上記の利点を実現する。好適
な一実施態様によれば、Ｘはヨウ素又は臭素原子、Ｙは
ニトロ基、かつＺは臭素又は塩素原子である。
【００１５】本発明の別の一面によれば、一般式（IV）
【化１４】 （式中、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素の各原子、Ｙ′はニ
トロ基又はニトロソ基、Ｙ″は塩素、臭素又はヨウ素の
各原子、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の各原子であ
る）で示される蛋白誤差指示薬となる化合物が提供され
る。好適な一実施態様によれば、Ｘはヨウ素原子、Ｙ′
はニトロ基、Ｙ″は臭素原子及びＺは臭素原子である。
トロ基又はニトロソ基、Ｙ″は塩素、臭素又はヨウ素の
各原子、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の各原子であ
る）で示される蛋白誤差指示薬となる化合物が提供され
る。好適な一実施態様によれば、Ｘはヨウ素原子、Ｙ′
はニトロ基、Ｙ″は臭素原子及びＺは臭素原子である。
【００１６】本発明の更に別の一面は、生体試料中の蛋
白質を検出するための分析用試験片であって、上記の蛋
白誤差指示薬化合物の一つで含浸した吸収性担体が含有
される試験片に指向されている。
白質を検出するための分析用試験片であって、上記の蛋
白誤差指示薬化合物の一つで含浸した吸収性担体が含有
される試験片に指向されている。
【００１７】本発明のもう一つの側面は、生体試料中の
蛋白質を検出する方法、分析用試験片を該生体試料で湿
らす段階を有する方法に指向されている。該試験片に
は、上記の蛋白誤差指示薬である化合物の一つで含浸し
た吸収性担体が含有される。そうして、該試験片を観察
して何らかの変色を検出する。変色は該生体試料中の蛋
白質の表示である。
蛋白質を検出する方法、分析用試験片を該生体試料で湿
らす段階を有する方法に指向されている。該試験片に
は、上記の蛋白誤差指示薬である化合物の一つで含浸し
た吸収性担体が含有される。そうして、該試験片を観察
して何らかの変色を検出する。変色は該生体試料中の蛋
白質の表示である。
【００１８】本発明によれば、吸収性の紙の試験片を本
発明の新規な蛋白誤差指示薬で含浸することによって、
生体体液中の蛋白質を測定するための、蛋白質に対する
著しく増大された感度を有する試験片を得ることが可能
であることが発見されている。
発明の新規な蛋白誤差指示薬で含浸することによって、
生体体液中の蛋白質を測定するための、蛋白質に対する
著しく増大された感度を有する試験片を得ることが可能
であることが発見されている。
【００１９】下記の新規な蛋白誤差指示薬を含有する試
験片は、淡灰色若しくは無色であって、蛋白質を含有す
る生体試料に浸した際に青色に強く発色し、その強度は
試料中の蛋白質の濃度を反映する。形成されたこの青色
は、陰性検査結果の淡灰色若しくは無色とは明確に異な
る。
験片は、淡灰色若しくは無色であって、蛋白質を含有す
る生体試料に浸した際に青色に強く発色し、その強度は
試料中の蛋白質の濃度を反映する。形成されたこの青色
は、陰性検査結果の淡灰色若しくは無色とは明確に異な
る。
【００２０】淡灰色若しくは無色から青への観察可能な
変色に関して述べると、本発明に従って製造された試験
片は、蛋白質の存在下で「発色する」ことによって、生
体体液中の蛋白質を検出するための改善された診断補助
手段となる。このことは、アルブミンの存在下で「変色
する」他の試験片とは際立って異なる。陰性検査結果に
おける淡灰色若しくは無色、及び陽性検査結果における
色の特徴は、生体試料中の蛋白質を検出するために用い
られる従来の方法及び指示薬からの有意義な決別である
と見なされる。より具体的に述べると、本発明は臨床医
に、生体試料中の蛋白質を検出するための単純で信頼性
に富み、かつ正確な方法を提供する。淡灰色若しくは無
色から青色への変化によって、これらの蛋白誤差指示薬
を含有する分析用試験片の読み取りが容易となる。この
ことは、より少ない誤診を結果的にもたらし、それによ
って、より少ない費用を患者及び健康管理施行者にもた
らすであろう。
変色に関して述べると、本発明に従って製造された試験
片は、蛋白質の存在下で「発色する」ことによって、生
体体液中の蛋白質を検出するための改善された診断補助
手段となる。このことは、アルブミンの存在下で「変色
する」他の試験片とは際立って異なる。陰性検査結果に
おける淡灰色若しくは無色、及び陽性検査結果における
色の特徴は、生体試料中の蛋白質を検出するために用い
られる従来の方法及び指示薬からの有意義な決別である
と見なされる。より具体的に述べると、本発明は臨床医
に、生体試料中の蛋白質を検出するための単純で信頼性
に富み、かつ正確な方法を提供する。淡灰色若しくは無
色から青色への変化によって、これらの蛋白誤差指示薬
を含有する分析用試験片の読み取りが容易となる。この
ことは、より少ない誤診を結果的にもたらし、それによ
って、より少ない費用を患者及び健康管理施行者にもた
らすであろう。
【００２１】その上、本発明に従って製造された試験片
は、試料中の約２〜約５００mg/dlの範囲の蛋白質を陽
性であるとして検出する。本発明以前は、約１０mg/dl
を下回るアルブミン濃度を正確に検出することは不可能
であった。本発明を用いたこのような低濃度での蛋白質
の検出によって、糖尿病及び腎疾患など生命に脅威とな
るいくつかの病態の早期診断が可能となる。例えば、３
mg/dl 若しくはそれ以上のレベルのアルブミン尿症の検
出は、臨床医が初期段階で糖尿病をより巧みに診断する
ことに役立つであろう。本発明を用いて得られる疾患の
診断におけるこの有意義な進歩を考慮すると、本発明の
蛋白誤差指示薬及び試験片は、有意義な進歩を当技術に
もたらす。
は、試料中の約２〜約５００mg/dlの範囲の蛋白質を陽
性であるとして検出する。本発明以前は、約１０mg/dl
を下回るアルブミン濃度を正確に検出することは不可能
であった。本発明を用いたこのような低濃度での蛋白質
の検出によって、糖尿病及び腎疾患など生命に脅威とな
るいくつかの病態の早期診断が可能となる。例えば、３
mg/dl 若しくはそれ以上のレベルのアルブミン尿症の検
出は、臨床医が初期段階で糖尿病をより巧みに診断する
ことに役立つであろう。本発明を用いて得られる疾患の
診断におけるこの有意義な進歩を考慮すると、本発明の
蛋白誤差指示薬及び試験片は、有意義な進歩を当技術に
もたらす。
【００２２】本発明は、部分的にハロゲン化されたトリ
フェニルメタン化合物のＢ及びＣ環にニトロ若しくはニ
トロソ置換基を有する新規な一群の蛋白誤差指示薬を提
供することによって、上記の有意義な進歩を達成する。
より詳細に述べると、本発明の一実施態様によれば、本
発明の蛋白誤差指示薬は、一般式（Ｉ）
フェニルメタン化合物のＢ及びＣ環にニトロ若しくはニ
トロソ置換基を有する新規な一群の蛋白誤差指示薬を提
供することによって、上記の有意義な進歩を達成する。
より詳細に述べると、本発明の一実施態様によれば、本
発明の蛋白誤差指示薬は、一般式（Ｉ）
【化１５】 （式中、Ｘ、Ｙ及びＺは前記と同じであり、好ましく
は、Ｘはヨウ素又は臭素原子、Ｙはニトロ基及びＺは臭
素又は塩素原子である。より好ましくは、Ｘはヨウ素原
子、Ｙはニトロ基及びＺは臭素原子である）で示される
化合物である。
は、Ｘはヨウ素又は臭素原子、Ｙはニトロ基及びＺは臭
素又は塩素原子である。より好ましくは、Ｘはヨウ素原
子、Ｙはニトロ基及びＺは臭素原子である）で示される
化合物である。
【００２３】更に、本発明の別の一実施態様によれば、
一般式（IV）
一般式（IV）
【化１６】 （式中、Ｘ、Ｙ´、Ｙ″及びＺは前記と同じであり、よ
り好ましくは、Ｘはヨウ素原子、Ｙ′はニトロ基、Ｙ″
は臭素原子及びＺは臭素原子である）で示される蛋白誤
差指示薬となる化合物が提供される。
り好ましくは、Ｘはヨウ素原子、Ｙ′はニトロ基、Ｙ″
は臭素原子及びＺは臭素原子である）で示される蛋白誤
差指示薬となる化合物が提供される。
【００２４】図面を参照すると、図１は、本発明の２種
類のジニトロソ置換指示薬の合成を一般的に図示してい
る。より詳細に述べると、図１は、商業的に入手可能な
３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタ
レイン（図１の化合物Ａ）からの、３′，３″−ジニト
ロソ−５′，５″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェ
ノールスルホンフタレイン（図１の化合物Ｃ）及び
３′，３″−ジニトロソ−５′，５″−ジヨード−３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン（図１の化合物Ｅ）の可能な合成方法を示す。ジブロ
モ中間体（図１の化合物Ｂ）は、酢酸（ＨＯＡｃ）に溶
かしたテトラブロモフェノールスルホンフタレインの溶
液に２当量の分子状臭素を常温で作用させることによっ
て、容易に製造される。次いで、アセトニトリル（ＣＨ
3 ＣＮ）中で、亜硝酸イソアミルとの酸触媒反応によっ
てこれをニトロシル化して、３′，３″−ジニトロソ−
５′，５″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレインを得る。
類のジニトロソ置換指示薬の合成を一般的に図示してい
る。より詳細に述べると、図１は、商業的に入手可能な
３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタ
レイン（図１の化合物Ａ）からの、３′，３″−ジニト
ロソ−５′，５″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェ
ノールスルホンフタレイン（図１の化合物Ｃ）及び
３′，３″−ジニトロソ−５′，５″−ジヨード−３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン（図１の化合物Ｅ）の可能な合成方法を示す。ジブロ
モ中間体（図１の化合物Ｂ）は、酢酸（ＨＯＡｃ）に溶
かしたテトラブロモフェノールスルホンフタレインの溶
液に２当量の分子状臭素を常温で作用させることによっ
て、容易に製造される。次いで、アセトニトリル（ＣＨ
3 ＣＮ）中で、亜硝酸イソアミルとの酸触媒反応によっ
てこれをニトロシル化して、３′，３″−ジニトロソ−
５′，５″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレインを得る。
【００２５】ジヨード類似体も同様にして製造される。
ＨＯＡｃ中で３．０当量の一塩化ヨウ素（ＩＣｌ）と常
温で反応させることによって、３，４，５，６−テトラ
ブロモフェノールスルホンフタレインをヨウ素化して、
図１に化合物Ｄとして示される化合物を得る。次いで、
この化合物を上記のようにニトロシル化して、３′，
３″−ジニトロソ−５′，５″−ジヨード−３，４，
５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレインを
得る。上記の方法に従えば、３′、３″、３、４、５、
５′、５″又は６位に他のハロゲン原子、アルキル基又
はプロトン（Ｈ）を有する類似体の合成は簡明であり、
予期した化合物が得られる。
ＨＯＡｃ中で３．０当量の一塩化ヨウ素（ＩＣｌ）と常
温で反応させることによって、３，４，５，６−テトラ
ブロモフェノールスルホンフタレインをヨウ素化して、
図１に化合物Ｄとして示される化合物を得る。次いで、
この化合物を上記のようにニトロシル化して、３′，
３″−ジニトロソ−５′，５″−ジヨード−３，４，
５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレインを
得る。上記の方法に従えば、３′、３″、３、４、５、
５′、５″又は６位に他のハロゲン原子、アルキル基又
はプロトン（Ｈ）を有する類似体の合成は簡明であり、
予期した化合物が得られる。
【００２６】図２は、本発明のニトロ基置換蛋白誤差指
示薬の合成を一般的に示している。ＨＯＡｃに溶かした
図２の化合物Ａの溶液に２当量を超えない硝酸（ＨＮＯ
3 ）を常温で作用させることによって、３′，３″−ジ
ニトロ−５′，５″−ジヨード−３，４，５，６−テト
ラブロモフェノールスルホンフタレイン（図２の化合物
Ｂ）が得られる。ＨＯＡｃ中で図２の化合物Ａに１当量
のＨＮＯ3 を常温で徐々に作用させ、次いで、還流温度
で過剰量のＢｒ2 を作用させることによって、モノニト
ロ類似体である３″−ニトロ−５′，５″−ジヨード−
３，３′，４，５，６−ペンタブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（図２の化合物Ｃ）を得る。上記の方法に
従えば、３′，３″，３，４，５，５′，５″又は６位
に他のハロゲン原子、アルキル基又はプロトン（Ｈ）を
有する類似体の合成は簡明であり、予期した化合物が得
られる。実施例中に後述されているのは、図１及び図２
に示した化合物のそれぞれを製造するための詳細な合成
方法である。
示薬の合成を一般的に示している。ＨＯＡｃに溶かした
図２の化合物Ａの溶液に２当量を超えない硝酸（ＨＮＯ
3 ）を常温で作用させることによって、３′，３″−ジ
ニトロ−５′，５″−ジヨード−３，４，５，６−テト
ラブロモフェノールスルホンフタレイン（図２の化合物
Ｂ）が得られる。ＨＯＡｃ中で図２の化合物Ａに１当量
のＨＮＯ3 を常温で徐々に作用させ、次いで、還流温度
で過剰量のＢｒ2 を作用させることによって、モノニト
ロ類似体である３″−ニトロ−５′，５″−ジヨード−
３，３′，４，５，６−ペンタブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（図２の化合物Ｃ）を得る。上記の方法に
従えば、３′，３″，３，４，５，５′，５″又は６位
に他のハロゲン原子、アルキル基又はプロトン（Ｈ）を
有する類似体の合成は簡明であり、予期した化合物が得
られる。実施例中に後述されているのは、図１及び図２
に示した化合物のそれぞれを製造するための詳細な合成
方法である。
【００２７】本発明を限定するわけではないが、Ｂ及び
Ｃ環のニトロ基又はニトロソ基の置換が、尿アルブミン
に対するこれらの化合物の感度の増大と、非常に低濃度
の蛋白質の存在下での淡灰色若しくは無色から青への変
化という驚くべき特性の原因であると考えられる。電子
の求引及び電荷の分散という現象が結び付いて、感度が
増大し指示薬を実現するものと考えられる。
Ｃ環のニトロ基又はニトロソ基の置換が、尿アルブミン
に対するこれらの化合物の感度の増大と、非常に低濃度
の蛋白質の存在下での淡灰色若しくは無色から青への変
化という驚くべき特性の原因であると考えられる。電子
の求引及び電荷の分散という現象が結び付いて、感度が
増大し指示薬を実現するものと考えられる。
【００２８】更に詳細に述べると、４′及び４″位のヒ
ドロキシル基に隣接して位置する高度に電気陰性のニト
ロ基及びニトロソ基が、これらのヒドロキシル基の反応
性を高めるものと考えられる。更に、共鳴安定性によっ
てヒドロキシル基の反応性が一層高められることも考え
られる。イオン形態の分子は電荷の分散によって安定化
されるものと考えられる。置換基であるニトロ基及びニ
トロソ基によって付与された共鳴の安定性は、隣接する
４′及び４″位のヒドロキシル基の水素の酸性度を増大
させる。これらの現象が結び付き、相乗的に指示薬のpK
a を低下させ、それに応じてアルブミンに対する指示薬
の感度を増大させるのであると考えられる。
ドロキシル基に隣接して位置する高度に電気陰性のニト
ロ基及びニトロソ基が、これらのヒドロキシル基の反応
性を高めるものと考えられる。更に、共鳴安定性によっ
てヒドロキシル基の反応性が一層高められることも考え
られる。イオン形態の分子は電荷の分散によって安定化
されるものと考えられる。置換基であるニトロ基及びニ
トロソ基によって付与された共鳴の安定性は、隣接する
４′及び４″位のヒドロキシル基の水素の酸性度を増大
させる。これらの現象が結び付き、相乗的に指示薬のpK
a を低下させ、それに応じてアルブミンに対する指示薬
の感度を増大させるのであると考えられる。
【００２９】本発明の更に別の一面は、生体試料中の蛋
白質を検出するための分析用試験片であって、上記本発
明の蛋白誤差指示薬である化合物の一つで含浸した吸収
性担体が含有される試験片に指向されている。試験片の
吸収性基質の素材は、好ましくはろ紙である。吸収性基
質の素材として有用な他の素材としては、フェルト、多
孔性セラミックの片、多孔性合成膜及び米国特許第３，
８４６，２４７号明細書に記載された織物状又はマット
状のガラス繊維がある。米国特許第３，５５２，９２８
号明細書に記載された木材、布、海綿素材及び粘土質の
物質の使用も示唆される。これらに代えて、担体基質は
多孔性でないもの、例えば各種のポリマーフィルム、ガ
ラス及びその他であることも可能である。このような担
体基質の素材はすべて、他のものと同様に、本発明での
使用に適している。ろ紙は特に適当であることが見いだ
されている。
白質を検出するための分析用試験片であって、上記本発
明の蛋白誤差指示薬である化合物の一つで含浸した吸収
性担体が含有される試験片に指向されている。試験片の
吸収性基質の素材は、好ましくはろ紙である。吸収性基
質の素材として有用な他の素材としては、フェルト、多
孔性セラミックの片、多孔性合成膜及び米国特許第３，
８４６，２４７号明細書に記載された織物状又はマット
状のガラス繊維がある。米国特許第３，５５２，９２８
号明細書に記載された木材、布、海綿素材及び粘土質の
物質の使用も示唆される。これらに代えて、担体基質は
多孔性でないもの、例えば各種のポリマーフィルム、ガ
ラス及びその他であることも可能である。このような担
体基質の素材はすべて、他のものと同様に、本発明での
使用に適している。ろ紙は特に適当であることが見いだ
されている。
【００３０】吸収性ストリップは、好ましくは緩衝液で
含浸する。約１．５〜約４．５のpHに調整できるいかな
る緩衝系も本発明の実施に有用である。好ましくは緩衝
系を約２．０〜約３．０、最も好ましくは約２．５のpH
に調整する。
含浸する。約１．５〜約４．５のpHに調整できるいかな
る緩衝系も本発明の実施に有用である。好ましくは緩衝
系を約２．０〜約３．０、最も好ましくは約２．５のpH
に調整する。
【００３１】試験片を増色ポリマーで含浸することも可
能である。本発明の目的として、「増色ポリマー」とい
う用語は、本発明の蛋白誤差指示薬の色彩形成の反応速
度及び用量作用の双方を増大させ、又は陰性検査結果の
バックグラウンド色を薄くする、分子量が約４００〜約
２５，０００であるポリマーを意味することが意図され
ている。好適な増色ポリマーとしては、ポリプロピレン
グリコール、ポリカーボネート及びポリビニルエーテル
がある。本発明の実施には、水と混和する及び水と混和
しないポリプロピレングリコールの双方が有用である。
ポリプロピレングリコールは分子量が約４００〜約１
０，０００であることが好ましい。より好ましくは、ポ
リプロピレングリコールの分子量は約１，０００〜約
４，０００である。しかし、最も好ましくは、ポリプロ
ピレングリコールの分子量は約２，０００である。
能である。本発明の目的として、「増色ポリマー」とい
う用語は、本発明の蛋白誤差指示薬の色彩形成の反応速
度及び用量作用の双方を増大させ、又は陰性検査結果の
バックグラウンド色を薄くする、分子量が約４００〜約
２５，０００であるポリマーを意味することが意図され
ている。好適な増色ポリマーとしては、ポリプロピレン
グリコール、ポリカーボネート及びポリビニルエーテル
がある。本発明の実施には、水と混和する及び水と混和
しないポリプロピレングリコールの双方が有用である。
ポリプロピレングリコールは分子量が約４００〜約１
０，０００であることが好ましい。より好ましくは、ポ
リプロピレングリコールの分子量は約１，０００〜約
４，０００である。しかし、最も好ましくは、ポリプロ
ピレングリコールの分子量は約２，０００である。
【００３２】本発明の実施に役立つ、水と混和しないポ
リプロピレングリコールは米国特許第４，０１３，４１
６号明細書に詳細に考察されている。ところが、平均分
子量が約４００である、水と混和するポリプロピレング
リコールが本発明の実施に役立つことが確認された。そ
の他の好適な増色ポリマーとしては、ＫＯＫ１０，００
２という商標名のもとでドイツ国バイエル社から入手可
能であるポリカーボネート、Fenoil Ｄ４０３０という
商標名で同社から入手可能である１，６−ジメチル−４
−ノニルフェノールのポリプロピレンオキサイドとエチ
レンオキサイドの付加物、Lutonal Ｉ３０という商標名
のもとで米国ＢＡＳＦ社から入手可能であるポリビニル
エーテル、及びBaylube ＦＥ３０１６という商標名のも
とでドイツ国バイエル社から入手可能であるポリマーが
挙げられる。
リプロピレングリコールは米国特許第４，０１３，４１
６号明細書に詳細に考察されている。ところが、平均分
子量が約４００である、水と混和するポリプロピレング
リコールが本発明の実施に役立つことが確認された。そ
の他の好適な増色ポリマーとしては、ＫＯＫ１０，００
２という商標名のもとでドイツ国バイエル社から入手可
能であるポリカーボネート、Fenoil Ｄ４０３０という
商標名で同社から入手可能である１，６−ジメチル−４
−ノニルフェノールのポリプロピレンオキサイドとエチ
レンオキサイドの付加物、Lutonal Ｉ３０という商標名
のもとで米国ＢＡＳＦ社から入手可能であるポリビニル
エーテル、及びBaylube ＦＥ３０１６という商標名のも
とでドイツ国バイエル社から入手可能であるポリマーが
挙げられる。
【００３３】ある特定の増色ポリマー、すなわちポリプ
ロピレングリコール類を含有する本発明の試験片は、増
大された用量作用範囲を有することが確認されている。
ポリプロピレングリコールは、試験片の用量作用範囲の
全域にわたってアルブミンの応答に関する反応速度も改
善した。その結果、本発明の指示薬及びポリプロピレン
グリコールを含有する試験片は、この増色ポリマーなし
の場合よりも、より多くの色をはるかに高速度で発現す
る。また、本発明の試験は、ある特定の増色ポリマー、
すなわちＫＯＫ１０，００２及びポリプロピレングリコ
ールを含有する試験片は、より良好な解像力をアルブミ
ンレベル間で生起することも立証している。下記の実施
例に示されたデータは、本発明の好適な増色ポリマーが
特定の場合、指示薬のpKa 、解像力並びにアルブミンの
用量作用、及び発色の反応速度を増大させることが可能
であることを立証している。
ロピレングリコール類を含有する本発明の試験片は、増
大された用量作用範囲を有することが確認されている。
ポリプロピレングリコールは、試験片の用量作用範囲の
全域にわたってアルブミンの応答に関する反応速度も改
善した。その結果、本発明の指示薬及びポリプロピレン
グリコールを含有する試験片は、この増色ポリマーなし
の場合よりも、より多くの色をはるかに高速度で発現す
る。また、本発明の試験は、ある特定の増色ポリマー、
すなわちＫＯＫ１０，００２及びポリプロピレングリコ
ールを含有する試験片は、より良好な解像力をアルブミ
ンレベル間で生起することも立証している。下記の実施
例に示されたデータは、本発明の好適な増色ポリマーが
特定の場合、指示薬のpKa 、解像力並びにアルブミンの
用量作用、及び発色の反応速度を増大させることが可能
であることを立証している。
【００３４】
【実施例】以下の実施例は、本発明の好適な実施態様及
び効用を説明するために提示され、添付の請求範囲に別
に述べられていない限りは、本発明を制限することを意
味するものではない。
び効用を説明するために提示され、添付の請求範囲に別
に述べられていない限りは、本発明を制限することを意
味するものではない。
【００３５】実施例１：３′，３″，３，４，５，６−
ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン 酢酸［ＨＯＡｃ、５０ml（ミリリットル）］に溶かし
た、米国ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッ
チ・ケミカル（Aldrich Chemical）社から入手した３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン［５．０３ｇ（グラム）、７．５mmol( ミリモル) ］
の溶液を不活性気体雰囲気中で常温に保った。この溶液
に、アルドリッチ・ケミカル社から入手した臭素の溶液
（２．４ｇ、１５mmol、ＨＯＡｃ１０ml中）を１０分間
にわたって滴下し作用させ、その後１晩撹拌した。反応
混合物から分離した固体をろ過して捕集し、ＨＯＡｃで
洗浄し、減圧下で乾燥して３′，３″，３，４，５，６
−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレインを得た。
沸騰中のＨＯＡｃからの再結晶によって、分析用として
純粋な化合物（１．９３ｇ、２９．３％）が淡桃色粉末
として得られた。このものは１５９〜１６０℃で軟化
し、１６２〜１６４℃で気体の放出とともに融解し、こ
れを再固化すると、２７０℃より下の温度では融解する
ことがなくなった。この化合物を同定する分光分析デー
タを下記に示す。
ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン 酢酸［ＨＯＡｃ、５０ml（ミリリットル）］に溶かし
た、米国ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッ
チ・ケミカル（Aldrich Chemical）社から入手した３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン［５．０３ｇ（グラム）、７．５mmol( ミリモル) ］
の溶液を不活性気体雰囲気中で常温に保った。この溶液
に、アルドリッチ・ケミカル社から入手した臭素の溶液
（２．４ｇ、１５mmol、ＨＯＡｃ１０ml中）を１０分間
にわたって滴下し作用させ、その後１晩撹拌した。反応
混合物から分離した固体をろ過して捕集し、ＨＯＡｃで
洗浄し、減圧下で乾燥して３′，３″，３，４，５，６
−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレインを得た。
沸騰中のＨＯＡｃからの再結晶によって、分析用として
純粋な化合物（１．９３ｇ、２９．３％）が淡桃色粉末
として得られた。このものは１５９〜１６０℃で軟化
し、１６２〜１６４℃で気体の放出とともに融解し、こ
れを再固化すると、２７０℃より下の温度では融解する
ことがなくなった。この化合物を同定する分光分析デー
タを下記に示す。
【００３６】 IR(KBr) 、cm-1 3,435 、1,703 、1,605 、1,497 、1,416 、1,360 、 1,340 、1,295 、1,227 、1,192 1 H NMR(DMSO-d6)δ 8.03 (s 、2H) 、7.59 (d 、J ＝2.4Hz 、2H) 、 7.31 (d のd 、J1＝8.7Hz 及びJ2＝2.4Hz 、2H)、 7.11 (d 、J ＝8.7Hz 、2H) 元素分析 C19H8Br6O5S ・HOAcとしての計算値： C ：28.90 、H
：1.39 実測値： C ：28.55 、H ：1.38
：1.39 実測値： C ：28.55 、H ：1.38
【００３７】実施例２：５′，５″−ジニトロソ−
３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレイン 無水アセトニトリル（ＣＨ3 ＣＮ、５０ml）に溶かした
３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレイン（０．６７ｇ、０．８mmol）の撹拌
溶液を不活性気体雰囲気中で常温に保った。この溶液に
触媒量のＨＯＡｃ（１滴）及び亜硝酸イソアミル（０．
５６ｇ、４．８mmol）を作用させ、その後４日間撹拌し
た。反応混合物から分離した固体をろ過して捕集し、Ｃ
Ｈ3 ＣＮ（１０ml）で洗浄した。この固体を減圧下で乾
燥して５′，５″−ジニトロソ−３′，３″，３，４，
５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン
（０．４５ｇ、６４％）を、融点が２６７〜２６９℃で
ある分析用として純粋な黄色粉末として得た。引き続
き、濃縮された母液から第二の捕集物（０．０３ｇ、４
％）を得た。この化合物を同定する分光分析データを下
記に示す。
３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレイン 無水アセトニトリル（ＣＨ3 ＣＮ、５０ml）に溶かした
３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロモフェノール
スルホンフタレイン（０．６７ｇ、０．８mmol）の撹拌
溶液を不活性気体雰囲気中で常温に保った。この溶液に
触媒量のＨＯＡｃ（１滴）及び亜硝酸イソアミル（０．
５６ｇ、４．８mmol）を作用させ、その後４日間撹拌し
た。反応混合物から分離した固体をろ過して捕集し、Ｃ
Ｈ3 ＣＮ（１０ml）で洗浄した。この固体を減圧下で乾
燥して５′，５″−ジニトロソ−３′，３″，３，４，
５，６−ヘキサブロモフェノールスルホンフタレイン
（０．４５ｇ、６４％）を、融点が２６７〜２６９℃で
ある分析用として純粋な黄色粉末として得た。引き続
き、濃縮された母液から第二の捕集物（０．０３ｇ、４
％）を得た。この化合物を同定する分光分析データを下
記に示す。
【００３８】 IR(KBr) 、cm-1 1,621 、1,543 、1,468 、1,416 、1,361 、1,341 、 1,325 、1,258 、1,194 、1,162 、1,096 1 H NMR(DMSO-d6)δ 7.93 (d 、J ＝2.5Hz 、2H) 、 7.73 (d 、J ＝2.5Hz 、2H) 、 4.20 (v.br.s、2H) 元素分析 C19H6Br6N2O7S としての計算値： C ：25.76 、H ：0.
68、N ：3.16 実測値： C ：25.61 、H ：0.58、N ：3.40
68、N ：3.16 実測値： C ：25.61 、H ：0.58、N ：3.40
【００３９】実施例３：３′，３″−ジヨード−３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン ３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタ
レイン（２０．１ｇ、３０mmol）を７０℃のＨＯＡｃ
（５５０ml）に溶解し、次いで水浴上で常温まで冷却し
た。撹拌溶液を不活性気体雰囲気中に保った。この溶液
に、ＨＯＡｃ（５０ml）に溶かした一塩化ヨウ素（ＩＣ
ｌ）（１４．６１ｇ、９０mmol）の溶液を作用させ、常
温にて２２．３時間放置した。反応混合物をCelite ５
２１（商品名、Johns-Manville社製、米国コロラド州デ
ンバー）のパッドを通してろ過し、減圧下で蒸発乾固さ
せた。得られた赤色タールをＨＯＡｃ（１５０ml）に溶
かした。静置してこの溶液から分離した固体をろ取し、
ＨＯＡｃで洗浄し、減圧下で乾燥して３′，３″−ジヨ
ード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（９．６６ｇ、３４．９％）を桃色粉末と
して得た。引き続き、濃縮された母液から第二の捕集物
（４．０３ｇ、１４．６％）を得た。この化合物を同定
する分光分析データを下記に示す。
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン ３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタ
レイン（２０．１ｇ、３０mmol）を７０℃のＨＯＡｃ
（５５０ml）に溶解し、次いで水浴上で常温まで冷却し
た。撹拌溶液を不活性気体雰囲気中に保った。この溶液
に、ＨＯＡｃ（５０ml）に溶かした一塩化ヨウ素（ＩＣ
ｌ）（１４．６１ｇ、９０mmol）の溶液を作用させ、常
温にて２２．３時間放置した。反応混合物をCelite ５
２１（商品名、Johns-Manville社製、米国コロラド州デ
ンバー）のパッドを通してろ過し、減圧下で蒸発乾固さ
せた。得られた赤色タールをＨＯＡｃ（１５０ml）に溶
かした。静置してこの溶液から分離した固体をろ取し、
ＨＯＡｃで洗浄し、減圧下で乾燥して３′，３″−ジヨ
ード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（９．６６ｇ、３４．９％）を桃色粉末と
して得た。引き続き、濃縮された母液から第二の捕集物
（４．０３ｇ、１４．６％）を得た。この化合物を同定
する分光分析データを下記に示す。
【００４０】 IR(KBr) 、cm-1 1,697 、1,598 、1,486 、1,405 、1,338 、1,293 、 1,226 、1,191 1 H NMR(DMF-d7) δ 8.03 (s 、2H) 、7.97 (d 、J ＝2.3Hz 、2H) 、 7.49 (d のd 、J1＝8.6Hz 及びJ2＝2.3Hz 、2H) 、 7.02 (d 、J ＝8.6Hz 、2H) 元素分析 C19H8Br4I2O5S ・HOAcとしての計算値： C ：25.69 、
H ：1.23 実測値： C ：25.94 、H ：0.94
H ：1.23 実測値： C ：25.94 、H ：0.94
【００４１】実施例４：５′，５″−ジニトロソ−
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン 無水ＣＨ3 ＣＮ（５０ml）に溶かした３′，３″ジヨー
ド−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホン
フタレイン（１．４７ｇ、１．６mmol）の溶液を不活性
気体雰囲気中で常温に保った。その後、この混合物に触
媒量のＨＯＡｃ（２滴）及び亜硝酸イソアミル（２．３
ｇ、２０mmol）を作用させた。得られた混合物を２日間
撹拌した。反応混合物から分離した固体をろ過して捕集
し、冷ＣＨ3 ＣＮで洗浄し、減圧下で乾燥して５′，
５″−ジニトロソ−３′，３″ジヨード−３，４，５，
６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン（０．
４１ｇ、２６％）を得た。ＣＨ3 ＣＮ（１５０ml）から
の再結晶によって、融点が２７０℃を下回ることのない
分析試料が淡黄色ウール状繊維として得られた。この化
合物を同定する分光分析データを下記に示す。
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン 無水ＣＨ3 ＣＮ（５０ml）に溶かした３′，３″ジヨー
ド−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホン
フタレイン（１．４７ｇ、１．６mmol）の溶液を不活性
気体雰囲気中で常温に保った。その後、この混合物に触
媒量のＨＯＡｃ（２滴）及び亜硝酸イソアミル（２．３
ｇ、２０mmol）を作用させた。得られた混合物を２日間
撹拌した。反応混合物から分離した固体をろ過して捕集
し、冷ＣＨ3 ＣＮで洗浄し、減圧下で乾燥して５′，
５″−ジニトロソ−３′，３″ジヨード−３，４，５，
６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン（０．
４１ｇ、２６％）を得た。ＣＨ3 ＣＮ（１５０ml）から
の再結晶によって、融点が２７０℃を下回ることのない
分析試料が淡黄色ウール状繊維として得られた。この化
合物を同定する分光分析データを下記に示す。
【００４２】 IR(KBr) 、cm-1 1,616 、1,541 、1,460 、1,410 、1,360 、1,322 、 1,257 、1,195 、1,091 1 H NMR(DMSO-d6)δ 8.00 (d のd 、J1＝2.0Hz 及びJ2＝1.2Hz 、2H) 、 7.93 (d 、J ＝2.2Hz 、2H) 、 4.76 (v.br.s、2H) 元素分析 C19H6Br4I2N2O7S としての計算値： C ：22.93 、H ：
0.46、N ：2.80 実測値： C ：23.08 、H ：0.71、N ：2.83
0.46、N ：2.80 実測値： C ：23.08 、H ：0.71、N ：2.83
【００４３】実施例５：５′，５″−ジニトロ−３′，
３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノー
ルスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ） 沸騰中のＨＯＡｃ（９０ml）に溶かした３′，３″ジヨ
ード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（１．８５ｇ、２．０mmol）の撹拌溶液を
約１６〜２０℃まで冷却した。４分間にわたり、この溶
液にＨＯＡｃ（１０ml）に溶かした９０％硝酸（０．２
８ｇ、４．０mmol) の溶液を滴下し作用させ、不活性気
体雰囲気中で常温にて１晩にわたって撹拌し続けた。反
応混合物から分離した固体をろ過して捕集し、ＨＯＡｃ
（５ml）で洗浄し、減圧下で乾燥し５′，５″−ジニト
ロ−３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロ
モフェノールスルホンフタレインの粗調製品を得た。Ｈ
ＯＡｃ（１１０ml）からの１回の再結晶によって、分析
用として純粋な化合物である５′，５″−ジニトロ−
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン（０．９０ｇ、３８％) を
黄色粉末として得た。この物質には明確な融点が存在し
なかった。しかし、約１８９〜１９０℃でこの物質は収
縮し、約２１０〜２２０℃で気体を放出し、約２２５℃
で融解した。この化合物を同定する分光分析データを下
記に示す。
３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノー
ルスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ） 沸騰中のＨＯＡｃ（９０ml）に溶かした３′，３″ジヨ
ード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホ
ンフタレイン（１．８５ｇ、２．０mmol）の撹拌溶液を
約１６〜２０℃まで冷却した。４分間にわたり、この溶
液にＨＯＡｃ（１０ml）に溶かした９０％硝酸（０．２
８ｇ、４．０mmol) の溶液を滴下し作用させ、不活性気
体雰囲気中で常温にて１晩にわたって撹拌し続けた。反
応混合物から分離した固体をろ過して捕集し、ＨＯＡｃ
（５ml）で洗浄し、減圧下で乾燥し５′，５″−ジニト
ロ−３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロ
モフェノールスルホンフタレインの粗調製品を得た。Ｈ
ＯＡｃ（１１０ml）からの１回の再結晶によって、分析
用として純粋な化合物である５′，５″−ジニトロ−
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン（０．９０ｇ、３８％) を
黄色粉末として得た。この物質には明確な融点が存在し
なかった。しかし、約１８９〜１９０℃でこの物質は収
縮し、約２１０〜２２０℃で気体を放出し、約２２５℃
で融解した。この化合物を同定する分光分析データを下
記に示す。
【００４４】 IR(KBr) 、cm-1 1,707 、1,616 、1,541 、1,460 、1,408 、1,370 、 1,322 、1,257 、1,195 、1,092 1 H NMR(DMSO-d6)δ 8.03 (d 、J ＝2.4Hz 、2H) 、 7.91 (d 、J ＝2.4Hz 、2H) 、 6.0 〜7.0 (br.s 、2H) 元素分析 C19H6N2Br4I2O9S ・2HOAc としての 計算値： C ：24.40 、H ：1.25、N ：2.48 実測値： C ：24.49 、H ：1.00、N ：2.42
【００４５】実施例６：５′−ニトロ−３′，３″−ジ
ヨード−５″，３，４，５，６，−ペンタブロモフェノ
ールスルホンフタレイン 沸騰中のＨＯＡｃに溶かした３′，３″ジヨード−３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン（０．９２ｇ、１．０mmol）の撹拌溶液を常温まで冷
却し、不活性気体雰囲気中に保った。１．５時間にわた
り、この溶液にＨＯＡｃ（１．０５ml、１．０５mmol）
に溶かした１M ＨＮＯ3 を徐々に滴下作用させた。添加
完了後、反応混合物に５分間の撹拌を施した。その後、
反応混合物にＨＯＡｃ（１．５ml、１．５mmol）に溶か
したＢｒ2 溶液を作用させ、５．５時間還流した。その
後、混合物を常温まで冷却し、減圧下で蒸発乾固させ
て、金褐色のガラス状物質（１．１０ｇ）を得た。この
粗生成物を最小量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に溶か
し、ＨＯＡｃで希釈して結晶性固体を得た。２回の再結
晶の後、分析用として純粋な５′−ニトロ−３′，３″
ジヨード−５″，３，４，５，６−ペンタブロモフェノ
ールスルホンフタレイン（０．５７ｇ、５４．５％) を
明黄色粉末として得た。この化合物を同定する分光分析
データを下記に示す。
ヨード−５″，３，４，５，６，−ペンタブロモフェノ
ールスルホンフタレイン 沸騰中のＨＯＡｃに溶かした３′，３″ジヨード−３，
４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイ
ン（０．９２ｇ、１．０mmol）の撹拌溶液を常温まで冷
却し、不活性気体雰囲気中に保った。１．５時間にわた
り、この溶液にＨＯＡｃ（１．０５ml、１．０５mmol）
に溶かした１M ＨＮＯ3 を徐々に滴下作用させた。添加
完了後、反応混合物に５分間の撹拌を施した。その後、
反応混合物にＨＯＡｃ（１．５ml、１．５mmol）に溶か
したＢｒ2 溶液を作用させ、５．５時間還流した。その
後、混合物を常温まで冷却し、減圧下で蒸発乾固させ
て、金褐色のガラス状物質（１．１０ｇ）を得た。この
粗生成物を最小量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に溶か
し、ＨＯＡｃで希釈して結晶性固体を得た。２回の再結
晶の後、分析用として純粋な５′−ニトロ−３′，３″
ジヨード−５″，３，４，５，６−ペンタブロモフェノ
ールスルホンフタレイン（０．５７ｇ、５４．５％) を
明黄色粉末として得た。この化合物を同定する分光分析
データを下記に示す。
【００４６】 IR(KBr) 、cm-1 1,708 、1,614 、1,540 、1,462 、1,406 、1,371 、 1,338 、1,324 、1,252 、1,194 、1,162 、1,091 、 1,016 、823 、789 、765 、723 、671 1 H NMR(DMSO-d6)δ 8.03 (d のd 、J1＝24.8Hz及びJ2＝2.3Hz 、2H) 、 7.98 (d のd 、J1＝22.7Hz及びJ2＝2.4Hz 、1H) 、 7.90 (br.m、1H) 、7.67 (br.m、1H) 元素分析 C19H6Br4I2NO7Sとしての計算値： C ：21.82 、H ：0.
58、N ：1.34 実測値： C ：22.16 、H ：0.33、N ：1.33
58、N ：1.34 実測値： C ：22.16 、H ：0.33、N ：1.33
【００４７】実施例７：指示薬のpKa 滴定 異なるpHの緩衝液を用い、染料であるＤＩＤＮＴＢを含
ませたＥ＆Ｄ２３７（商品名、Ahlstrom Filtration 社
製、米国ペンシルバニア州Mount Holley Springs）ろ紙
のストリップを滴定することによって、指示薬のpKa を
求めた。２回の試行を実行した。一方の試行では、蛋白
質増強ポリマーである分子量が約２，０００のポリプロ
ピレングリコール（ＰＰＧ）を試験片に追加的に含ませ
た。ＰＰＧを含ませたストリップでは、脱プロトン化さ
れた形態に対するプロトン化されたそれの比率が増大し
た。このことは、ＰＰＧを含ませたストリップについて
のピークＫ／Ｓ値の減少として示された。ストリップは
すべて、蛋白質の不在下では淡灰色又は灰白色であり、
蛋白質の存在下では青に変色した。
ませたＥ＆Ｄ２３７（商品名、Ahlstrom Filtration 社
製、米国ペンシルバニア州Mount Holley Springs）ろ紙
のストリップを滴定することによって、指示薬のpKa を
求めた。２回の試行を実行した。一方の試行では、蛋白
質増強ポリマーである分子量が約２，０００のポリプロ
ピレングリコール（ＰＰＧ）を試験片に追加的に含ませ
た。ＰＰＧを含ませたストリップでは、脱プロトン化さ
れた形態に対するプロトン化されたそれの比率が増大し
た。このことは、ＰＰＧを含ませたストリップについて
のピークＫ／Ｓ値の減少として示された。ストリップは
すべて、蛋白質の不在下では淡灰色又は灰白色であり、
蛋白質の存在下では青に変色した。
【００４８】青色種の形成は６１０nmの波長で追跡し、
Ｋ／Ｓ単位で表した。Ｋ／Ｓ値は式
Ｋ／Ｓ単位で表した。Ｋ／Ｓ値は式
【数１】 （式中、Ｒは検査装置からの反射率、Ｋは定数、Ｓは個
々の反射媒体の光散乱係数である）から算出した。上式
は、周知のKubelka-Munkの式［Gustav Kortum 著、「Re
flectance Spectroscopy」、シュプリンガー・フェルラ
ーク、ニューヨーク（1969年）、１０６〜１１１ページ
を参照のこと］を簡略化した形態である。
々の反射媒体の光散乱係数である）から算出した。上式
は、周知のKubelka-Munkの式［Gustav Kortum 著、「Re
flectance Spectroscopy」、シュプリンガー・フェルラ
ーク、ニューヨーク（1969年）、１０６〜１１１ページ
を参照のこと］を簡略化した形態である。
【００４９】図３を参照すると、滴定曲線中の低いプラ
トー及び高いプラトーは、５′，５″−ジニトロ−
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ）のプロト
ン化された形態及び脱プロトン化された形態が出現する
pH値を示している。２回の試行の双方において、ＤＩＤ
ＮＴＢのＣ環のヒドロキシル基は２．５を下回るpHで完
全にプロトン化され（Ｋ／Ｓは最小となった）、５以上
のpHで完全に脱プロトン化された（最大Ｋ／Ｓ）。Ｋ／
Ｓ値は２５秒後に測定した。
トー及び高いプラトーは、５′，５″−ジニトロ−
３′，３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフ
ェノールスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ）のプロト
ン化された形態及び脱プロトン化された形態が出現する
pH値を示している。２回の試行の双方において、ＤＩＤ
ＮＴＢのＣ環のヒドロキシル基は２．５を下回るpHで完
全にプロトン化され（Ｋ／Ｓは最小となった）、５以上
のpHで完全に脱プロトン化された（最大Ｋ／Ｓ）。Ｋ／
Ｓ値は２５秒後に測定した。
【００４９】分子量が約２，０００のポリプロピレング
リコール（ＰＰＧ）の存在下では、ＤＩＤＮＴＢのpKa
は４．０６から４．４７へと増大した。このパラメータ
ーは、基質であるろ紙の影響も含まれていることから、
見かけの量に過ぎないものと考えられた。事実、ＤＩＤ
ＮＴＢの溶液のpKa は２．９であった。測定された滴定
パラメーターを考慮すると、指示薬のpKa はろ紙基質及
び増色ポリマーの双方に影響されるものと考えられる。
リコール（ＰＰＧ）の存在下では、ＤＩＤＮＴＢのpKa
は４．０６から４．４７へと増大した。このパラメータ
ーは、基質であるろ紙の影響も含まれていることから、
見かけの量に過ぎないものと考えられた。事実、ＤＩＤ
ＮＴＢの溶液のpKa は２．９であった。測定された滴定
パラメーターを考慮すると、指示薬のpKa はろ紙基質及
び増色ポリマーの双方に影響されるものと考えられる。
【００５０】このpKa よりも１単位少ないpHにおいて
は、指示薬であるＤＩＤＮＴＢの色は、ポリプロピレン
グリコールによって淡灰色から無色へと褪色した。更
に、ポリプロピレングリコールを含有する試験片では、
脱プロトン化されたピークのＫ／Ｓは２．５から３．９
へと上昇したが、これは見かけの吸収係数の５６％の増
加に対応する。このことは、蛋白質の存在下での指示薬
による、より多量の色の形成として反映された。
は、指示薬であるＤＩＤＮＴＢの色は、ポリプロピレン
グリコールによって淡灰色から無色へと褪色した。更
に、ポリプロピレングリコールを含有する試験片では、
脱プロトン化されたピークのＫ／Ｓは２．５から３．９
へと上昇したが、これは見かけの吸収係数の５６％の増
加に対応する。このことは、蛋白質の存在下での指示薬
による、より多量の色の形成として反映された。
【００５１】実施例８：生体体液に関する用量作用 免疫検定によってアルブミンを欠くことが示された比重
１．００７の貯溜尿を、Pentex（商品名、Miles Inc.、
インジアナ州Elkhart ）ヒト血清アルブミンを用いて臨
床的有意な各種のアルブミンレベルに強化した。次い
で、これらの強化された貯溜尿を、CLINITEK２００（商
品名、Miles Inc.、インジアナ州Elkhart）という器具
に装着した、ＤＩＤＮＴＢのみ含有する１組みの指示薬
片、並びにＤＩＤＮＴＢ及び分子量が約２，０００のポ
リプロピレングリコールを含有する第二の１組みの試験
片を用いて試験した。データを図４にまとめた。試験片
のpHは２．５であって、ＤＩＤＮＴＢのpKa を１．６単
位下回っていた。試験片のpHは、最大感度であってバッ
クグラウンド色が最小となるpH値である。Ｋ／Ｓは２５
秒後に測定した。
１．００７の貯溜尿を、Pentex（商品名、Miles Inc.、
インジアナ州Elkhart ）ヒト血清アルブミンを用いて臨
床的有意な各種のアルブミンレベルに強化した。次い
で、これらの強化された貯溜尿を、CLINITEK２００（商
品名、Miles Inc.、インジアナ州Elkhart）という器具
に装着した、ＤＩＤＮＴＢのみ含有する１組みの指示薬
片、並びにＤＩＤＮＴＢ及び分子量が約２，０００のポ
リプロピレングリコールを含有する第二の１組みの試験
片を用いて試験した。データを図４にまとめた。試験片
のpHは２．５であって、ＤＩＤＮＴＢのpKa を１．６単
位下回っていた。試験片のpHは、最大感度であってバッ
クグラウンド色が最小となるpH値である。Ｋ／Ｓは２５
秒後に測定した。
【００５２】分解能は、下記の表１に示したとおり、ア
ルブミンレベル間のΔＫ／Ｓとして定量的に表した。
ルブミンレベル間のΔＫ／Ｓとして定量的に表した。
【００５３】
【表１】
【００５４】両試験片とも、発色によって１５mg/dl の
濃度のアルブミンの存在を明瞭に示した。実際には、Ｄ
ＩＤＮＴＢのみ含有する試験片は、３０mg/dl 未満の蛋
白質濃度に対しての方が、より高い濃度に対してよりも
鋭敏であった。この濃度は、大半の商業的試験片が劣悪
な分解能を有するレベルよりも低いレベルである。その
一方で、ポリプロピレングリコールを含有する試験片
は、５００mg/dl までの濃度の蛋白質に対して感度を示
した。したがって、ポリプロピレングリコールによって
分解能の増大がもたらされる。その上、バックグラウン
ド色は、試験片のＫ／Ｓ値の低下に示されるとおり、陰
性レベルではわずかな灰色から無色ないし灰白色へと褪
色した。
濃度のアルブミンの存在を明瞭に示した。実際には、Ｄ
ＩＤＮＴＢのみ含有する試験片は、３０mg/dl 未満の蛋
白質濃度に対しての方が、より高い濃度に対してよりも
鋭敏であった。この濃度は、大半の商業的試験片が劣悪
な分解能を有するレベルよりも低いレベルである。その
一方で、ポリプロピレングリコールを含有する試験片
は、５００mg/dl までの濃度の蛋白質に対して感度を示
した。したがって、ポリプロピレングリコールによって
分解能の増大がもたらされる。その上、バックグラウン
ド色は、試験片のＫ／Ｓ値の低下に示されるとおり、陰
性レベルではわずかな灰色から無色ないし灰白色へと褪
色した。
【００５５】実施例９：反応速度の測定 上記と同じ貯溜尿を用い、同じ試験片及びマイルス（Mi
les ）高速スキャナー器具を用いて反応速度の測定を行
った。データを図５にまとめた。図５は、ポリプロピレ
ングリコールをＤＩＤＮＴＢとともに用いた場合の増大
された反応速度及び、より大きいアルブミンレベル間の
分解能を示す。しかし、両試験片とも、１５mg/dl のア
ルブミンを明確に検出した。
les ）高速スキャナー器具を用いて反応速度の測定を行
った。データを図５にまとめた。図５は、ポリプロピレ
ングリコールをＤＩＤＮＴＢとともに用いた場合の増大
された反応速度及び、より大きいアルブミンレベル間の
分解能を示す。しかし、両試験片とも、１５mg/dl のア
ルブミンを明確に検出した。
【００５６】実施例１０：選ばれた数種類の増色ポリマ
ーのうち１種類を含有する各種試験片との比較 上記と同じ貯溜尿を用い、ＤＩＤＮＴＢを含有し、かつ
増色ポリマーを含まないか、又は、Fenoil Ｄ４０３
０、Baylube ＦＥ３０１６、ＫＯＫ １０，００２、Ｐ
−２０００（Fluka Chemical社よりＰ−２０００という
商標名で入手可能であって、平均分子量が２，０００で
あるポリプロピレングリコール）、及びＰＰＧ Ｄ４０
０（Olin Chemical 社よりＰＰＧ Ｄ４００という商標
名で入手可能であって、平均分子量が４００であるポリ
プロピレングリコール）よりなる群から選ばれる増色ポ
リマーのうち１種類を含有する試験片を用いて測定を行
った。Ｋ／Ｓ値は２５秒後に測定した。データを図６に
まとめる。
ーのうち１種類を含有する各種試験片との比較 上記と同じ貯溜尿を用い、ＤＩＤＮＴＢを含有し、かつ
増色ポリマーを含まないか、又は、Fenoil Ｄ４０３
０、Baylube ＦＥ３０１６、ＫＯＫ １０，００２、Ｐ
−２０００（Fluka Chemical社よりＰ−２０００という
商標名で入手可能であって、平均分子量が２，０００で
あるポリプロピレングリコール）、及びＰＰＧ Ｄ４０
０（Olin Chemical 社よりＰＰＧ Ｄ４００という商標
名で入手可能であって、平均分子量が４００であるポリ
プロピレングリコール）よりなる群から選ばれる増色ポ
リマーのうち１種類を含有する試験片を用いて測定を行
った。Ｋ／Ｓ値は２５秒後に測定した。データを図６に
まとめる。
【００５７】盲検のバックグラウンド色は、Fenoil Ｄ
４０３０、Baylube ＦＥ３０１６及びＰ−２０００によ
って僅かな灰色から無色へと僅かに薄められた。ＫＯＫ
１０，００２及びＰＰＧ Ｄ４００はバックグラウン
ド色を薄めなかったが、Ｐ−２０００に加えると、これ
らは、用量作用の顕著な増進を生起した。図６にまとめ
られたデータから、Ｐ−２０００は、より好適な増色ポ
リマーであろうと思われたが、それは、これがアルブミ
ン濃度間の分解能を向上させ、同時にバックグラウンド
色を薄めるからである。分子量が１，０００及び４，０
００であるポリプロピレングリコールを用いても、これ
らと同じ結果が示されている。
４０３０、Baylube ＦＥ３０１６及びＰ−２０００によ
って僅かな灰色から無色へと僅かに薄められた。ＫＯＫ
１０，００２及びＰＰＧ Ｄ４００はバックグラウン
ド色を薄めなかったが、Ｐ−２０００に加えると、これ
らは、用量作用の顕著な増進を生起した。図６にまとめ
られたデータから、Ｐ−２０００は、より好適な増色ポ
リマーであろうと思われたが、それは、これがアルブミ
ン濃度間の分解能を向上させ、同時にバックグラウンド
色を薄めるからである。分子量が１，０００及び４，０
００であるポリプロピレングリコールを用いても、これ
らと同じ結果が示されている。
【００５８】実施例１１：選ばれた数種類の増色ポリマ
ーのうち１種類を含有する各種試験片との第二の比較 ワットマンＣＣＰ５００という紙の試薬試験片を下記の
浸漬液で含浸し、下記のような標準方法に従って乾燥さ
せた。初めに試験片をpH２．５の０．５M クエン酸緩衝
液に浸し、その後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶
かした０．３０mM のＤＩＤＮＴＢを入れた浴中にこの
試験片を浸すことによって対照試薬試験片を製造した。
その他の試験片は、第二の浴に１％の増色ポリマーを更
に含ませた以外は実質的に同じ要領で製造した。実施例
に用いたポリマーは、フルカ（Fluka ）のＰＰＧ Ｐ−
２０００、オリーン（Olin）の各種の分子量のＰＰＧ
（Ｄ系列）、ダウ・ケミカル（Dow Chemical）のポリプ
ロピレングリコールモノブチルエーテル（ＰＰＧＭＢ
Ｅ）、及びバイエル（Bayer ）のＫＯＫ １０，００２
であった。
ーのうち１種類を含有する各種試験片との第二の比較 ワットマンＣＣＰ５００という紙の試薬試験片を下記の
浸漬液で含浸し、下記のような標準方法に従って乾燥さ
せた。初めに試験片をpH２．５の０．５M クエン酸緩衝
液に浸し、その後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶
かした０．３０mM のＤＩＤＮＴＢを入れた浴中にこの
試験片を浸すことによって対照試薬試験片を製造した。
その他の試験片は、第二の浴に１％の増色ポリマーを更
に含ませた以外は実質的に同じ要領で製造した。実施例
に用いたポリマーは、フルカ（Fluka ）のＰＰＧ Ｐ−
２０００、オリーン（Olin）の各種の分子量のＰＰＧ
（Ｄ系列）、ダウ・ケミカル（Dow Chemical）のポリプ
ロピレングリコールモノブチルエーテル（ＰＰＧＭＢ
Ｅ）、及びバイエル（Bayer ）のＫＯＫ １０，００２
であった。
【００５９】上記の試薬紙から製造した試験片を、免疫
検定法を用いてアルブミンを欠くことが示され、次いで
Pentexヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて臨床的有
意な各種のアルブミンレベルに強化した、比重１．００
７の貯溜尿からの尿試料を用いて試験した。試験片を検
査液に浸した後、２５秒で６１０nmにおける試験片の反
射率を測定した。盲検に対するポリマーの影響は、アル
ブミンの不在下（陰性レベル）で得られたＫ／Ｓとして
定量的に表すことが可能であり、増加した発色速度の結
果としての分解能の向上は、アルブミンレベル間のΔＫ
／Ｓで表すことが可能である。データを下記の表２にま
とめる。
検定法を用いてアルブミンを欠くことが示され、次いで
Pentexヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて臨床的有
意な各種のアルブミンレベルに強化した、比重１．００
７の貯溜尿からの尿試料を用いて試験した。試験片を検
査液に浸した後、２５秒で６１０nmにおける試験片の反
射率を測定した。盲検に対するポリマーの影響は、アル
ブミンの不在下（陰性レベル）で得られたＫ／Ｓとして
定量的に表すことが可能であり、増加した発色速度の結
果としての分解能の向上は、アルブミンレベル間のΔＫ
／Ｓで表すことが可能である。データを下記の表２にま
とめる。
【００６０】
【表２】
【００６１】この群のポリマーはすべて、ポリマーなし
の対照例の２〜２０倍というΔＫ／Ｓの増大によって表
される、分解能の大幅な増加を生起した。バックグラウ
ンド色に対するはるかに少ない影響は、ＰＰＧ Ｄ−４
００及びＫＯＫ １０，００２を除くすべてのポリマー
についての陰性レベルでのＫ／Ｓの減少から明白であ
る。したがって、これらの影響を双方とも生起する能力
は、必ずしも常にではないが、通例として同一のポリマ
ーに内在する。２種類のＰＰＧＭＢＥポリマーは、ＰＰ
Ｇポリマーと同等若しくはそれらより僅かに良好である
性能上の特性を有する。
の対照例の２〜２０倍というΔＫ／Ｓの増大によって表
される、分解能の大幅な増加を生起した。バックグラウ
ンド色に対するはるかに少ない影響は、ＰＰＧ Ｄ−４
００及びＫＯＫ １０，００２を除くすべてのポリマー
についての陰性レベルでのＫ／Ｓの減少から明白であ
る。したがって、これらの影響を双方とも生起する能力
は、必ずしも常にではないが、通例として同一のポリマ
ーに内在する。２種類のＰＰＧＭＢＥポリマーは、ＰＰ
Ｇポリマーと同等若しくはそれらより僅かに良好である
性能上の特性を有する。
【００６２】実施例１２：試験片の製造 ここで考察した尿蛋白質試薬の試験片を製造する一つの
方法を次に示す。この方法は、尿蛋白質試薬のを大量に
生産するための連続的方法である。
方法を次に示す。この方法は、尿蛋白質試薬のを大量に
生産するための連続的方法である。
【００６３】この方法によれば、薄い吸収性の紙製スト
リップを、好適な速度の毎分約１．２ｍ（約４フィー
ト）でラインを移動させる。好適な紙の一つとしてＥ＆
Ｄ２３７がある。増色ポリマー、例えばポリプロピレン
グリコールを試験片に組み込もうとするならば、初めに
紙を、エタノール又は他の適当な有機溶媒に溶かした増
色ポリマーを入れた浴中に浸す。例えば、ポリプロピレ
ングリコールを用いる場合、エタノール浴には１％のポ
リプロピレングリコールを含有させなければならない。
平均分子量が約２，０００である好適なポリプロピレン
グリコールが、Ｐ−２０００という商標名のもとにフル
カ・ケミカル（Fluka Chemical）社から入手可能であ
る。しかし、増色ポリマーを含有しない試験片を製造し
ようとする場合は、最初の浸漬はエタノールのみの中で
行わなければならない。続いて２回目に、蛋白誤差指示
薬、及び水−エタノール混合物又は他の適当な有機溶媒
に溶かした緩衝液を入れた浴中にこの紙を浸す。好適な
一方法によれば、２回目の浴には５０％エタノールに溶
かした０．０２５％のＤＩＤＮＴＢ及びpH２．５の０．
４５M クエン酸カリウム緩衝液を入れる。そうして、こ
の試験片を、水柱約２．５cm（１インチ）の空気圧及び
６０℃の温度の乾燥機中を毎分約１．２ｍ（４フィー
ト）の速度で通過させる。その後、試験片を裁断かつ包
装する。
リップを、好適な速度の毎分約１．２ｍ（約４フィー
ト）でラインを移動させる。好適な紙の一つとしてＥ＆
Ｄ２３７がある。増色ポリマー、例えばポリプロピレン
グリコールを試験片に組み込もうとするならば、初めに
紙を、エタノール又は他の適当な有機溶媒に溶かした増
色ポリマーを入れた浴中に浸す。例えば、ポリプロピレ
ングリコールを用いる場合、エタノール浴には１％のポ
リプロピレングリコールを含有させなければならない。
平均分子量が約２，０００である好適なポリプロピレン
グリコールが、Ｐ−２０００という商標名のもとにフル
カ・ケミカル（Fluka Chemical）社から入手可能であ
る。しかし、増色ポリマーを含有しない試験片を製造し
ようとする場合は、最初の浸漬はエタノールのみの中で
行わなければならない。続いて２回目に、蛋白誤差指示
薬、及び水−エタノール混合物又は他の適当な有機溶媒
に溶かした緩衝液を入れた浴中にこの紙を浸す。好適な
一方法によれば、２回目の浴には５０％エタノールに溶
かした０．０２５％のＤＩＤＮＴＢ及びpH２．５の０．
４５M クエン酸カリウム緩衝液を入れる。そうして、こ
の試験片を、水柱約２．５cm（１インチ）の空気圧及び
６０℃の温度の乾燥機中を毎分約１．２ｍ（４フィー
ト）の速度で通過させる。その後、試験片を裁断かつ包
装する。
【００６４】本発明は様々な変化形及び代替形態とする
ことが可能であるが、その特定の実施態様が実施例を用
いて示されていて、ここに詳細に記載されたのである。
しかし、開示された特定の形態に本発明を限定すること
が意図されているのではなく、反対に、添付の請求範囲
によって定義された限りの本発明の精神及び範囲内に属
するすべての変化形、等価形及び代替形を網羅すること
がその意図であることを理解しなければならない。
ことが可能であるが、その特定の実施態様が実施例を用
いて示されていて、ここに詳細に記載されたのである。
しかし、開示された特定の形態に本発明を限定すること
が意図されているのではなく、反対に、添付の請求範囲
によって定義された限りの本発明の精神及び範囲内に属
するすべての変化形、等価形及び代替形を網羅すること
がその意図であることを理解しなければならない。
【図１】ニトロソ基で置換された蛋白誤差指示薬の合成
法を示す概略図である。
法を示す概略図である。
【図２】ニトロ基で置換された蛋白誤差指示薬の合成法
を示す概略図である。
を示す概略図である。
【図３】ＤＩＤＮＴＢ（５′，５″−ジニトロ−３′，
３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノー
ルスルホンフタレイン）のみ（−○−）、及び分子量が
２，０００のポリプロピレングリコール（−△−）で含
浸した分析用試験片についての滴定曲線を示すグラフで
ある。
３″ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノー
ルスルホンフタレイン）のみ（−○−）、及び分子量が
２，０００のポリプロピレングリコール（−△−）で含
浸した分析用試験片についての滴定曲線を示すグラフで
ある。
【図４】ＤＩＤＮＴＢのみ（−■−）、及び分子量が
２，０００のポリプロピレングリコール（−□−）で含
浸した分析的試験片の用量作用曲線を示すグラフであ
る。
２，０００のポリプロピレングリコール（−□−）で含
浸した分析的試験片の用量作用曲線を示すグラフであ
る。
【図５】ＤＩＤＮＴＢのみ（Ａ図）、及び分子量が２，
０００のポリプロピレングリコール（Ｂ図）で含浸した
分析用試験片の動力学的作用曲線を示すグラフである。
０００のポリプロピレングリコール（Ｂ図）で含浸した
分析用試験片の動力学的作用曲線を示すグラフである。
【図６】ＤＩＤＮＴＢのみ、ＤＩＤＮＴＢ及びFenoil
Ｄ４０３０、ＤＩＤＮＴＢ及びBaylube ＦＥ３０１６、
ＤＩＤＮＴＢ及びＰ−２０００、ＤＩＤＮＴＢ及びＫＯ
Ｋ １０，００２、並びにＤＩＤＮＴＢ及びＰＰＧ Ｄ
４００で含浸した分析用試験片の用量作用を示す棒グラ
フである。
Ｄ４０３０、ＤＩＤＮＴＢ及びBaylube ＦＥ３０１６、
ＤＩＤＮＴＢ及びＰ−２０００、ＤＩＤＮＴＢ及びＫＯ
Ｋ １０，００２、並びにＤＩＤＮＴＢ及びＰＰＧ Ｄ
４００で含浸した分析用試験片の用量作用を示す棒グラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロイス・ジェー・プラウド アメリカ合衆国、インデイアナ州、 46530、グレンジャー、フィルバート・ ロード 52350 (72)発明者 マイケル・サルベッチ アメリカ合衆国、ミネソタ州、55104、 セント・ポール、テンプル・コート 2071 (72)発明者 ロバート・ダブリュ・トリマー アメリカ合衆国、メリーランド州、 20874、ジャーマンタウン、バージン・ ウェイ 20410 (72)発明者 ロナルド・ジー・ソマー アメリカ合衆国、インデイアナ州、 46514、エルクハート、マール・ドライ ブ 55745 (56)参考文献 特開 昭50−34537（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−108300（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−275579（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−2992（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 31/00 G01N 31/22 122 G01N 33/68 C07D 327/04 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 生体試料中の蛋白質を検出するための分
析用試験片であって、一般式（Ｉ） 【化６】 （式中、Ｘはヨウ素、臭素又は塩素の各原子、Ｙはニト
ロ基又はニトロソ基、かつＺはヨウ素、臭素又は塩素の
各原子である）で示される化合物で含浸した吸収性担体
が含有される試験片。 - 【請求項２】 生体試料中の蛋白質を検出するための分
析用試験片であって、一般式（IV） 【化７】 （式中、Ｘはヨウ素、臭素又は塩素の各原子、Ｙ′はニ
トロ基又はニトロソ基、Ｙ″はヨウ素、臭素又は塩素の
各原子、かつＺはヨウ素、臭素又は塩素の各原子であ
る）で示される化合物で含浸した吸収性担体が含有され
る試験片。 - 【請求項３】 生体試料中の蛋白質を検出するための方
法において、（ａ）一般式（Ｉ） 【化８】 （式中、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素の各原子、Ｙはニト
ロ基又はニトロソ基、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の
各原子である）で示される化合物で含浸した吸収性担体
が含有される分析用試験片を生体試料で湿らす段階、及
び（ｂ）生体試料中の蛋白質を表示する試験片の何らか
の変色を観察かつ記録する段階を含む方法。 - 【請求項４】 生体試料中の蛋白質を検出するための方
法において、 （ａ）一般式（IV） 【化９】 （式中、Ｘは塩素、臭素又はヨウ素の各原子、Ｙ′はニ
トロ基又はニトロソ基、Ｙ″は塩素、臭素又はヨウ素の
各原子、かつＺは塩素、臭素又はヨウ素の各原子であ
る）で示される化合物で含浸した吸収性担体が含有され
る分析用試験片を生体試料で湿らす段階、及び（ｂ）生
体試料中の蛋白質を表示する試験片の何らかの変色を観
察かつ記録する段階を含む方法。 - 【請求項５】 試験片が更に緩衝液及び増色ポリマーで
含浸されている請求項３又は４の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/710,952 US5187104A (en) | 1991-06-06 | 1991-06-06 | Nitro or nitroso substituted polyhalogenated phenolsulfonephthaleins as protein indicators in biological samples |
| US710952 | 1991-06-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05230054A JPH05230054A (ja) | 1993-09-07 |
| JP3157607B2 true JP3157607B2 (ja) | 2001-04-16 |
Family
ID=24856182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17004192A Expired - Lifetime JP3157607B2 (ja) | 1991-06-06 | 1992-06-05 | 生体試料中の蛋白質指示薬としてのニトロ又はニトロソ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタレイン |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5187104A (ja) |
| EP (1) | EP0517054B1 (ja) |
| JP (1) | JP3157607B2 (ja) |
| KR (1) | KR100232439B1 (ja) |
| AT (1) | ATE161838T1 (ja) |
| AU (1) | AU636540B2 (ja) |
| CA (1) | CA2070039A1 (ja) |
| DE (1) | DE69223851T2 (ja) |
| DK (1) | DK0517054T3 (ja) |
| ES (1) | ES2111009T3 (ja) |
| FI (1) | FI922588A (ja) |
| GR (1) | GR3026262T3 (ja) |
| IE (1) | IE921838A1 (ja) |
| IL (1) | IL101859A (ja) |
| NO (1) | NO922071L (ja) |
| NZ (1) | NZ242731A (ja) |
| ZA (1) | ZA923804B (ja) |
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| US5424215A (en) * | 1994-02-07 | 1995-06-13 | Miles Inc. | Assay for the determination of protein in a biological sample |
| US5750405A (en) * | 1996-03-01 | 1998-05-12 | Bayer Corporation | Method for the detection for protein |
| KR100352837B1 (ko) * | 2001-05-22 | 2002-09-16 | 성홍제 | 호스용 폴리에틸렌 타포린과 그 제조 방법 및 호스용폴리에틸렌 타포린을 사용하여 제조된 호스 |
| US7459127B2 (en) * | 2002-02-26 | 2008-12-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Method and apparatus for precise transfer and manipulation of fluids by centrifugal and/or capillary forces |
| DE60334548D1 (en) * | 2002-08-09 | 2010-11-25 | Arkray Inc | Teststück fur proteinassay |
| WO2004015424A1 (ja) * | 2002-08-09 | 2004-02-19 | Arkray, Inc. | 蛋白質測定用試験片およびその製造方法 |
| US7125711B2 (en) * | 2002-12-19 | 2006-10-24 | Bayer Healthcare Llc | Method and apparatus for splitting of specimens into multiple channels of a microfluidic device |
| US7094354B2 (en) * | 2002-12-19 | 2006-08-22 | Bayer Healthcare Llc | Method and apparatus for separation of particles in a microfluidic device |
| US7435381B2 (en) * | 2003-05-29 | 2008-10-14 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Packaging of microfluidic devices |
| US20040265171A1 (en) * | 2003-06-27 | 2004-12-30 | Pugia Michael J. | Method for uniform application of fluid into a reactive reagent area |
| US20080257754A1 (en) * | 2003-06-27 | 2008-10-23 | Pugia Michael J | Method and apparatus for entry of specimens into a microfluidic device |
| US20040265172A1 (en) * | 2003-06-27 | 2004-12-30 | Pugia Michael J. | Method and apparatus for entry and storage of specimens into a microfluidic device |
| US7347617B2 (en) * | 2003-08-19 | 2008-03-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Mixing in microfluidic devices |
| CN102617410B (zh) * | 2012-03-15 | 2013-11-06 | 长春万成生物电子工程有限公司 | 一种3,4,5,6-四卤代酚磺酞的纯化方法 |
| CN106957247B (zh) * | 2017-03-16 | 2020-03-20 | 长春万成生物电子工程有限公司 | 一种微蛋白指示剂的纯化方法 |
| KR102268024B1 (ko) | 2019-09-30 | 2021-06-23 | 주식회사 청도제약 | 높은 민감도를 가진 소변 내 미세알부민 검출 시험 스트립 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH593503A5 (ja) * | 1973-07-09 | 1977-12-15 | Oce Van Der Grinten Nv | |
| DE2510633C3 (de) * | 1975-03-12 | 1978-07-13 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Eiweiß in Körperflüssigkeiten und dafür geeignete Indikatorfarbstoffe |
-
1991
- 1991-06-06 US US07/710,952 patent/US5187104A/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-05-14 NZ NZ242731A patent/NZ242731A/en unknown
- 1992-05-14 IL IL10185992A patent/IL101859A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-05-23 ES ES92108737T patent/ES2111009T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-23 DE DE69223851T patent/DE69223851T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-23 DK DK92108737T patent/DK0517054T3/da active
- 1992-05-23 AT AT92108737T patent/ATE161838T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-05-23 EP EP92108737A patent/EP0517054B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-05-25 ZA ZA923804A patent/ZA923804B/xx unknown
- 1992-05-25 NO NO92922071A patent/NO922071L/no unknown
- 1992-05-29 CA CA002070039A patent/CA2070039A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-04 FI FI922588A patent/FI922588A/fi unknown
- 1992-06-04 KR KR1019920009662A patent/KR100232439B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-06-04 AU AU18045/92A patent/AU636540B2/en not_active Ceased
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-
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