KR0182395B1 - 트레할로스를 안정제로 이용한 단백질용액의 액상가열처리방법 - Google Patents

트레할로스를 안정제로 이용한 단백질용액의 액상가열처리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질을 주성분으로 하는 의약품 생산시, 수용액 상태의 시료를 가열처리(섭씨 60℃,10시간)에 의한 각종 바이러스 불활화시에 트레할로스(D-(+)-Trehalose)를 안정제로 사용하는 액상가열처리방법에 관한 것이다. 트레할로스 농도를 10-100w/v %로 조정하고 pH 5.0-9.0, 섭씨 40-70℃에서 적당한 농도의 단백질을 액상 가열처리시 단백질의 생리활성은 충분히 유지하면서 바이러스를 불활화시킨다. 트레할로스를 안정제로 사용하는 경우 기존의 안정제로서 사용되는 당류에 비해 가열 후에도 단백질의 2차 구조에 가장 적은 변화를 나타내었다.

Description

트레할로스를 안정제로 이용한 단백질용액의 액상가열처리방법.
제1도는 안정제로서 트레할로스를 함유한 피브리노겐 용액의 액상가열처리 전과 후의 회전이선광 스펙트럼을 나타낸 것이며,
제2도는 안정제로서 수크로즈,
제3도는 글루코스를 함유한 피브리노겐 용액의 액상가열처리 전과 후의 회전이선광 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.
[해당 기술분야]
본 발명은 단백질을 주성분으로 하는 의약품 생산시, 효과적으로 각종 바이러스를 불활화하여 안전성이 확보된 의약품을 산업적 규모로 생산하는 방법에 관한 것이다. 좀더 상세히 말해서 수용액 상태의 시료를 가열처리(섭씨 60℃,10시간)에 의한 각종 바이러스 불활화시에 트레할로스(D-(+)-Trehalose)를 안정제로 사용함으로서 가열처리된 안전한 의약품용 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
[선행기술]
전통적인 인혈장 혹은 인뇨 유래의 의약품 뿐만 아니라 사람 혹은 동물의 장기나 조직으로부터 유래된 의약품의 경우 각종 바이러스에 오염될 가능성이 매우 크다. 예를 들어 사람의 혈액이나 혈장으로부터 유래될 수 있는 바이러스는 B형, C형, 혹은 NANB형 간염 바이러스, 후천성 면역결핍증 바이러스, 사람 T세포백혈병/림프종바이러스(HTLV-1), 살마사이토메갈로바이러스(HCMV), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus), 허피스바이러스 6 및 7(Herpes virus 6 및 7), 파르보바이러스(Parvovirus B 19), 뮤린 바이러스(Murine virus) 등이며, 유전자 조작 등의 목적으로 쓰이는 세포주로부터 유래될 수 있는 바이러스는 허피스바이러스(Herpes virus), 레트로바이러스(Retro virus) 등이다. 또한 단세포군 항체를 생산하는 사람림프아구종(Human Lymphoblastoid) 세포주에서는 뮤린 레트로바이러스(Murine Retrovirus가 유래될 수 있으며 이로 인해 각종 바이러스 질환이 야기될 수 있다. 따라서 세계보건기구(World Health Organization, WHO), 미국의 식품 의약국(Food Drug Administration, FDA), 유럽공동체(EC)에서는 상기와 같은 이유로 인한 바이러스 질병 전염을 방지하기 위하여 각종 규정을 마련하여 시행중에 있다.
바이러스로부터 안전한 의약품을 제조하는데 있어 가장 핵심적인 사항은 의약품 제조시의 바이러스 불활화이다. 현재까지 개발된 불활화 방법은 다음과 같다.
1) 물리적 방법
ㄱ) 액상 가열처리 방법: 주로 바이러스 단백질의 변성에 의해 바이러스가 불활화된다. 독성, 돌연변이성, 면역원성이 없으며 외피가 있거나(enveloped) 외피가 없는(non-enveloped) 바이러스 및 세균, 기생충 등에 모두 효과가 있고 경제적이다. 단지 원하는 물질의 활성을 유지하기 위하여 안정제가 필요하다.
ㄴ) 건조 가열처리 방법: 주로 바이러스의 지방성분의 산화에 의해 바이러스가 불활화 된다. 동결건조 조건, 잔존수분과 같은 요인들에 주의하여야 한다.
ㄷ) 자외선 조사
2) 화학적 방법
ㄱ) 솔벤트/세제(Solvent/Detergent)방법 : 트리톤 X-100(Triton X-100), 트윈80(Tween 80)과 같은 비이온성세제(non-ionic detergent), 에테르(ether), 아세톤(aceton), 트리 엔 뷰틸 인산(tri-n-butyl-phosphate, TnBP)같은 지질용제(lipid solvent)를 이용하여 외피가 있는 바이러스(enveloped virus)막의 지질성분을 녹여내는 방법이다. 그러나 반대로 외피가 없는 바이러스(non-enveloped virus)는 이에 내성을 가지며, 세균, 기생충 등에 대한 효과도 의문시되고 물질자체의 독성문제가 따른다.
ㄴ) 베타 프로피오락톤(β-propiolaton) : 바이러스 단백질 및 핵산에 작용한다. 매우 약한 화합물로서 전 공정에 걸쳐 농도 유지 여부를 점검해보아야 한다.
ㄷ) 기타 새로운 화학물질 : 소라렌(Psoralen S-59), 소라렌 유도체(AMT), 하이퍼리신(Hypericin, HY), 브롬화 1,8 나프탈렌 광화합물(brominated 1,8-naphthalimite photo compound, LY 66Br) 등이 있다. 이들도 모두 독성 및 돌연변이성 등에 문제를 갖고 있거나 외피가 없는 바이러스(non-enveloped virus) 및 세균, 기생충에 대한 고른 불활화 효과를 보이지 못하고 있다.
3) 마이크로 웨이브 순간열처리법(Ultra short time microwave heating)
4) 맴브레인 여과법(membrane filter method) : 15-75nm크기의 기공(pore)을 가진 맴브레인을 이용하여 바이러스를 걸러낸다.
이외에도 여러 가지 불활화방법이 소개되고 있으나 아직까지 섭씨 60℃, 10시간동안 액상열처리 방법만큼 광범위한 효과와 안정성을 주는 방법은 없는 형편이다. 이러한 액상 가열처리방법은 머레이 등 (Merray, The New York Academy of Med i c ine, 31(5), 341-358, 1955)이 보고한 이래 가장 바람직한 바리어스 불활화 방법으로서 사용되고 있다. 따라서 앞서 언급했듯이 바이러스를 효과적으로 불활화하면서 열에 안정한 생리활성물질들을 적절히 보호할 수 있는 안정제의 선택과 새로운 안정제의 발견에 대한 연구가 꾸준히 계속되고 있으며, 현재까지 액상 가열처리방법에 주로 쓰인 안정제는 주로 알부민과 같은 단백질, 각종 아미노산, 솔비톨(sorbitol)과 같은 폴리올(ployol) 및 당류, 구연산(citrate)과 같은 염류(salts)등이 연구되어 왔다. 본 발명에서는 트레할로스가 전통적으로 사용되어온 다른 당류에 비해 액상 가열처리시 단백질 이차구조의 변화가 가장 적음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본발명의 목적은 안정제로서 트레할로스를 이용하여 단백질 용액을 액상 가열처리하여 바이러스를 불활성화 시키는 방법을 제공하는데 있다. 이하에서는 본발명을 구체적으로 설명한다.
[본발명의 구성]
트레할로스 농도를 10-100w/v %로 조정하고 pH 5.0-9.0, 섭씨 40-70℃에서 적당한 농도의 단백질을 액상 가열처리시 단백질의 생리활성은 충분히 유지하면서 바이러스를 불활화시킨다.
트레할로스는 글로코오스 두 개로 이루어진 이당류이다. 트레할로스의 단백보호기작은 아직 명확히 규정되어 있지 않다. 영국에서는 Q-T4라는 트레할로스를 주성분으로 한 제제를 개발했는데 이것이 생리활성 물질의 보존에 매우 획기적이라고 주장하고 있다(Genetic engineering News, 10-MAR 15 1995). 이들은 특히 동결건조시 생리활성물질에 함유되어 있는 물분자들이 손실되면서 발생하는 생리활성물질의 구조적 변화를 트레할로스가 물분자를 대체하면서 상온 건조시 딱딱한 유리와 같은 구조를 형성, 이 내부에서 생리활성 물질이 구조와 활성을 유지할 수 있다고 보고하였다.
이외에 트레할로스는 단백질 뿐 아니라 효모, 식물 등 고등생물의 건조시 이들의 생존을(Viability)을 높이는데 유효하며, 이들 생물체가 가열(Heat shock)등의 환경적 손상을 받게 되었을 때 자신을 보호하기 위해서 생체내에서 분비된다는 보고도 있으며(The occurrence of trehalose in the leaves of the desiccation-tolerant Angio sperm Myrothamnus-Flabellifolius Welw; Drennan PM, Smith MT, Goldswo rthy D, Vanstaden J, Kournal of Plant Physiology, 142(4),493-496,1993. The role of trehalose synthesis for the acquisition of thermotolerance in Yeast. 2 . Physiological concentrations of trehalos increase the thermal stability of prot eins in vitro; Hottiger T. Devirgilio C, Hall MN, Boller T, Wiemken A. European Journal of Biochemistry, 219(1-2),187-193,1994) 또한 트레할로스가 건조중 각종 단백의 안정성을 높이는 연구 및 건조중 트레할로스의 효모에 대한 안정화 기작을 밝히는 핵자기 공명(NMR)장치를 이용한 연구도 보고되어 있다.(Stability of mono clonal IgM antibodies freeze-dried in the presence of trehalose; Draber P, Dr aberova E, Novakova M, Journal of Immunological Methods. 181(1)37-43, 19 95. On the nature of Yeast cells resistance to drying; Volkov Vy, Sakharov BV, Shchepkin Vd, Fedyukina GN, Kashaba AA, Microbiology 61(2)137-144,1992)
본 발명에 사용된 시료 단백질은 피브리노겐(fibrinogen), 면역글로불린-지(immunoglobulin G), 혈액응고 제 8, 9, 13 인자, 유로키나제, 인뇨유래 트립신저해제 등이다.
본 발명에 따른 열처리 효과를 시험하기 위하여 트레할로스의 존재하에, 그리고 안정제 없이 상기의 각 단백질 용액에 존재할 수 있는 각종 바이러스의 감염성을 다음과 같은 방법으로 검사하였다. 즉 상기의 각 단백질 용액에 폴리오(소아마비 바이러스), 한탄 바이러스, 일본 뇌염바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 수두 바이러스, 수포성 구내면 바이러스를 가하고 얻어진 혼합물을 60℃에서 10시간 동안 열처리하고 시간 경과에 따른 바이러스의 잔류 감염성을 결정하였다. 그 결과 안정제가 존재하거나 존재하지 않거나 관계없이 10시간이 지난후에는 감염성이 완전히 소멸되는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터, 상기에서 사용한 바이러스 이외의 다른 바이러스도 본 발명에 따라 열처리를 실시했을 때 그 감염성을 상실하리라는 것을 암시하고 있다.
또한 본 발명에 따른 트레할로스 존재하에 상술한 열처리를 실시한 후, 시료액의 외관을 검사하고 각 단백의 잔존 역가 및 특성을 다음과 같이 조사하였다. 먼저 피브리노겐의 경우 응고성 단백함량을 검사하여 백분율(%)로 표시하였고, 공지된 방법에 따라 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 실시하였다. 또한 피브리노겐의 열처리 전,후의 구조적 안정성을 입증하기 위하여 회전 이선광분광기(Circular Dichroism)를 사용하였다. 면역글로불린 지의 경우는 중합체의 함량을 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 측정하였으며, 홍역 항체가는 중화항체법을 실시하여 결정하고 국제단위(IU/150mg)로서 나타내었다. 항보체 활성은 카바트와 마이어의 방법[Kabatt Meyer, Experimental Immunochemistry, 2 2 5 ( 1 961)]에 따라 결정하였다. 또한 혈액응고 제 8, 9, 13 인자, 유로키나제, 인뇨유래 트립신 저해제 등도 공개된 방법에 따라 액상가열처리 전후의 역가를 비교 검토하였다. 이하 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
기존 안정제 및 트레할로스를 이용한 피브리노겐 용액의 안정화 효과실험
피브리노겐(fibrinogen)의 농도를 0.3%로 조절하여 제조한 시료를 가지고 실시했다. 각종 안정제를 가한 후(첨가량은 표3에 지시하였다), 시료를 섭씨 60℃에서 10시간 동안 열처리한 후 안정제의 효과를 측정하였는데, 용액의 혼탁도는 외관으로 관찰하고 응고성 단백함량은 변성된 피브리노겐을 원심으로 제거한 상청을 가지고 실험하여 백분율로 알아보았다. 얻어진 결과는 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 플럭토스를 안정제로 사용한 경우 안정성이 유지됨을 나타내었다.
[실시예 2]
약 0.3%의 피브리노겐용액에 표 2에 기재된 안정제를 기재된 양만큼 가한다. 그 후의 공정은 실시예 1과 같으며 얻어진 결과는 글루코스, 수크로스, 트레할로스 안정제의 농도가 60%까지도 피브리노겐의 안정성이 유지되었으며 특히 트레할로스는 높은 응고성 단백질량을 나타냈다.
[실시예 3]
약 0.3%의 피브리노겐용액에 주 안정제로 트레할로스를 표 3에 기재된 양만큼 가한다. 이때 용액은 표 3에 기재된 완충액을 사용하고 pH는 7.0-7.1, 7.37-7.52로 맞춘다. 그 이후의 공정은 실시예 1과 같으며 얻어진 결과는 증류수뿐만 아니라 구연산 나트륨 완충액, 트리스 완충액에서도 피브리노겐의 안정성이 유지되었다.
-구연산 나트륨 완충액(20mM 구연산 나트륨, 75mM 염화나트륨)
-트리스 완충액(5mM Trisma base)
[실시예 4]
주 안정제의 농도를 80%로 맞추고 피브리노겐의 농도를 표 5와 같이 조제한다. 그 이후의 공정은 실시예 1과 같으며 얻어진 결과는 열처리에 첨가된 피브리노겐의 양이 0.45%까지도 피브리노겐의 안정성이 유지되었다.
[실시예 5]
트레할로스 존재하에 액상 가열처리시 각종 바이러스에 대한 불활화 효과를 측정하기 위해 피브리노겐 농도를 0.3%로 한 후 폴리오(소아마비 바이러스), 한탄 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 수두 바이러스, 수포성 구내염 바이러스를 가하고 트레할로스 농도를 80%로 맞추었다. 대조군으로 트레할로스만 첨가하지 않은 동일한 시료를 준비하였다. 이를 섭씨 60℃에서 10시간 동안 열처리하고 시간 경과에 따른 바이러스의 잔류감염성을 결정하였다. 그 결과 안정제가 존재하거나 존재하지 않거나에 관계없이 수시간내에 감염성이 완전히 소멸되는 것을 알 수 있다.
* : log TCID 50/㎖
** : logPFU/㎖
[실시예 6]
약 0.2%의 피브리노겐 용액에 트레할로스, 수크로스, 글루코스 농도를 70%로 맞춘 시료를 섭씨 60℃에서 10시간 동안 열처리 한 후 시료를 2배희석하고, 동일한 당 농도에 피브리노겐이 동일 농도로 함유된 액상 가열처리 전 시료와 함께 회전 이선광(Circular Dichroism) 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과 제 1,2,3도에서 볼 수 있듯이 트레할로스가 가장 유사한 회전이 선광 스펙트럼을 나타내며, 표 6에서 볼수있듯이 트레할로스가 액상 가열 처리에도 불구하고 피브리노겐 이차구조의 변화가 가장 적음을 알 수 있다.
[실시예 7]
주 안정제(트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 면역글로블린 지의 농도를 2%로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 중합체의 함량, 항보체 활성을 시험한다. 얻어진 결과는 면역글로블린 지의 열 안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타내었다. 중합체 함량도 거의 비슷하게 유지되었다.
[실시예 8]
주 안정제(트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 혈액 응고 제 8인자를 10U/ml로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 각각의 활성을 시험했다. 얻어진 결과는 혈액 응고 제 8인자의 열안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타냈다.
[실시예 9]
주 안정제 (트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 혈액 응고 제 9인자를 20U/ml로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 각각의 활성을 시험한다. 얻어진 결과는 혈액 응고 제 9인자의 열안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타내었다.
[실시예 10]
주 안정제(트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 혈액 응고 제 13인자를 20U/ml로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 각각의 활성을 시험한다. 얻어진 결과는 혈액 응고 제 13인자의 열 안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타내었다.
[실시예 11]
주 안정제(트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 유로키나아제를 200,000IU/ml로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 각각의 활성을 시험한다. 얻어진 결과는 유로키나아제의 열 안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타내었다.
[실시예 12]
주 안정제(트레할로스)의 농도를 40%로 맞추고 인뇨 유래 트립신 저해제(UTI)를 10,000U/ml로 조제하여 섭씨 60도에서 10시간동안 열처리한 후, 각각의 활성을 실험한다. 얻어진 결과는 인뇨 유래 트립신 저해제의 열안정성이 안정제를 가함으로써 유지됨을 나타내었다.

Claims (2)

  1. 단백질을 주성분으로 하는 용액의 바이러스를 불활화하기 위하여 단백질을 액상가열처리하는데 있어서, 상기 단백질은 피브리노겐, 면역글로블린 지, 혈액응고 제 8인자, 혈액응고 제 9인자, 혈액응고 제 13인자, 유로키나아제 또는 인뇨 유래 트립신 저해제이며, 안정화제로 트레할로스를 40∼90w/v%로 첨가함을 특징으로 하는 단백질 용액의 액상가열처리방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단백질 용액의 pH가 5.0∼9.0임을 특징으로 하는 단백질 용액의 액상처리방법.
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