KR0154576B1 - 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바이러스 또는 세균에서 기인한 펩타이드 항원을 리포좀(liposome)에 포획하여 면역시켜, 바이러스 또는 세균을 중화할 수 있는 항체를 생성하는 체액성 면역(humoral immunity) 및 바이러스 또는 세균에 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic T immunity : CTL)의 생성을 유도하는 세포성 면역(cellular immunity)을 동시에 유도하는 리포좀에 관한 것이다. 이러한 리포좀은 HIV 및 HCV뿐만 아니라, 병원성 바이러스 관련 질환 및 세균성 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있을 것이다.

Description

펩타이드 항원을 함유하는 리포좀

제1도는 펩타이드 면역에 의해 생성된 항체의 웨스턴 블럿분석(Western blot analysis) 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

본 발명은 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀(liposome)에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 바이러스 또는 세균 유래의 펩타이드 항원을 리포좀 제제화하여, 바이러스 또는 세균을 중화시킬 수 있는 항체를 생성하는 체액성 면역(humoral immunity) 및 바이러스 또는 세균에 특이적인 세포독성 T 임파구(cytotoxic T lymphocyte, 'CTL')의 생성을 유도하는 세포성 면역(cellular immunity)을 동시에 유도하는 리포좀에 관한 것이다.

바이러스성 질환은 끊임없이 인간을 괴롭혀 왔으나, 이에 대한 획기적인 치료법은 오늘날까지도 발견되지 않고 있다. 다만, 예방백신에 의한 보호만이 가능할 따름이나, 예방백신이 개발되어 있는 경우에도 감염환자는 계속 발생하고 있고, 일단 발생한 바이러스 질환에 관한 근원적 치료를 할 수 있는 약물은 개발되어 있지 않다. 더구나, 백신이 개발되어 있지 않은 바이러스 질환, 예를 들면, 인간면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, 'HIV')나 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, 'HCV') 질환의 경우에는 감염 환자가 날로 증가하고 있어, 이들 질환을 처치할 수 있는 백신 개발에 박차를 가하고 있으나 백신이 곧 개발되리라는 확실한 전망은 없다.

HIV의 경우를 보면, 감염된 환자에게서 항체가 생성되더라도 치료가 되지 않고 있어, 항체생성을 유도하는 백신 제제로는 바이러스성 질환의 근원적 치료를 기대할 수 없다. 따라서, 이러한 병원성 바이러스에 대한 치료는 체내의 면역체계를 이용한 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 유발하는 면역요법이 최선이라 할 수 있다.

체액성 면역(humoral immunity)이란 혈청내에 존재하는 항체에 의해 이루어지는데, 그 항체가 외부 물질(항원)과 결합함으로써 그것을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 이러한 면역체계는 숙주세포밖에 있는 박테리아, 단백질이나 탄수화물과 같은 외부 물질에 대해 효과적으로 작용하나, 바이러스 감염의 경우 바이러스가 숙주세포 내에 국한되어 활동하므로 이에 대해서는 효과적으로 작용하지 못한다.

세포성 면역(cellular immunity)이란 임파계에 속하는 몇 종류의 세포에 의해 이루어지는데, 이러한 세포는 박테리아나 바이러스에 의해 감염된 세포와 조직을 직접 파괴하는 기능을 가지고 있다. 따라서, 세포성 면역은 박테리아나 바이러스의 세포내 감염 또는 암세포 등에 효과적으로 그 기능을 발휘한다.

따라서, 본 발명에 있어서는 바이러스 또는 세균에서 기인한 펩타이드 항원을 리포좀 제제화하여 펩타이드 항원에 대한 중화항체 및 CTL 생성을 유도함으로써 바이러스성 및 세균성 질환의 예방 및 치료에 응용하고자 하였다.

일반적으로, 인지질(phospholipid)을 수중에 분산시키면 인지질의 친수성 머리부분(polar head group)은 물쪽으로 향하고, 소수성꼬리부분(hydrophobic tail)은 꼬리끼리 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해서 화합하여, 이중분자막(bilayer)의 구형의 폐쇄소포체를 형성하는데 이를 '리포좀(liposome)'이라 한다. 이러한 리포좀은 생체막의 모델로 이용되어 왔을 뿐만 아니라, 약물의 전달매체로도 널리 이용되어 왔다(참조 : Lee, J. W. and Kim, H., Arch. Biochem. Biophys., 297:354(1992); Hahn, K. H. and Kim, H., J. Biochem., 110:635(1991); Yun, C. H. and Kim, H., J. Biochem., 105:406(1989); Kim, J. and Kim, H., Biochemistry, 25:7867(1986); Kim, J. and Kim, H., Korean Biochem. J., 18:403(1985)).

최근에는 리포좀을 면역학 분야에도 이용하여, 리포좀을 백신의 운반체(carrier) 또는 면역보조제(adjuvant)로의 사용이 집중적으로 연구되어지고 있다(참조 : Rooijen, N. V., Vaccine, 11:1170(1993)). 일반적으로, 리포좀을 정맥 주사하면 혈액내에 다량으로 존재하는 대식세포(macrophage, 'MO')에 의해 쉽게 포획된다. MO는 항원의 면역적 프로세싱(processing)에 매우 중요할 뿐만 아니라, 리포좀 항원의 프로세싱에도 매우 중요한 역할을 한다.

또한, 최근 pH에 민감한 리포좀(pH-sensitive liposome)을 이용하여 바이러스에 선택적인 CTL 생성을 유도하는 방법(참조 : Readdy, R. et al., J. Immunol. Methods, 141:157(1991); Zhou, F. et al., J. Immunol. Methods, 145:143(1991); Nair, S. et al., J. Exp. Med., 175:609(1992); Harding, C. V. et al., J Immunol. 147:2860(1991); Zhou, F. and Huang, L., Vaccine, 11:1139(1993))이 개발되어, 치료용 백신의 운반체 또는 면역보조제로 널리 이용되고 있다. 이에, 본 발명자들도 항암약물의 선택적인 전달이 가능한 pH에 민감한 리포좀의 제조방법(Choi, M. J. et al., J. Biochem., 112:694(1992))과 그 조성에 대해서 특허를 출원한 바 있다(참조 : 대한민국 특허출원 제 93-18389호 및 제 93-18390호).

본 발명의 발명자들은 본 발명자들에 의해 특허출원되어 공지된 pH에 민감한 리포좀의 인지질 조성으로 리포좀을 제조하고, HIV의 gp120 중의 주된 중화항체 생성부위(principal neutralization determinant)의 아미노산 서열로 된 펩타이드 항원과 HCV 코어(core) 부위의 CTL 생성 유도 펩타이드 항원을 포획하여 마우스(mouse)에 면역하면, 체액성 면역과 세포성 면역이 동시에 유도됨을 확인하고, 바이러스성 질환의 예방과 치료에 이용하기 위하여 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 목적은 바이러스 또는 세균에서 유래한 펩타이드 항원을 포함하며, 체액성 면역 및 세포성 면역을 동시에 유도하는 리포좀을 제공하는 것이다.

본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다:

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀을 제조하기 위하여, 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidylethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl: POPE)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisuccinate : CHOH)를 몰 비율로 6:4 내지 6:2, 가장 바람직하게는 7:3으로 혼합하여 형성된 인지질이 얇은 막을 형성하도록 한 다음, 포획시킬 펩타이드 항원을 용해시킨 완충용액을 첨가하였다. 이때, 펩타이드 항원을 함유하는 리포좀은 펩타이드와 인지질을 몰 비율로 1:15 내지 1:25, 가장 바람직하게는 1:20이 되도록 혼합하여 제조된 것이다.

전기에서 제조된 각 펩타이드 항원을 함유한 pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 체액성 면역을 확인하기 위하여, 마우스의 혈청을 분리하고, 항체생성능, 항체역가 및 중화항체가를 측정하였다. 그 결과, 전기 각 펩타이드 항원을 면역한 마우스에서는 80% 내지 100%의 면역효과 및 400 내지 800의 항체역가를 각각 나타내었다. 또한, 형청에 의한 바이러스 중화능력은 각 펩타이드 항원의 제공 바이러스가 다핵 거대세포를 형성하지 못하는 정도로써 측정하였는데, 중화항체가가 2,000 이상인 높은 수치를 나타내었다. 아울러, 전기에서 생성된 항체의 웨스턴 블럿분석으로, 생성된 항체가 각 펩타이드 항원에 특이적임을 확인하였다. 한편, 본 발명에 의해 제조된 pH에 민감한 리포좀은 체액성 면역을 유도할 수 있는 단일인산화 지질 A(monophosphoryl lipid A), Quil A, 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide) 등의 면역보조제(adjuvant)를 추가로 함유하여 사용할 수 있을 것이다.

전기의 pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 세포성 면역을 확인하기 위하여, 펩타이드 항원으로 면역된 마우스로부터 분리한 T 임파세포가 방사능 원소로 표지된 표적세포(target cell)를 인지하여 살해(lysis)하는 능력을 측정한 결과, 바이러스에 특이적인 CTL 생성을 유도하여 세포성 면역을 유도함을 확인하였다.

이상과 같이 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 유도할 수 있는 리포좀은 HIV 및 HCV뿐만 아니라, 병원성 바이러스 관련 질환 및 세균성 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1 : 펩타이드를 함유한 pH에 민감한 리포좀의 제조]

POPE/CHOH(7:3 몰 비율)으로 된 인지질을 유리병(glass vial)에 넣어 유기용매에 용해시킨 후, 질소가스를 불어 넣어 유리병 내에 얇은 막을 형성시켰다. 그런 다음, 포획시킬 펩타이드를 용해시킨 완충용액(pH 8.0)을 첨가하여 충분히 수화시킨 후, 강하게 교반하여 중첩된 다층막 리포좀(multilamellar vesicle, 'MLV')을 제조하고, 이를 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 소형 단층막 리포좀(small unilamellar vesicle, 'SUV')을 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 SUV를 상온에서 2 내지 12시간 방치한 다음, 액체질소로 급격히 냉동시키고 다시 상온에서 천천히 해동시키는 과정을 3 내지 4회 반복하여 펩타이드를 함유한 리포좀을 제조하였다. 이렇게 제조된 펩타이드를 함유한 리포좀은 펩타이드와 인지질을 몰 비율로 1:20이 되도록 혼합하여 제조된 것이며, 사용한 펩타이드는 하기 표1에 나타낸 바와 같다. 이때, 리포좀 내에 들어가지 않은 펩타이드를 세파덱스 G-50컬럼(1×20cm)을 통과시켜 제거하고, 리포좀 용액만을 모아서 하기의 실시예에 이용하였다.

[실시예 2 : 항체의 역가 측정]

전기 실시예 1에서 제조된 리포좀으로 마우스를 면역시켰다. 즉, HIV 펩타이드 항원의 경우, 5주령의 마우스(Balb/C mouse) 꼬리정맥에 200㎕의 리포좀 용액(펩타이드 100㎍ 정도)을 주사하여 면역하였다. 2주 후 같은 리포좀으로 추가접종(boosting)하여 면역을 완료하였으며, 항체의 역가(titer value)가 100이하로 떨어질 때, 다시 한번 면역시켰다. HCV 펩타이드 항원의 경우, 5주령의 마우스(C57BL/6 mouse)에 같은 방법으로 면역시켰다. 이렇게 면역된 마우스로부터 혈청을 얻어서 간접면역표지 흡착분석법으로 항체생성능과 항체역가를 확인하였다. 즉, 탄산염(carbonate) 완충용액(pH 9.6)에 26mer와 15mer을 2.5㎎/㎖로 용해시키고 96공(well) 플레이트에 각공 당 100㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간동안 방치하였다. 0.02% 트윈 20(Tween 20)을 함유한 인산 완충용액(이하, '세척용액'이라함)으로 3번 세척한 다음, 1% 우혈청알부민(BSA) 용액 400㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 방치하였다. 세척용액으로 3번 세척한 후, R15X나 T26K 펩타이드를 함유한 리포좀으로 면역한 마우스의 혈청을 얻어서 100배부터 두배계대희석(2 fold dilution)하여 100㎕씩 넣고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 상기 세척용액으로 3번 세척하고 호스 라디쉬 퍼록시다제(horse raddish peroxidase : HRPO)가 표지된 anti-mouse IgG를 500배 희석하여 100㎕씩 넣고 37℃에서 45분간 반응시켰다. 다시 한번 세척용액으로 세척한 후, ABTS(2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid))와 과산화수소 기질 용액을 1:1로 혼합하여 100㎕씩 넣고 실온에서 15분간 방치하여 405nm에서의 흡광도 측정으로 항체의 역가를 결정하였다.

그 결과, R15K(15mer) 펩타이드 항원을 면역한 마우스에서는 80%의 면역효과를 나타내었고, T26K (26mer) 펩타이드 항원을 면역한 마우스에서는 100%의 면역효과를 나타내었는데, 이들의 면역효과에 차이가 생기는 이유는, 26mer 항원의 경우 보조 T 임파구(helper T cell)가 인지하는 아미노산 서열도 포함되어 있기 때문에, 항체의 역가도 조금 높은 값을 나타내는 것으로 추측되었다(참조:표 2).

[실시예 3 : HIV에 대한 중화항체가 측정]

실시예 2에서 얻은 각 마우스 혈청의 바이러스 중화능력을 확인하기 위하여, HIV의 다핵 거대세포(syncytia) 형성능의 억제 여부를 측정하였다. 즉, 상기의 혈청을 RPMI 세포 배양배지(90% RPMI-1640(Gibco, USA) 및 10% 우태아 혈청으로 구성된 배지)로 4배에서 8,000배까지 단계적으로 희석한 다음, 이를 HIV바이러스가 함유된 배지와 부피비로 1:1로 혼합한 후 실온에서 1시간동안 정치하였다. 그런 다음, 실온에서 1시간동안 정치하여 HIV 바이러스가 혈청에 의해 중화되도록 하고, 이를 미리 준비된 MT-2 세포(사람의 혈액에서 추출한 면역계 T세포) 함유 배지와 부피비로 1:2의 비율로 혼합하여 HIV 바이러스를 MT-2 세포에 감염시켰다. 감염된 MT-2세포를 37℃에서 4일간 배양한 후 현미경으로 관찰하여 HIV바이러스에 의해 형성된 다핵 거대세포의 수를 세고, 이를 중화시키지 않은(혈청을 처리하지 않음)대조군과 비교하여, 혈청에 의한 다핵 거대세포의 형성 억제정도를 결정하였다. 다핵 거대세포를 50% 감소시키는 혈청의 희석배수를 그 혈청의 중화항체가라 할 때, 상기의 혈청은 중화항체가가 2,000 이상인 높은 수치를 나타내었다(참조:표 3). 하기 표 3에서 보듯이, T26K 펩타이드의 경우 중화항체가가 3,072 정도이며, R15K 펩타이드의 경우 2,048의 중화항체가를 나타내었다.

표 2 및 표 3으로부터, 실시예 1에서 제조된 pH에 민감한 리포좀에 함유된 펩타이드 항원의 항체 생성능력과 이들 항체들이 실험동물에서 매우 우수한 중화항체 생성능이 있음을 알 수 있었다.

[실시예 4 : 생성된 항체의 웨스턴 블럿분석]

전기의 HIV 펩타이드 항원에 대하여 생성된 항체가 그 펩타이드에 특이적임을 확인하기 위하여, 생성된 항체를 웨스턴 블럿 분석하였다. 즉, 인산 완충용액으로 5%의 스킴밀크(skim milk) 용액을 제조하고 와트만(Whatman) 3번 여과용지(filter paper)로 여과한 다음, 실시예 2에서 얻은 각 마우스의 혈청을 100배 희석하여 첨가하고 21℃에서 16시간동안 HIV 임뮤노블럿 스트립(Immunoblot Strip, DuPont, USA)과 반응시켰다. 세척용액으로 5분간 3번 세척 후, 5% 스킴밀크 용액으로 500배 희석한 HRPO가 표지된 anti-mouse IgG를 첨가하고 실온에서 1시간 반응시켰다. 세척용액으로 5회 세척한 다음, 디아미노 벤지딘(diamino benzidine: DAB) 6㎎을 염화코발트(CoCl) 300㎕dp 용해시켜 인상 완충용액으로 10㎖로 조절하고, 30% 과산화수소 용액 10㎕를 첨가하여 제조된 발색용 용액으로 발색시켰다.

그 결과, HIV의 gp120에서 기인한 T26K와 R15K 펩타이드 항원에 대한 항체는 HIV 단백질 중의 gp120과만 결합한다는 것을 확인하였다(참조:제1도). 제1도에서, 제 1 레인은 HIV의 표준 단백질 마커; 제 2 레인은 T26K 펩타이드 항원을 면역하여 얻은 혈청; 및, 제 3 레인은 R15K 펩타이드 항원을 면역하여 얻은 혈청을 각각 웨스턴 블럿분석한 결과를 나타낸다. 제1도에서 보듯이, gp120에 해당하는 부분에서만 단백질 띠를 확인할 수 있었다. 따라서, pH에 민감한 리포좀으로 HIV 펩타이드 항원을 면역했을 때, 그 펩타이드에 특이적인 항체가 생성됨을 알 수 있었다.

[실시예 5 : 펩타이드와 CTL간의 인지도 측정]

pH에 민감한 리포좀으로 면역된 마우스의 세포성 면역을 확인하기 위하여, 펩타이드 항원으로 면역된 마우스로부터 분리한 T 임파세포가 Cr 로 표지된 표적세포를 인지하여 살해하는 능력을 측정하였다.

HIV의 경우, R15K와 T26K 펩타이드를 함유한 pH에 민감한 리포좀으로 면역하여 추가접종 4주 후, 마우스(Balb/C mouse)의 비장을 절취하여 균질기(homogenizer)에 비장과 RPMI 세포 배양배지 2㎖을 넣고 균질하게 분쇄하였다. 피콜(ficoll) 2㎖에 비장을 분쇄한 용액 2㎖을 넣고, 1,500rpm서 30분간 원심분리하였다. 피콜과 세포 배양배지 사이에 있는 T 임파세포를 분리하여 RPMI-10 세포 배양배지를 15㎖을 넣고, 1,000rpm에서 원심분리하여 RPMI-10 배지로 3회 세척하였다. T 임파세포가 1㎖당 5×10 이 되도록 하여 24공 플레이트에 분주한 다음, 면역시킨 펩타이드 항원을 2μM이 되도록 첨가하고 3일간 37℃에서 5%의 이산화탄소를 함유하고 있는 배양기(COincubatoer)에서 T 임파세포를 배양하여 효과세포(effector cell)로 이용하였다. HCV의 경우, D8L 펩타이드 항원을 리포좀에 포획하여 5주령의 마우스(C57BL/6 mouse)에 면역하고, 전기 HIV의 경우와 같은 방법으로 T 임파세포를 분리하여 효과세포로 이용하였다. 한편, 표적세포로는 HIV의 경우, Balb/C 마우스와 동일한 주조직 적합분자(major histocompatibility complex molecule: MHC) 제 1군(class I)을 가지는 p815 세포(ATCC TIB64)를 이용하였고, HCV의 경우 C57BL/6 마우스와 동일한 MHC 제 1군을 가지는 RMA 세포(참조: Hosken, N. A. and Bevan, M. J., Exp. Med., 175:719(1992)) 또는 EL4 세포(ATCC TIB39)를 이용하였다.

전기의 각 표적 세포에 면역에 사용한 펩타이드 100μM씩 넣고 37℃에서 16시간 반응시켜 RPMI 세포 배양배지로 2회 세척한 다음, 방사능을 가진 소디움 크로메이트(Cr )를 첨가하고 37℃의 CO배양기에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 끝나면, RPMI 세포 배양배지로 충분히 세척하여 미반응한 소디움 크로메이트를 제거하고, 인산 완충용액으로 세척한 효과세포와 일정한 비율로 혼합하여 37℃의 CO배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응한 배양액을 취하여 감마선의 세기를 측정하므로써, 효과세포가 표적세포를 살해하는 능력을 측정하였다(참조:표4).

하기 표 4에서 보듯이, R15K, T26K 및 D8L 펩타이드 항원으로 면역된 마우스의 비장에서 분리한 효과세포가 표적세포를 인지하여 살해하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, pH에 민감한 리포좀을 이용하여 CTL 생성을 유도하는 펩타이드 항원을 면역시켰을 때, 바이러스에 특이적인 CTL을 유도하여 세포성 면역을 유도함을 확인하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 바이러스 또는 세균에서 기인한 펩타이드 항원의 운반체로 pH에 민감한 리포좀을 사용하며 체액성 면역과 세포성 면역을 동시에 유동할 수 있는 리포좀을 제공한다. 이러한 리포좀은 HIV 및 HCV뿐만 아니라, 병원성 바이러스 관련 질환 및 세균성 질환의 예방과 치료에 이용될 수 있을 것이다.

Claims (1)

1. 포스파티딜에탄올아민-β-올레일-γ-팔미토일(phosphatidyl-ethanolamine-β-oleoyl-γ-palmitoyl)과 콜레스테롤 헤미석시네이트(cholesterol hemisucciante)를 6:4 내지 8:2의 몰비율로 혼합한 인지질, 및 중화항체와 세포독성 T 임파구의 생성을 유도하는, 인간면역결핍 바이러스 또는 C형 간염 바이러스의 펩타이드 항원을 15:1 내지 25:1의 몰비율로 함유하는 pH에 민감한 리포좀.