KR0165673B1 - 항생 물질 ge 2270 인자 a1, a2, a3 및 h - Google Patents

항생 물질 ge 2270 인자 a1, a2, a3 및 h Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H
제1, 4, 7도 및 제11도는 각각 항생물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H의 자외선 흡수 스펙트럼.
제2, 5, 8도 및 제12도는 각각 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H의 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼.
제3, 6, 9도 및 제13도는 각각 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H의1H-BMR 스펙트럼.
제10도는 항생 물질 GE 2270 인자 A3의3C-NMR 스펙트럼.
첨부한 UV 스펙트럼에 사용한 기호는 다음 의미를 갖는다.
Figure kpo00002
본 발명은 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H로 명명되는 신규 항생물질, 이의 부가염, 이의 제약학적 조성물 및 이의 약제로서의 용도, 특히 이 항생물질에 감수성인 미생물과 관련된 감염증 치료시 약제로서의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 화합물은 가금, 돼지, 반추 동물과 같은 동물 등의 성장 촉진제로서 작용한다.
본 발명의 또 다른 목적은 항생 물질 GE 2270 인자 A를 선택적으로 전환시켜 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H를 제조하는 방법이다. 이 물질은 또한, 플라노비스포라 로제아(Planobispora rosea) ATCC 53773(1989년 9월 8일에 특허 출원 89-13021과 관련하여 대한민국 특허청에 수탁증을 제출함) 표본을 배양하거나 또는 이 미생물의 변종 또는 변이체를 제조하고, 균사체 및/또는 발효 육즙으로부터 목적 항생 물질을 단리하는 방법에 의해 제조된다. 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773은 토양 표본으로부터 단리되었으며, 부다페스트 조약의 조항에 의거하여 1988년 6월 14일 미합중국 20852 메릴랜드주 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재한 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되었다.
이 균주의 기탁 번호는 ATCC 53773이다.
항생물질 GE 2270 인자 A 및 플라노비스포라 로제아 ATCC 53773은 유럽 특허 출원 공고 제359062호에 기재되어 있다.
항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H와 이에 상응하는 제약학적으로 허용되는 염의 항균 활성이 유용할 때는 유사하다는 점에서, 본 출원에서 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H의 생물학적 특성을 다룰 대는 이에 상응하는 염들도 포함하고, 역으로 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3및 H의 제약학적으로 허용되는 부가염의 생물학적 특성을 다룰 때는 이에 상응하는 비(非)부가염 형태도 포함한다.
특히, 항생 물질 GE 2270 인자 A3는 통상의 절차에 의해 염기 부가염을 형성할 수 있다.
이러한 염기로서 대표적인 예에는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물(수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 및 수산화바륨) 및 암모니아 및 지방족, 지환족 또는 방향족 유기 아민(메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민 및 피콜린)이 있다. 또한, 본 명세서에 정의된 염기 부가염은 염기성 아미노산 또는 이들의 유도체(아르기닌, 리신 또는 오르니틴)와의 염도 포함한다.
본 발명의 비염(非鹽) 화합물을 상응하는 부가염으로 변환시키거나, 역으로 본 발명의 화합물의 부가염을 비염 형태로 변환시키는 방법은 통상의 기술 영역에 속하며, 본 발명은 이러한 방법도 포함한다.
예를 들면, 항생 물질 GE 2270 인자 A3의 염기 부가염은 비염형을 수성 용매 중에 용해시키거나 또는 헌탁시키고, 선택한 염기를 약간의 몰과량으로 첨가함으로써 제조할 수 있다. 이어서, 얻어진 용액 또는 현탁액을 동결건조시켜 목적하는 염을 회수한다.
비염형이 용해될 수 있는 용매 중에서 최종 염이 불용성인 경우, 선택한 염기를 화학양론적으로 약간의 몰과량으로 첨가한 후, 비염형의 유기 용액을 여과하여 최종 염을 회수한다.
비염형은 상응하는 염기염을 수성 용매 중에 용해시키고, 이어서 중화시킴으로써 유리 비염형으로 제조할 수 있다.
중화 후, 과량의 산 또는 염기를 제거할 필요가 있을 때는 통상적인 탈염법을 이용할 수 있다.
예를 들면, 실란화 실리카겔, 비(非) 관능화 폴리스티렌, 아크릴계 수지 및 조절된 기공을 갖는 폴리덱스트란 수지(세파덱스(Sephadex)
Figure kpo00003
LH 20) 또는 활성탄 상에서의 컬럼 크로마토그래피가 통상적으로 사용될 수 있다. 목적하지 않는 염을 수용액으로 용출한 후, 아세토니트릴/물(50:50 내지 약 100% 아세토니트릴)과 같은 물 및 극성 또는 비극성 유기 용매의 화합물의 선형 기울기 용리 또는 단계 기울기 용리에 의해 목적물을 용출한다.
본 발명의 화합물들은 선택적인 화학적 전환 조건하에서 항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 제조된다.
더 구체적으로 말하면, 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, 및 A3는 선택적 가수분해 조건하에서 항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 제조되는 반면, 항생 물질 GE 2270 인자 H는 항생물질 GE 2270 인자 A를 환원 조건하에서 선택적으로 분할시켜 제조한다.
일반적으로, 전술한 가수 분해 조건에서는 완충 또는 비완충 수성 산 매질과 극성 유기 용매의 혼합물의 사용을 포함한다. 반응 온도는 사용한 산의 세기 및 농도와 같은 인자에 따라 변하는데, 일반적으로 -10℃ 내지 90℃의 온도이다. 또한, 반응 시간은 온도, 산의 세기 및 농도와 같은 나머지 변수에 따라 크게 변하고; 일반적으로는 수 분 내지 수 시간으로 변할 수 있다.
일반적으로, 보다 온화한 가수 분해 조건(예를 들면, 반응 시간이 보다 짧고, 반응 온도가 보다 낮거나 또는 산의 세기 또는 농도가 보다 낮음)에서는 통상적으로 항생 물질 GE 2270 인자 A1이 얻어지고, 보다 강한 조건에서는 항생 물질 GE 2270 인자 A2가 얻어진다. 산 가수 분해 조건하에서 항생 물질 GE 2270 인자 A3을 얻기 위해서는 여전히, 보다 격렬한 조건이 필요하다.
그러나, 반응 과정이 통상의 절차(예를 들면, TLC 또는 HPLC)에 의해 모니터링할 수 있기 때문에 출발 물질의 소멸 및/또는 최종 생성물의 출현에 의해, 당업자는 반응의 완결 시점을 결정하여 회수 절차를 시작할 수 있다.
완충 또는 비완충 수성 산 매질의 예에는 염화수소, 브롬화수소 또는 요오드화 수소와 같은 할로겐화수소; 인산; 황산; (C1-C6) 지방족산, 할로겐화 (C2-C5) 지방족산 또는 아릴산; (C2-C6)알킬술폰산 또는 아릴술폰산; 산 형태의 양이온 교환 수지 및 다양성자산의 부분 염화(鹽化) 생성물(즉, 물 중에서 산성 반응을 하는 염)로서, 예를 들면 알칼리 금속 인산일수소염 또는 인산이수소염, 알칼리 금속 황산수소염 등과 같은 무기산 또는 유기산의 수용액 또는 수현탁액이 있다. 알칼리 금속의 예에는 나트륨 및 칼륨이 있다.
상기의 (C1-C6) 지방족산으로서 대표적인 예에는 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 발레르산, 이소발레르산, 트리메틸아세트산 등이 있다.
상기의 할로겐화 (C2-C5) 지방족산으로서 대표적인 예는 플루오로아세트산, 클로로아세트산, 디플루오로아세트산, 디클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 트리클로로아세트산, 펜타플루오로프로피온산, 2, 2, 3, 4, 4, 4,-헥사플루오로부티르산, 헵타플루오로부티르산 등과 같은 모노- 또는 폴리-클로로, 브로모 또는 요오드 지방족산이다.
상기의 아릴산으로서 대표적인 예에는 벤조산 및 일- 또는 다-치환된 벤조산(클로로벤조산, 메틸벤조산, 프탈산, 테르프탈산, 벤질아세트산 등)이 있다.
상기의 술폰산으로서 대표적인 예에는 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 시클로헥산술폰산, 캄포르술폰산, 알파-나프날렌술폰산 및 베타-나프탈렌술폰산이 있다.
상기의 양이온 교환 수지로는 산 형태의 술폰화 스티렌 수지 및 스티렌-디비닐 벤젠 수지와 같은 통상적으로 공지되며 시판 중인 수지가 있다.
상기의 적합한 유기 용매는
a) 출발 물질을 적어도 부분적으로 가용화시킬 수 있고,
b) 일단 생성된 생성물이 분리되거나 또는 통상의 기술에 의해 분리될 수 있으며,
c) 어떠한 경우든, 반응 과정에 불리하게 지장을 주지 않는 용매가 적절하다.
상기의 극성 유기 용매의 예로는 디옥산(즉, 디에틸렌디옥시드), 테트라히드로푸란 등과 같은 산소 함유 고리 지방족 용매, 저급 알칸올, 페닐기로 치환된 저급 알칸올, 저급 알킬 카르복사미드, 저급 알킬 술폭사미드, 저급 알킬 포스포라미드, 저급 알킬 술폭시드 및 저급 알킬 술폰 등 및 이들의 혼합물이 있다. 상기의 저급 알킬이란 용어는 바람직하기로는 탄소 원자수가 1 내지 6인 알킬기를 의미한다.
저급 알칸올의 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 1-메틸에탄올, 부탄올 및 2-메틸 프로판올과 같은 C1-C6알칸올이 있다.
페닐기로 치화된 저급 알칸올의 예로는 벤질 알코올, m-클로로벤질 알코올, o-플루오로벤질 알코올, m-플루오로벤질 알코올, p-플루오로벤질 알코올, m-메틸벤질 알코올, m-메톡시벤질 알코올, o-에톡시벤질 알코올, m-부톡시벤질 알코올, p-tert.부톡시벤질 알코올, p-tert.부틸벤질 알코올, 펜에틸 알코올, o-클로로펜에틸 알코올, m-클로로펜에틸 알코올, o-메톡시펜에틸 알코올, m-메톡시펜에틸 알코올, o-프로필펜에틸 알코올, o-에톡시펜에틸 알코올, p-플루오로펜에틸 알코올, p-브로모펜에틸 알코올, o-프로폭시펜에틸 알코올, o-부톡시펜에틸 알코올, 1-(p-이소프로필페닐)에탄올, 3-페닐-1-프로판올, 2-페닐-1-프로판올, 4-페닐-1-부탄올 및 3-페닐-1-부탄올이 있다.
저급 알킬 카르복사미드의 예로는 디메틸포름아미드, 디에틸포름아미드 등이 있다. 바람직한 저급 알킬 술폭시드는 디메틸 술폭시드이고, 바람직한 저급 알킬 술폰은 디메틸술폰이며, 바람직한 저급 알킬 포스포라미드는 헥사메틸 포스포라미드이다.
본 발명의 바람직한 실시 태양에서는 항생 물질 GE 2270 인자 A를 -10℃ 내지 50℃, 바람직하기로는 4℃ 내지 25℃의 온도에서 극성 유기 용매 존재 하에 완충 또는 비완충 산매질과 접촉시키는 것을 포함하여 항생 물질 GE 2270 인자 A1을 제조하는 방법을 기술한다. 반응 시간은 나머지 특정 반응 변수에 의해 상당히 달라지지만, 이 경우에는 일반적으로 5분 내지 16시간이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에서는 항생 물질 GE 2270 인자 A 또는 A1을 40℃ 내지 90℃, 바람직하기로는 50℃ 내지 70℃에서 극성 유기 용매 존재하에 완퉁 또는 비완충 산매질과 접촉시키는 것을 포함하여 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 제조하는 방법을 기술한다. 반응 시간은 나머지 특정 반응 변수에 의해 상당히 달라지지만, 이 경우에는 일반적으로 12시간 내지 24시간이다.
상기 조건하에서 인자 A1을 인자 A2로 전환시키는 경우, 출발 물질 분자에 의해 암모니아가 소비되는 것으로 보인다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에서는 항생 물질 GE 2270 인자 A를 40℃ 내지 90℃, 바람직하기로는 65℃ 내지 80℃의 온도에서 극성 유기 용매 존재하에 완충 또는 비완충 산매질과 접촉시키는 것을 포함하여 항생 물질 GE 2270 인자 A3를 제조하는 방법을 기술한다. 반응 시간은 나머지 특정 반응 변수에 의해 상당히 달라지지만, 이 경우에는 일반적으로 8시간 내지 48시간이다.
그러나, 이 경우에, 전환 수율은 강력한 반응 조건을 이용한다 하더라에도 일반적으로 낮다(수율 5-15몰%).
허용되는 수율 및 순도로 항생 물질 GE 2270 인자 A3를 제조하는 바람직한 방법은 극성 유기 용매 존재하에 염기성 가수 분해 조건에서 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 처리하는 것이다. 극성 유기 용매의 예는 상기한 바와 같고, 염기성 조건은 염기성 수용액 또는 수현탁액에 의해 얻을 수 있다.
편리하게 사용할 수 있는 염기의 예로는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물; 알칼리 금속의 탄산염 또는 중탄산염과 같이 수중에서 염기성 반응을 하는 염; 암모니아 및 알킬 아민(예:디메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리메틸아민) 및 피콜린과 같은 지방족 또는 방향족 아민과 같은 무기 또는 유기 염기가 있다. 알칼리 토금속의 예로는 칼슘과 마그네슘이 있다.
다음의 특정 반응 조건은 본 발명의 방법을 구체적으로 설명하기 위해 주어진 것에 지나지 않는다.
다음 표에서, R.T.는 실온 즉, 약 15℃-25℃를 나타내고, EtOH는 에탄올을 나타내고, TFA는 트리플루오로아세트산을 나타내고, AcOH는 아세트산을 나타내고, Dowex 50W×2(H+)는 산 형태의 양이온 교환 수지이고, TEA는 트리에틸아민을 나타낸다.
항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 항생 물질 GE 2270 인자 A1을 제조하기 위한 특히 바람직한 반응 조건은 다음과 같다.
Figure kpo00004
항생 물질 GE 2270 인자 A 또는 인자 A또는 이 인자들의 혼합물로부터 항생 물질 GE 2270 인자 A를 제조하기 위한 특히 바람직한 반응 조건은 다음과 같다.
Figure kpo00005
항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 항생 물질 GE 2270 인자 A를 제조하기 위한 특히 바람직한 반응 조건은 다음과 같다.
Figure kpo00006
항생 물질 GE 2270 인자 A로부터 항생 물질 GE 2270 인자 A을 제조하기 위한 특히 바람직한 반응 조건은 다음과 같다.
Figure kpo00007
항생 물질 GE 2270 인자 H는 항생 물질 GE 2270 인자 A를 환원 조건하에서 조절 분할시켜 제조한다.
바람직한 환원 조건은 상기의 용매중 하나와 같은 상용성 극성 유기 용매 중의 붕수소화나트륨 또는 붕수소화칼륨과 같은 알칼리 금속의 붕수소화염으로 주어진다. 바람직한 용매는 수성 테트라히드로푸란이고, 바람직한 붕수소화염은 붕수소화나트륨이다.
본 발명의 화합물은 그 자체로 공지된 기술 즉, 용매 추출법, 침전제, pH 변화 및/또는 논축에 의한 침전법, 및 크로마토그래피, 역상 분배 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분자 배제 크로마토그래피, 예비(preparative) PHLC 등과 같은 크로마토그래피법에 의해 제법 공정의 종료시에 회수한다.
항생 물질 GE 2270 인자 A의 물리화학적 특성
A) 첨부 도면 제1도에 도시한 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타낸다.
Figure kpo00008
B) 첨부 도면 제2도에 도시한 뉴졸 멀(nujol mull)의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝ )를 나타낸다.
3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1650; 1535; 1505; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1310; 1240; 1190; 1165; 1130-1000; 980; 930; 930; 840; 805; 750; 720 (뉴졸); 700;
C) 제3도에 도시한 H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널을 나타내고, 각 시그널의 다중도를 함께 표시한다(s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
0.84, d; 0.87, d; 1.35, m; 1.91, m; 2.08, m; 2.16, m; 2.46, d; 2.58, s; 2.70, dd; 3.38, s; 3.76, m; 3.84, m; 4.26, dd; 4.33, m; 4.89, m; 4.97, s; 5.00, dd; 5.20, dd; 5.22, dd; 5.28 (2개의 양성자), m; 6.01, d; 7.07, s; 7.2, s; 7.34, s; 7.22-7.38 (6개의 양성자), m; 8.29, s; 8.39, d; 8.44, m; 8.45, d; 8.54, s; 8.60, s; 8.66, d; 9.69, d; 8.99, d.
D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt)은 13.4분이다.
컬럼:울트라스피어(Ultrasphere) ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(Altex)(베크만(Beckman)) 4.6㎜(내경)×250㎜
프리(pre)-컬럼:브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
용출제 A:아세토니트릴:18mM NaHPO, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용출제 B:아세토니트릴:18mM NaHPO, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
유속:1.8ml/분
U.V. 검출기:254㎚
내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석은 다음의 조성을 나타냈다:탄소, 수소, 질소 및 황
F) FAB-MS 분석은 1308m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석했을 때, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하였다.
항생 물질 GE 2270 인자 A의 물리화학적 특성
A) 첨부 도면 제4도에 도시한 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타낸다.
Figure kpo00009
B) 첨부 도면 제5도에 도시한 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝ )를 나타낸다.
3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1725; 1655; 1590-1480 (뉴졸); 1410; 1375 (뉴졸); 1335; 1305; 1265-1130; 1090; 1050; 1015; 980; 945; 930; 840; 805; 745; 720 (뉴졸); 700;
C) 제9도에 도시한 H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널(ppm)을 나타내었고, 각 시그널의 다중도를 함께 표시하였다(s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
0.83, d; 0.86, d; 1.30, m; 1.82, m; 1.90, m; 2.17, m; 2.46, d; 2.57, s; 2.70, dd; 3.37, s; 3.40, m; 3.48, m; 3.77, dd; 4.24, m; 4.28, dd; 4.52, d; 4.53, br s; 4.67, d; 4.96, s; 4.98, dd; 5.19, m; 5.21, m; 5.28, m; 6.01, d; 7.34, s; 7.22-7.35, m; 8.26, d; 8.28, s; 8.42, d; 8.45, s; 8.59, s; 8.67 (2개의 양성자), d; 8.73, s; 9.00, d;
D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt)은 17.0분이다.
컬럼:울트라스피어 ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(베크만) 4.6㎜(내경)×250㎜
프리 컬럼:브라운리 랩스 RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
용출제 A:아세토니트릴:18mM NaHPO, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용출제 B:아세토니트릴:18mM NaHPO, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
유속:1.8ml/분
U.V. 검출기:254㎚
내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석은 다음의 조성을 나타냈다:탄소, 수소, 질소 및 황
F) FAB-MS 분석은 1291m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스 MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석했을 때, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하였다.
항생 물질 GE 2270 인자 A의 물리화학적 특성
A) 첨부 도면 제7도에 도시한 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타낸다.
Figure kpo00010
B) 첨부 도면 제8도에 도시한 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝ )를 나타낸다.
3700-3140; 3110; 3020-2750 (뉴졸); 1720; 1655; 1690-1520; 1500; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1270-1200; 1130-1030; 1020; 980; 930; 840; 805; 750; 720 (뉴졸); 700;
C) 제9도에 도시한 H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널(ppm)을 나타내었고, 각 시그널의 양성자의 수 및 다중도를 함께 표시하였다(s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
9.02, 1H (d); 8.71, 1H (d); 8.70, 1H (d); 8.65, 1H (s); 8.57, 1H (s); 8.46, 1H (m); 8.38, 1H (d); 8.28, 1H (d); 8.25, 1H (s); 7.38, 1H (m); 7.37, 1H (s); 7.36-7.20, 5H (m); 6.05, 1H (br s); 5.31, 1H (m); 5.27, 1H (dd); 5.20, 1H (dd); 5.03, 1H (d); 4.99, 2H (s); 4.32, 1H (dd); 3.82, 1H (dd); 3.38, 3H (s); 2.74, 1H (dd); 2.60, 3H (s); 2.49, 3H (d); 2.17, 1H (m); 1.35, 1H (m); 0.88, 3H (d); 0.84, 3H (d);
D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt)은 7.1분이다.
컬럼:울트라스피어 ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(베크만) 4.6㎜(내경)×250㎜
프리 컬럼:브라운리 랩스 RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
용출제 A:아세토니트릴:18mM NaHPO, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용출제 B:아세토니트릴:18mM NaHPO, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
유속:1.8ml/분
U.V. 검출기:254㎚
내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석은 다음의 조성을 나타냈다:탄소 51.27%, 수소 4.02%, 질소 14.94% 및 황
F) FAB-MS 분석은 1125m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스 MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석했을 때, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하였다.
G) 첨부 도면 제10도에 도시한 C-NMR 스펙트럼은 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여, DMSO-d중에서 125㎒로 측정한 것이며, 다음의 시그널(ppm)을 나타내었다.
171.2; 169.9, 169.6; 168.5; 167.8; 165.7; 164.8; 162.2; 161.4; 161.3; 160.3; 160.5; 160.4; 153.5; 150.4; 150.1; 149.5; 149.1; 147.0; 143.8; 142.1; 141.8; 141.4; 141.0; 139.6; 131.8; 128.0 (2개의 탄소); 127.7; 127.6; 126.9; 126.8 (2개의 탄소); 123.1; 118.7; 116.4; 73.9; 67.4; 58.7; 58.3; 55.5; 48.2; 41.2; 37.7; 34.1; 25.9; 18.5; 18.0; 12.0;
H) CHCl+10% CHOH 중에서 고유 광학 회전[a] 은 +182.5이다.
항생 물질 GE 2270 인자 H의 물리화학적 특성
A) 첨부 도면 제11도에 도시한 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타낸다.
Figure kpo00011
B) 첨부 도면 제12도에 도시한 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝ )를 나타낸다.
3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1655; 1590-1480; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1310; 1220; 1190; 1130-1000; 980; 930; 840; 820-680; 720 (뉴졸); 640;
C) 제13도에 도시한 H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널(ppm)을 보여주며, 각 시그널의 다중도를 함께 표시하였다(s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
0.83, d; 0.87, d; 1.30, m; 2.16, m; 2.46, d; 2.58, s; 2.70, dd; 3.38, s; 3.52, m; 3.61, m; 3.77, dd; 4.25, m; 4.30, m; 4.35, m; 4.47, m; 4.88, m; 4.97, s; 4.99, dd; 5.20, m; 5.23, m; 5.28, m; 6.02, d; 7.36, s; 7.22-7.40, m; 8.26, d; 8.28, s; 8.42, d; 8.43, m; 8.47, s; 8.60, s; 8.67, d; 9.02, d;
D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt)은 18.0분이다.
컬럼:울트라스피어 ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(베크만) 4.6㎜(내경)×250㎜
프리 컬럼:브라운리 랩스 RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
용출제 A:아세토니트릴:18mM NaHPO, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용출제 B:아세토니트릴:18mM NaHPO, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
유속:1.8ml/분
U.V. 검출기:254㎚
내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석은 다음의 조성을 나타냈다:탄소, 수소, 질소 및 황
F) FAB-MS 분석은 1180m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스 MS-50 이중 촛점 질량 분석기를 이용하여 분석했을 때, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하였다.
본 발명의 화합물의 향균 활성은 일련의 시험관 내 표준 시험에 의해 증명될 수 있다.
클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 프로피오니박테륨 아크네스(Propionibacterium acnes) 및 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)에 대한 MIC는 한천 희석법(접종물 10 내지 10 개의 CFU/스폿)에 의해 측정된다. 기타 유기체에 대한 MIC는 미세육즙 희석법(microbroth dilution)(접종물 10 내지 10 개의 CFU/ml)에 의해 측정된다. 나이제리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae), 브란하멜라 카타르할리스(Branhamella catarrhalis), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 클로스트리듐 디피실레(C. difficile), 프로피오니박테륨 아크네스(P. acnes), 박테로이데스 프라길리스(B. fragilis)에 대한 배양 시간은 48시간이지만, 이외의 기타 유기체의 배양 시간은 18 내지 24시간이다. 모든 유기체의 배양 온도는 37℃이다. 나이제리아 고노리아(N. gonorrhoeae) 및 헤모필루스 인플루엔자(H. influenzae)는 CO가 5%인 대기 중에서 배양하고, 혐기균은 혐기성 기체 혼합물 중에서 배양한다. 사용한 배지는 스타필로코키(Staphylococci), 스트렙토코쿠스 파칼리스(Streptococcus faecalis), 에웨리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)의 경우로는 이소-센시테스트(Iso-Sensitest) 육즙[옥소이드(Oxoid) 제품]이고, 다른 스트렙토코쿠스에 대해서는 토드-헤위트(Todd-Hewitt) 육즙[디프코(Difco) 제품]이며, 브란하멜라 카타르할리스에 대해서는 뮤엘러 힌톤(Mueller Hinton) 육즙(BBL 제품)이고, 나이제리아 고노리아에 대해서는 GC 베이스 브로스(GC base broth)(디프코)+1% 이소비탈렉스(Iso Vitalex)(BBL)이며, 헤모필루스 인플루엔자에 대해서는 뇌 심장 추출 육즙(brain heart infusion broth)(디프코)+1% 서플리먼트 시(Supplement C)(디프코)이고, 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium Perfringens)에 대해서는 AC 배지(디프코)이며, 기타 혐기균에 대해서는 윌킨스-샬그렌 한천(Wilkins-Chalgren agar)(디프코)이다[참조:윌킨스(T.D. Wilkins) 및 샬그렌(S. Chalgren), Antimicrob. Ag. Chemother. 10, 926, 1976]. 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)는 CO가 5%인 대기 중에서, 10% 송아지 태아 혈청이 첨가된 이글스(Eagle's) MEM 배지(깁코(Gibco) 제품) 중에서 시클로헤시미드 처리된 맥코이(McCoy) 세포 단층상의 미소역가(microtiter) 판에서 배양허였다. 접종물은 300배 현미경 시야당 30 내지 60개의 봉입물(inclusion)을 제공하도록 제조했다. 48시간 후, 클라미디아의 봉입물을 주요 외막 단백질(Syva)에 대한 형광 표지된 단일클론 항체로 착색해서 형광 현미경 검사법으로 계수하였다. MIC는 봉입물이 더 이상 보이지 않았고 세포 형태가 정상이 되었을 때의 농도로서 취하였다.
몇몇 미생물에 대한 최소 억제 농도(MIC, ㎍/ml)를 하기 표 Ⅰ에 나타낸다.
Figure kpo00012
Figure kpo00013
Figure kpo00014
Figure kpo00015
또한, 본 발명의 화합물의 항균 활성은 생쥐의 실험적 패혈증에서도 확인된다.
양성(兩性)으로 구성된 5마리의 CDI 생쥐군 그룹(찰스 리버(Charles River), 평균 중량 18 내지 22g)의 복강 내로 스타필로코카스 아우레우스(Staphylococcus aureus) ATCC 19636을 감염시켰다. 세균 감염물(10 개의 세포/생쥐 1마리)은 5%의 세균학적 점액(디프코) 0.5ml 중에 현탁시켰다. 시험 화합물은 5%의 디메틸포름아미드 및 10%의 크레모포르(Chremophor) EL(폴리에톡실화 피마자유)를 함유하는 무균 수용액 중에서 감염 직후 정맥내로 1회 투여했다.
제7일째 되는 날, 스피어만 및 카에르버법(Spearman and Kaerber method)에 의한 각 투여량에서 생존하는 동물의 백분율로부터 ED을 계산했고; 그 결과, 항생 물질 GE 2270 인자 A의 ED은 15.4㎎/㎏이었고, 항생 물질 GE 2270 인자 A의 ED은 3.2㎎/㎏이었다.
8마리의 생쥐군을 사용하고 시험 화합물을 1회 투여(20㎎/㎏)량으로 투여한 것을 제외하고는 상기와 유사한 실험에서, 제7일째 되는 날에 생존한 쥐/처리된 쥐의 비가 항생 물질 GE 2270 인자 A의 경우 1/8이었고, 항생 물질 GE 2270 인자 H의 경우 6/8이었다. 시험 화합물은 5%의 수성 글루코스 중 10%의 디메틸로픔아미드 중에 현탁시킨 유(乳)상 현탁액으로 정맥내로 투여했다.
본 발명의 화합물은 이들의 특성상 사람 또는 동물의 치료용 의약 제조시 활송 성분으로서 사용될 수 있다.
특히, 항생 물질 GE 2270 인자 A, A, A및 H는 주로 그람 양성균 및 그람 양성 혐기균은 물론 그람 음성 혐기균에 대해서도 주로 활성인 항균제이다.
따라서, 본 발명의 항생 물질의 주된 치료적 적용 범위는 이 항생물질에 감수성인 미생물의 존재와 관련된 감염증 치료이다.
치료라는 용어는 예방, 치유 및 요법을 포함한다.
이러한 치료의 적용 대상은 영장류, 특히 사람 및 말, 소, 돼지 및 양과 같은 기타 포유류 및 통상적으로는 가금 및 애완 동물을 포함하는 상기의 치료를 필요로 하는 임의의 동물이다.
본 발명의 화합물은 화합물 단독으로 또는 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 투여할 수 있으며, 또한 다른 항균제와 함께 공동으로 투여할 수도 있다. 따라서, 공동 투여 요법은 제1 투여 물질의 치료적 효과가 완전히 소멸되기 전에 제2투여 물질을 투여하는 방식으로 활성 화합물을 순차적, 동시적 및 개별적으로 투여함을 포함한다.
바람직한 제약학적 제형은 손상된 또는 손상되지 않은 피부 또는 점막 상에 국소적으로 도포하기에 적합한 제형이다. 이러한 제형의 예로는 분말, 연고, 크림 및 로션이 있다. 이들 제형의 부형제로는 유성 연고 기재(예를 들면, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브유, 파라핀, 경랍, 전분 글리세라이트), 흡수성 연고 기재(예를 들면, 무수 라논린, 친수성 바셀린), 에멀젼 연고 기재(예를 들면, 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린, 스테아르산), 수용성 연고 기재(예를 들면, 글리콜 에테르 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(옥시-1, 2-에탄디일)-알파-히드로-오메가-히드록시-옥타데카노에이트, 폴리소르베이트 및 폴리에틸렌 글리콜 모노-스테아레이트를 포함하는 글리콜 에테르의 유도체)와 같은 통상의 제약학적으로 허용되는 부형제이다.
이들 제형은 방부제와 같은 기타 공지의 부형제를 함유할 수 있고, 당업계에서 공지된 대로 제조되며, 문헌[참조:Remington's Pharmaceutical Sciences, 17판, 1985, 맥(Mack) 출판사]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 당업계에 공지되어 있는 절차에 따라 비경구 투여에 적합한 제형으로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 폴리프로필렌글리콜 또는 디메틸아세트아미드 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 또는 폴리에톡실화 피마자유와 같은 계면활성제와 함께 제형화할 수 있다.
바람직한 비경구 투여용 제형은 크레모포르
Figure kpo00016
EL(폴리옥실 35 피마자유 USP/NF) 20%, 프로피렌 글리콜 5 내지 10%의 부형제를 포함한다.
바람직하기로는, 이 제형은 본 발명의 항생 물질에 감수성인 미생물과 관련된 임의의 감염증 치료시 정맥내 투여에 사용된다.
위장관 내에 혐기균이 존재함으로써 발생할 수 있는 위막(僞膜) 대장염 또는 기타 질병의 치료시, 본 발명의 화합물의 유효량을 캡슐 또는 수성 현탁액과 같은 적절한 제약 제형으로 경구 투여할 수 있다.
활성 성분의 투여량은 환자의 유형, 연령 및 상태, 투여를 위해 선택된 특정 활성 성분 및 제형, 투여 계획 등을 포함하는 다수 요인에 따라 좌우된다.
일반적으로, 효과적인 항균 투여량은 1회 투여량으로 사용된다. 일반적으로는 이러한 투여 제형의 반복 투여, 예를 들면 1일 2 내지 6회 투여하는 것이 바람직하다. 효과적인 투여량은 일반적으로 0.5 내지 50㎎/㎏(체중)/일이다.
바람직한 국소용 제제는 본 발명의 화합물을 1% 내지 10% 함유하는 연고이다.
어느 식으로든, 처방내리는 의사는 특정 상태의 특정 환자에게 투여하는 최적량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 화합물은 이들의 사람 및 동물 치료시 의약으로서의 용도 외에, 또한 동물 성장 촉진제로서 사용될 수 있다.
이러한 목적을 위해, 본 발명의 화합물을 적절한 사료 중에 혼합되어 경구 투여된다. 사용된 정확한 농도는 정상량의 사료를 소비할 때 성장을 효과적으로 촉진시킬 수 있는 양의 활성 성분을 공급하는 데에 필요한 농도이다.
본 발명의 활성 화합물 동물 사료에 첨가하는 방법은 유효량의 활성 화합물을 함유하는 적당한 사료 프리믹스(premix)를 제조하고 이 프리믹스를 완비된 배급량에 혼입시킴으로써 바람직하게 달성된다.
별법으로는, 활성 성분을 함유하는 중간 농축물 또는 사료 보충물을 사료가 되도록 혼합할 수 있다. 이러한 사료 프리믹스 및 완비된 배급량을 제조 및 투여할 수 있는 방식은 문헌(참조:Applied Animal Nutrition, W.H. Freedman Co., S. Francisco, USA, 1969 또는 Livestock Feeds and Feeding O and B books, Crovallis, Oregon, USA, 1977)에 기재되어 있다.
후술하는 실시예는 본 발명의 예를 든 것에 불과하며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
항생 물질 GE 2270 인자 A1의 제조
1.1 95% 에탄올 16ml중에 항생 물질 GE 2270 인자 A 150㎎을 용해시킨 용액에 1M 염산 3.3ml를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 방치한 후, 0.1M 인산나트륨 완충제(pH 7.5)로 희석시킨 후 수산화나트륨으로 pH 7.5가 되도록 조절하였다. 이 혼합물을 감압 하에서 수성상으로 농축시킨 후, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 이어서, 유기상(주로 항생 물질 GE 2270 인자 A1을 함유함)을 고체 잔분으로 농축시켰고 이것을 테트라히드로푸란 5ml 중에 용해시킨 후, 용해도 한계까지 물로 희석시켰다. 이 용액을 스타크로마
Figure kpo00017
(Stacroma)로 충전된 뉴클레오실
Figure kpo00018
(Nucleosil) C 18(5 마이크로몰) 역상 실리카 겔 컬럼(250×20㎜)을 사용하여, 약 15ml/분의 유속으로 20분간, 상 A 중의 상 B가 64% 내지 94%인 선형 기울기 용리로 용출시키는 HPLC를 10회 연속 행하여 정제하였다. 이 시스템에서, 상 A는 18mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 비가 90:10(v/v)인 혼합물이었고, 상 B는 18mM 인산나트륨(pH 7/2) 및 아세토니트릴의 비가 40:60(v/v)인 혼합물이었다. 분획을 모아서 330㎚에서 UV로 검출하였고; 실질적인 양의 항생 물질 GE 2270 인자 A1을 함유하는 UV 플로트의 피이크에 해당하는 이 분획들을 모아서 감압하에 수성상으로 농축시켰고, 이를 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 이어서, 이 유기층을 증류수로 세척하여 잔류 무기염을 제거하였고, 고체 잔분으로 농축시킨 후 이것을 테트라히드로푸란 중에 용해시켰고, 석유 에테르로 재침전시켜, 순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A164㎎을 수득하였다.
1.2 항생 물질 GE 2270 인자 A1은항생 물질 GE 2270 인자 A를 실온에서 15분동안 디에틸렌디옥시드, 물 및 트리플루오로아세트산의 비가 5/4/1(v/v)인 혼합물 중에서 배양할 때 생성되는 상기 항생 물질의 주요 반응 생성물이다.
또한, 항생 물질 GE 2270 인자 A1은 항생 물질 GE 2270 인자 A를 실온에서 디에틸렌디옥시드 및 물의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 중의 0.5N 황산 또는 0.25M 인산에서 배양할 때도 얻어진다. 이 혼합물을 냉수로 희석시켰고 중화시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였고 유기상을 농축시켰고 석유 에테르를 첨가함으로써 고체를 침전시켰다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A1은 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 예비 HPLC를 행함으로써 얻어진다.
1.3 항생 물질 GE 2270 인자 A1은 항생 물질 GE 2270 인자 A를 50℃에서 하룻밤동안, 디에틸렌디옥시드/물의 비가 1:1(v/v)인 혼합물 중의 0.5M 염화암모늄 중에서 배양할 때 생성되는 상기 항생 물질의 주요 반응 생성물이다. 이 혼합물을 냉수로 희석시켰고 중화시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였고, 유기상을 농축시켰고, 석유 에테르를 첨가함으로써 고체를 침전시킨다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A1은 실시예 1.1에 기재된 바와 같이 예비 HPLC를 행함으로써 얻어진다.
[실시예 2]
항생 물질 GE 2270 인자 A2의 제조
2.1 항생 물질 GE 2270 인자 A 86㎎을 95% 에탄올 17ml 및 아세트산 1.7mnk 중에 용해시켰다. 생성된 용액을 60℃에서 24시간 동안 배양한 후, 0.1M 인산나트륨 완충제(pH 7.5)로 희석시켰고 1M 수산화나트륨으로 pH 7.5가 되도록 조절하였다. 감압 하에서 증발시켜 에탄올을 제거하였고, 수성 잔분을 에틸 아세테이트(100ml)로 2회 추출하였다. 유기상을 감압하에 농축시켜 고체 잔분을 얻었고, 이를 테트라히드로푸란으로 용해시킨 후, 석유 에테르를 첨가함으로써 침전시켰다. 소량의 항생 물질 GE 2270 인자 A및 A1과 함께 항생 물질 GE 2270 인자 A2(62㎎)가 얻어졌다. 순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A2는 후술하는 예비 HPLC를 행함으로써 얻어졌다.
상기의 조 생성물 10㎎을 테트라히드로푸란 중에 용해시켰고, 물로 용해도 한계까지 희석시킨 후 스타크로마R로 충전된 뉴클레오실RC 18(15㎛) 역상 실리카 겔 컬럼(250×20㎜)을 사용하여, 약 15ml/분의 유속으로 20분간 상 A 중의 상 B가 64% 내지 93%인 선형 기울기 용리로 용출시키는 HPLC 시스템에 주입시켰다. 이 시스템에서, 상 A는 18mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 비가 90:10(v/v)인 혼합물이었고, 상 B는 18mM 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 비가 40:40(v/v)인 혼합물이었다. 연속적으로 5회 행해서 얻은 분획을 모아서 330㎚에서 UV로 검출하였다. 실질적인 양의 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 함유하는, UV 용출 프로필의 주요 피이크에 해당하는 분획들을 모아서 감압하에서 수성상으로 농축시켰고, 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 이어서, 이 유기층을 증류수로 세척하여 잔류물인 무기염을 제거하였고, 농축시켜 고체 잔분을 침전시킨 다음, 이를 테트라히드로푸란 중에 용해시켰고 석유 에테르로 재침전시켜, 순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A245㎎을 수득하였다.
2.2 항생 물질 GE 2270 인자 A2는항생 물질 GE 2270 인자 A를 80℃에서 하룻밤동안 아세트산 및 몰의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 중에서 배양할 때 생성되는 상기 항생 물질의 주요 반응 생성물이다. 물로 희석시켰고 중화시킨 후, 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 에틸 아세테이트로 추출하였고, 감압하에서 농축시켰고, 석유 에테르를 첨가함으로써 침전시켰다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A2유도체는 실시예 2.1에 기재된 바와 같이 예비 HPLC를 행함으로써 얻어졌다.
2.3 항생물질 GE 2270 인자 A2는 항생 물질 GE 2270 인자 A를 50℃에서 하룻밤동안 디에틸렌디옥시드, 물 및 트리플루오르아세트산의 비가 5/4/1(v/v)인 혼합물 중에서 배양할 때 생성되는 상기 항생 물질의 주요 반응 생성물이다. 별법으로는, 이 반응은 디에틸렌디옥시드 및 물의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 중에 0.5N 황산 또는 0.25M 인산과 같은 무기산의 존재하에서 행할 수도 있다. 물로 희석시켰고 중화시킨 후, 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 에틸 아세테이트로 추출하여, 감압하에 농축시켰고, 석유 에테르를 첨가함으로써 침전시켰다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A2는 실시예 2.1에 기재된 바와 같이 예비 HPLC를 행함으로써 얻을 수 있었다.
2.4 항생물질 GE 2270 인자 A2는 항생 물질 GE 2270 인자 A를 디에틸렌디옥시드 및 물의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 중에 용해시켰고, 이를 산 이온형 DowexR50W×2와 같은 산성 양이온 교환 수지의 존재하에 50℃에서 하룻밤동안 배양할 때 생성되는 상기 항생 물질의 주요 반응 생성물이다. 이어서, 이 수지를 반응 혼합물로부터 제거하였고, 이 용액을 냉수로 희석시켰고 중화시켰다. 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 에틸 아세테이트로 추출시켰고, 감압하에 농축시켰고, 석유 에테르를 첨가함으로써 침전시켰다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A2는 실시예 2.1에 기재된 바와 같이 예비 HPLC를 행함으로써 얻을 수 있었다.
2.5 항생 물질 GE 2270 인자 A2는 또한, 실시예 2.1, 2.2, 2.3 또는 2.4에서 항생 물질 GE 2270 인자 A에 대해 기술한 조건에서 항생 물질 GE 2270 인자 A1을 처리함으로써 얻어졌다.
일반적으로, 이 반응에서는 수율이 60 내지 85몰%이었다.
[실시예 3]
항생 물질 GE 2270 인자 A3의 제조
3.1 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 실온에서 1시간 동안 0.5M 탄산나트륨 중에서 배양하였다. 이어서, 이 반응 혼합물을 냉수로 희석시켰고, 염산으로 pH 6.5가 되도록 하였다. 중화된 용액은 주요 반응 생성물로서 항생 물질 GE 2270 인자 A3를 함유하였다. 수성상으로부터 이 항생 물질을 에틸 아세테이트로 추출한 후, 이를 석유 에테르를 첨가함으로써 농축된 유기상으로부터 침전시켰다.
순수한 항생 물질 GE 2270 인자 A3는 후술하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 얻어졌다.
3.2 조 GE 2270 A31.5g을 메탄올 및 디클로로메탄의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 60ml중에 용해시켰고, 용매를 감압하에 증발시킴으로써 실리카겔(75 내지 230 메쉬)상에 흡착시켰다. 이어서, 고체 잔분을 디클로로메탄으로 평형시킨 실리카겔(75 내지 230 메쉬) 컬럼(층 높이, 40㎝) 상부에 넣었다. 이어서, 칼럼을 디클로메탄 중 메탄올의 혼합물, 즉 1) 2% 메탄올(450ml), 2) 5% 메탄올(500ml), 3) 10% 메탄올(600ml), 4) 15% 메탄올(500ml), 5) 20% 메탄올(500ml) 및 6) 30% 메탄올(250ml)의 순으로 용출시킨다.
분획을 모아서 TLC 및 박테로이데스 서브틸리스(B. subtilis) ATCC 6633에 대한 미생물 분석으로 모니터링하였다. 항생 물질 GE 2270 인자 A3는 일반적으로 약 15 내지 20%의 메탄올을 함유하는 용출물 중에 존재한다.
목적 생성물을 함유하는 분획을 모아서 감압하에 농축시켰다. 이 잔분에 석유 에테르를 첨가함으로써, 항생 물질 GE 2270 인자 A3가 침전하여 순수한 생성물 854㎎을 수득하였다.
3.3 디에틸렌디옥시드 및 물의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 중에 용해된 항생 물질 GE 2270 인자 A를 H+형의 양이온 교환 수지(Dowex
Figure kpo00019
50W×2) 존재하에서 40시간 동안 배양하였다. 이어서, 이 수지를 제거하였고 반응 용액을 냉수로 희석시켰고, 수성 수산화나트륨으로 pH 6.5가 되도록 하였다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하였고, 석유 에테르를 첨가함으로써 농축된 유기상으로부터 침전시켰다. 이어서, 항생 물질 GE 2270 인자 A3를 단리하였고, 실시예 3.2에 기재된 컬럼 크로마토그래피로 정제시켰다(전체 수율:15몰%).
[실시예 4]
항생 물질 GE 2270 인자 H의 제조
4.1 붕수소화나트륨 500㎎ 및 항생 물질 GE 2270 인자 A 250㎎을 테트라히드로푸란 및 물의 비가 1/1(v/v)인 혼합물 100ml 중에 용해시켰다. 실온에서 3일간 방치한 후, 이 용액을 1M NaH2PO4로 약 pH 7이 되도록 하였고, 이어서 감압하에 농축시켰다. 물을 에틸 아세테이트로 2회 추출하였고, 유기상을 농축 건조시켰다. 고체 잔분(항생 물질 GE 2270 인자 H를 주로 함유함)을 테트라히드로푸란 중에 용해시킨 다음, 석유 에테르를 첨가함으로써 침전시켜, 후술하는 예비 HPLC를 행함으로써 정제된 백색 침전물 213㎎을 수득하였다.
조 반응 생성물 10㎎을 테트라히드로푸란 중에 용해시켰고, 물로 용해도 한계까지 희석시킨 다음, 스타크로마
Figure kpo00020
로 충전된, 뉴클레오실
Figure kpo00021
C 18 (5㎛) 역상 실리카 겔 컬럼을 사용하여, 약 15ml/분의 유속으로 20분간, 상 A 중의 상 B가 64% 내지 93%인 선형 기울기 용리로 용출시키는 HPLC 컬럼(250×20㎜)에 주입하였다. 이어서, 상 B만으로 5분 동안 용리를 계속하였다. 이 시스템에서, 상 A는 18mM 인산나트륨(pH 7/2) 및 아세토니트릴의 비가 90:10(v/v)인 혼합물이었고, 상 B는 인산나트륨(pH 7.2) 및 아세토니트릴의 비가 40:60(v/v)인 혼합물이었다. 연속해서 10회 행하여 얻은 분획을 모아 330㎚에서 UV로 모니터링하였고; 실질적인 양의 항생 물질 GE 2270 인자 H를 함유하는 UV 용리 프로필의 피이크에 해당하는 분획들을 모아서 감압하에 수성상으로 농축시켰고, 이를 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 이어서, 이 유기층을 증류수로 세척하여 무기염을 제거하였고, 농축시켜 고체 잔분을 침전시켰다. 이어서, 이를 테트라히드루푸란 중에 용해시켰고 석유 에테르로 재침전시켜, 순수한 항생 물질 GE 2270 인자 H 55㎎을 얻었다.
[출발 물질의 제조]
츨발 물질은 유럽 특허 출원 공고 제359062호에 기재된 방법에 의하여 제조한다.

Claims (5)

  1. 하기 특성을 갖는 비염형(非鹽形)의 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2, A3또는 H 및 이들의 허용되는 염으로부터 선택된 항생 물질.
    항생 물질 GE 2270 인자 A1의 물리화학적 특성
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타냄.
    Figure kpo00022
    B) 뉴졸 멀(nujol mull)의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝-1)를 나타냄.
    3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1650; 1535; 1505; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1310; 1240; 1190; 1165; 1130-1000; 980; 930; 930; 840; 805; 750; 720 (뉴졸); 700;
    C)1H-NMR 스펙트럼은 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D6(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널을 나타냄(각 시그널의 다중도를 함께 표시한다:s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
    0.84, d; 0.87, d; 1.35, m; 1.91, m; 2.08, m; 2.16, m; 2.46, d; 2.58, s; 2.70, dd; 3.38, s; 3.76, m; 3.84, m; 4.26, dd; 4.33, m; 4.89, m; 4.97, s; 5.00, dd; 5.20, dd; 5.22, dd; 5.28 (2개의 양성자), m; 6.01, d; 7.07, s; 7.2, s; 7.34, s; 7.22-7.38 (6개의 양성자), m; 8.29, s; 8.39, d; 8.44, m; 8.45, d; 8.54, s; 8.60, s; 8.66, d; 9.69, d; 8.99, d.
    D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt):13.4
    컬럼:울트라스피어(Ultrasphere) ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(Altex)(베크만(Beckman)) 4.6㎜(내경)×250㎜
    프리(pre)-컬럼:브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
    용출제 A:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용출제 B:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
    유속:1.8ml/분
    U.V. 검출기:254㎚
    내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
    E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석 결과는 탄소, 수소, 질소 및 황의 조성을 나타냄.
    F) FAB-MS 분석은 1308m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석시, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하로 나타냄.
    항생 물질 GE 2270 인자 A2의 물리화학적 특성
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타냄.
    Figure kpo00023
    B) 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝-1)를 나타냄.
    3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1725; 1655; 1590-1480 (뉴졸); 1410; 1375 (뉴졸); 1335; 1305; 1265-1130; 1090; 1050; 1015; 980; 945; 930; 840; 805; 745; 720 (뉴졸); 700;
    C)1H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D6(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널들을 나타냄(각 시그널의 다중도를 함께 표시하였다:s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
    0.83, d; 0.86, d; 1.30, m; 1.82, m; 1.90, m; 2.17, m; 2.46, d; 2.57, s; 2.70, dd; 3.37, s; 3.40, m; 3.48, m; 3.77, dd; 4.24, m; 4.28, dd; 4.52, d; 4.53, br s; 4.67, d; 4.96, s; 4.98, dd; 5.19, m; 5.21, m; 5.28, m; 6.01, d; 7.34, s; 7.22-7.35, m; 8.26, d; 8.28, s; 8.42, d; 8.45, s; 8.59, s; 8.67 (2개의 양성자), d; 8.73, s; 9.00, d;
    D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt):17.0분
    컬럼:울트라스피어(Ultrasphere) ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(Altex)(베크만(Beckman)) 4.6㎜(내경)×250㎜
    프리(pre)-컬럼:브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
    용출제 A:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용출제 B:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
    유속:1.8ml/분
    U.V. 검출기:254㎚
    내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
    E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석 결과는 탄소, 수소, 질소 및 황의 조성을 나타냄.
    F) FAB-MS 분석은 1291m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석시, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하로 나타남.
    항생 물질 GE 2270 인자 A3의 물리화학적 특성
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타냄.
    Figure kpo00024
    B) 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝-1)를 나타냄.
    3700-3140; 3110; 3020-2750 (뉴졸); 1720; 1655; 1690-1520; 1500; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1270-1200; 1130-1030; 1020; 980; 930; 840; 805; 750; 720 (뉴졸); 700;
    C)1H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D6(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널들을 나타냄(각 시그널의 다중도를 함께 표시하였다:s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
    9.02, 1H (d); 8.71, 1H (d); 8.70, 1H (d); 8.65, 1H (s); 8.57, 1H (s); 8.46, 1H (m); 8.38, 1H (d); 8.28, 1H (d); 8.25, 1H (s); 7.38, 1H (m); 7.37, 1H (s); 7.36-7.20, 5H (m); 6.05, 1H (br s); 5.31, 1H (m); 5.27, 1H (dd); 5.20, 1H (dd); 5.03, 1H (d); 4.99, 2H (s); 4.32, 1H (dd); 3.82, 1H (dd); 3.38, 3H (s); 2.74, 1H (dd); 2.60, 3H (s); 2.49, 3H (d); 2.17, 1H (m); 1.35, 1H (m); 0.88, 3H (d); 0.84, 3H (d);
    D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt):7.1분
    컬럼:울트라스피어(Ultrasphere) ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(Altex)(베크만(Beckman)) 4.6㎜(내경)×250㎜
    프리(pre)-컬럼:브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
    용출제 A:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용출제 B:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
    유속:1.8ml/분
    U.V. 검출기:254㎚
    내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
    E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석 결과는 탄소 51.27%, 수소 4.02%, 질소 14.94% 및 황의 조성을 나타냄.
    F) FAB-MS 분석은 1125m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석시, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하로 나타남.
    G)13C-NMR 스펙트럼은 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하여, DMSO-d6중에서 125㎒로 측정한 것이며, 다음의 시그널(ppm)을 나타냄.
    171.2; 169.9, 169.6; 168.5; 167.8; 165.7; 164.8; 162.2; 161.4; 161.3; 160.3; 160.5; 160.4; 153.5; 150.4; 150.1; 149.5; 149.1; 147.0; 143.8; 142.1; 141.8; 141.4; 141.0; 139.6; 131.8; 128.0 (2개의 탄소); 127.7; 127.6; 126.9; 126.8 (2개의 탄소); 123.1; 118.7; 116.4; 73.9; 67.4; 58.7; 58.3; 55.5; 48.2; 41.2; 37.7; 34.1; 25.9; 18.5; 18.0; 12.0;
    H) CHCl3+10% CH3OH 중에서의 고유 광학 회전[a]D 20: +182.5
    항생 물질 GE 2270 인자 H의 물리화학적 특성
    A) 자외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치를 나타냄.
    Figure kpo00025
    B) 뉴졸 멀의 적외선 흡수 스펙트럼은 다음과 같은 최대 흡수치(㎝-1)를 나타냄.
    3700-3000; 3000-2800 (뉴졸); 1655; 1590-1480; 1460 (뉴졸); 1375 (뉴졸); 1310; 1220; 1190; 1130-1000; 980; 930; 840; 820-680; 720 (뉴졸); 640;
    C)1H-NMR 스펙트럼은, 내부 표준물로서 TMS(0.00ppm)를 사용하고, DMSO-D6(헥사듀테로디메틸술폭시드) 중에서 500㎒로 측정한 것이며, 다음과 같은 시그널들을 나타냄(각 시그널의 다중도를 함께 표시하였다:s=단일선; d=이중선; m=다중선; dd=한 쌍의 이중선; br s=브로드한 단일선):
    0.83, d; 0.87, d; 1.30, m; 2.16, m; 2.46, d; 2.58, s; 2.70, dd; 3.38, s; 3.52, m; 3.61, m; 3.77, dd; 4.25, m; 4.30, m; 4.35, m; 4.47, m; 4.88, m; 4.97, s; 4.99, dd; 5.20, m; 5.23, m; 5.28, m; 6.02, d; 7.36, s; 7.22-7.40, m; 8.26, d; 8.28, s; 8.42, d; 8.43, m; 8.47, s; 8.60, s; 8.67, d; 9.02, d;
    D) 다음 조건하에서 역상 HPLC로 분석시의 체류 시간(Rt):18.0분
    컬럼:울트라스피어(Ultrasphere) ODS(역상 실란화 실리카 겔; 5㎛) 알텍스(Altex)(베크만(Beckman)) 4.6㎜(내경)×250㎜
    프리(pre)-컬럼:브라운리 랩스(Brownlee Labs) RP 18(옥타데실실란 실리카겔; 5㎛)
    용출제 A:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 70:30 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용출제 B:아세토니트릴:18mM NaH2PO4, 10:90 (v/v), pH 7.0으로 조절됨.
    용리 방식:20분간 용출제 B 중 용출제 A의 45%에서 70%로의 선형 기울기 용리.
    유속:1.8ml/분
    U.V. 검출기:254㎚
    내부 표준물:클로람페니콜(Rt=3.6분)
    E) 불활성 분위기하에 약 140℃에서 시료를 미리 건조시킨 후 행한 원소 분석 결과는 탄소, 수소, 질소 및 황의 조성을 나타냄.
    F) FAB-MS 분석은 1180m/z 질량 단위에서 양성자 첨가된 분자 이온의 저질량 동위 원소를 보여주며, 6Kv에서 Xe의 빠른 원자 충돌, 0.6㎃의 방전 전류, 글리세롤 매트릭스, 양성 이온화 방식으로 이루어진 실험 조건하에서, 크라토스(Kratos) MS-50 이중 촛점 질량 분광기를 이용하여 분석시, 이 스펙트럼의 800m/z 질량 단위를 초과하는 나머지 피이크들은 모두 동위 원소 피이크를 계수하지 않았을 때 상기 분자 이온의 20% 이하로 나타남.
  2. a) 항생 물질 GE 2270 인자 A를 선택적으로 가수분해시켜 항생 물질 GE 2270 인자 A1, A2또는 A3을 얻고, b) 항생 물질 GE 2270 인자 A를 환원 조건하에서 선택적으로 분할시켜 항생 물질 GE 2270 인자 H를 얻고, c) 얻은 생성물을 공지된 방법에 따라 단리하고 정제하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 화합물의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 a) 단계의 선택적 가수분해 조건이 수성 산 매질 및 극성 유기 용매인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 40℃ 내지 90℃의 온도에서 극성 유기 용매 존재하에 산 매질에서 가수분해를 수행하여 항생 물질 GE 2270 인자 A2를 선택적으로 얻는 방법.
  5. 제1항에 따른 화합물 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항균 활성을 갖는 제약학적 조성물.
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