KR0133990B1

KR0133990B1 - 염 및 솔비톨을 이용한 슈도모나스 균종의 l-시스테인 생성효소의 안정화 방법

Info

Publication number: KR0133990B1
Application number: KR1019940017767A
Authority: KR
Inventors: 신철수; 류옥희
Original assignee: 신철수
Priority date: 1994-07-22
Filing date: 1994-07-22
Publication date: 1998-04-20

Abstract

본 발명은 생물전환을 이용한 L-시스테인(cysteine) 및 L-시스타인(cystine)의 신규한 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 슈도모나스 균종(Pseudomonas sp.)을 이용하여 D,L-2-아미노-△²-티아졸린-4-카르복실산(D,L-2-amino-△²-thiazoline-4-carboxylic acid, 이하 'D,L-ATC'라 함)로 부터 효과적으로 L-시스테인 및 L-시스타인을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 염 및 솔비톨을 이용하여 L-시스테인 생성효소의 안정성을 증진시킬 수 있고, 솔비톨을 이용한 효소안정성 증진방법을 연속생산에 적용하여 L-시스테인의 생성 반응시간을 장기간 연장 시킬 수 있으며, 반응중에 생성된 L-시스테인을 분리하여 생성물에 의한 생합성 억제를 줄이면서 L-시스테인의 제조효율을 높일 수 있는 동시에 미반응된 D,L-ATC를 재사용할 수 있다는 효과를 지니고 있다는 것이 확인되었다.

Description

염 및 솔비톨을 이용한 슈도모나스 균종의 L-시스테인 생성효소의 안정화 방법

본 발명은 염 및 솔비톨을 이용한 슈도모나스 균종(Pseudomonas sp.)의 L-시스테인 생성효소의 안정화 방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 D,L-2-아미노-△²-티아졸린-4-카르복실산(D,L-2-amino-△²-thiazoline-4-carboxylic acid, 이하 'D,L-ATC'라 함)의 기질로부터 L-시스테인(cystein)을 생산하는 슈도모나스 균종의 L-시스테인 생성효소를 염 및 솔비톨의 첨가에 의해 안정화시키는 방법에 관한 것이다.

황함유 아미노산인 L-시스테인은 공기중의 산소에 의해 쉽게 L-시스타인으로 산화되며, 주로 의약품, 화장품, 식품첨가물 등에 이용되어 왔다. 종래, 이러한 L-시스테인의 산업적 생산은 동물의 털이나 인모(人毛)로 부터 추출하는 방법에 의존하여 왔으나, 이 방법은 수율이 7 내지 8%로 아주 낮음은 물론, 제조시 악취가 발생하며 부산물로 발생하는 폐기물 처리가 어렵다는 문제점을 지니고 있다. 한편, 화학적으로 시스테인을 합성하는 방법도 있으나, 공정이 복잡하고 생성된 시스테인은 D 및 L형이 공존하므로, 광학적 분리가 수반되어야하는 등의 문제점이 있다. 따라서, 이러한 추출방법이나 화학적 합성방법이 아닌 제3의 방법으로 미생물이나 효소를 이용하여 L-시스테인 만을 제조하는 방법이 다양하게 시도되었으며, 이 중에서도 L-시스테인의 화학적 합성중간체인 D,L-ATC를 기질로 사용하여 L-시스테인 및 L-시스타인을 생산하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다[참조: Agric. Biol. Chem., 42, 2315(1978)].

한편, 효소나 미생물을 이용하여 물질을 효과적으로 대량생산하기 위해서는, 반응에 관여하는 효소의 활성을 장기간 유지시켜 이를 연속생산 공정에 적용하는 것이 필수 불가결하다. 그러나, L-시스테인 생성에 관여하는 효소는 실제적인 반응조건하에서 매우 불안정하여 활성이 급격히 감소하므로, 이를 연속생산에 적용하여 L-시스테인을 제조한 예는 전무한 실정이다. 더구나, L-시스테인의 제조에 관여하는 효소는 최종생성물인 L-시스테인 및 L-시스타인에 의해 생합성이 억제(product inhibition)되는 것도 문제점으로 지적되어 왔다[참조: Kor. J. Appl. Microbil. Biotech., 18, 49(1990)].

이에, 본 발명의 발명자들은 반응물에 염 또는 솔비톨을 가하면, 반응중 L-시스테인 생성효소계의 안정성이 증대되어L-시스테인 및 L-시스타인의 제조시 연속생산이 가능하며, 반응중에 생성된L-시스테인 및 L-시스타인을 제거하여 반응액내 생성물의 농도를 낮추면, L-시스테인 생성반응속도가 증가하여 생산성을 증대시킬 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 L-시스테인 및 L-시스타인의 연속생산이 가능하도록 L-시스테인 생성효소계의 안정성을 증진시키는 방법을 제공 하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기의 L-시스테인 생성효소계를 사용한 연속반응을 통해 L-시스테인 및 L-시스타인을 제조하는 동시에 반응 중에 생성된 L-시스테인 및 L-시스타인을 분리하여, 즉 연속반응공정과 분리공정을 병용하여 L-시스테인을 효과적으로 대량생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서는 L-시스테인 생성효소계의 안정성 증진방법 및 전기방법을 연속생산에 적용하여 L-시스테인 및 L-시스타인을 제조하는 방법이 제공되고, 아울러 생성된 L-시스테인 및 L-시스타인을 제거하는 분리공정을 병용한 새로운 L-시스테인 제조방법이 제공된다. 즉, 본 발명에서는 염 또는 솔비톨을 사용하여 L-시스테인 생성효소의 안정성을 증진시키는 공정, 이를 고정화 균체로 충진된 연속반응기에 적용하는 공정 및 L-시스테인 분리공정을 병용한 2단 반응공정을 개발하여 효과적으로 L-시스테인을 제조한다.

이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 D,L-2-아미노-△²-티아졸린-4-카르복실산 기질용액에 염 및 솔비톨 중 1종 이상의 화합물을 가하는 공정에 의해 슈도모나스 M-38 균종으로 부터 분리한 L-시스테인 생성효소의 안정성을 증대시킨다. 이때, 염으로는 KCl, NaCl, CaSO₄, (NH₄)₂SO₄, Na₂SO₄및 MgSO₄등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 L-시스테인 생성효소로는 D,L-ATC로 부터 L-시스테인을 생산하는 능력을 가지며, 시스테인 디설프하이드라제(cystein desulfhydrase) 활성이 미약한 변이주인 슈도모나스 균종(Pseudomonas sp.) M-38[Biotech. Lett., 14, 1143(1992)]을 사용한다. 즉, 전기 균주를 2.0% 글루코스, 0.5% 효모 추출물, 0.5%펩톤, 0.25% NaCl, 0.1%KH₂PO₄, 0.05%MgSO₄·7H₂O을 포함하는 수용액을 pH가 7.0이 되도록 유지한 배지에서, 30℃, 200rpm으로 진탕배양기(rotary shaker)에서 12시간 정도 배양하여 종배양액을 만든다. 본 배양은 전기와 동일한 배지 50ml을 함유하고 있는 500ml 삼각 플라스크에 종배양액을 8%(v/v)가 되도록 접종하여, 30℃, 200rpm의 조건 및 호기적 조건에서 12시간 진탕배양한다. 그런 다음, 균체내에 효소의 유도생산을 위하여 배양액에 0.15%되게 D,L-ATC(pH 7.0)를 첨가하고, 12시간 동안 계속 진탕배양한다. 일정량의 배양액을 취하여 4℃에서 8000rpm으로 10분간 원심분리하여 균체를 모으고 0.1M Tris 완충용액(pH 7.8)으로 세척한 후, 균체액을 농축하여 약 40g/1 농도의 균체현탁액을 수득한다. 이를 음파파쇄기(sonicator)로 파쇄하고, 원심분리하여 얻은 상등액을 효소액으로 사용한다. 한편, 고정화균체의 제조는 균체현탁액을 3% 소디움 알지네이트(sodium alginate) 용액과 동량 혼합한 다음, 주사바늘을 이용하여 0.05M CaCl₂용액에 적하시켜 지름 2mm의 Ca-알지네이트 비드(alginate bead)를 만들어 사용한다. 고정화 균체의 구조를 숙성시키기 위하여, 비드를 4℃에서 12시간 보존하며 L-시스테인 생성능을 향상시키시 위하여 0.1%(w/v) CaCl₂를 포함하고 있는 배양배지에서 30℃, 120rpm으로 5시간 진탕배양하고 활성화시켜 사용한다.

그런 다음, D,L-ATC 용액에 염 및 솔비톨 중 1종 이상의 화합물을 전기의 L-시스테인 생성효소와 반응시킨다. 효소액을 이용한 L-시스테인 및 L-시스타인의 생성반응은 0.5mM MnSO₄와 0.1% Triton X-100을 포함한 30mM D,L-ATC 기질용액에 효소액을 가하여 30℃에서 일정시간 반응시켜 진행시킨다.

본 발명의 제조방법에 의해 생성된 L-시스테인 또는 L-시스타인의 생성량은 고속액체크로마토그래피(컬럼: Crownpak CR(+) 150mm×4mm I.D., 이동상: perchloric acid 수용액(pH 1.3)를 사용하여 측정한다.

또한, L-시스테인의 연속생산은 컬럼(1.7cm×15cm)에 30ml의 고정화 균체를 채워 제조한 공간분율(void fraction) 약 80%의 충진형 반응기(packed bed reactor)를 이용하는데, L-시스테인 생성반응은 0.5mM MnSO₄와 0.1% CaCl₂, 0.1% Triton X-100을 포함한 30mM D, L-ATC 기질용액을 미량정량펌프를 이용하여 0.25 또는 0.75hr^-1의 희석율로 반응기에 연속공급하여 반응을 수행한다. 이때, 반응기 내부의 온도유지는 반응기 외부의 워터쟈켓(water jacket)을 이용하여 항온수조의 물을 순환시켜 30 내지 42℃로 유지시키며, L-시스테인 생성효소의 활성유지는 반응시간에 따른 L-시스테인의 생성량을 측정하여 계산한다.

한편, 반응중에 생성된 반응액 중의 L-시스테인 및 L-시스타인의 분리를 위하여 이온교환수지로 충진된 분리조를 사용한다. 수지를 컬럼에 충진하여 활성화시킨 후 0.1M Tris 완충용액(pH 7.8)으로 평형화시키고, 솔비톨, D,L-ATC 및 L-시스타인이 포함된 반응액을 통과시켜 생성물인 L-시스타인 만을 흡착시킨다. L-시스테인 및 L-시스타인의 연속생산을 위하여 고정화균체로 충진된 부피 30ml의 충진형 반응기 2개와 이온교환수지로 충진된 2개의 L-시스테인 분리조를 연결하여 반응을 수행한다.

본 발명의 방법에 의하면, 염 및 솔비톨을 이용하여 L-시스테인 생성효소의 안정성을 증진시킬 수 있고, 솔비톨을 이용한 효소안정성 증진방법을 연속생산에 적용하여 L-시스테인의 생성 반응시간을 연장시킬 수 있으며, 반응중에 생성된 L-시스테인을 분리하여 생성물에 의한 생합성 억제를 줄이면서 L-시스테인의 제조효율을 높일 수 있는 동시에 미반응된 D,L-ATC를 재사용할 수 있는 장점을 지니고 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1:

포화농도의 KCL, NaCL, CaSO₄, (NH₄)SO₄, NaSO₄, MgSO₄염용액과 0, 40, 80% 솔비톨 용액을 각각 동량 혼합하여 제조한 30℃로 유지된 각 용액상에서 슈도모나스 균종(Pseudomonas sp.) M-38[Biotech. Lett., 14, 1143(1992)]로 부터 얻어진 L-시스테인 생성효소를 48시간 저장하였다. 그런 다음, 0.5mM MnSO₄와 0.1% Triton X-100을 포함한 30mM D,L-ATC 기질용액과 30℃, 120rpm으로 반응시켜 생성된 L-시스테인의 양을 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 측정하여 효소의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과, 저장하지 않은 효소활성을 100으로 하여 상대치로 나타낼 때, 염이나 솔비톨이 첨가되지 않은 0.1M Tris 완충용액상에 효소를 저장한 경우 약 12%의 잔존활성을 보였으나, 염과 솔비톨이 함유된 용액상에서는 이들 염의 종류나 첨가량 및 솔비톨 첨가농도에 따라 효소활성이 달리 유지되었다. 즉, 염을 첨가하여 효소가 존재하는 환경의 이온강도를 증가시키거나, 낮은 이온강도 조건에서는 솔비톨을 가하여 수분활성도를 저하시키므로써, L-시스테인 생성효소의 안정성을 효과적으로 유지할 수 있었다. 예를 들어, 솔비톨이 첨가되지 않은 Na₂SO₄(이온강도 2.5), (NH₄)₂SO₄(이온강도 5부근) 또는 MgSO₄용액(이온강도 6.3)에서는, 각각 15, 40, 55%의 효소활성이 유지되었다. 20% 솔비톨이 함유된 Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄또는_sMgSO₄의 각 용액에 효소를 저장한 경우에서는 효소활성이 각각 35, 47,78%로 증가되었고, 이러한 염용액에 솔비톨을 40%되게 첨가한 경우에는, 효소활성이 각각 50, 75, 92%로 더욱 증가되었다.

실시예 2:

20% 솔비톨이 첨가되거나 또는 첨가되지 않은 0.1M Tris 완충용액(pH 7.8)에 슈도모나스 균종 M-38 균체를 30℃에서 48시간 저장한 다음, 0.5 mM MnSO, 0.1% CaCl₂와 0.1% Triton X-100을 포함한 30mM D,L-ATC 기질용액과 30℃, 120rpm으로 반응시켜 생성된 L-시스테인의 양을 고속액체크로마토그래피로 측정하여 균체내 L-시스테인 생성효소의 안정성에 미치는 솔비톨의 영향을 조사하였다. 그 결과, 균체를 솔비톨이 첨가되지 않은 완충용액상에 저장한 경우에는 저장 2일 후에 L-시스테인 생성에 관여하는 효소의 활성이 33%로 유지된 데 대하여, 20% 솔비톨이 첨가된 용액에서는 효소활성이 90%이상 유지되었다.

실시예 3:

슈도모나스 균종 M-38 균체 및 이를 Ca-알지네이트로 포괄시킨 고정화균체를 0, 20, 40% 솔비톨이 첨가된 완충용액에서 저장온도를 각각 26, 30, 37, 42℃로 변화하며 48시간 저장하여 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 L-시스테인 생성효소의 안정성을 조사하였다. 그 결과, 완충용액에 균체 또는 고정화균체를 저장한 경우에서 저장온도의 증가에 따라 효소안정성이 낮게 유지되어 저장온도 30, 37, 42℃에서 고정화균체를 저장한 경우에는 효소활성이 44, 22, 4%로 각각 유지되었으며, 20% 솔비톨을 첨가한 경우에는 30℃까지는 효소안정성이 90% 정도로 높게 유지되었으나 37℃에서는 효소안정성이 급격히 감소하였다. 또한, 40% 솔비톨 용액을 첨가한 경우는 26℃에서 37℃의 온도범위에서 효소안정성이 90% 이상으로 높게 유지되었다. 한편, 효소가 불활성화되지 않는 한 가능하면 고온에서 반응을 수행하는 것이 생산성 증가에 효과적이므로, L-시스테인 생산에 있어서도 여러가지 다른 온도조건에서 솔비톨의 농도를 변화시켜 L-시스테인의 생산성을 조사하였다. 효소원으로는 균체 또는 고정화균체를 이용하여, 반응온도를 각각 26, 30, 37, 42℃로 하여, 0, 20, 40%의 솔비톨을 포함한 D,L-ATC 기질용액으로 반응을 진행하였다. 그 결과, 균체와 고정화균체 모두에서 반응온도의 증가에 따라 생성된 L-시스테인 양이 증가하여, 20% 솔비톨 내 고정화균체는 반응온도 37℃에서, 26℃에서의 반응에 비해 약 2배 가량의 L-시스테인을 생성하였다.

실시예 4:

고정화균체로 충진시켜 제조한 컬럼형태의 충진형 반응기에 실시예 2에서와 동일한 30mM의 D,L-ATC 기질용액을 미량정량 펌프로 이용하여, 0.25 hr^-1의 희석율(유속 6ml/hr)로 30℃로 유지시킨 반응기에 연속공곱하여 반응을 수행하였다. L-시스테인 생성 효소의 안정성 증진을 위한 방법으로 D,L-ATC 기질용액에 20%되게 솔비톨을 첨가하여 반응을 수행하였고, 그 결과를 솔비톨이 전혀 첨가되지 않은 경우와 비교하였다. 충진형 반응기에서 반응하고 나온 액을 시간에 따라 채취하여 생성된 L-시스테인을 측정한 결과, 솔비톨이 첨가되지 않은 기질용액으로 반응을 수행한 경우에서는 반응초기에 15.2mM의 L-시스테인이 생성되었고, 반응 147시간 후에는 2.6mM만의 L-시스테인이 생성되어, 빠른 시간내에 효소활성이 급격히 감소됨을 알 수 있었다. 반면, 20% 솔비톨을 포함한 기질용액으로 반응시킨 경우에서는 초기에 17.6mM의 L-시스테인이 생성되었고, 반응 600시간 이후에도 12.0mM의 L-시스테인이 생성되어 초기 효소활성의 68%가 유지되었다.

실시예 5:

L-시스테인 또는 L-시스타인의 분리를 위해 양이온 교환수지인 DOWEX 50W(Sigma Chemical Co., U.S.A.)로 충진된 컬럼에 D,L-ATC, L-시스테인, L-시스타인 및 솔비톨 등이 포한된 반응액을 통과시키고 Tris 완충용액으로 세척한 다음, 0 내지 2M HCL로 농도구배를 변화시키면서 흡착된 물질을 유출시켜 분획하였다. 그 결과, 솔비톨은 이온교환수지에 흡착되지 않고 컬럼을 통과하였으나, D,L-ATC, L-시스테인 및 L-시스타인은 이온교환수지에 흡착되었다. 흡착된 물질들의 분리를 위해 0 내지 2N HCL로 농도구배를 변화시키면서 용출시켰을 때, D,L-ATC는 0.7N HCL에서, L-시스테인과 L-시스타인은 0.5와 1.ON HCL에서 각각 탈착되었다. 그런 다음, 반응액에 공기를 주입시켜 L-시스테인을 L-시스타인으로 산화시킨 후, 전기의 방법으로 분리하였다. 그 결과, 솔비톨은 이온교환수지에 흡착되지 않고 컬럼을 통과하였으나, D,L-ATC와 L-시스테인은 HCL농도 0.7N과 1.ON에서 각각 분리되었다.

실시예 6:

40% 솔비톨을 포함한 실시예 2의 D,L-ATC 기질용액을 0.75hr^-1의 희석율(유석 18.0ml/hr)로 37℃의 첫번째 반응기에 연속공급하여 얻은 반응액에 공기를 주입하였다. 이 용액에 5.4ml/hr의 유속으로 3.5N HCL을 연속공급하여 HCL의 최종농도가 0.8N이 되도록 조절한 다음, 23.4ml/hr의 유속으로 첫번째 분리조에 유입하였다. 분리조를 통과하여 나온 액에 5.4ml/hr의 유속으로 3.5N NaOH를 공급하여 pH를 7.8로 조절하고, 이 용액에 MnSO₄와 CaCl₂가 포함된 용액을 각각의 최종농도가 0.5mM과 0.1% 되게 5.4ml/hr의 유속으로 공급한 후, 희석율 1.71hr^-1(유속 34.2 ml/hr)로 두 번째 반응기에 공급하여 30℃에서 반응을 수행하였다. 두번째 반응기로 부터 유출된 반응액에 다시 공기를 주입시키고 이를 두번째 분리조에 공급하였다. 이때, L-시스테인의 생산성은 첫번째 반응기와 두번째 반응기로 부터 유출된 반응액에 존재하는 L-시스테인의 양을 측정하여 계산하였다. 한편, 분리공정을 수반하지 않은 2단 반응에서는 기질희석율을 0.75hr^-1(유속 18.0ml/hr)로 하였고, 첫번째 반응기의 온도는 37℃, 두 번째 반응기는 30℃로 하여 실험을 수행하였다. 이상과 같은 장치를 이용한 L-시스테인의 연속생산 공정으로 부터 다음과 같은 결과를 얻었다. 분리단계를 병용한 2단 반응의 연속생산 공정에서는 반응 20시간 후의 정상상태에서 첫번째 반응기에서는 14.9mM의 L-시스테인이 생성되었고, 두번째 반응기에서는 8.0mM의 L-시스테인이 생성되어 최종 22.9mM의 L-시스테인이 생성되었다. 한편, 분리공정을 수반하지 않은 2단 반응에서는 최종 16.0mM의 L-시스테인이 생산되었다. 분리공정이 없는 2단 반응에서의 L-시스테인 생산성은 12.0mM/hr인데 비해 분리공정을 병용한 2단 반응에서의 L-시스테인 생산성은 17.2mM/hr로 연속생산 반응에 분리공정을 병행하므로써, L-시스테인 생산성이 43% 더 증가하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명에 의하여 다양한 염 및 솔비톨을 이용하여 L-시스테인 생성효소의 안정성을 증진시킬 수 있고, 솔비톨을 이용한 효소안정성 증진방법을 연속생산에 적용하여 L-시스테인의 생성 반응시간을 장기간 연장시킬 수 있으며, 반응중에 생성된 L-시스테인을 분리하여 생성물에 의한 생합성 억제를 줄이면서 L-시스테인의 제조효율을 높일 수 있는 동시에 미반응된 D,L-ATC를 재사용할 수 있다는 효과를 지니고 있다는 것이 확인되었다.

Claims

KCl, NaCl, CaSO₄, (NH₄)₂SO₄, NaSO₄, 및 MgSO₄로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염 및 0∼40% 솔비톨 중에서 1종 이상을 첨가하여, D, L-2-아미노-△²-티아졸린-4-카르복실산 (D,L-2-amino-△²-thiazoline-4-carboxylic acid )의 기질로부터 L-시스테인을 생산하는 슈도모나스 균종의 L-시스테인 생성효소를 안정화시키는 방법.