KR0168670B1 - 스트렙토마이세테스내에서의 조절된 유전자 발현 - Google Patents

Abstract

플라스미드pIJ101로부터의 kil-kor 시스템은 스트렙토마이세테스내에서의 조절된 유전자 발현에 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위하여, kora단백질은 특성 유전자가 스위치온되도록 불활성화되거나 제거된다.

Description

스트렘토마이세테스내에서의 조절된 유전자 발현

제1도는 플라스미드pKORE2의 제한지도이다.

제2도는 플라스미드 pKILP1의 제한지도이다.

본 발명은 스트렙토마이세테스(strepromycetes)숙주균주내에서의 조절된 유전자 발현에 관한 것이다. 비록 스트렙토마이세테스가 항생물질의 가장 중요한 생산자이기는 하지만 유전학과 관련하여 아직까지는 비교적 알려진 것이 별로 없다. 즉, 스트렙토마이세테스내 유전자 발현을 조절하는 기전에 대하여는 거의 알려져 있지 않다. 비록 티오스트렙톤에 의한 유도 발현이 알려져 있기는 하지만 비용이 많이 들고 수중 용해도가 낮기 때문에 산업적인 규모로 실용화하기에는 부적합하다.

본 발명에 이르러 ,플라스미드 pIJ101로부터의 KIL-KOR시스템이 스트렙토마이세테스내에서의 조절된 유전자 발현에 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 시스템은 문헌[참조:Kendall and Cohen, j.Bacteriol. 169(1987) 4177~4183; 170(1988) 4634-4651]에 기술되어 있으며, 플라스미드 pIJ101의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 상기 두 번째 참조문헌에 기재되어 있다. 이후의 이러한 서열은 상기 문헌을 참조한다. 특히 kilA유전자의 조절 영역이 본 발명에 따른 공정에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다.

즉, 본 발명은 kilA- kora시스템을 스위치로 사용하여 발현시킬 유전자를 kilA조절 영역에 커플링시키고 korA단백질을 불활성화시키거나 제거하여 스위치(switch on)온 되도록 함으로써 스트렙토마이세테스 숙주 균주내에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 개선점 및 바람직한 양태는 이하에서 상세히 설명되고 특허청구의 범위에서 정의된다.

본 발명에 따른 스위치의 일부는 korA단백질이 부착되거나 결합됨으로써 억제되고 반드시 그럴 필요는 없지만 편의상 kilA유전자의 프로모터를 포함하는 DNA영역인 kilA유전자의 조절 영역에 존재한다. 이러한 영역은 천연 DNA서열에서 효소 bglII(제 6160번 뉴클레오타이드에서 시작) 또는 Hinfl(제 6027번 뉴클레오타이드에서 시작) 및 NcoI(제 5764번 뉴클레오타이드에서 시작)의 절단부위에 의해 경계를 이루고 있으며 마지막에서 언급한 절단 부위는 kilA단백질의 ATG출발코돈(본원에서 tra로 언급됨)을 포함하고 있다. kilA프로모터의-35 영역의 DNA서열 TTGACA는 제 5975번 뉴클레오타이드에서 개시된다. 이들 데이터에 대한 지식에 근거하여 조절 영역에 대한 보다 짧거나 변형된 DNA단편을 사용할 수 있고, 경우에 따라서는 다른 프로모터도 사용할 수 있다.

조절된 방법으로 발현시키고자 하는 유전자는 NcoI절단 부위에 상용하는 돌출서열에 직접 연결시킬 수 있다. 출발 코돈뒤의 첫 번째 코돈이 G로 시작하는 경우 NcoI절단 부위를 그대로 둘 수 있다.

본 발명에 따른 스위치의 두 번째 필수 성분은 kilA유전자에 대한 억제자로서 작용하는 korA단백질이다. 적당량의 활성 korA단백질이 존재하는 한, 목적 유전자의 조절된 발현은 수위치 오프된다. 즉, 원리상 스위치 온에 대한 두가지 가능성이 존재한다;

a) korA단백질의 불활성화 또는 b)이의 제거.korA단백질은 이의 온도-민감성 돌연변이체를 발현시켜 목적 유전자를 스위치 온 시키고, 온도-민감성 돌연변이체가 불활성이 되는 즉 kilA유전자의 조절 영역의 억제에 더 이상 적합하지 않게 되는 역치이상의 온도로 온도를 상승시킴으로써 불활성화시킬 수 있다. 이와 같은 온도- 민감성 돌연변이체의 제조방법은 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Birch et al. j Gen Microbiol. 131 (1985) 1299-1303]에 기술되어 있다. 이러한 유형의 돌연변이는 높은 수율로 발생하며, 생성된 온도-민감성 단백질은 본 발명의 범위내에서 적절한 검정법을 이용하여 용이하게 발견할 수 있다. korA단백질은 몇몇 방법을 이용하여 제거시킬 수 있다:

korA유전자를 스위칭 가능한 프로모터 조절하에 둘 수 있다. 리신 데카복실라제에 대한 mRNA의 전사가 염화 제2철(III)을 배지에 첨가함으로써 억제됨이 알려져 있다. [참조문헌 Schupp et al., Gene 64 (1988)179-188]중금속 이온을 공업용 발효조에 첨가할 수도 있지만 예를 들면, 이의 첨가와 관련한 부식의 위험이 따르기 때문에 불리하다.

korA유전자를 온도-민감성 플라스미드에 도입시키는 것이 더욱 유리하며, 이러한 경우 스트렙토마이세테스내에서 활성적인 자체의 프로모터 또는 다른 프로모터가 사용될 수 있다. 스트렙토마이세테스 내에서 복제되는 온도- 민감성 플라스미드는 공지되어 있으며 예를 들면, 버치(Birch)등에 의해 기술되어 있다. 그러나, 플라스미드 pSG5의 온도 -민감성 레플리콘을 사용한 플라스미드가 특히 유리하다. 이러한 플라스미드는 EP-B제 0 158 872 호 및 US-A제 4 880 746호에 기술되어 있으며 온도 -민감성 플라스미드로서 pSG5를 사용한 예가 EP-A제 0 334 282 호에 기술되어 있다. 플라스미드 pSG5는 숙부범위가 광범위하고 다수의 다른 스트렙토마이세테스 플라스미드와 병존할 수 있다. 이들 특성을 이용한 셔틀 벡터가 EP-B제 0 158 201 호에 기술되어 있다.

따라서 본 발명에 따라 korA 유전자를 pSG5의 온도- 민감성 레플리콘을 함유하는 플라스미드에 도입시킬 수 있고 이렇게 하는 것이 특히 유리하며, 이때 발현시키고자 하는 유전자는 kilA조절 영역의 조절하에 pSG5유도체와 병존할 수 있는 다른 플라스미드에 도입되고 pSG5 레플리콘의 역치 온도 이상에서 여전히 안정하게 복제된다.

korA유전자는 편의상 플라스미드 pIJ101의 AhaII-BclI단편으로서 사용된다. (AhaII에 대한 인식 서열은 제 5930번 뉴클레오타이드에서 시작되고 인식서열은 제 6753번에서 시작되며; KorA프로모터의 -35영역의 CGCACA서열로 제 5957번 뉴클레오타이드에서 시작되며, 전사는 제 5992번 뉴클레오타이드에서 개시된다.)

두 개의 상이한 플라스미드가 사용될 경우, 반드시 그러한 것은 아니지만 두 플라스미드가 셔틀 벡터가 될 수 있다. 그러나 재조합 과정의 방해를 배제하기 위하여 두 플라스미드가 어떠한 상동성 영역도 함유하지 않도록 주의해야 한다. 발현시키고자 하는 유전자는 kilA조절영역의 조절하에 통상적인 스트렙토마이테스 발현 플라스미드에 탑제시킬수 있다. 본 발명의 유리한 개선점은 목적 단백질을 암호화하는 유전자, 예를 들어 프로인슐린을 암호화하는 유전자를 α-아밀라제 억제자 텐다미스테스에 대한 유전자 또는 이 유전자의 일부와 커플링시킴을 특징으로 한다. 이렇게 하여 암호화된 융합 단백질은 세포로부터 배출되어 발효 상등액으로부터 간단히 수득될 수 있다. 이러한 유형의 유전자 융합은 프로인슐린을 함유하는 융합 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드의 몇몇 예를 기술하고 있는 EP-A제 0 289 936호와 더불어 예를 들면, EP-A 제 0 281 090호 및 EP-A 제 0 289 936호에 기술되어 있다. 본 발명은 하기 실시예에서 상세히 설명된다.

[실시예1]

벡터 pKORE2의 작제

플라스미드pIj101(John Innes Foundation, Norwich, England)을 AhaII 및 BclI로 분해한 다음 830bp크기의 단편을 분리해낸다.

플라스미드 pSG5(EP-B제 0 158 872 호 및 US-A 제 4 880 746호)로부터 3.8kbp크기의 EcoRI-BamHI단편을 분리해내고 BamHI-AhaII링커를 제공한다.

시판되고 있는 플라스미드 pUC19를 효소 EcoRI 및 HindIII로 분해한 다음Bbal유전자를 함유하는 거대 단편을 분리해 낸다.

스트렙토마이세테스내에서 선별가능한 마커를 도입시키기 위하여 크기가 1.85kbp이고 aphII유전자를 함유하는 트랜스포손 Tn5로부터의 HindIII-BamHI단편을 사용한다. 이들 DNA단편을 연결시킴으로써 9.2kbp크기의 플라스미드 pKORE2(제1도)가 생성된다. 이 플라스미드는 플라스미드 pSG5로부터의 온도-민감성 레플리콘을 함유하며, 따라서 34℃이하의 온도에서만 복제가 안정하게 일어난다. 이와는 달리 36℃이상의 온도에서는 플라스미드 복제가 억제되고 세포로부터 플라스미드가 제거된다.

pSG5 레플리콘의 광범위한 숙주 범위 및 예를 들면, 플라스미드pSVH1(EP-B 제 0 070 533호, US-A 제 4 673 642호), pSG2( EP-B제 0 066 701호, US-A제 4 621 061호) pIJ101[참조: Kiser et al., Mol. Gen. Genet.185 (1982)223-238]및

SLP 1.2 [참조: Thompson et al., Genet 20(1982)51-62]를 기본으로 하는 다수의 기타 벡터 시스템과의 병존성으로 인하여, 플라스미드pKORE2는 목적 단백질을 암호화하는 다수의 플라스미드와 조합시킬 수 있다.

[실시예2]

융합 단백질의 가열-유도 생산

플라스미드 pIj101의 kilA유전자의 프로모터 영역을 제한효소 Sau3A로 절단하고 프로모터 선별 벡터pIj487(john Innes Foundation)의 고유한 BamHI절단 부위에 클로닝시킨다. 스트렙토마이세테스 리비단스(s. lividans)TK24에 형질전환시킨후에 네오마이신 내성을 발현시킴으로써 성공적으로 클로닝이 일어났는지 인지한다. 분리해낸 프로모터 영역(단편1)은 제한효소 KpnI및SphI로 절단하고 전기용출에 의해 공지된 방법에 따라 분리해낼 수 있다.

α-AI프로모터를 플라스미드 pGF1(EP-A 제 0 289 936호, ZA 제 88/3168호,AU-A제 15 559/88호, 제 222 464호)로부터 SphI- XmaIII DNA 단편을 절단된 합성 SphI-XmaIII DNA단편(서열 확인번호:1)으로 대체시킴으로써 결실시킨다:

상기와 같이 수행함으로써 시그날 서열 α-AI유전자,프로인슐린 유전자 및 종결 서열로 이루어진 완전한 융합 작제물을 함유하는 플라스미드 pGF1p1이 생성된다. 이러한 DNA서열 (단편2)을 제한효소 SphI 및 SstI로 분해 절단하여 공지의 방법으로 분리할 수 있다. 시판되고 있는 발현 벡터pIJ702 (John Innes Foundation)를 제한효소 kpnI 및 SstI로 분해하고 거대 단편(단편3)을 전술한 바와 같이 전기용출시킨다.

단편 1,2 및 3을 연결시킴으로써 재조합 플라스미드 pKILP1(제2도)이 생성된다. 병존할 수 있는 플라스미드 pKORE2를 이미 함유하고 있는 스트렙토마이세테스 리비단스 TK24에 형질전화시킨 다음 티오스트렙톤 및 네오마이신 내성마커의 존재에 따라 선별한다. 온도를 36℃로 상승시킨후에도 두 플라스미드 모두를 함유하는 클론은α-아밀라제 억제자 및 프로인슐린으로 이루어진 목적하는 융합 단백질을 분비하며 이것을 공지된 방법으로 탐지하고 분리할 수 있다.

Claims (5)

1. 스위치로서 KilA-KorA시스템을 사용하고, 발현시킬 유전자를 kilA조절 영역과 커플링시키며, KorA단백질을 불활성화시키거나 제거시켜 스위치 온(switsh on)시킴을 특징으로 하는 스트렙토마이세테스 숙주 균주내에서의 유전자의 조절된 발현 방법.
2. 제 1항에 있어서, 온도-민감성 korA단백질을 발현시키고 온도를 이의 역치이상으로 상승시키는 방법.
3. 제1항에 있어서, KorA 유전자를 스위칭 가능한 프로모터의 조절하에 있도록 하는 방법.
4. 제1항에 있어서 kora유전자를 온도- 민감성 플라스미드에 의해 발현시키고 온도를 이의 역치 이상으로 상승시키는 방법.
5. 스트렙토마이세테스 숙주 균주내에서의 유전자의 조절된 발현을 위한 스위치로서의 KilA-KorA시스템의 용도 .

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