JPH0779716B2 - 加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片 - Google Patents

加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片

Info

Publication number
JPH0779716B2
JPH0779716B2 JP2276586A JP27658690A JPH0779716B2 JP H0779716 B2 JPH0779716 B2 JP H0779716B2 JP 2276586 A JP2276586 A JP 2276586A JP 27658690 A JP27658690 A JP 27658690A JP H0779716 B2 JPH0779716 B2 JP H0779716B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
hydrolase
formula
sample
groups
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP2276586A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03151397A (ja
Inventor
ハンス‐ヨアヒム・グーダー
ヴエルナー・ギユートライン
ヴオルフガング・ヴエツケルレ
ヨハン・ベルガー
ハーヴイ・バツク
ルツペルト・ヘルマン
Original Assignee
ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング filed Critical ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Publication of JPH03151397A publication Critical patent/JPH03151397A/ja
Publication of JPH0779716B2 publication Critical patent/JPH0779716B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings
    • C07D263/30—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D263/32—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/24—Radicals substituted by oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/28—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6503—Five-membered rings
    • C07F9/6506—Five-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6527—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/653—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6536—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having nitrogen and sulfur atoms with or without oxygen atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6539—Five-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Thiazole And Isothizaole Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規加水分解酵素基質、その製法及び試料中
の加水分解酵素活性を有する物質を検出するための方法
に関する。
〔従来の技術〕
加水分解酵素は、最近重要となつた酵素である。これは
一方では、植物、動物及び人間の物質代射で重要な役割
を演じる。生物系で加水分解酵素の濃度が、その中に一
般に存在する濃度と異なつている場合には、これが病気
の原因である可能性がある。従つて、臨床診断の課題
は、病気が存在する場合に、体液中の加水分解酵素の濃
度を測定することによつて正常値との相違を確認するこ
とである。これは有利には、指示薬反応により加水分解
酵素活性を測定することによつて行われる。このために
検査すべき試料に、該当する加水分解酵素の基質を加え
る。基質から生成される生成物の量は、存在する加水分
解酵素濃度の目安である。
他方、加水分解酵素は免疫活性化合物を標識付けするた
めの酵素として頻繁に使用される。その際、免疫試験で
例えば抗体を標識付けするためにβ‐ガラクトシダーゼ
が特に広く使用される〔アナールス オブ クリニカル
バイオケミストリー（Annals of Clinical Biochemis
try）第16巻、221頁（1979年）〕。この種の試験は、試
料中の免疫活性分析物の含量を測定するために役立つ。
これは、分析物の濃度を、標識として共有結合したβ‐
ガラクトシダーゼを有する一過性の免疫相手を介して測
定することから成る。この試験を実施することによつ
て、免疫相手の濃度が測定すべき分析物の濃度に直接左
右されることになる。標識付けされた免疫相手の濃度は
同様に指示薬反応により可視性になる。指示薬反応でβ
‐ガラクトシダーゼで標識付けされた免疫相手をβ‐ガ
ラクトシダーゼの基質と反応させる。
生成物の形成量は、免疫相手の濃度に比例する。公知分
析物濃度を有する試料を用いて作成した検量線の値と比
較することによつて、試料中の未知の分析物濃度を測定
することができる。
加水分解酵素は、核酸を検出するための方法で核酸の標
識付け用の酵素として使用することもできる。酵素標識
としてβ‐ガラクトシダーゼを使用するこの種の方法
は、西ドイツ特許（DE-A）第2915082号明細書に詳説さ
れている。この場合でも、標識付けの量を指示薬反応で
測定する。
加水分解酵素は研究試薬としても使用される。この場合
にも、酵素の濃度を正確かつ迅速に測定することができ
ることが重要である。このために、一般に臨床診断で使
用されるものと同じ方法を使用することができる。
その際、基質は大抵の場合に試料液体に可溶性の化合物
である。加水分解酵素との反応で、その特性において、
例えば特徴的な吸光、光放出（蛍光）等によつて基質と
相違し、それによつて検出することができる生成物が形
成される。
免疫活性物質に関する試験方法には、二つの異なる技術
的態様がある。しばしば使用される態様では、測光法に
よる検査で一般的に使用されるように、検出反応はキユ
ベツト中で行われる。次いで、指示薬反応の評価を、吸
光、放射又は放射能の測定を適当な装置で測定すること
によつて行う。
その他の態様では、一部が試験支持体である一個又は数
個のフリース又はフイルム中で反応が行われる。このフ
リース又はフイルム上に必要な試薬が塗布されている。
指示薬反応の間に加水分解酵素基質から加水分解酵素活
性によつて遊離される生成物の量を、次いでこの種のフ
リース又はフイルム中で直接測定することができる。こ
の態様の利点は、大抵の場合にただ一種類の溶液、液体
試料を用いて操作することができることであり、このこ
とは方法の実施を著しく簡単にする。生じた生成物の量
を吸光度を特定の波長で測定することによつて特に簡単
に実施することができる。
このために好適な基質は、欧州特許（EP-A）第0146866
号明細書に記載のフエノールスルホンフタレイニル‐β
‐D-ガラクトシド及びその誘導体であり、これからβ‐
D-グリコシダーゼとの反応によつてフエノールスルホン
フタレイン誘導体が遊離される。基質は黄色色調を有す
るが、生成物は赤色に着色する。従つて、指示薬反応の
間に黄色から橙色をへて赤色への一般的な色変化が生じ
る。この色変化は肉眼では非常に不正確にしか判定でき
ないので、従つて、測定するために適当な測光器を使用
せねばならない。
欧州特許（EP-A）第0156347号明細書に記載のレゾルフ
イン‐β‐D-グリコシドも、グリコシダーゼとの反応で
黄色から赤色への色変化が起こる基質である。黄色と赤
色の間の移行範囲では、特に低いβ‐グリコシダーゼ活
性での視覚による評価は、主観的な結果を生じ、従つて
この場合にも評価するために装置が使用されることは明
らかである。しかし、これらの装置は比較的複雑で、従
つて高価である。レゾルフイングリコシドは、これから
生成されるレゾルフインがブリード（ausbluten）する
ので、試験支持体に使用するための基質としては好適で
はない。
加水分解酵素基質、例えばメチルウンベリフエロンガラ
クトシドも、その加水分解で蛍光特性の変化しか起こら
ないので、視覚による評価に好適ではない。これから生
成されるメチルウンベリフエロンも試験紙からブリード
しやすい。
加水分解酵素との反応で有色の生成物に変わる加水分解
酵素基質が使用される。この検出反応では色変化ではな
く、色の生成を評価すべきである。即ち、これは色強度
を色尺度の色調と比較することによつて簡単に行うこと
ができる。色盲の人でもこの種の試験は評価することが
できる。
この種の基質は、5-ブロム‐4-クロル‐3-インドリル‐
β‐ガラクトシドである。この基質は分離及び酸化後に
試験支持体からブリードしない色素を生じる。しかし、
基質自体は僅かにしか水溶性でない。従つて、これを基
礎とする試験は迅速な視覚評価にはあまり適さない。色
生成を生じる機構は、２個の5-ブロム‐4-クロル‐イン
ドリル単位のインジゴ色素誘導体への酸化性ジメン化
（Dimensierung）である。その後、色素分子を生成する
ために、基質の酵素による２回の分解が必要である。そ
れによつて理論的に可能な感受性の半分しか得られな
い。
バイオヒエミツシエ ツアイトシユリフト（Biochemisc
he Zeitschrift）第333巻、209頁（1960年）中で、基質
として、加水分解でフエノールを遊離する化合物が提案
された。しかし、これは試験支持体上でブリードしやす
い。ニトロフエノールの場合には、指示薬反応の間に、
多少の差はあれ黄色着色が起こる。少ない濃度の範囲で
視覚による評価はニトロフエノールの波長では非常に不
利である。
可視性を改良するために、付加的な反応で遊離したフエ
ノールを酸化的にアミノアンチピリン又はメチルベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンと結合させる〔アナリテイカル
バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）第4
0巻281頁（1971年）〕か又はジアゾニウム塩と反応させ
てアゾ色素にする〔例えば、ヒストヒエミー（Histoche
mie）第37巻、89頁（1973年）〕。これらの色素は大
抵、あまり簡単にブリードしないので、試験支持体に使
用するために好適であるが、これらのカツプリング反応
の使用は、その他の理由から不利である。フリース又は
フイルム上で試験を実施するために、この付加的な反応
に必要な試薬を全て同様にフリース上に塗布するか又は
フイルム中に導入しなければならない。多数の試薬、例
えばカツプリング成分は試験実施を複雑にし、多くの欠
点及び困難をもたらす；即ち、個々の場合に、試薬が時
期尚早に相互にか又は試料溶液のその他の成分と非特異
的に反応しないように注意する必要がある。即ち、アミ
ノアンチピリン又はメチルベンゾチアゾリノンヒドラゾ
ンは、成分と、例えば被検尿中で反応し、測定に誤差を
生じる恐れがある。その他のカツプリング成分、例えば
ジアゾニウム塩は貯蔵安定性を著しく損なう。試薬を選
択する場合に、試薬が既にそれ自体固有の色を有さない
こと等に配慮せねばならない。
生成された若干の色素で試験支持体上で起こるブリード
現象は、例えば、色強度がフリース又はフイルムの全場
所で同じではないという結果を生じ、これは評価する際
に不利となる。即ち、例えば測定値に誤差が生じる。
〔発明が解決しようとする課題〕
従つて、前記欠点を回避し、それを用いて加水分解酵素
活性を有する物質を試験支持体上でも簡単に、迅速かつ
正確に検出することができる加水分解酵素基質への要求
が存在した。
本発明の課題はこの要求を満たすことであつた。
〔課題を解決するための手段〕
この課題は、式I: 〔式中、Ｚは酸素、硫黄又は基Ｎ−R4を表し、R1、R2
及びR3は同一又は異なるものであつてよく、水素、アル
キル‐又はアラルキル基又は芳香族炭化水素基を表し、
R4は水素又はアルキル基を表し、式中、基R1、R2及びR3
の１個又は数個は基： −Ｏ−Ｘ で置換された芳香族炭化水素を表す〕の化合物により解
決される。
基R1、R2、R3及びR4のアルキル基は有利には炭素原子１
〜６個を有する。特に、炭素原子１〜４個を有するアル
キル基が有利であり、更に特に有利なのはメチル基であ
る。
基R1、R2及びR3のアラルキル基としては、炭素原子７〜
11個を有するアラルキル基、特にはベンジル基が有利で
ある。
基R1、R2及びR3の芳香族基は、置換されていてもよい
し、置換されていなくともよく、有利には炭素原子６〜
12個を有する。
置換されていない基としては、フエニル‐及びナフチル
基が有利である。その他の可能な基は例えば、ヘテロア
リール基、例えばフリール基及びピリジル基である。
置換された芳香族基は、有利には水素原子が１個又は数
個のハロゲン、ヒドロキシル‐、アルコキシ‐、アルキ
ル‐、アミノ‐、モノ‐又はジアルキルアミノ‐、カル
ボキシル‐、カルバモイル‐、アルコキシカルボニル、
アルキルカルボニル‐、ホルミル‐又はスルホ基又は基
‐O-Xにより置換されているフエニル‐及びナフチル基
である。芳香族基は種々のこれらの置換分を同時に有し
ていてもよい。ハロゲンとしては、塩素、臭素及びヨウ
素、特に塩素が有利である。
芳香族基のアルキル基及び芳香族基の個々の置換分中の
アルキル基は、有利には炭素原子１〜６個、特に１〜４
個を有し、それ自体置換されていてもよいし、置換され
ていなくともよい。特にメチル基が有利である。アルキ
ル基の置換分としては、ハロゲン又はヒドロキシ‐、ア
ルコキシ‐、カルボキシ‐、スルホ‐、ホスホノ‐又は
モルホリノ基が有利である。
カルボキシル‐、スルホ‐及びホスホノ基は、例えばメ
タノール又はエタノールでエステル化されていてもよ
い。
芳香族基の有利な置換位置はメタ‐及びパラ位である。
特に有利な式Ｉの化合物は、式中、基R1、R2及びR3の一
つが基‐O-Xにより置換されたフエニル基であり、もう
一つ又は二つのその他の基が、１個又は数個の電子押し
だし性置換基、例えばヒドロキシ基、置換された又は非
置換されたアミノ基又はアルコキシ基等を有する芳香族
基であるような化合物である。電子押しだし性置換基
（elektronenschiebende Substituenten）の有利な置換
位置は、パラ位である。アミノ基の有利な置換基は、炭
素原子１〜４個を有するアルキル基、特に有利にはメチ
ル‐及びエチル基であり、又は炭素原子１〜６個を有す
るアシル基、有利にはアセチル基である。２置換された
アミノ基が有利である。
基‐O-Xを有する芳香族基は同様に付加的に置換されて
いてよい。有利な置換基はアルコキシ‐及びアルキル基
である。特にメトキシ基が有利である。基‐O-Xを有さ
ない基R1、R2及びR3の芳香族基としては、4-ジメチルア
ミノフエニル‐、9-ユロリジノ‐、4-C1〜C4‐アルコキ
シフエニル基、特に有利には4-メトキシフエニル基並び
に6-N-メチル‐1,2,3,4-テトラヒドロキノリノ‐基が有
利であり、その際、メチル置換分はカルボキシル‐、ホ
スホノ‐又はスルホ‐基を有していてもよい。
基‐O-X中で、Ｏは酸素を表し、Ｘはグリコシル‐、ホ
スフエート‐又はアシル基を表す。
基Ｘのグリコシル基はヘキソースピラノシド系の単‐、
少‐及び多糖基である。有利には、単糖基、例えばグリ
コシル‐及びガラクトシル基又は所望によりアシル化さ
れた、有利にはN-アセチル化されていてもよいグルコサ
ミン基である。グルコシド基の結合は、α‐又はβ‐グ
リコシド的であつてよい。
基Ｘのアシル基は有利には炭素原子１〜20個を有し、飽
和又は不飽和、直鎖又は分枝鎖状であつてよい。特にア
シル基が有利である。
アシル基にはアミノアシル基も該当する。アミノアシル
基として有利には、天然起源のα‐L-アミノ酸のカルボ
キシル基を介して結合した基である。その際、アミノ酸
の遊離極性基、例えばアミノ官能基は好適な保護基によ
り保護されていてもよい。この種のアミノ酸は、例えば
アミノ酸基は例えばアミノ基にトシル基を有するアラニ
ル基である。
ホスフエート基は基‐PO3H2及びその塩である。これら
の塩中の陽イオンとしては、全ての陽性に荷電したイオ
ンが挙げられる。有利にはアルカリ金属、アルカリ土類
金属及びアンモニウムイオンであり、特にナトリウム
‐、カリウム‐、マグネシウム‐及びカルシウムイオン
が有利である。
式Ｉの化合物中で基R1、R2及びR3は全て基‐O-Xにより
置換された芳香族基を表すことができる。しかし、式
中、基R1、R2及びR3の最高２個、特に有利には１個だけ
がその種の芳香族基を表す式Ｉの化合物が有利である。
Ｚが酸素又は硫黄を表す場合には、R1及びR2がこれらの
基であるが、R3は水素を表さない化合物が有利である。
Ｚが酸素又は硫黄を表す場合には、式中、基R1及びR2の
一つだけが基‐O-Xにより置換された芳香族基を表す式
Ｉの化合物が特に有利である。基R1、R2及びR3からの２
つの基が、基‐O-Xにより置換された芳香族基を表さな
い場合には、両方のヒドロキシ基又は非置換のアミノ基
を有するような芳香族基ではないようなものが有利であ
る。しかし、例えばこの両方の基として、一つがヒドロ
キシ基によつて、もう一つが置換されたアミノ基によつ
て置換された芳香族基を表すようなものでないのが有利
である。
Ｚが基N-R4を表す場合には、式中、基R1、R2及びR3の
一つだけが基‐O-Xにより置換された芳香族基を表す式
Ｉの化合物が特に有利である。‐R1がこの基である場合
には、式中R2及びR3が同時にはヒドロキシ基又はアミノ
基により置換された芳香族基を表さないか又は二つの基
の一つがアミノ基により、もう一つがヒドロキシ基によ
つて置換された芳香族基を表す化合物が有利である。
‐R2又はR3がこの基である場合には、式中、R1及びその
他の基R3又はR2が同時にはヒドロキシ基又はアミノ基に
より置換された芳香族基を表さない化合物が有利であ
る。
式Ｉの化合物は、新規化合物である。
この化合物は、式II: 〔式中、Ｚ、R1、R2、R3及びR4は前記のものを表し、そ
の際、基R1、R2及びR3の１個又は数個は基‐O-Xの代わ
りに基‐O-Hにより置換された基を表す〕の化合物を、
式III: X-Y （III） 〔式中、Ｘは前記のものを表し、Ｙは反応性基を表す〕
の化合物と反応させることによつて製造することができ
る。
Ｘがグリコシル基である場合には、類似の化合物におけ
るように炭化水素化学から公知である方法を使用するこ
とができる。
このために、式IIの化合物を式IIIの活性糖と反応させ
る。その際、式中Ｙが良好な出現性の親核性基、例えば
ハロゲン、特に塩素又は臭素又はスルホニルオキシ基、
特にトルオルスルホニルオキシ‐又はメタンスルホニル
オキシ基を表す化合物が有利であると実証された。その
際、遊離ヒドロキシ‐又はアミノ基が反応の間に好適な
保護基により保護されたままであるのが有利であると実
証された。その際、基‐O-Xに変えるべきである基‐O-H
はもちろん保護基を有してはならない。
Ｘがアシル基である場合には、アルコール並びに特にフ
エノールからエステルを有機カルボン酸との反応により
製造するために一般に公知である方法を使用することが
できる。アミノ酸の官能基はエステル化の前に有利には
好適な保護基によりマスキングされる。反応により保護
基を再び脱離することができる。反応性基Ｙは良好な出
現性の親核基である。その際、特にハロゲン、アルコラ
ート及びカルボキシレートが有利である。
式中、Ｘがホスフエート基である式Ｉの化合物を製造す
るためには、式中Ｘが基‐POW2又は‐PW4（式中、Ｗは
良好な脱離基、特にＣ原子１〜４個を有するアルコラー
ト又は塩素、臭素又はヨウ素を表す）を表し、Ｙがハロ
ゲン、有利には塩素、臭素又はヨウ素又はアルコラート
を表す式Ｉの化合物を製造するためには、特に有利には
式Ｘ−Ｙはオキシ三塩化燐である。この場合でも、遊離
ヒドロキシ基及びアミノ基を、基‐O-Xに変えられるヒ
ドロキシ基を除いて、反応後に脱離可能な保護基により
マスキングすることが有利である。Ｘが基‐POW2又は‐
PW4を表す化合物は公知方法でホスフエートに変えるこ
とができる。
ホスフエートの塩は、公知方法で、例えばイオン交換体
により遊離酸から製造することができる。
式II及びIIIの化合物は公知化合物であるか、又は有機
合成の公知方法と同様にして製造することができる。特
にトリアリールイミダゾールが西ドイツ特許（DE-A）第
2735690号明細書から公知である。欧州特許（EP-B）第0
161436号及び欧州特許（EP-A）第0167973号明細書にも
式IIの化合物が記載されている。使用にはヒドロキシペ
ルオキシドの検出が含まれる。
本発明による式Ｉの物質は、例えば、自体公知の方法に
よつてか、又はＺが基N-R4を表し、Ｘがグリコシル基
を表す場合には、式IV: 〔式中、R2及びR3は前記のものを表す〕のα‐ジケトン
を式V: Ｏ＝CH-R1 （Ｖ） 〔式中R1は前記のものを表す〕のアルデヒド及びアンモ
ニア又は式VI: NH2R4 （VI） 〔式中、R4は前記のものを表す〕と氷酢酸中で縮合させ
るか又は ｂ）Ｚが基N-Hを表し、Ｘがグリコシル基を表す場合
には、式VII: 〔式中、R2及びR3は前記のものを表す〕のα‐ケトキシ
ムを式Ｖのアルデヒド及びアンモニア又は式VIのアミン
を反応させて、式VIIa）： 〔式中、R1、R2及びR3は式IIに記載のものを表す〕の化
合物にし、この化合物を還元するか又は ｃ）Ｚが基N-Hを表し、Ｘがグリコシル基を表す場合
には、式VIII: R2‐CO-CHR3Hal （VIII） 〔式中、R2及びR3は前記のものを表し、Halは弗素、塩
素又は臭素を表す〕のα‐ハロゲンケトンを式IX: 〔式中、R1は前記したものを表す〕のアミジンとアルカ
リ媒体中で反応させるか又は ｄ）Ｚが酸素又は基N-Hを表す場合には、式X: 〔式中、R1、R2及びR3は前記のものを表す〕の化合物を
ルイスの酸又はペンタスルフイドと反応させるか又は ｅ）Ｚが酸素を表す場合には、式XI: 〔式中、R1、R2及びR3は前記のものを表す〕の化合物を
酢酸アンモニウムと氷酢酸中で反応させるか又は ｆ）Ｚが硫黄を表し、Ｘがグリコシル基を表す場合に
は、式XII: 〔式中、R1は前記のものを表す〕のチオアミドを式VIII
〔式中、R2及びR3は前記のものを表し、Halは弗素、塩
素又は臭素を表す〕のα‐ハロゲンケトンと反応させ、
引き続き、所望により、得られた化合物を式Ｉの化合物
に変え並びに相応する塩基を塩に変えるか又は塩を塩基
に変えることによつて製造することができる。
この方法で場合により存在する反応性官能基（ここで反
応は起こるべきではない）を、あとで再び脱離させるこ
とができる、公知保護基により保護することができる。
方法ａ）〜ｆ）により得られる化合物を式Ｉの化合物に
変えることは、例えば、接触水素添加（ニトロ‐‐→ア
ミン）、Pd/Cを用いる水素添加による保護基の脱離（O-
ベンジル‐‐→ヒドロキシル）、複素環の水素添加（フ
ラニル‐‐→テトラヒドロフラニル）、水素添加による
複素環の分解（テトラヒドロフラニル‐‐→4-ヒドロキ
シブチル）、アミンの還元アルキル化（アミン‐‐→ジ
アルキルアミン）によつて行われる。
式Ｉの4-アミノ‐化合物をハロゲン‐メタン‐又は2-エ
タン‐カルボン酸、‐スルホン酸並びに‐ホスホン酸又
はその塩とDMF中で反応させることによつて、相応するN
-アルキルアミノ‐メタン‐又は2-エンタ‐酸基が得ら
れる。
式VIIa）のN-オキシデンの還元は、例えば亜鉛／酢酸又
は触媒的に刺激された水素を用いて行うことができる。
式Ｉの化合物の合成は、ジヤーナル オブ オーガニツ
ク ケミストリー（Jounal of Organic Chemistry）第
２巻319頁（1937年）又はツアイトシユリフテ ヒユア
ヒエミー（Zeitschrift fuer Chemie）第10巻431頁
（1970年）及び第11巻10頁（1971年）により行うことが
できる。
意外にも、本発明による式Ｉの化合物は、加水分解酵素
基質として非常に好適である。この化合物は加水分解酵
素と接触しない限り、水溶性であり、無色で安定してい
る。
非常に良好な水溶性が所望される場合には、有利には１
個又は数個の極性基、例えばカルボキシル基、スルホ‐
又はホスホノ基が含有されている式Ｉの化合物を使用す
る。
式Ｉの化合物の溶解性は、反応媒体の極性を低下させる
ことによつて、例えば有機溶剤、例えばアルコール、ジ
メチルスルホキシド又は清浄剤を添加することによつて
達成することもできる。
本発明による方法で加水分解酵素基質として、分子部分
Ｘが相応する加水分解酵素の天然の基物の分子と同じで
あるような式Ｉの化合物が、特に好適である。即ち、例
えばβ‐ガラクトシダーゼ基質として、式中Ｘがβ‐ガ
ラクトシル基を表す式Ｉの化合物が、エステラーゼ基質
として、式中Ｘがアシル基を表すものが、そしてホスホ
ターゼ基質として、式中Ｘがホスフエート基である式Ｉ
の化合物が特に好適である。
本発明の目的は、加水分解酵素基質として式Ｉの化合物
少なくとも１種類を使用することを特徴とする、試料を
加水分解酵素基質及び酸化剤と混合し、生じる色強度を
評価することによつて、試料中の加水分解酵素活性を有
する物質を検出する方法でもある。
加水分解酵素活性を有する物質は、化学的な化合物を水
の使用下で二つの生成物に分解することができる物質で
ある。これには、天然起源又は人工的に製造される酵素
主群３（Enzymhauptklasse3）の加水分解酵素が属す
る。本発明による方法はグリコシダーゼ、有利にはグリ
コシダーゼ及びガラクトシダーゼ及びエステラーゼ、有
利にはリパーゼ及びホスフアターゼ、特に有利にはアル
カリ性ホスフアターゼ又は豚肝臓‐エステラーゼの検出
に特に有利であると実証された。
しかし、加水分解酵素活性を有する物質には、その他に
これらの加水分解酵素とその他の化学的化合物、例えば
免疫学的に活性化合物又は核酸との化合物も含まれる。
免疫学的に活性化合物には、例えばハプテン、抗原及び
抗体及び免疫複合体が属す。しかし、これには抗体のフ
ラグメント、例えばFab-又はＦ（ab′）２‐フラグメン
トも含まれる。これらの加水分解酵素と免疫学的に活性
の化合物との結合物は、しばしば加水分解酵素‐複合体
とも呼ばれる。その際、加水分解酵素は、免疫学的に活
性の化合物を標識付けするために役立つ。特に本発明に
よる方法は、標識としてβ‐ガラクトシダーゼ、β‐グ
ルコシダーゼ並びにアルカリ性又は酸性ホスフアターゼ
を用いる免疫学的に活性の化合物の検出に好適である。
加水分解酵素基質とは、加水分解酵素活性を有する該当
する物質による反応を受ける化合物のことである。この
基質から、水の吸収下に２つの生成物が生成される。そ
の際、反応は酵素運動学で公知の規則に従う。前提条件
は、基質が少なくとも大部分加水分解酵素活性を含有す
る溶液に可溶性であることである。
試料とは、有利には固体又は液体試料である。
固体試料の場合には、可溶性と殆ど不溶性の試料に区別
することができる。
可溶性試料は、有利には検出するために液体試料に変え
る。
殆ど不溶性の試料とは、有利には、その外又は内表面上
に加水分解酵素活性を有する物質が結合している固体で
ある。この結合の種類は本発明による方法に重要ではな
い。この結合は例えば、共有結合的なものであつてもよ
いし、イオン又は吸着性のものであつてもよいし又は生
物特異的なものであつてもよい。生物特異的な結合は生
物学的結合相手間の結合、例えば抗原又はハプテンとし
て作用する物質と抗体、ビオチンとアビジン又はストレ
プトアビジン、相補的核酸等との間の結合である。
加水分解酵素活性を有する物質を検出すべきである液体
試料とは、主として水溶液である。これらの溶液は例え
ば水中の加水分解酵素の溶液である。しばしば、これら
の溶液に混合物、例えば塩、界面活性剤等を、例えば貯
蔵安定性を高めるために、添加することができる。この
種の溶液中に本発明による化合物を使用することもでき
る。液体試料は体液又はそれから成分を添加又は分離後
に得られる液体であつてよい。これには例えば、血液、
血シヨウ、血清又は尿が属す。
液体試料は有利には、免疫学的試験法の経過中に生成す
るような液体であつてもよい。これらは、例えば、アナ
ールス オブ クリニカルバイオケミストリー（Annals
of Clinical Biochemistry）第16巻、221頁（1979年）
に記載されているもの及びその有利な発展物であり、こ
れらは免疫分析の分野の専門家に公知である。この種の
液体中で加水分解酵素活性を有する物質を本発明による
方法で検出することができる。これらの溶液は多くの場
合に、検出に重大な傷害を引き起こさないような緩衝物
質、安定化剤、湿潤剤等を含有する。
加水分解酵素活性を有する物質の濃度は、有利には10-6
〜10-15モル/1、有利には10-6〜10-12モル/1の範囲で測
定することができる。
この方法は、pH値が５〜11、有利には６〜10である試料
溶液に好適である。方法が実施される最適pH値は、使用
される加水分解酵素に左右される。方法は迅速に行うた
めに、加水分解酵素が最高活性を有するようなpH値でか
又はその近くで実施するのが有利である。この範囲の外
では著しい非酵素的加水分解又は加水分解酵素の不活性
化が起こりうる。
検出反応は有利には吸収性又は膨潤性支持体で行われ
る。
この種の支持体は例えばフリース又はフイルムである。
フリースが有利である。フリースとは、繊維から成る紙
状の材料である。繊維材料としては、有利にはセルロー
ス、プラスチツク又はその混合物が使用される。スポン
ジ状又は／及び多孔性支持体も好適である。
しかし、検出反応は任意の容器中で、例えばキユベツト
中で実施することもできるし、微量滴定プレート上でも
行うことができる。反応経過を吸光光度計により追跡す
べきである場合には、反応媒体中に可溶性である生成物
を形成するような式Ｉの化合物が特に好適である。一つ
の方法は、反応媒体の極性により１個又は数個の極性
基、例えば１個のカルボキシル‐又はスルホ基を有し、
それらの基が強力な親油性特性を有さない、式Ｉの化合
物を使用することである。溶液中の加水分解酵素活性を
有する物質を検出するためのその他の方法は、反応媒体
の極性を低下させる溶液、例えば有機溶剤を添加するこ
とである。これらの付加的な成分の欠点を甘受すること
によつて、加水分解生成物の溶解度は高められる。
指示薬反応の間に色を発現させるために、酸化剤の存在
が必要である。酸化剤としては、その酸化ポテンシヤル
が式IIの遊離された化合物の値より上であるような物質
又は物質混合物を使用することができる。例えば、ヘキ
サシアノ鉄（III）カリウム、過ホウ酸塩／ペルオキシ
ダーゼ、過酸化物／ペルオキシダーゼ、テトラゾリウム
塩又は酸素／ビリルビンオキシダーゼが特に有利である
と実証された。
本発明による方法を実施するために、試料を、加水分解
酵素基質としての少なくとも１種類有利には１種類の、
式Ｉの化合物及び酸化剤と混合する。
試料と加水分解酵素基質との混合は種々の方法で行うこ
とができる。
試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合することが、
同時に行つても、順次行つてもよい。
液体試料、例えば加水分解酵素活性を有する物質の溶液
の場合には、加水分解酵素基質又は酸化剤を固体、例え
ば粉末、錠剤、凍結乾燥物等の形でか又は試料の溶液の
形で添加することができる。
検出反応が吸収性又は膨潤性支持体で行われる場合に
は、試料を、その上に加水分解酵素基質並びに場合によ
り酸化剤及び添加剤を含浸させてある支持体上に載せる
のが特に有利であると実証された。含浸させるために、
前記物質の溶液を製造し、それを支持体材料に含浸させ
る。引き続き、含浸させた支持体材料を乾燥させる。
支持体がフイルムである場合には、有利には加水分解酵
素基質並びに場合により酸化剤及び添加剤をその製造の
時に既にフイルム中に組み入れる。
酸化剤が加水分解酵素基質と一緒には存在しない場合に
は、酸化剤を、試料を加水分解酵素基質と混合する前又
はその後に試料と混合する。
後反応が容器中で起こる場合には、加水分解酵素基質を
固体又は溶液として、場合により酸化剤及び添加剤と混
合して使用することが有利であると実証された。この場
合にも酸化剤又は添加剤を別々に添加することができ
る。
固体の試料の場合に、例えば加水分解酵素活性を有する
物質が支持体材料と結合している場合には、加水分解酵
素基質又は／及び酸化剤を試料に溶液の形で添加するこ
とが有利である；しかし、例えば成分を先ず混合し、次
いで液体を溶液を製造するために添加することもでき
る。
検出法の結果に重要なのは、加水分解酵素基質を試料中
に存在する加水分解酵素活性を有する物質と酵素反応が
起こるように接触させることである。
指示薬反応の間に、置換の型により赤から青に及ぶ強力
な色が生じる。その色強度は公知方法により光度計、特
に反射光度計を用いて測定することができる。その際、
指示薬反応の生成物が吸収することができる波長の光を
照射する。500〜700nm、特に520〜680nmの波長が有利で
ある。
色強度を、加水分解酵素活性を有する公知濃度の物質を
含有する試料に関して値を測定することによつて得られ
た検量線の値と比較し、各各の強度を特定の濃度に対応
させる。この比較は有利にはコンピユーターを用いて行
う。
しかし、色の変化ではなく、色発現を観察すべきである
ので、肉眼で評価することも可能である。このことは、
装置を使用しなくともよいという利点を有する。即ち、
誤謬の源の可能性、例えば装置の操作ミス等も無くな
る。
本発明による方法は、加水分解酵素活性を有する物質の
定性検査に使用することもできるし、定量検査に使用す
ることもできる。定性評価のために、変色が起きたか否
かを観察する。定量測定には、特定の時点で色を、各々
の色が特定の濃度に対応している色段階と視覚により比
較する。
本発明による加水分解酵素基質を使用する場合に、特に
強力に発色する化合物が生じる。置換の型に依り、青か
ら赤の色を有する化合物が得られる。これにより大きな
使用分野が生じる。
本発明による方法は、特に有利な利点を有する試験支持
体に使用することができる。例えば、方法が簡単で安価
であり、しかも確実な結果を生じることは有利である。
方法は例えば、視覚によつても評価できることにより簡
単であり；これによつて高価な装置が省かれる。試験支
持体上でブリード現象が起きないので、特に正確であ
る。これは非常に有利である。
試験支持体とは、この試験の実施による物質を検出する
物体である。この試験支持体は一般に主として、その上
に試験に必要な試薬を大抵はフリース又はフイルムによ
り塗布されている基礎プレート又はシートから成る。
本発明の方法では、有利にはその他のカツプリング成
分、例えばジアゾニウム塩を使用しない。それは、これ
らが副反応を生じるか又は安定性を失わせることになる
からである。発色には式Ｉの化合物だけが関与する。こ
れによつて、２つの化合物の間の縮合過程で生じる欠点
及びインドール型の化合物で存在するような欠点が回避
される。
免疫学的試験法には、特に、加水分解酵素活性を有する
物質の含量を調べるべきである加水分解酵素複合体の試
料も使用される。
本発明による方法は別に、加水分解酵素活性を有する物
質を検出するために、従つて例えば分析物を検出するた
めに免疫学的方法で使用することができる。この種の方
法は免疫分析の分野の専門家に公知である〔例えば、ア
ナールス オブ クリニカル ケミストリー（Annals o
f Clinical Chemistry）第16巻、221頁（1979年）〕。
この方法は、加水分解酵素で標識付けした免疫学的に活
性の化合物を本発明による方法を用いて実施するという
ふうに変更される。下記の例に付き詳説する： 分析物が抗原又はハプテンである場合には、下記の方法
が挙げられる： ‐分析物を含有する試料容液に分析物に対する抗体及び
加水分解酵素から成る過剰の複合体を加える。分析物及
び複合体から成る免疫複合体が生じる。過剰の複合体は
免疫反応により、過剰の分析物又は分析物類似化合物と
結合している支持体と結合される。加水分解酵素及び免
疫複合体から成る複合体を含有する溶液を支持体から分
離し、本発明による方法により処理する。加水分解酵素
複合体に関する実験結果が得られ、これから、分析物の
存在又は量を推測することができる。その他の可能性
は、支持体と結合した、加水分解酵素及び抗体から成る
複合体の検出である。これも本発明による方法により可
能である。
‐分析物を含有する試料溶液に、分析物に対する抗体及
び加水分解酵素から成る過剰の複合体を加える。分析物
及び複合体から成る免疫複合体が生成される。過剰の複
合体は免疫反応により、分析物に対する過剰のその他の
抗体が結合している支持体と結合される。加水分解酵素
及び抗体から成る過剰の複合体を含有する溶液を支持体
から分離し、本発明による方法によつて、支持体と結合
した免疫複合体及び加水分解酵素から成る複合体又は溶
液中に含有される抗体及び加水分解酵素から成る複合体
を検出する。
‐分析物を含有する試料溶液に、公知量の分析物又は分
析類似物及び加水分解酵素から成る複合体を加える。混
合物を支持体（これに分析物及び複合体から成る合計に
対して公知の不足の分析物及び分析物類似物に対する抗
体が結合している）上に載せる。分析物及び複合体の一
部は、支持体に結合される。本発明の方法によれば、溶
液の分離後、支持体に結合したか又は溶液中に存在する
複合体を検出することができる。
分析物が抗体である場合には、同じ原理を使用すること
ができるが、その場合には前記方法における抗体の代わ
りに、抗原又はこの抗体に対応する抗体を使用すべきで
ある。
分析物を検出するための免疫学的方法では、本発明の方
法による加水分解酵素複合体の検出に引き続いて評価を
行う。検出された加水分解酵素複合体の存在からか又は
その量を定量的に評価する際に、最初に使用した試料中
の分析物の存在又は量を推論することができる。これは
例えば、検量線を用いて行うことができる。
更に、加水分解酵素活性を有する物質を検出するための
本発明による方法を、核酸の検出法に使用することがで
きる。この種の方法は、核酸ハイブリツド化試験の分野
の専門家に公知である。この試験で、その量が検出すべ
き核酸の濃度の尺度である。一本鎖又は二本鎖の核酸、
特にDNA又はRNA又は酵素標識付けとして加水分解酵素と
結合しているフラグメントが検出される。この加水分解
酵素標識付けされた核酸の検出は、加水分解酵素活性を
有する物質を検出するための本発明の方法により、有利
に行われる。
この新規免疫学的方法及び核酸を検出するための新規方
法の利点は、加水分解酵素活性を有する物質を検出する
ための本発明の方法の利点から明らかである。
本発明のもう１つの目的物は、少なくとも１種類の式Ｉ
の化合物を含有する加水分解酵素活性を有する物質の検
出剤である。この種の検出剤は、前もつてか、同時にか
又は次の工程で酸化剤を添加される試料中の加水分解酵
素活性を有する物質の検出に好適である。
式Ｉの化合物少なくとも１種類及び酸化剤を含有する加
水分解酵素活性を有する物質の検出剤が有利である。
更に、この検出剤は、本来の検出反応には必要ではない
が、有利な作用を生じる添加剤を含有することができ
る。これには特に、検出反応を一定のpH値で行うことが
できるようにするpH緩衝物質が属する。同様に支持体材
料の均一な湿潤を惹起する湿潤剤及び清浄剤が包含され
る。
本発明による検出剤は有利には一種又は数種の吸収性又
は膨潤性の支持体を含有する。この種の支持体は、例え
ば、フリース又はフイルム、有利にはフリースである。
スポンジ状又は多孔性支持体も好適である。
この検出剤は有利には、この上に加水分解酵素及び酸化
剤が一緒にか別々に含浸させてあるか又はフイルムの場
合には組み込んである、一種又は数種の吸収性又は膨潤
性支持体を含有する。この種の検出剤の製造は自体公知
の方法により行われる。
本発明による検出剤は、例えば加水分解酵素及び酸化剤
並びに場合により存在する添加物の他に溶剤も含有す
る。有利な溶剤は水である。この場合でも、加水分解酵
素基質及び酸化剤は一緒にか又は別々に溶液として存在
してもよい。
本発明による検出剤は、一種又は数種の粉末又は粉末混
合物の形で存在してもよい。加水分解酵素基質及び酸化
剤の他に、この種の検出剤は、有利には常用の不活性の
可溶性ガレヌス填料、例えばポリビニルピロリドン、ポ
リエチレングリコール等を含有することができる。粉末
又は粉末混合物を圧縮成形して錠剤にすることもでき
る。
この種の検出剤は、加水分解酵素活性を有する物質の検
出法に使用するために好適である。
本発明のその他の目的は、式Ｉの化合物を試料中の加水
分解酵素活性を有する物質を検出するための前記方法に
使用することである。
次に本発明を実施例につき詳説する。
例１（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）1-
H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール‐ヒ
ドロクロリド 氷酢酸400ml中の4-ヒドロキシ‐3-メトキシベンズアル
デヒド（バニリン）30.4g（0.2モル）の溶液を1-（4-ジ
メチルアミノフエニル）プロパンジオン‐1,238.24g
（0.2モル）及び酢酸アンモニウム154g（２モル）と一
緒に３時間還流下で加熱し、その後、氷冷却下で濃アン
モニア1.1中に注入する。得られた粗生成物を酢酸エ
ステル中に入れ、水と一緒に十分に振り、溶剤を硫酸ナ
トリウム上で乾燥後、真空中で濃縮する。残分をエタノ
ール中に溶かした後、5Nのエーテル性塩酸の添加により
塩酢塩を沈澱させ、これをイソプロパノール‐水3:1か
ら再結晶させることによつて精製する。標題化合物の無
色結晶58g（81％）が得られる。触点＞200℃（分解）M
S:m/e＝323（塩基）。
H2O2/PODを用いるロイコ化合物の酸化により‐‐→発色
体λmax693nm、ε＝19500DC（シリカゲル60、酢酸エス
テル）:0.27 例２（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）オ
キサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール ａ）4-N,N-ジメチルアミノ‐α〔（4-ヒドロキシ‐3-メ
トキシ）‐ベンゾイルオキシ〕‐プロピオフエノン 4-ヒドロキシ‐3-メトキシ安息香酸ナトリウム4.5g（0.
024モル）をDMF50ml中に懸濁させ、4-N,N-ジメチルアミ
ノ‐α‐ブロムプロピオフエノン8g（0.03モル）を添加
し、６時間還流下で加熱する。真空中で濃縮した後、残
分をシリカゲルカラム（シリカゲル60;φ3cm、充填高さ
26cm）のクロマトグラフイーにかける（溶離剤:n-ヘプ
タン／メチルエチルケトン2/1）。標題化合物3.5g（42.
5％）が得られる。融点151/154℃。
ｂ）4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチ
ル）‐オキサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール 2aで得られた生成物を氷酢酸18ml中の酢酸アンモニア4.
2g（0.054モル）と一緒にアルゴン化で３時間、還流下
で加熱し、冷却する際に着色した生成物が得られ、これ
を水50mlと攪はんし、吸引濾過し、五酸化二燐を用いて
乾燥させた後、標題化合物3.1g（94.5％）、融点170〜1
73℃、が得られる。
DC:（シリカゲル60-F254、溶離剤：トルエン／メタノー
ル5/1） RF＝0.31、MS:m/e324 H2O2/PODを用いる酸化後、λmax542nm、ε＝14558 例３（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
チアゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエノール ａ）4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチ
ル）‐チアゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエノー
ル‐ベンジルエーテル 4-ベンジルオキシ‐3,5-ジメトキシ‐フエニルチオアセ
トアミド7.4g（0.024モル）を無水エタノール240ml中に
溶かし、4-ジメチルアミノ‐α‐ブロムプロピオフエノ
ン6.2g（0.026モル）を加え、６時間還流下で加熱す
る。吸引濾過し、反応生成物を無水エタノールで洗浄し
た後、ベンジルオキシ化合物8.5g（76％）、黄色結晶、
融点50〜53℃、が得られる。
DC（シリカゲル60-F254、トルエン／酢酸エステル5:1-
均一） ｂ）4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチ
ル）‐チアゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエノー
ル 3aで得られたＯ−ベンジルエーテルをメタノール300ml
中に加熱下で溶かし、還流煮沸下で２時間塩化水素ガス
を導入する。冷却する際に、黄色の結晶3b、5.9g（88.2
％）が晶出する。
融点230〜233℃。
MS:m/e＝370 H2O2/PODを用いる酸化後、λmax564nm、ε＝7687 例４（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニルアセ
テート 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール‐
ヒドロクロリド3.5gをピリジン200ml中に溶かし、無水
酢酸20mlを滴加し、１時間室温で攪はんし、生成した結
晶を吸引濾過し、濾過器残分を氷冷エタノールで洗浄
し、得られた晶状酢酸塩を40℃で乾燥箱中で乾燥させ
る。標題化合物の淡黄色結晶3.23g（82％）が得られ
る。
DC:（シリカゲル 60 F254-塩化メチレン／メタノール5
/1-RF＝0.77） 同様にして次のものが製造される： 例4a（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
オキサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニルアセテー
ト MS:m/e＝366、融点97/102℃、収率75％ DC:（シリカゲル 60 F-254-トルエン／メタノール5/1:
RF＝0.36） 例4b（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
チアゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシ‐フエニルアセ
テート MS:m/e＝412、融点247〜249℃、収率73％ DC:（シリカゲル 60-F 254-トルエン／酢酸エステル5/
1） RF＝0.34 例4c（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1H-イミダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシ‐フエニ
ルアセテート MS:m/e＝395、融点＞250℃、 収率:78％ DC:（SiO2‐60-F 254-トルエン‐メタノール5:1）RF＝
0.19 酵素分解及び引き続くK3〔Fe(CN)6〕を用いる酸化‐‐
→ 発色体：λmax680nm、1gε＝4.4 例4d（参考例） 4-〔（4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）1H-イミ
ダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエニルアセテー
ト MS:m/e＝500、融点261〜262℃、 収率:72％ DC:（シリカゲル60-F254:クロロホルム／テトラヒドロ
フラン1/1）:RF＝0.81酵素分解及び引き続くK3〔Fe(CN)
6〕を用いる酸化‐‐→ 発色体：λmax643nm、1gε＝4.36 例５（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシ‐ドデカノエ
ート 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシ‐フエノール
1.6g（0.005モル）を無水ピリジン20ml中に溶かし、10
分以内にドデカン酸クロリド98％3.6ml（0.01モル）を
攪はん下で滴加する。１時間更に攪はんした後、氷水50
mlを添加し、酢酸エステル各々50mlで２回抽出する。硫
酸ナトリウムを用いて乾燥させ、溶剤を蒸発除去した
後、粗生成物をカラムクロマトグラフイーで精製する。
（SiO2、トルエン／酢酸エステル1:1）。標題化合物の
ベージユ色の結晶1.3g（48％）が得られる。
MS:m/e＝505。融点110〜112℃。
DC:（シリカゲル60-F254-トルエン／メタノール5/1）RF
＝0.34）、 同様にして次のものが製造される： 例5a（参考例） 4-〔（４（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐プ
ロパノエート MS:m/e＝379、融点244〜246℃、収率56％ DC:（シリカゲル 60 F-254-トルエン／酢酸エステル1/
1）RF＝0.31 例5b（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐ブ
タノエート MS:m/e＝393、融点62〜64℃、収率:63％ DC:（シリカゲル 60F 254-トルエン／酢酸エステル1/
1、RF＝0.33 例5c（参考例） 4-〔（４（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐ペ
ンタノエート MS:m/e＝407、無定形、収率:72％ DC:（シリカゲル 60-F 254-トルエン／酢酸エステル2/
1）、RF＝0.18 例5d（参考例） 4-〔4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐1-
H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐オク
タノエート MS:m/e＝449、融点126〜129℃、 収率:78％ DC:（シリカゲル 60-F 254-トルエン／酢酸エステル1/
1）:RF＝0.44 例６（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシ‐ジヒドロゲ
ンフオスフエート ピリジン20ml及びオキシ三塩化燐6ml（0.065モル）の混
合物に10分間以内にピリジン20ml中の4-〔（4-（4-ジメ
チルアミノフエニル）‐5-メチル）‐1-H-イミダゾール
‐2-イル〕‐2-メトキシ‐フエニノール3.2g（0.01モ
ル）の溶液を滴加し、その際、温度は約30℃に上昇す
る。３時間室温で攪はんし、室温で２時間放置した後、
生成した結晶を吸引濾過し、水で洗浄し、粗生成物を五
酸化二燐を用いて乾燥させる。イソプロパノール/n-ブ
チルアセテート／水／アンモニア50:30:15:5を用いるシ
リカゲル60のカラムクロマトグラフイーによる精製（カ
ラム：充填高さ84cm φ2.5cm）により、標題化合物が
得られる。
MS:m/e＝403、融点226/230℃。
DC:（シリカゲル 60 F254-n-プロパノール／酢酸エス
テル／H2O／酢酸60:10:30:5、RF＝0.51） 同様にして次のものが製造される： 例6a（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエニル
‐ジヒドロゲンホスフエート MS:m/e＝433、融点196〜198℃、収率35％ DC:（シリカゲル 60-F254、塩化メチレン／メタノール
75/75）均一。
例6b（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-フエニル）
‐1-H-イミダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエニ
ル‐ジヒドロゲンフオスフエート MS:m/e＝495、融点230/235℃、収率:28％ が下記から得られる： 例１のような相応するジケトンからの４〔（4-（4-ジメ
チルアミノフエニル）‐5-フエニル）‐1-H-イミダゾリ
ル〕‐2,6-ジメトキシフエノールから、 MS:m/e＝410、融点181℃（分解）λmax（H2O2/PODを用
いる酸化後）680nm。
1gε＝4.3 例6c（参考例） 4-〔4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）‐1-H-イミ
ダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシ‐ジヒドロゲンフ
オスフエート MS:m/e＝538、融点258〜260℃、 収率:45％ 4-〔（4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）‐1-H-イ
ミダゾール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエノール（KO
DAK）から、λmax（H2O2/PODを用いる酸化後）643nm、1
gε＝4.4 例７（参考例） 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル‐5-メチル）‐オ
キサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐ジヒドロ
ゲンフオスフエート ａ）4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル‐5-メチル）
‐オキサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニルジベン
ジルオキシフオスフエート 4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐
オキサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール3.24g
（0.01モル）を無水テトラヒドロフラン40ml中に懸濁さ
せ、四塩化炭素2mlを添加し、油浴中で40℃に加熱する
と、その際、オキサゾールは完全に溶液になる。その
後、順次燐酸ジベンジル6ml及びトリエチルアミン4mlを
５分間以内に滴加する。５時間室温で攪はんし、生成し
た塩化トリエチルアンモニウムを吸引濾過し、濾液を真
空中で濃縮する。得られた粗生成物をカラムクロマトグ
ラフイーにより精製する（シリカゲル60カラム1.1m、φ
3cm-トルエン／メタノール20/1）。
ｂ）4-〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチ
ル）‐オキサゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエニル‐
ジヒドロゲンホスフエート ａ）からの化合物1gをメタノール8ml及びジオキサン8ml
の混合物中で、PdO0.06gの添加下で４時間半室温で加水
分解する。その後、最終生成物をカラムクロマトグラフ
イーにより精製し、標題化合物0.8g（19.8％）、黄色油
状物が得られる。
MS:m/e＝404、無定形、 DC:（シリカゲル 60-F254-n-プロパノール／酢酸エス
テル／水／トルエン／氷酢酸60/10/30/5/2）:RF＝0.7
4。
ｃ） ４〔（4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）オキサゾ
ール‐2-イル〕‐2,6-ジメトキシフエニル‐ジヒドロゲ
ンホスフエート MS:m/e＝539、融点195/200℃ ４〔（4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）オキサゾ
ール‐2-イル〕‐2,6-ジメチルオキシフエノールから。
MS:m/e＝459、融点218℃ λmax（H2O2/PODを用いる酸化後、）555nm、1gε＝3.85 例８（参考例） 4-（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐1H
-イミダゾール‐2-イル）‐2-メトキシフエニル）‐2-
（アセトアミド）‐2-デオキシ‐β‐D-グルコピラノシ
ド ａ）２〔4-（2-アセトアミド‐2-デオキシ‐3,4,6-トリ
アセチル‐β‐D-グリコピラノシルオキシ）‐3-メトキ
シフエニル〕‐5-メチル）‐４（4-ジメチルアミノフエ
ニル）‐1,3-イミダゾール（MS＝651） 水200ml中のn-ブチルトリエチルアンモニウムブロミド7
g（0.025モル）の溶液に、クロロホルム200ml中の4-
〔（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル）‐1-
H-イミダゾール‐2-イル〕‐2-メトキシフエノール5.9g
（0.0164モル）の溶液、更に1-クロル‐2-デソキシ‐2,
3,4,6-テトラアセチル‐β‐D-グルコスサミン14.2g
（0.039モル）及び炭酸カリウム13.9g（0.102モル）を
添加する。強力に攪はんしながら４時間還流下で煮沸す
る。冷却後、クロロホルム相を分離し、溶剤を真空中で
濃縮する。得られた粗生成物をシリカゲルを用いるカラ
ムクロマトグラフイーにより精製する（溶離剤‐塩化メ
チレン／メタノール1:1）。テトラアセチル化合物4.4g
（41.1％）が得られる。
ｂ）（4-（4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチ
ル）‐1H-イミダゾール‐2-イル）‐2-メトキシフエニ
ル）‐2-アセトアミド‐2-デオキシ‐β‐D-グルコピラ
ノシド 8a）で得られた生成物を脱アセチル化するために、これ
をメタノール300ml中に溶かし、炭酸水素ナトリウム20g
の添加後に３時間30℃で攪はんする。無機物質を吸引濾
過した後、溶剤を濃縮し、最終生成物をシリカゲル60、
溶離剤：トルエン／メタノール1:1を用いるカラムクロ
マトグラフイーにより後精製する。DC-均一な生成物3.1
g（36％）が得られ、氷冷メタノールと一緒に攪はんし
た後、標題化合物1.8g（21％）が得られる。
MS:m/e＝525、融点181℃ DC:（シリカゲル 60F254、トルエン／氷酢酸／メタノ
ール1:1:1）RF＝0.21。
この化合物は、pH6及びpH9でN-アセチル‐β‐D-グルコ
ースアミニダーゼ用の非常に良好な基質となる（強力な
青色着色）。
例９（参考例） 2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ‐3-メトキシフ
エノル）‐5-メチル‐4-（4-ジメチルアミノフエニル）
‐1,3-イミダゾール ａ）２〔（4-（テトラ‐o-アセチル‐β‐D-ガラクトピ
ラノシルオキシ）‐3-メトキシフエニル〕‐5-メチル‐
4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐1,3-イミダゾール 氷酢酸（200ml）中の（4-ホルミル‐2-メトキシフエニ
ル）2,3,4,6-テトラ‐o-アセチル‐β‐D-ガラクトピラ
ノシド〔R.G.プライス（Price）その他、クリニカ ヒ
エミカ アクタ（Clinica Chemica Acta）第124巻（198
2年）195〜204頁;4.8g、10モル〕、1-（4-ジメチルアミ
ノフエニル）プロパンジオン‐1,2（1.9g、10ミリモ
ル）及び酢酸アンモニウム（7.7g、100ミリモル）の溶
液を１時間125℃に加熱する。引き続き、氷／水上に注
ぎ、沈澱を吸引濾過し、乾燥させる。カラムクロマトグ
ラフイーによる精製後（SiO2；トルエン／酢酸エステル
／メタノール＝4:4:1）、融点163〜168℃、m/e653
（M+）の標題化合物4.2g（65％）が得られる。
ｂ）2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ‐3-メトキ
シフエノル）‐5-メチル‐4-（4-ジメチルアミノフエニ
ル）1,3-イミダゾール メタノール（30ml）中のａで得られた化合物（5g、7.6
ミリモル）に０℃で1NのNa-メチラート溶液（5ml）を加
える。３時間後、溶液を弱酸性イオン交換体〔例えばア
ンバーライト（Ameberlite）IRC50、H+‐形〕で処理
し、濾過し、濃縮する。残分をエーテル／石油エーテル
で浸漬し、濾別する；収量2.7g（73％）；融点140℃
（沸騰下）。
MS（neg.FAB）m/e＝484 DC:（シリカゲル 60、イソプロパノール／メタノール1
/1）RF＝0.4。
例10（参考例） 2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ‐3-メトキシフ
エノル）‐4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）‐1,
3-イミダゾール ａ）例９と同様にして、（4-ホルミル‐2-メトキシフエ
ニル）‐2,3,4,6-テトラ‐o-アセチル‐β‐D-ガラクト
ピラノシド〔R.G.プライスその他、クリニカ ヒエミカ
アクタ第124巻（1982年）195〜204頁;4.8g、10モ
ル〕、4,4′‐ビス（ジメチルアミノ）ベンジル（3g、1
0ミリモル）及び酢酸アンモニウム（7.7g、100ミリモ
ル）を氷酢酸（200ml）中で反応させる。18時間還流下
で煮沸し、後処理し、クロマトグラフイーにより精製し
た後、テトラ‐o-アセチルガラクトシル‐誘導体が得ら
れる；収量4.7g（62％）。
ｂ）脱アセチル化するために、前に得られた生成物（1.
26g、1.7ミリモル）をメタノール（150ml）中の炭酸水
素ナトリウム（1.7g）の懸濁液で２時間40℃で処理す
る。無機沈澱を濾別した後、濃縮し、残分をクロマトグ
ラフイーで精製する（シリカゲル 60、トルエン／酢酸
エステル／メタノール＝2:2:1）；収量0.77g（77％）；
融点174〜182℃。
例11（参考例） 同様にして２つの反応工程で、例10に記載したようにし
て、次に記載のイミダゾール誘導体が得られた。最初の
工程で、相応する過アセチル化された（4-ホルミルフエ
ニル）‐β‐D-ガラクトシド及び相応する1,2-ジケトン
から、氷酢酸中で酢酸アンモニウムと反応させることに
よつて過アセチル化されたガラクトシドを生成し、これ
を第２工程で脱アセチル化する。
ａ）2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシフエノル）
‐4-（4-ジメチルアミノフエニル）‐5-メチル‐1,3-イ
ミダゾール （4-ホルミルフエニル）‐2,3,4,6-テトラ‐o-アセチル
‐β‐D-ガラクトピラノシド〔Z.クスロス（Csuros）そ
の他、Acta Chim.Acad.Sci.Hung、第42巻（1964年）263
〜267頁、4.5g、10モル〕及び1-（4-ジメチルアミノフ
エニル）プロパンジオン‐1,2（1.9g、10ミリモル）；
反応時間:2時間； テトラ‐o-アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド：収
量:4.6g（74％）。
例10bによる脱アセチル化；収率74％、融点177〜187
℃。
ｂ）2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシフエノル）
‐4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）‐1,3-イミダ
ゾール （4-ホルミルフエニル）‐2,3,4,6-テトラ‐o-アセチル
‐β‐D-ガラクトピラノシド〔Z.クスロスその他、Acta
Chim.Acad.Sci.Hung、第42巻（1964年）263〜267
頁）、4.5g、10モル〕及び4,4′‐ビス（ジメチルアミ
ノ）ベンジル（3g、10ミリモル）から； 反応時間:2時間； テトラ‐o-アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド：収
量:2.2g（30％）。
例10bによる脱アセチル化；収率83％、融点230〜237℃ ｃ）2-（3-クロル‐4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ
フエノル）‐5-メチル‐4-（4-ジメチルアミノフエニ
ル）‐1,3-イミダゾール （2-クロル‐4-ホルミルフエニル）2,3,4,6-テトラ‐O-
アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド〔R.G.プライスそ
の他、クリニカ ヒエミカ アクタ第124巻（1982年）1
95〜204頁の指針により、2,3,4,6-テトラ‐O-アセチル
‐β‐D-ガラクトピラノシルブロミド及び2-クロル‐4-
ホルミルフエノールから製造した〕;4.9g、10モル及び1
-（4-ジメチルアミノフエニル）プロパンジオン‐1,2
（1.9g、10ミリモル）から； 反応時間:2時間、 テトラ‐O-アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド：収
量:5.95g（90％）。
例10bによる脱アセチル化。
ｄ）2-（3-クロル‐4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ
フエニル）‐4,5-ビス（4-ジメチルアミノフエニル）‐
1,3-イミダゾール （2-クロル‐4-ホルミルフエニル）2,3,4,6-テトラ‐O-
アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド〔R.G.プライスそ
の他、クリニカ ヒエミカ アクタ第124巻（1982年）1
95〜204頁の指針により、2,3,4,6-テトラ‐O-アセチル
‐α‐D-ガラクトピラノシルブロミド及び2-クロル‐4-
ホルミルフエノールから製造した〕;4.4g、９ミリモル
及び4,4′‐ビス（ジメチルアミノ）ベンジル（2.7g、
９ミリモル）から； 反応時間:6時間； テトラ‐O-アセチル‐β‐D-ガラクトピラノシド：収
量：粗生成物6.9g（これはクロマトグラフイーによる精
製なしに、例10aと同様にして脱アセチル化を行つ
た）。
例12（参考例） 2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキ‐3-メトキシフエ
ノル）‐4,5-ビス（4-メトキシ‐フエニル）‐1,3-イミ
ダゾール ａ）２〔（4-（テトラ−O-アセチル‐β‐D-ガラクトピ
ラノシルオキシ）‐3-メトキシフエニル〕‐4,5-ビス
（4-メトキシフエニル）‐1,3-イミダゾール 氷酢酸700ml中のバニリン‐2,3,4,6-テトラ‐O-アセチ
ル‐β‐D-ガラクトピラノシド〔プライスその他、前記
文献〕14g（29ミリモル）、4,4′‐ジメトキシベンジル
7.8g（29ミリモル）及び酢酸アンモニウム13.2g（174ミ
リモル）から成る溶液を、攪はん下で保護気体雰囲気中
で５時間還流下で煮沸する。引き続き、20℃に冷却さ
せ、トルエンを数回添加して真空中で酢酸を蒸発除去す
る。粗生成物を更に精製せずに次の合成工程に使用す
る。DC（シリカゲル60、溶離剤酢酸エチル／石油エーテ
ル1/1）:RF＝0.1。
ｂ）2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ‐3-メトキ
シフエニル）‐4,5-ビス（4-メトキシ‐フエニル）‐1,
3-イミダゾール ａ）で得られた粗生成物を無水メタノール300ml中に懸
濁させ、十分な量の飽和メタノール性ナトリウムメチラ
ート溶液を加え、pH値を12〜13にする。20℃で約１時間
完全に脱アセチル化するまで攪はんし（DC-制御、pH-制
御）、溶液を酸性イオン交換体（Dowex50WX8、H+）の添
加により中和する。15分後に、イオン交換体を濾別し、
濾液を真空中で濃縮する。精製はシリカゲルを用いるフ
ラツシユ‐クロマトグラフイー（溶離剤：酢酸エチル／
メタノール/7/3）により行う。DC（シリカゲル60、溶離
剤：酢酸エチル／メタノール/7/3）:RF＝0.4。収量:4.9
g（30％）。MS（neg.FAB）:m/e＝563。
例13（参考例） 2-（4-β‐D-ガラクトピラノシルオキシ‐3-メトキシフ
エニル）‐4,5-ビス（4-メチルフエニル）‐1,3-イミダ
ゾール 4,4′‐ジメチルベンジルを用いて例12と同様にして相
応するガラクシドを製造する。
DC（シリカゲル60、溶離剤：酢酸エチル／メタノール7/
3）:RF＝0.5。MS（neg.FAB）:m/e＝531。
例14 加水分解酵素‐基質としての適性 点滴試験で種々の化合物の加水分解を相応する加水分解
酵素（アルカリ性ホスファターゼ、豚肝臓からのエステ
ラーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ及
びリパーゼ）により検査した。
その際遊離する塩基を同時にヘキサシアノ鉄（III）カ
リウム、K3〔Fe(CN)6〕により酸化して色素にし、色生
成を視覚により評価した。
実施／結果 加水分解速度をpH6.0並びにpH9.0で加水分解酵素溶液を
基質／緩衝剤／酸化剤／紙上に滴加することによつて視
覚により評価した。
酵素濃度は約1000U/mlであり、その際、試験温度は室温
であつた。
比較用に、試料として0.9％NaCl溶液を用いる非酵素的
加水分解を評価した。
相応する遊離塩基の使用により、K3〔Fe(CN)6〕を用い
る酸化可能性を裏付けた。
基質‐紙の製造 フリースpH6.0- 燐酸二水素カリウム 100ミリモル/l 含浸溶液 ヘキサシアノ鉄（III）カリウム 10ミリモル/l プルロニツクRF68 ２％ pH値を2NKOH溶液で6.0に調節した。
フリースpH9.0-グリシン 100ミリモル/l ヘキサシアノ鉄（III）カリウム 10ミリモル/l プルロニツクRF68 ２％ pH値を2NNaOH溶液で9.0に調節した。
含浸:8×30cmの紙フリース（Whatman 3M）を含浸溶液8m
lで含浸させ、30分間乾燥箱中で50℃で乾燥させた。
こうして含浸させた緩衝剤‐酸化剤‐紙を８×2cmの条
片に切り、基質溶液を後含浸させた。
基質‐溶液／含浸溶液： メタノール1ml中に試験すべき基質（又は遊離塩基）5mg
を溶かすか又は懸濁させ、これを各々10μｌずつ緩衝剤
‐酸化剤‐紙上に添加した。乾燥器を用いて溶剤を蒸発
除去した。
次いでこの基質‐酸化平面上に加水分解溶液を滴加し、
評価した。例１から7aに記載の化合物は上記の紙で陽性
の結果を示した： 酵素１ 豚肝臓からのエステラーゼ（EC3.1.1.1） ２ アルカリ性ホスフアターゼ ３ N-アセチル‐β‐D-グルコサミニダーゼ（EC3.
2.1.30） ４ リパーゼ 着色＋ 着色 ++ 強力に着色 +++ 強力かつ迅速に着色 例15 試料中のヒトのコリオンゴナドトロピン（hCG）の検出 Ａ）支持体の製造（図１） ａ）フリース３の製造 １枚の紙〔カルフ社（Firma Kalff）の4210型〕を条片
（長さ2.6cm、幅0.6cm）に切断した。DMSO中の2-メトキ
シ‐4-〔4,5-ビス‐（4-メトキシフエニル）‐イミダゾ
ール‐2-イル〕‐フエニル‐β‐D-ガラクトピラノシド
（例12からのガラクトシダーゼ基質）40mg/mlの溶液20
μｌを水中のポリビニルアルコール24％溶液20μｌと混
合した。この混合物を紙条片の中央に載せた。
ｂ）フリース５の製造 １枚の紙〔カルフ社の4210型〕を条片（長さ2.6cm、幅
0.6cm）に切断した。一方の端部をPBS緩衝剤（燐酸塩で
緩衝した塩水、pH7.0、豚血清アルブミン１％、トウイ
ーンR20 0.1％）100μｌで含浸した。紙条片の中央に、
hCGに対するモノクローナル抗体のFab-フラグメント及
びβ‐ガラクトシダーゼ（ガラクトシダーゼ活性を有す
る物質）から成る複合体20U/ml、hCGのβ鎖に対するモ
ノクローナルマウス‐抗体100μg/ml及び4-アミノベン
ジル‐1-チオ‐β‐D-ガラクトピラノシド7.5mg/mlを含
有する溶液7.5μｌを載せた。緩衝剤を含浸させた端部
と反対の端部に水中のポリビニルアルコールの５％溶液
10μｌを含浸させた。
ｃ）フリース６の製造 １枚の紙片〔シユライヒヤー＆シユル社（Firma Schlei
cher＆Schull）の3512型〕にブロムシアンで活性化した
後、マウス抗体のFc部に対するヒツジ抗体を固定した。
この材料の一片を条片（長さ1.1cm、幅0.6cm）に切つ
た。
ｄ）フリース７の製造 １枚の紙片〔ワツトマン社（Firma Whatmann）のD-28
型〕を５×0.6cmの大きさに切つた。
ｅ）フリース３及び５はプラスチツクシートにより相互
に分かれている。
乾燥させたフリースを幅0.6cmの基底シート２に貼付け
ることによつて、図１に記載の試験支持体１を製造し
た。その際、フリース５は、ポリビニルアルコールで含
浸させた端部が試験支持体端部８の方法を向くように貼
付けた。
Ｂ）試験の実施 ａ）試料準備 試料0.5mlを、燐酸塩緩衝剤中（pH7）の過ホウ酸ナトリ
ウム４ミリモル/l及びオランダガラシ‐ペルオキシダー
ゼ（酸化剤）を含有する溶液0.5mlと混合した。
ｂ）試料の試験条片への施与 試験条片１の端部８を溶液に入れた。hCGを含有する溶
液はフリース５及びフリース３に浸透し、その上に存在
する物質を溶かした。hCGと、hCGに対するモノクローナ
ル抗体のβ‐ガラクトシダーゼで標識付けされたFab-フ
ラグメント及びhCGのβ‐鎖に対するモノクローナル抗
体との反応により、フリース５の溶液中にβ‐ガラクト
シダーゼ標識付けされた３つの成分から成る免疫複合体
が生成した。次いで、この場合に加水分解酵素活性を有
する物質であるこの免疫複合体を、本発明による方法を
用いてフリース６で検出する。免疫複合体を有する溶液
は、基質を有する溶液と全く同様にフリース３からフリ
ース６中に浸透し、そこでこの基質溶液と混合させられ
た。フリース６で、生成された免疫複合体並びにhCGの
β‐鎖に対する過剰のモノクローナル抗体は、固定され
たヒツジ抗体を介してフリース６と結合させられた。場
合により過剰のβ‐ガラクトシダーゼ標識付けされたFa
b-フラグメントは更にフリース７中に流入した。結合さ
れた免疫複合体のβ‐ガラクトシダーゼ標識付けにより
及び酸化剤を用いて、10分間以内にフリース６で赤色着
色が生じた。
hCGが全く試料中に含有されていない場合には、β‐ガ
ラクトシダーゼ標識付けされた免疫複合体も全く生成さ
れなかつた。従つて、加水分解酵素活性を有する物質は
全くフリース６で結合されず、従つて発色は全く見られ
なかつた。これに対して、β‐ガラクトシダーゼ標識付
けされたFab-フラグメントは全量なお溶液中に含有され
ており、これはフリース７中に浸透する。従つて、β‐
ガラクトシダーゼ標識付けされたFab-フラグメント（こ
れも加水分解酵素活性を有する物質である）の反応によ
り惹起されたフリース７で発色が観察される。従つて、
試験の対照は、フリース７でも本発明による方法が実施
されることによつて、行われる；これは特に、試料中に
hCGが全く存在しなかつた場合に重要である。
試料中にhCGが多く存在すればするほど、従つてフリー
ス６中に結合したβ‐ガラクトシダーゼで標識付けされ
た免疫複合体が多く存在すればするほど、それだけ強力
な着色がフリース６で10分間の経過後に見られるので、
評価は定量的にも行われる。
例16 チロキシン（T4）の検出 Ａ）試験条片11（図２）の製造 ａ）フリース14 フリース14はβ‐ガラクトシダーゼとT4に対する抗体の
複合体で含浸してある。
ｂ）フリース15 １枚の紙片〔シユライヒヤー＆シユル社の3512型〕にブ
ロムシアンで活性化し、それにT4スクシンイミドエステ
ルを結合させた。
ｃ）フリース16 フリース16は、2-メトキシ‐4-〔4,5-ビス‐（4-メトキ
シフエニル）‐イミダゾール‐2-イル〕‐フエニル‐β
‐D-ガラクトピラノシド（例12）を含浸させたフリース
である。
ｄ）フリース13は試料施与に役立つ。
試験支持体11を製造するために、図２に記載のフリース
を基礎シート12上に固定した。
Ｂ）試験実施 ａ）試料準備 試料は例15と同様にして準備した。
ｂ）実施 試験条片11の端部17を溶液に入れた。T4を含有する試料
はフリース13中に浸透した。そこから更にフリース14中
に流入し、そこでβ‐ガラクトシダーゼ‐複合体を溶か
した。抗体とT4との免疫反応によつて、β‐ガラクトシ
ダーゼ標識付けされた免疫複合体が生成された。この免
疫複合体の他になお過剰のβ‐ガラクトシダーゼ複合体
を含有する溶液は、フリース15中に侵入した。そこでこ
の過剰分は結合したT4を介して紙と結合した。
なお免疫複合体を含有する溶液は、フリース16中に侵入
した。そこで本発明によるβ‐ガラクトシダーゼで標識
付けされた免疫複合体（これは加水分解酵素活性を有す
る物質である）の検出方法が行われる。溶液中この錯体
が多く存在すればするほど、従つて溶液中にT4が多く含
有されていればそれだけ、より強力にフリース16が10分
後に赤色に着色した。T4が存在しない場合には、フリー
ス16は白色のままである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明による試験条片の断面図であり、第２図
は本発明によるもう１つの態様の試験条片を示す断面図
である。 １…試験条片、２…基底シート、3,4,5,6,7…フリー
ス、８…端部、11…試験条片、12…基底シート、13,14,
15,16…フリース、17…端部
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヴオルフガング・ヴエツケルレ ドイツ連邦共和国グリユンシユタツト・ア ウフ・デム・ライメン 12 (72)発明者 ヨハン・ベルガー ドイツ連邦共和国イツフエルドルフ・イエ ーガーガツセ 10 (72)発明者 ハーヴイ・バツク アメリカ合衆国インディアナ・インディア ナポリス・ハーグ・ロード 9115 (72)発明者 ルツペルト・ヘルマン ドイツ連邦共和国ヴアイルハイム・イン・ デア・アウ 23 (56)参考文献 Ｃｈｅｍ Ａｂ，106（17），（1987）, 要約番号131151ｅ

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式I: ［式中、Ｚは酸素、硫黄又は基Ｎ−R4を表し、R1、R2
    及びR3は同一又は異なるものであってよく、水素、アル
    キル基又はアラルキル基又は芳香族炭化水素基を表し、
    アラルキル基及び芳香族炭化水素基の芳香基部分は１個
    又は数個のハロゲン、ヒドロキシル−、アルコキシ−、
    アルキル−、アミノ−、モノ−又はジアルキルアミノ
    −、カルボキシル−、カルバモイル−、アルコキシカル
    ボニル、アルキルカルボニル−、ホルミル−又はスルホ
    基又は基−Ｏ−Ｘにより置換されていてよく、R4は水素
    又はアルキル基を表し、かつ、基R1、R2及びR3の１個又
    は数個は、基： −Ｏ−Ｘ （式中、Ｏは酸素を表し、Ｘはグリコシル−ホスフェー
    ト−又はアシル基を表す）で置換された芳香族炭化水素
    基を表す］のオキサゾール−、チアゾール−又はイミダ
    ゾール−核を有する加水分解酵素基質。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の化合物少なくとも１種類
    を含有することを特徴とする、試料中の加水分解酵素活
    性を有する物質の検出剤。
  3. 【請求項３】試料を加水分解酵素基質及び酸化剤と混合
    し、生じる色強度を評価することによって、試料中の加
    水分解酵素活性を有する物質を検出するための方法にお
    いて、加水分解酵素基質として請求項１に記載の化合物
    少なくとも１種類を使用し、その際、グルコシダーゼ、
    ホスファターゼ又はエステラーゼを検出することを特徴
    とする、加水分解酵素活性を有する物質の検出法。
  4. 【請求項４】加水分解酵素で標識付けした化合物及び加
    水分解酵素基質を使用して分析物を検出するための試験
    片において、加水分解酵素基質として、吸収性支持体上
    に含浸させてある請求項１に記載の化合物を使用し、そ
    の際、グルコシダーゼ、ホスファターゼ又はエステラー
    ゼを検出することを特徴とする、分析物を検出するため
    の試験片。
JP2276586A 1989-10-17 1990-10-17 加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片 Expired - Lifetime JPH0779716B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US42249689A 1989-10-17 1989-10-17
US422496 1989-10-17

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03151397A JPH03151397A (ja) 1991-06-27
JPH0779716B2 true JPH0779716B2 (ja) 1995-08-30

Family

ID=23675150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2276586A Expired - Lifetime JPH0779716B2 (ja) 1989-10-17 1990-10-17 加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5292669A (ja)
EP (1) EP0423632B1 (ja)
JP (1) JPH0779716B2 (ja)
AT (1) ATE126513T1 (ja)
AU (1) AU621245B2 (ja)
CA (1) CA2027648A1 (ja)
DE (1) DE59009529D1 (ja)
ES (1) ES2078282T3 (ja)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9020889D0 (en) * 1990-09-25 1990-11-07 May & Baker Ltd New compositions of matter
ES2245660T3 (es) * 1990-11-30 2006-01-16 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Derivados de azol y su utilizacion como inhibidores de los radicales superoxidos.
US5646281A (en) * 1990-12-28 1997-07-08 Neurogen Corporation Certain 4-piperidino- and piperazinomethyl-2-phenyl imidazole derivatives; dopamine receptor subtype specific ligands
US5681956A (en) * 1990-12-28 1997-10-28 Neurogen Corporation 4-aryl substituted piperazinylmethyl phenylimidazole derivatives; a new class of dopamine receptor subtype specific ligands
US5646279A (en) * 1990-12-28 1997-07-08 Neurogen Corporation Substituted 4-piperazinylmethyl 2-phenylimidazoles; dopamine receptor subtype specific ligands
US5633376A (en) * 1990-12-28 1997-05-27 Neurogen Corporation Certain aminomethyl phenylimidazole derivatives; and 4-aryl substituted piperazinyl and piperidinylmethyl phenylimidazole derivatives; a new class of dopamine receptor subtype ligands
US5700826A (en) * 1995-06-07 1997-12-23 Ontogen Corporation 1,2,4,5-tetra substituted imidazoles as modulators of multi-drug resistance
MY128323A (en) 1996-09-30 2007-01-31 Otsuka Pharma Co Ltd Thiazole derivatives for inhibition of cytokine production and of cell adhesion
HUP0003934A3 (en) 1997-07-03 2002-01-28 Pfizer A part of diaryl imidazole derivatives, pharmaceutical composit
US6166205A (en) * 1998-09-02 2000-12-26 Neurogen Corporation 2-Aryl-4-(1-[4-heteroaryl]piperazin-1-yl)methylimidazoles: dopamine . D.sub4 receptor subtype ligands
JP2002543396A (ja) * 1999-04-26 2002-12-17 ユーエス アーミー メディカル リサーチ アンド マテリアル コマンド 化学毒素用バイオセンサとしての固定化酵素
US6783947B1 (en) * 1999-09-09 2004-08-31 Dade Behring Marburg Gmbh Protecting groups for biological labeling
WO2007024055A1 (en) * 2005-08-23 2007-03-01 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Surface modified inorganic material and producing method thereof
EP2023919A4 (en) * 2006-05-08 2010-12-22 Molecular Neuroimaging Llc COMPOUNDS AND AMYLOID PROBES FOR THERAPY AND IMAGING USES
BRPI0815116A2 (pt) * 2007-08-13 2015-01-27 Synta Pharmaceuticals Corp Compostos de triazol que modulam a atividade da hsp90
FR2964978B1 (fr) * 2010-09-21 2013-11-15 J Soufflet Ets Nouveaux substrats fluorescents, procede d'obtention de ces produits et leur application
WO2023191513A1 (ko) * 2022-03-29 2023-10-05 주식회사 퓨전바이오텍 당 결합된 이미다졸린 유도체 및 이의 용도

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4089747A (en) * 1976-08-09 1978-05-16 Eastman Kodak Company Compositions for the detection of hydrogen peroxide
US4279992A (en) * 1978-03-13 1981-07-21 Miles Laboratories, Inc. Specific binding assay employing an enzyme-cleavable substrate as label
JPS5935597B2 (ja) * 1980-12-23 1984-08-29 富士レビオ株式会社 アンジオテンシン変換酵素の活性測定法
DE3150878A1 (de) * 1981-12-22 1983-06-30 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim "verfahren und reagenz zur bestimmung von creatinin"
DE3323245A1 (de) * 1983-06-28 1985-01-10 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Verfahren und reagenz zur bestimmung von (alpha)-amylase
DE3411997A1 (de) * 1984-03-31 1985-10-17 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue redox-indikatoren
JPS614960A (ja) * 1984-06-19 1986-01-10 Fuji Photo Film Co Ltd 分析試薬および多層化学分析要素
DE3425118A1 (de) * 1984-07-07 1986-01-16 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Neue redox-indikatoren
US4812399A (en) * 1986-04-21 1989-03-14 Eastman Kodak Company Analytical element and method for the determination of creatinine or creatine
EP0285095B1 (en) * 1987-04-02 1994-11-30 Fuji Photo Film Co., Ltd. Dry type analysis element
CA1311179C (en) * 1987-05-14 1992-12-08 Richard Linn Detwiler Element and method for determination of creatinine or creatine
CA1338238C (en) * 1988-01-07 1996-04-09 David John Carini Angiotensin ii receptor blocking imidazoles and combinations thereof with diuretics and nsaids
JPH0833393B2 (ja) * 1988-03-14 1996-03-29 富士写真フイルム株式会社 乾式分析要素
US5047318A (en) * 1988-06-13 1991-09-10 Eastman Kodak Company Imidazole leuco dye composition containing 4'-hydroxyacetanilide, diagnostic kit and method using same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＣｈｅｍＡｂ，１０６（１７），（１９８７），要約番号１３１１５１ｅ

Also Published As

Publication number Publication date
AU621245B2 (en) 1992-03-05
EP0423632B1 (de) 1995-08-16
ATE126513T1 (de) 1995-09-15
AU6396890A (en) 1991-05-30
CA2027648A1 (en) 1991-04-18
EP0423632A1 (de) 1991-04-24
US5292669A (en) 1994-03-08
JPH03151397A (ja) 1991-06-27
DE59009529D1 (de) 1995-09-21
ES2078282T3 (es) 1995-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0231125B1 (en) Hydrolyzable fluorescent substrates and analytical determinations using same
JPH0779716B2 (ja) 加水分解酵素基質、加水分解活性を有する物質の検出剤及び検出法並びに分析物を検出するための試験条片
JP3130316B2 (ja) 蛍光性沈澱を生じる基質を用いる酵素分析
US4665023A (en) Imidazole derivatives as redox indicators
KR100259144B1 (ko) 포스파타제와의 반응에 의해 화학발광을 생성하는 화합물, 조성물 및 방법
JP4408451B2 (ja) フッ素化キサンテン誘導体
Evangelista et al. Enzyme-amplified lanthanide luminescence for enzyme detection in bioanalytical assays
DE68915267T2 (de) Enzymatisch kontrolliertes freisetzungssystem.
JPH02180893A (ja) １，２−ジオキセタン化合物及びそれを用いた発光方法
JPH0137693B2 (ja)
US6162610A (en) Xanthan-ester and acridan substrates for horseradish peroxidase
JP2732501B2 (ja) β―ガラクトシダーゼのための基質
EP0656005B1 (en) Biotinylated chemiluminescent label, conjugates, assays, assay kits
JPH027589B2 (ja)
JPS62249979A (ja) 基質又は酵素活性を測定するための方法及び試薬
US4812393A (en) Fluorescent dyes and biological and analytical uses thereof
JP2583327B2 (ja) 分析で使用するジオキセタン
US5202233A (en) Process for the detection of substances with hydrolase activity
KR890004092B1 (ko) 과산화수소, 과산화염-작용화합물 및 과산화효소의 결정을 위한 방법 및 시약조성물
US5254677A (en) β-galactosidase substrates for cedia
KR920000058B1 (ko) 가수분해효소 활성을 갖는 물질들의 검출방법 및 약품
US5260428A (en) Agent for the detection of substances with hydrolase activity
JPS62190191A (ja) 加水分解可能なホスフアタ−ゼ用螢光基質ならびにそれを用いる分析組成物，要素および方法
JP3262868B2 (ja) ８−ヒドロキシ−２Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−２−オン系染料
US4927927A (en) Fluorescent dyes and biological and analytical uses thereof