KR0147878B1 - L-트립토판의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 야생균주인 대장균 K-12로 부터 유도한 변이주 SWT 9410을 이용한 L-트립토판의 발효생산에 있어서 미생물 자체의 생리적 특성인 균의 증식과 당 소비능력을 이용하여 제조하는 방벙에 관한 것으로, 발효생산에 있어서 배양액내 적정 용존산소의 부족, 적정 이상의 당농도에 의해 초산이 축적되며 축적된 초산의 영향에 의해 균 생육을 저해 및 생산성이 감소함으로 이를 방지하기 위하여 배양중 용존산소 농도를 설정치 만큼 유지시킬 수 있는 자동 변속 교반에 의해 용존산소 농도를 20∼30%로 유지하고 당이 축적되지 않도록 생육에 필요한 최소한의 추가당을 연속적으로 추가함으로써 배양액내의 초산 축적을 억지하여 L-트립토판 생산을 최대로 향상시킨 유용한 L-트립토판 제조방법이다.

Description

L-트립토판의 제조방법

제1도는 본 발명의 실시전·후의 잔당(글루코스)비교그래프이고,

제2도는 본 발명의 실시전·후 생육도(OD)와 용존산소(DO)비교그래프이고,

제3도는 본 발명의 실시전·후 트립토판과 초산생성량의 비교그래프이다.

본 발명은 L-트립토판(L-tryptophan)의 제조방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 발효에 의한 L-트립토판의 제종바엉에 관한 것이다.

L-트립토판은 필수아미노산으로서 의약용의 수혈제로 사용되며, 가금류에 있어서 메치오닌 L-라이신 다음의 제한 필수아미노산이고, 돼지에 있어서는 L-라이신 다음의 제한 아미노산이기대문에 사료첨가물로서 최근 수요의 증대가 예상되는 아미노산이다.

종래의 L-트립토판의 제조방법중 미생물을 이용한 L-트립토판의 제조방법으로는 바실러스(Bacillus)속 균주를 이용하여 트립토판을 생산하는 일본공개특허공보 평2-190182의 L-트립토판 생산성 미생물 및 L-트립토판의 제조법 코리네박테리움(Corynebacterium)속 균주를 이용한 일본공개특허 공보 평 1-265892의 L-트립토판의 제조법, 일본공개특허공보 소 64-71478의 트립토판을 생성하는 재조합 플라스미드를 함유한 대장균, 트립토판 생산표소를 이용한 일본공개특허공보 평 10128792의 L-트립토판의 제조법, 일본공개특허공보 소 62-51980의 재조합 디엔에이(DNA)를 함유하는 코리네형 세균 및 그것을 이용한 L-트립토판의 제조법 등이 있다.

또한, 생물공정공화면에 있어서 적용 범위가 넓고, 높은 수준의 안전한 제어가 가능한 배양관리 시스템을 구축하려는 여러가지의 방법들이 많이 발표되고 있는데, 전통적인 제어방법으로서는 수학적인 수법을 구사하여 생물공정기내에 발생하는 현상을 추정, 분석하여 적절한 제어를 행하는 것이 주된 경향이었으나, 생물공정기 내는 현상이 복잡하고 불명확안 면이 많이 존재하기 때문에 전통적인 제어방법을 실용화하려고 할 때 많은 문제가 발생하여 현재의 산업적 생물공정깅는 인간의 수작업으로 행하여지는 부분이 많으며, 타산업에 비하여 자동화가 저조한 수준이다. 그러나, 최근 계산기 및 응용기술의 발달로 생물공정공학 분야에도 인공지능의 신개념을 생물공정 제어에 응용하기 위한 연구가 활성화되고 있으며, 인공지능적 수법은 전통적인 수학적 수법에서 다루기 어려웠던 인간적인 예측, 학습등을 논리적으로 생물공정제어에 적용가능하여, 실제로 컴퓨터와 여러가지의 센서들을 퍼멘터(Fermentor)에 연결하여 자동화된 사례가 많이 발표되고 있다. 그러나 이들 방법은 미생물의 생리적 특성이 아닌 환경인자를 이용하기 때문에 실제 배양 미생물의 생리적상태를 이용하지 못하는 결점이 있다.

따라서, 본발명은 배양미생물의 생리적 상태를 이용하여 배양관리 시스템을 자동화에 적용할 수 있는 방법으로 특히 L-트립토판의 제조방법에 있어서 L-트립토판 생산균주인 대장균 SWT9410의 생리적 특성을 이용하여 균의 생육 및 목적 생산물의 생산성이 최적 상태로 유지되고 생물공정기의 자동화가 가능한 배양법버을 제공하기 위한 것으로, 본 발명들은 대장균 SWT9410을 이용한 L-토립토판의 발효생산에 있어서 배양액내 적정 용존산소의 부족, 적정이상의 당농도에 의해 초산이 축적되며 축적된 초산의 영향에 의해 균생육의 저해 및 생산성이 감소함을 알게 되었고 따라서, 초산의 축적 억제에 의한 생산성 증대의 배양방법에 대하여 깊은 연구를 하던 중 미생물의 생리적 특성을 이용한 최적발효에 의하여 배양액내 초산의 축적을 억제시켜 균생육 및 생산성을 향상시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.

본 발명을 보다 자세히 설명하면 소형발효조를 이용하여 통기량을 1브이비엠(vvm)으로 일정하게 고정한 상태에서, 배양중 용존산소 농도를 설정치만큼 유지시킬 수 있는 자동 변속 교반에 의해 용존산소농도를 20∼30%로 유지한다. 당고갈에 의해 용존산소농도가 증가되는 지표를 설정하고 일정시간 간격으로 균의 증식도를 측정, 일정시간내에 균이 당을 소모할 수 있는 생리적특성과 균의 증식도를 이용하여 배양액내 당이 축적되지 않도록 생육에 필요한 최소한의 추가당을 연속적으로 추가함으로써 일반적인 대장균의 배양시 배양액중에 축적되는 초산의 축적을 최소화하고 기질에 의한 저해를 받지 않도록 배양액내 당농도를 최소화하는 유가배양 방법으로 기존의 발효방법에 사용되는 발효환경인지 pH, 용존산소농도(DO), 배기가스등이 아닌 미생물이 탄소원을 소비할 수 있는 능력의 생리적특성을 이용하는 배양방법에 관한 것이다.

트립토판 생산배지중(후기 실시예 1. 참조) 초기 글루코스 농도를 6%로 하고 통기량 1vvm, 교반 500rpm, 배양온도 37℃, pH 7.0의 조건을 일정하게 유지하고 초기 글로코스 농도가 고갈되는 시점에서 배양액내 당 농도가 3%정도가 되도록 추가당을 일시적으로 총 2∼3회 첨가하면서 48시간 배양하는 기존의 유가배양방법과 초기당의 고갈후 처음 추가당이 첨가되는 시점을 기준으로 그 이후 배양액중의 용존산소가 40%이하의 일정 범위에서 설정치를 유지할 수 있도록 자동 변속 교반배양에 의한 본 발명의 유가배양방법과의 L-트립토판 생산량 및 초산의 생성관계를 비교하여 표 1.에 나타났다.

상기 표 1에 나타난 듯이 용존산소의 범위를 20∼30%로 유지하는 경우 L-트립토판의 생산량은 최대이었으며, 이대 초산은 거의 생성되지 않았다.

제1도 내지 제3도는 기존의 방법과 본 발명의 방법과의 비교로 실시전, 후 20L 소형발효조에 생산배지(후기 실시예 1. 참조) 8L를 사입, 멸균후 냉각하여 본 발명의 사용균주 SWT9410(KFCC-10847)전배양액 2%를 접종후 48시간 배양, 발효상태를 비교한 것으로 본 발명의 실시전은 기존의 유가배양방법을 실시후는 후기실시예 3. 의 방법을 이용하였다.

실시전은 배양 12시간 이후부터 초산의 다량 생성으로 인해 균생육의 저해 및 트립토판 생산량이 적은 반면, 실시후는 균생육의 저해가 없었으며, 전혀 초산이 생성되지 않아 트립토판의 생산성이 증대하였다.

상기와 같이 본 발명에 의한 L-트립토판의 제조방법은 대장균을 배양할 때 통상의 유가배양방법에 있어서 탄소원의 축적, 산소의 부족에 의해 초산이 다량 생성되어 목적 생산물인 L-트립토판의 생산량이 저조한 단점을 본 발명의 방법에 의해 해결할 수 있었다.

기존의 일반적인 유가배양과 본 발명에 의한 유가배양과의 배양방법상의 차이점을 간단히 요약하면 다음의 표 2와 같다.

이하 본 발명을 실시예에서 상세히 설명하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

사용균주:대장균 SWT9410(KFCC-10847)

전배양 배지조성:글루코스 2%, 박토 트립톤(bacto tryptone) 1%, 박토 효소 추출물(bacto yeast extract) 0.5%, 염화나트륨(NaCl) 1%

전배양 방법:

500ml 사카구치플라스크에 상기의 전배양 배지 100ml을 주입하고 121℃에서 15분간 가압 멸균한 후 냉각한다. 여기에 미리 준비한 본 발명의 사용균주 대장균 SWT9410(KFCC-10847)을 1백금이 접종하여 37℃에서 12시간 배양한 것을 전 배양액으로 한다.

생산 배지조성

추가당 배지조성

생산배양방법

20L의 소형발효조를 이용하여 트립토판의 생산배지 8L를 사입하고, 121℃에서 15분간 가압 멸균한 후 냉각한다. 여기에 미리 준비한 전배양액 2%를 접종, pH 7.0, 온도 37℃, 초기 rpm3 500으로 유지 배양한 후, 최종 글로코스가 전부 소비된 상태에서 추가당 배지를 연속적으로 첨가한다. 배양중 용존산소농도를 설정치 만큼 유지시킬 수 있는 자동변속교반에 의해서 용존산소농도(DO)3FMF 20∼30%로 유지하면서, 추가당 첨가 시점으로 부터 30분 간격으로 추가당 첨가를 멈추고, 배양액 내에 잔존 당을 소모시키는 대장균의 생리적능력, 즉 DO가 30% 이상 넘는 시간을 측정하여 그 시간이 20초가 되도록 추가당량을 조절하면서 60시간 배양하였다. 발효 완료후 L-트립토판의 생산량은 6,7g/l, 초산의 생성은 7.5g/l이었다. 이때 대수증식기 이후부터 배양종료까지의 평균 추가당 첨가량은 136.6ml/hr 이었다.

[실시예 2]

실시예 1. 과 같은 방법으로 배양을 하되 당의 축적도(일정 시간 사이에 추가당 첨가를 멈추었을 경우, 용존 산소가 30%를 넘지 않게 하는 추가당량)를 10초로 유지하면서 60시간 배양을 한 결과 L-트립토판의 생산량을 8,7g/l, 초산의 생산량은 2.3g/l 이었다.

이때 대수증식기 이후부터 배양종료까지의 평균 추강당첨가량은 109.5ml/hr이었다.

[실시예 3]

사입배지의 초기 글루코스가 다 소모된 (DO가 30%를 넘는)시점에 추가당을 일시에 120ml 첨가하고 다시 DO가 30%를 넘는 시간까지를 기준으로 하여 기질소비속도를 산출하고, 탁도계를 이용 5∼30초 간격으로 측정한 탁도의 평균갑을 건조균체량으로 환산한 후 기질소비속도(gl^-hr^-)균체량 (gl^-) 식에 의하여 비길질소비속도(gg^-hr^-)를 산출하여 구간별로 표준화 하였다. 탁도계를 이용 5∼30초 간격으로 균체량을 측정하고 비기질소비속도((gg^-hr^-)×균체량(gl^-)의 식에 의해 추가당 첨가량을 결정하는 탁도계 이용법과 실시예 1, 2에와 같이 당의 축적도 10∼20초의 추가당량과 비교하는 용존산소 이용법에 의한 각각의 산출 추가당량을 비교하여 대수증식까지는 첨가량이 상대적으로 많은 쪽의 방법, 대수증식기 이후부터는 상대적으로 첨가량이 적은 쪽의 방법을 선택 60분 간격으로 추가당 첨가량을 수정하면서 60시간 배양한 결과, L-트립토판의 생산량은 14.7g/l, 초산은 전혀 생성되지 않았다.

이때 평균 추가당 첨가량을 대수증식기까지 112.5ml/hr, 대수중식기 이후부터 배양종료시까지는 83.2ml/hr 이었다.

이상에서 같이 본 발명에 의한 L-트립토판의 제조방법은 종래의 유가배양방법에 있어서의 탄소원 축적, 산소의 부족에 따른 문제점인 배양액내의 다량의 초산축적에 따른 L-트립토판 생산량 저조의 단점을 해결하여 배양액내에 다량의 L-트립토판을 축적시킬 수 있는 유용한 L-트립토판의 제조방법이다.

Claims (3)

1. 발효에 의한 L-트립토판을 생산함에 있어서, 대장균(Escherichia Coli) SWT 9410(KFCC-10847)의 배양액중 잔당이 축적되지 않도록 추가당을 150ml/hr 이하로 연속적으로 투립하고 배양액중 용존산소농도를 40% 이하로 유지되도록 자동변속교반 배양하여 L-트립토판을 생산함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 배양액 중 용존산소농도를 20∼30% 유지하고 당의 축적도를 10∼20초로 유지하여 배양함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 추가당의 첨가량을 배양액 중 당의 축적도를 10∼20초로 유지하는 첨가량과 탁도에 의한 균체량을 측정하여 비기질소비촉도×균체량에 의해 산출한 첨가량을 상대적으로 비교하여 균체의 대수 증식까지는 첨가량이 상대적으로 많은 양을, 대수증식 이후는 첨가량이 상대적으로 적은량을 추가하여 배양함을 측징으로 하는L-트리토판의 제조방법.