KR100188383B1 - 바이러스 헤마글루티닌 유전자영역의 역전사반응에 연속한 폴리머라제쇄 반응에 의한 인플루엔자 a바이러스의 검출방법 - Google Patents

바이러스 헤마글루티닌 유전자영역의 역전사반응에 연속한 폴리머라제쇄 반응에 의한 인플루엔자 a바이러스의 검출방법 Download PDF

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Abstract

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Description

바이러스 헤마글루티닌 유전자 영역의 역전사 반응에 연속한 폴리머라제 쇄 반응에 의한 인플루엔자 A 바이러스의 검출방법
제1도는 바이러스 현탁 희석액(10-2내지 10-6, 가로좌표)을 441개 길이의 염기쌍(bp)을 갖는 아가로즈 겔 밴드의 UV 광 강도(세로좌표)에 대해 플롯팅시킨 것을 도시한 것이다.
본 발명은 바이러스 헤마글루티닌 유전자 영역의 역전사 반응(RT)에 연속한 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의한 인플루엔자 A 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다.
바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin) 유전자의 비교적 보존된 영역으로부터의 올리고뉴클레오타이드 서열(앰플리머 :amplimer)을 사용하여 역전사 반응후 폴리머라제 쇄 반응을 수행함으로써, 인플루엔자 A 바이러스의 검출 감도를 실질적으로 증가시킬 수 있다. 앰플리머의 3' 말단이 영향을 받지 않는 한, 역전사 반응 및 PCR은 염기 교환에 의한 단일 돌연면이에 대해 민감하지 않다.
인플루엔자 A 바이러스는 사람에서 발견되고 또한 동물에서 종-특이적으로 발견되며, 비교적 긴 시간 간격으로 발생하는 유행병의 유발원이다. 유행병은 인플루엔자 A 바이러스의 항원성 이동(antigenic shift)에 의해 유발된다. 면역이 생기지 않은 새로운 항원성 변이체가 전개되면 극도로 빠르게 전염되며 높은 사망률과 관련된다.
따라서, 인플루엔자 A 바이러스 감염의 신속하고 확실한 검출이 매우 중요하다. 일반적으로, 실험실에서의 진단은 세포 배양물에서 바이러스를 분리하는 것으로 시도된다. 그러나, 인플루엔자 바이러스는 질병의 처음 며칠 동안에만 배양될 수 있다.
원숭이 신장 세포 배양물을 비인두 흡인물로 접종시킨 후, 기니아 피그 적혈구의 혈흡수물로부터 바이러스 성장이 입증된다. 이러한 특이성은 특이적 면역 혈청을 사용한 혈흡수물의 억제시험에 의해 시험할 수 있다. 세포병리학적 효과가 항상 일어나는 것은 아니다. 일부 인플루엔자 바이러스 균주는 수정 계란의 유양 막강에 접종함으로서 쉽게 분리할 수 있다.
인플루엔자를 신속히 진단하기 위한 연구가 수행되어 왔다 : 예를들면, 비인강 흡인물을 현미경 슬라이드상에 도말하고 바이러스의 항원을 특이적 면역 혈청을 사용하는 직접 또는 간접의 면역 형광법으로 검출한다. 이 시험은 수시간 내에 수행되지만, 특히 샘플 채취가 늦을 경우에는 감도가 충분하지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 인플루엔자 A 바이러스에 대한 현행의 바이러스 검출 방법의 감도를 개선시키는 것이다.
본 발명자는 바이러스 게놈의 4번째 단편상의 바이러스 헤마글루티닌 유전자의 실질적으로 보존된 영역으로부터 수득된 적합한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 역전사 반응 및 연속한 폴리머라제 쇄 반응에 의한 증폭반응으로 항원 검출의 감도를 실질적으로 증가시킬 수 있음을 밝혀내었다. 상술된 올리고뉴클레오타이드(앰플리머)가 위치하는 영역내에서의 염기 교환은, 앰플리머의 3' 말단에 영향을 미치지 않는 한, 항원 검출을 방해하지 않는다. 역전사 반응 및 증폭 반응에 가장 바람직한 영역은 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 위치 내지 536 위치의 영역인 것으로 증명되었으나, 언급된 위치로부터 ±80 뉴클레오타이드 영역이 또한 적합하다. 헤마글루티닌 유전자 H1, 특히 상기 영역의 선택은, 상기 제시한 예외는 별문제로 하고, 인플루엔자 A 바이러스의 모든 혈청형을 포함할 수 있다는 점에서 유리하다.
따라서, 본 발명은 헤마글루티닌 유전자 H1 영역의 역전사 반응(RT), RT에 사용된 앰플리머를 사용한 PCR에 의한 후속의 증폭 반응 및 이어서 증폭된 cDNA의 검출, 바람직하게는 겔 전기영동에 의한 분리후 염색에 의한 직접 검출에 의한 인플루엔자 A 바이러스의 검출 방법에 관한 것이다. 그러나, 증폭된 cDNA는, 방사선 표지되거나 바이오틴 처리된 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트가 이미 사용된 경우에는, 방사선 동위원소 또는 ELISA로 검출될 수 있다.
앰플리머는 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 ± 80 내지 536 ± 80 위치의 영역, 바람직하게는 96내지 536 위치의 영역에서 뉴클레오타이드 길이가 약 20bp인 올리고뉴클레오타이드로서 선택된다. PCR은 바람직하게는 전체 용적이 25㎕인, 1mM의 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 3% 디메틸술폭시드 및 각각의 앰플리머 0.8㎕의 존재하에서, 59℃ 및 91℃에서 및 각 경우 약1분간의 순환 시간(Cycle time)으로, 특히 바람직하게는 59℃에서 97초간 및 91℃에서 85초간 수행한다.
마지막으로, 본 발명은 실시예 및 특허청구범위에서 설명된다.
[실시예]
1. 바이러스 RNA의 분리
(1) 0.2% 알부민을 함유하는 PBS중의 인플루엔자 H1 바이러스(A/WSN/33) 현탁액 또는, (2) 감염된 것으로 추정되는 사람으로부터의 28개 비인두 세정액 또는, (3) 초음파 처리후 감염 세포로부터의 바이러스를 산성 구아니딘 티오시아네이트/페놀/클로로포름 용액으로 3회 추출한다[참조 : P.Chomczynski and N. Sacchi, (1987), Analytical Biochemistry 162, 156-159]. 바이러스 RNA를 2.5배 용적의 90% 에탄올 완충용액을 가함으로써 t-RNA 담체(1㎍/m)의 존재하에 -20oC에서 침전시킨다. 원심분리 후, 침전물을 80% 에탄올 완충용액으로 세척하고, 건조시킨후 멸균수 중에 재현탁시킨다. (3)의 경우에 초음파 처리는 브란손 B15 초음파 처리기(Branson B15 Sonicator)를 2로 고정시켜 파라핀 오일층하에 15초간 수행한다.
2. 역전사 반응
역전사 반응은 전체 용적 5㎕으로 42℃에서 30분 동안 수행한다. 이것은 pH 8.3인 50mM 트리스-염산(Tris-HCI), 50mM KCI, 7mM MgCl2, 170㎍/ml BSA,dATP, dTTP, dCTP, dGTP 각각 1mM, 0.1% 트리톤 X-100, 1mM DTT 및 10mM 2-머캅토에탄올의 완충용액(완충용액 A)중에 각각 0.4㎍의 2개의 앰플리머, 7U의 AMV 역전사효소[파마시아(Pharmacia) 제조원] 및 10U의 RNAsin[프로메가(Promega) 제조원]를 포함한다.
3. PCR에 의한 증폭 반응
상기에서 수득된 cDNA는 하기와 같이 증폭시킨다 : 1U의 Taq 폴리머라제(Biofinex, Praroman, Fribourg(스위스) 제조원)를 트리톤 X-100 및 DTT가 없고, 3%의 DMSO 및 0.8㎍의 각 앰플리머가 있는 전체용적 25㎕의 완충용액 A에 가한다.
증폭반응은 앰플리겐 장치[Ampligene apparatus ; Moretronic(스위스) 제조원]을 사용하여 59℃(각각의 경우 96초) 및 91℃(각각의 경우 85초)에서 30내지 40 주기로 수행한다.
4. 증폭된 cDNA의 검출
증폭된 샘플의 검출은 UV광 하에 pH 7.4의 10mM 트리스-염산, 0.1mM EDTA 및 0.7㎍/ml의 에티디움 브로마이드중에서 2% 아가로즈 겔로 수행한다.
DNA 합성기(Bio Applied System 제조원)로 합성하고 세파덱스 NAP-24 컬럼을 통해 정제된, RT 및 PCR에 사용된 앰플리머의 위치를 표1에 나타내었다(밑줄 표시).
제1도는 바이러스 현탁 희석액(10-2내지 10-6, 가로좌표)을 441개 길이의 염기쌍(bp)을 갖는 아가로즈 겔 밴드의 UV 광 강도(세로좌표)에 대해 플롯팅시킨 모델 시험 결과이다.
감염된 것으로 추정되는 사람으로부터의 28개의 새롭게 채취한 비인두 세정액중에서 441bp 밴드가 2회 검출되었다. 세포성 β-글로빈 유전자의 201bp 단편(717 내지 926 위치 : 참조 : J.C. Schimenti 및 C.H. Duncan, Nucl. Acids Res. 12,(1984), 1641-1653)이 각각의 경우 내부 대조군으로서 공증폭되었다.
Figure kpo00002

Claims (8)

  1. 역전사 반응(RT)에 헤마글루틴 유전자 H1의 96 ± 80 내지 536 ± 80 위치의 뉴클레오타이드를 포함하는 보존된 영역으로부터 수득된 앰플리머를 사용하는 단계 : 연속한 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 상기 앰플리머를 사용하는 단계 및 이어서 공지된 방법에 의해 증폭된 cDNA를 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A 바이러스를 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 앰플리머가 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 ± 80 내지 536 ± 80 위치내의 인접한 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 앰플리머가 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 ± 20 내지 536 ± 20 위치내의 인접한 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 앰플리머가 AUAGGCUACCAUGCGAACAA 및 GAAAU UUGCUAUGGCUGACG인 방법.
  5. 역전사 반응 및 연속한 폴리머라제 쇄 반응에 사용하기 위해 헤마글루티닌 유전자 H1 96 ± 80 내지 536 ± 80 위치의 뉴클레오타이드를 포함하는 보존된 영역으로부터 수득된 앰플리머를 함유하는, 인플루엔자 A 바이러스를 검출하기 위한 시약 조성물.
  6. 제5항에 있어서,. 앰플리머가 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 ± 80 내지 536 ± 80 위치내의 인접한 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오타이드를 포함하는 시약 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 앰플리머가 헤마글루티닌 유전자 H1의 96 ± 20 내지 536 ± 20 위치내의 인접한 뉴클레오타이드 서열에 상응하는 약 20개 뉴클레오타이드를 포함하는 시약 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 앰플리머가 AUAGGCUACCAUGCGAACAA 및 GAAAUU UGCUAUGGCUGACG인 시약 조성물.
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