JPWO2021191624A5

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Publication number: JPWO2021191624A5
Application number: JP2022558185A
Authority: JP
Publication date: 2024-03-29

Description

本発明は、トランスフェクション効率及び／又はタンパク質発現の向上を実現するための装置並びにその使用方法に関する。本装置はまた、細胞のタンパク質発現を向上させるためにも使用することができる。

好ましくは、本方法は、完全にインビトロで、又は完全にインビボで、又は部分的にインビトロで及び部分的にインビボで行われ得る。例えば、真核細胞はインビトロでトランスフェクトされ、１つ以上の目的又は適用にインビトロで使用される可能性がある。更なる例では、真核細胞は患者から抽出され、インビトロでトランスフェクトされ、次に患者に再導入して戻される可能性がある（これは、同義的に「エキソビボ」方法と称される）。或いは、トランスフェクション複合体は患者に注入されるか、又は他の方法で運び込まれる可能性があり、患者の細胞がインビボでトランスフェクトされる可能性がある。

実験で使用した核酸は、アルギニンバソプレシン（ＡＶＰ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、又はインスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）プロモーターを含むＤＮＡプラスミド物質を含んだ。サイトメガロウイルス（Ａｄｌｕｃ）プラスミド、ルシフェラーゼ対照（コントロール）ベクター（Ｒｅｎｉｌｌａ）プラスミド又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミドもまた使用した。

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
２００ｎｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
２ｎｇＲｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド（英国ダンディー大学が作製）
２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
２９３－Ｆｒｅｅ発現培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
１μｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
８０ｎｇＲｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
ＴｒａｎｓＩＴ２０２０（ＭｉｒｕｓＢｉｏ、米国）

＜対照－ＴｒａｎｓＩＴ２０２０を使用＞
１．７００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．４２μＬのＴｒａｎｓＩＴ２０２０を加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ、（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
３．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
４．５０μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。

Claims

真核細胞におけるトランスフェクション効率を向上させる方法であって、該方法は、
ａ）トランスフェクションに好適な少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した試薬を含むトランスフェクション混合物を提供するステップと；
ｂ）トランスフェクション複合体を形成するために、前記トランスフェクション混合物を１つ以上の真核細胞に導入するステップと；
ｃ）１つ以上のトランスフェクトされた細胞を形成するために、前記トランスフェクション複合体がトランスフェクションプロセスを受けることを許容するステップと
を含み、
前記方法は、所与の周波数、所与のパルス率、又は所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで、で供給されたパルス化電磁信号を、前記トランスフェクション複合体を生み出す前に前記ステップａ）で前記トランスフェクション混合物に、前記ステップｂ）において前記トランスフェクション複合体に、前記ステップｃ）において前記トランスフェクション複合体に、及び／又は前記ステップｃ）の後にトランスフェクトされた細胞の複合体に、指向させるステップを含むことを特徴とする、方法。
前記真核細胞は、溶液中に懸濁されている、及び／又は基質に付着している、請求項１に記載の方法。
前記真核細胞は不死細胞であるか、又は前記細胞は、ヒト及び／又は動物対象の組織から得られたものである、請求項１又は２に記載の方法。
前記真核細胞は、ヒト及び／又は動物対象から得られたものであり、Ｔ細胞、リンパ球、顆粒球及び／又はマクロファージを含む、請求項３に記載の方法。
前記トランスフェクション混合物中の前記試薬は、トランスフェクションに好適ないずれかの試薬、及び／又は核酸、医薬品用及び／又は治療用試薬又は化合物、治療的及び／又は医薬品的利益のある試薬、５キロダルトン未満の小分子又は小分子材料、約５キロダルトン以上の大型分子又は大型分子材料、１つ以上のタンパク質、ワクチン、有機剤、又は１つ以上の抗体のいずれか又はいずれかの組み合わせである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも１つの両親媒性構造体と会合した前記試薬は、前記両親媒性構造体の中に納められているか、前記試薬は前記両親媒性構造体と複合体を形成しているか、前記試薬は前記両親媒性構造体上に納められているか、又は前記試薬は前記両親媒性構造体に結合している、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記トランスフェクション混合物を形成するために、前記試薬を前記両親媒性構造体と混合するステップを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記両親媒性構造体は、少なくとも１つのリポソーム物質又は媒介体、少なくとも１つのペグ化されたリポソーム物質又は媒介体、ミセル、リン脂質二重層を有する構造体、カチオン重合体、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のいずれか又はいずれかの組み合わせを含み得るか、又はそれからなり得る、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記試薬が核酸であるとき、前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記試薬は、１つ以上の発現ベクターであるか、又は前記１つ以上の発現ベクターを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記試薬が核酸であるとき、前記トランスフェクションプロセスの結果、一過的発現が得られるか、又は前記試薬が前記核酸である方法であって、該方法は、前記トランスフェクションプロセス後に前記真核細胞の１つ以上を分離するステップと、前記試薬によってコードされる１つ以上のペプチドが１つ以上の分離した真核細胞又はその子孫において発現するレベルを試験するステップと、及び前記発現レベルに基づき前記１つ以上の分離した真核細胞又は子孫を選択するステップとを更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
パルス化電磁信号を指向させる前記ステップは、所与の期間にわたって行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記パルス化電磁信号が前記トランスフェクション試薬に指向されるとき、前記所与の期間は約１５分であり；及び／又は前記パルス化電磁信号がトランスフェクションの最中又は前記トランスフェクション後に前記トランスフェクション混合物に指向されるとき、約１～４時間である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記パルス化電磁信号は、１つ以上の電子機器によって生成され、前記１つ以上の電子機器は、使用時に前記パルス化電磁信号を生成し及び／又はそこから伝送する伝送手段又は１個以上の電子伝送チップを含み；各電子機器は単一の伝送手段又は電子チップを含むか、又は各電子機器は複数の伝送手段又は電子チップを含み、任意選択で前記電子機器は複数の伝送手段又は電子伝送チップを含み、前記伝送手段又は電子伝送チップの各々は、互いにある空間距離を離して配設され、ここで前記離される距離は、前記パルス化電磁信号の波長のほぼ半分に等しく；又は前記電子機器は、前記機器の筐体の表面、又は使用時に前記電子機器の上に配置されることになる１つ以上の物品の表面の１０５～１１５ｃｍ2当たり少なくとも１個の伝送手段又は電子伝送チップを含むか、又は前記電子機器は６個の伝送手段又は電子伝送チップを含み、及び前記チップは、使用時にプレートが前記電子機器に、その上に接して、又はそれを基準にして位置するとき、１個の伝送手段又は電子伝送チップが前記２４ウェルプレートの４つのウェルに指向するように、前記機器に互いにある空間距離を離して配設される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記伝送手段と使用時に前記パルス化電磁信号を受信する１つ以上の物品との間の距離は、約２５ｃｍ以下、約２０ｃｍ以下、約１５ｃｍ以下、約１０ｃｍ以下、約５ｃｍ以下、又は約１ｃｍに等しいか又はそれ未満である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、約２．２～２．６ＧＨｚの間であり、約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は約２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記パルス化電磁信号の前記所与のパルス率は約５０Ｈｚ以下、約２５Ｈｚ以下、約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルスは約１ｍｓ～２０ｍｓの間にわたって持続し、又は約１ｍｓであり、任意選択で前記パルス化電磁信号の各パルス間の休止期間は約６６ｍｓ以下持続し、及び／又は各伝送手段又は電子伝送チップによって供給された前記所与の出力は約＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり；及び／又は前記パルス化電磁信号は、０．４５～０．５５の間のガウス型周波数偏移変調（ＧＦＳＫ）を用いて伝送される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚ又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記所与のパルス率は１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び前記所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり、及び任意選択で前記試薬は核酸であるか、又は核酸を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の電子機器は、前記電子機器及び／又は伝送手段の操作及び／又は１つ以上のパラメーターを制御するための制御手段、使用時に前記１つ以上の機器に電力を供給する電力供給手段、１つ以上の回路基板、データを格納する記憶手段、ユーザーが前記機器の前記操作、１つ以上の条件及び／又は前記１つ以上のパラメーターを選択することを許容するユーザー選択手段、又は１つ以上の設定、若しくは設定のオプションを表示する表示手段のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項１４に記載の方法。
ユーザーが選択することのできる前記機器の前記１つ以上の条件又はパラメーターは、前記パルス化電磁信号の信号周波数、信号強度、信号又は伝送出力、各パルスの時間期間又は信号パルス間の休止期間、信号パルス率のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
真核細胞におけるトランスフェクション効率の向上を提供するための装置であって、筐体と、前記筐体に位置する、かつ使用時に所与の周波数、所与のパルス率、所与の出力のいずれか又はいずれかの組み合わせで供給されたパルス化電磁信号を伝送するように配設された伝送手段と、使用時に少なくとも前記伝送手段の操作を制御するための制御手段と、使用時に前記伝送手段及び／又は制御手段に電力を供給するための電力供給手段とを含む、装置。
１個以上の伝送手段又は電子伝送チップ、又は２個以上の伝送手段又は電子伝送チップを含む、請求項２０に記載の装置。
前記機器の筐体の表面、又は使用時に前記装置の上に配置されることになる１つ以上の物品の表面の１０５～１１５ｃｍ2当たり少なくとも１個の伝送手段又は電子伝送チップを含む、請求項２０又は２１に記載の装置。
前記装置は複数の伝送手段又は電子伝送チップを含み、前記伝送手段又は電子伝送チップは、ある空間距離を離して配設され、ここで前記離される距離は、前記パルス化電磁信号の波長の約半分に等しくなるようなものである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の装置。
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は約２．２～２．６ＧＨｚの間であり、約２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は約２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、及び／又は前記パルス化電磁信号の前記所与のパルス率は約５０Ｈｚ以下、約２５Ｈｚ以下、約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルスは約１ｍｓ～２０ｍｓの間にわたって持続し、又は約１ｍｓであり、及び／又は前記パルス化電磁信号の各パルス間の休止期間は約６６ｍｓ以下持続し、及び／又は前記パルス化電磁信号を伝送する前記伝送手段の各々によって供給された前記所与の出力は、約＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり、及び／又は前記パルス化電磁信号は、０．４５～０．５５の間のガウス型周波数偏移変調（ＧＦＳＫ）を用いて伝送される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の装置。
前記パルス化電磁信号の前記所与の周波数は２．２～２．６ＧＨｚの間であり、２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、前記所与のパルス率は約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び各伝送手段の前記所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷである、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の装置。
使用時に前記装置をユーザーの上に及び／又はユーザーに隣接して直接又は間接的に着脱可能に取り付けることを許容する取付手段が提供される、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の装置。
前記取付手段は、１つ以上のストラップ、ひも、ネックレス、ペンダント、ベルト、ブレスレット、クリップ、キーリング、ランヤード、ＶＥＬＣＲＯ（登録商標）（面ファスナ）、ホック、ボタン、ボタン穴、接着剤、絆創膏、縫合糸及び／又は生体適合性接着剤のいずれか又はいずれかの組み合わせを含む、請求項２６に記載の装置。
前記筐体は外装を含み、前記装置の少なくとも前記外装は、使用時に前記装置が身体の中又はユーザーの皮膚の下に埋込み可能であることを許容するための物質で被覆されている、及び／又は前記物質で形成されている、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の装置。
前記装置には、使用時に１つ以上の真核細胞又は人にトランスフェクトされることになるトランスフェクション混合物を保持する又は納めるための少なくとも１つの保持手段又はリザーバーが提供される、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の装置。
前記保持手段又はリザーバーは、使用時にトランスフェクトされることになる人の皮膚又は１つ以上の真核細胞上に及び／又はそれに隣接して位置することが可能であるように前記装置上に配設され、及び前記パルス化電磁信号は、身体の１つ以上の部位及び／又は真核細胞に指向させることが可能であって、使用時に前記試薬の吸収及び／又はトランスフェクションを向上させる助けとなる、請求項２９に記載の装置。
請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法により作製された細胞又はその子孫。