KR20220157375A - 형질감염 효율 및/또는 진핵세포로 작용제의 세포내 전달 효율의 개선 및/또는 단백질 발현 개선용 장치 및 이를 이용하는 방법 - Google Patents
형질감염 효율 및/또는 진핵세포로 작용제의 세포내 전달 효율의 개선 및/또는 단백질 발현 개선용 장치 및 이를 이용하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
적어도 하나의 진핵세포로 작용제의 개선된 형질감염 효율 및/또는 세포내 전달 효율 및/또는 단백질 발현용 장치 및 이를 이용하는 방법
하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 공정을 개선시키는 방법 및 장치가 제공된다. 상기 방법에는 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드 작용제를 제공하는 단계, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시켜 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 만드는 단계, 그리고 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형질감염 공정 또는 세포-내 전달 공정을 거쳐 하나 또는 그 이상의 형질감염된 또는 처리된 진핵세포를 만들도록 하는 단계가 내포된다. 상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 형질감염 혼합물에서, 단계 b)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 이후 형질감염된 또는 처리된 세포 혼합물에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 공정을 개선시키는 방법 및 장치가 제공된다. 상기 방법에는 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드 작용제를 제공하는 단계, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시켜 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 만드는 단계, 그리고 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형질감염 공정 또는 세포-내 전달 공정을 거쳐 하나 또는 그 이상의 형질감염된 또는 처리된 진핵세포를 만들도록 하는 단계가 내포된다. 상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 형질감염 혼합물에서, 단계 b)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 이후 형질감염된 또는 처리된 세포 혼합물에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 형질감염 효율 및/또는 진핵세포로 작용제의 세포내 전달 효율을 개선하기 위한 장치 및 이를 이용하는 방법에 관계한다. 상기 장치는 세포에서 단백질 발현을 개선시키고, 이를 이용하는 방법에 또한 이용될 수 있다.
다음 설명에서는 세포의 형질감염 개선 및/또는 진핵세포로 작용제의 세포내 전달의 개선을 허용하는 장치가 치료요법적 또는 약물 치료 목적으로 어떻게 사용될 수 있는지에 대해 언급하지만, 당업자는 본 발명이 진핵세포로 형질감염 및/또는 작용제의 세포내 전달세포이 요구되는 임의의 목적 또는 적용, 이를 테면, 바이러스 벡터의 생산, 유전자 요법 또는 변형, 단백질 발현, 자가 세포 요법 및/또는 이와 유사한 것들에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 장치 및 방법은 시험관내 세포, 생체-외 세포 및/또는 생체-내 세포와 관련하여 착수될 수 있음을 또한 인지할 것이다.
일반적으로, 특정 의학적 상태(다양한 정도의 심각성을 가질 수 있는)의 치료를 위한 약제 및/또는 기타 약물의 전달에 있어서, 약제 및/또는 기타 약물이 경피적(즉, 환자의 피부에 흡수되어 통과하여)으로 적용되는 것을 허용하고자 하는 요구가 있었다. 그러나, 원칙적으로 그러한 프로세스의 이점은 오랫동안 인정되어 왔지만, 다양한 환자에게 사용할 수 있도록 실용적이고, 효율적이며 반복 가능한 방식으로 이 기술을 제공하는 것은 오랫동안 과제였다.
중요한 문제가 되는 부분은 사람의 피부가 피부를 통해 신체로 물질이 전달되는 것을 방지하고 저항하는 장벽 역할을 하도록 자연적으로 구성되어 있다는 것이다. 그 결과, 현재 성공적으로 경피(즉, 피부를 통해)를 전달할 수 있는 매우 강력한 약물의 범위가 상대적으로 적다. 일반적으로, 이러한 약물의 전달은 젤, 크림 및/또는 패치 장치를 통해 사람의 피부 표면에 적용한 다음, 피부를 통해 사람의 신체로 흡수되도록 둔다.
예를 들면, 접착 패치는 펜타닐과 같은 오피오이드 약물 전달에 현재 사용된다 [1]. 펜타닐은 매우 강력한 약물이며, 따라서 피부 아래- 공간에서 환자의 모세관 시스템에 충분한 양을 제공도록 사람의 피부를 통과하는 약물은 미량만 필요하다. 그러나, 충분한 양의 약물이 환자의 모세혈관에 전달되어 치료를 수행하더라도, 해당 패치에 제공된 약물의 양이 환자의 몸에 들어갈 가능성은 적다. 이러한 것이 현재의 방법을 비효율적이고, 소모적으로 만든다.
더욱이, 바이오의약품 항체와 같이 상대적으로 큰 분자로 이루어진 약물은 크기 때문에 경피 전달이 불가능하고, 따라서 이것이 사람의 피부를 통과할 수 없다. 유사한 문제는 예를 들어, 세포독성 약물과 같은 다른 약제 및/또는 치료 분자에도 또한 적용된다.
또 다른 문제는 개인의 신체 일부에 대한 직접적인 치료를 가정에서 쉽게 달성할 수 없다는 점이다. 따라서, 이 환자는 일반적으로 치료 치료를 받기 위해 병원이나 또는 의사의 진료소를 정기적으로 방문해야 한다. 이것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 직원, 기구 및 환자가 지정된 치료 시간에 이용 가능하도록 배치하는 데 상당한 행정적 노력이 필요하다. 이의 대안으로 환자의 집에 적절한 치료 장치를 제공하는 것이지만, 이는 치료 장치를 한 명의 환자만 사용할 수 있음을 의미한다. 치료 장치는 일반적으로 고가이기 때문에, 가정 치료가 불가능한 경우가 많다. 더욱이, 치료 장치는 종종 부피가 커서 환자의 집에 설치하기 어려울 수 있다.
형질감염은 핵산이 진핵 세포로 도입되는 공정이다. 형질감염된 핵산이 연속적으로 발현될 수 있고, 딸(daughter) 세포로 전달될 수 있다는 점에서 형질감염은 안정할 수 있다. 대안으로, 형질감염은 일과성일 수 있으며, 이때 형질감염된 핵산은 형질감염 후 짧은 기간 동안만 발현되고, 딸 세포로 전달되지 않는다. 유전자 요법 분야에서 두 유형의 형질감염의 사용은 잘 알려져 있으며 [2], 질환 치료를 위한 약물로 작용하도록 환자의 세포로 치료요법적으로 핵산 전달을 전달하는 용도에 중점을 둔다. 예를 들면, 그 목적은 치료하지 않을 경우, 환자가 유전자 관련된, 그리고 유전된 질환을 앓게 될 수 있는 환자의 결함 유전자를 대체하는 것일 수 있다. 실험실 환경에서, 불사화된 세포주는 일반적으로 플라스미드 형태의 외인성 유전자로 형질감염되는 경우가 많다. 형질감염 후, 이렇게 성공적으로 형질감염된 세포는 해당 외인성 유전자를 발현시킬 것이다.
일과성 형질감염에서, 외인성 유전자 (전형적으로 담체 이를 테면, 폴리에틸렌이민 (PEI) 안에 포집됨)는 세포 집단으로 도입될 것이다. 이들 세포 일부가 성공적으로 형질감염될 것이고, 해당 외인성 유전자를 발현시키기 시작할 것이다. 짧은 시간이 지나면, 발현 수준이 떨어지고, 이들 세포는 전형적으로 처리되거나, 이 시점에서 폐기된다.
안정적 형질감염에서, 이들 세포는 상기와 같이 형질감염된다. 이들 세포의 일부는 안정적 방식으로 해당 외인성 유전자를 통합할 것이다. 안정적으로 형질감염된 세포들은 해당 외인성 유전자의 발현에 기초하여 세포 집단으로부터 단리되고, 선별될 수 있고, 이들 세포는 증식되어 더 오랜 기간에 걸쳐 해당 외인성 유전자를 발현시키는 불사화된 세포주를 생산하게 된다.
선행 기술방법에서 형질감염 효율 (즉, 외인성 유전자로 성공적으로 형질감염된 세포의 비율)은 전형적으로 낮다. 세포주의 형질감염 효율성을 높이기 위해 다수 전략(가령, 전기천공, 형질감염을 위한 특화된 시약들, 및 기타)이 채택되었다. 임의의 주어진 형질감염 프로토콜의 형질감염 효율을 개선하기 위해, 형질감염 프로토콜을 더 개선시키기 위한 장치 및 방법이 필요하다.
환자 자신의 면역 세포의 유전자 서열을 조작하여 환자의 신체 내의 특정 암세포를 인지하여 이를 공격하는 세포로 변형시키는 것이 최근 개발되었다[3]. 환자의 세포를 유전적으로 조작하는 접근 방식을 '유전자 요법'이라고 한다. 암 치료를 위한, 한 가지 유망한 유전자 요법의 방법은 T 세포의 유전자 조작으로써, T-세포가 암 조직 성장을 보다 효과적으로 표적화할 수 있도록 하는 키메라 항원 수용체를 발현하도록 한다. 이러한 세포는 키메라 항원 수용체 T-세포("CAR-T" 세포)로 알려져 있으며, 이 치료법은 "CAR-T 세포 요법"으로 알려져 있다. 면역 세포는 먼저 환자의 몸에서 제거된 다음, 이들 세포를 암을 찾는 킬러 세포로 전환시키는 생체외 형질감염 과정을 거친다. 그 다음, 상기 형질감염된 세포는 해당 환자의 암을 치료하기 위해 이 환자에게 다시-투여된다. 이들 세포의 형질감염은 전형적으로 외인성 유전 물질을 나노입자 또는 리포솜 담체와 같은 담체 분자와의 연합과 관련된 접근법을 사용하여 이루어진다.
통상적인 형질감염 과정의 예로는 표적 DNA를 인지질, 이중층 소포 또는 리포솜에 캡슐화시킨 다음, 진핵 세포 내로 투여하는 단계가 내포된다 [4]. 리포좀은 인지질로 구성되어 있기 때문에, 마찬가지로 인지질 이중층을 가지고 있는 진핵 세포막에 친화력이 있고, 따라서 이러한 시스템 융합이 있다. 따라서, 외부 DNA는 이러한 융합성 기전을 통해 진핵 세포로 전달되고, 이들 세포에 대한 염색체외 유전 정보가 될 수 있다. 단순한 기존의 형질감염 과정은 외인성 핵산(가령, 관심대상 유전자를 함유하는 DNA 플라스미드)을 양이온성 고분자(PEI)에 캡슐화하는 것과 관련된다[6]. 이러한 공정에는 잠재적으로 상당한 이점이 있지만, 이러한 기존 공정은 느리고, 형질감염 효율이 낮다. 이러한 방법들의 낮은 형질감염 효율은 낭비적이고, 시간 소모적이며, 비용이 많이 든다.
본 발명의 목적은 더 적은 비용으로 보다 표적화되고, 더 효율적인 방식으로 환자의 피부를 통해 작용제, 약물 및/또는 치료요법적 처리의 전달을 가능하게 하는 장치 및/또는 이의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자에게 작용제, 약물 및/또는 치료요법적 처리의 전달을 제공하는데 사용될 수 있는 장치 및/또는 사용 방법을 제공하는 것인데, 상기 장치는 쉽게 휴대할 수 있고, 및/또는 환자의 집에서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 목적은 상기 언급된 문제를 극복하도록, 진핵 세포에서 형질감염 효율, 세포내 전달 효율, 및/또는 단백질 발현을 개선시키는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 진핵 세포에서 형질감염 효율, 세포내 전달 효율, 및/또는 단백질 발현을 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 형질감염 및/또는 세포내 전달 효율을 강화시키는 장치 및/또는 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 동물 또는 인간에서 유전자 요법 및/또는 치료요법적 처치의 효과를 개선시키는 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 동물 또는 인간에서 유전자 요법 및/또는 치료요법적 처치의 효과를 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 바이러스 벡터 생산을 개선시키는 장치 및/또는 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 인간 및/또는 동물 세포에서 단백질 발현을 개선시키는 장치 및/또는 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 형질감염 물질 및/또는 세포내 전달 물질의 제조 및/또는 적용 속도가 개선되도록 하는 것이고, 또 다른 목적은 형질감염된 세포의 수율을 증가시키는 것이다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포내 전달을 개선시키는 방법이 제공되며, 전술한 방법에는 다음의 단계들이 내포된다:
a)
하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 및/또는 세포내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드(naked) 작용제를 제공하는 단계;
b)
상기 네이키드 작용제을 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시켜, 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 만드는 단계;
c)
상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 세포-내 전달 공정 또는 형질감염 공정을 거치게 하여 하나 또는 그 이상의 형질감염된 세포 또는 처리된 진핵세포가 형성되는 단계;
상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 형질감염 혼합물에서, 단계 b)의 의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 형질감염-후 형질감염된 또는 처리된 진핵세포에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 그리고 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
출원인은 형질감염 전, 후 및/또는 형질감염 동안 펄스된 전자기 (PEM) 신호의 투여로 상기 형질감염 및/또는 세포내 전달 공정에 의한 형질감염 효율, 세포내 전달 효율 및/또는 단백질 발현 수율이 상당히 증가된다는 놀라운 사실을 발견하였다. 상기 형질감염 및/또는 세포-내 전달율은 상당히 개선되고, 상기 작용제 및/또는 외인성 핵산을 함유하는 형질감염된 또는 처리된 세포의 빈도도 강화된다. 따라서, 본 발명은 세포 생존력, 유전자 전달, 형질감염율, 세포-외 환경으로부터 세포-내 환경으로 하나 또는 그 이상의 작용제의 세포-내 전달 및/또는 단백질 생산을 개선시키는 비-침습성, 비-화학적 접근방식을 제공한다. 본 발명은 세포 외부 환경으로부터 세포 안 내부 환경으로의 세포-외 물질 또는 작용제의 수송을 향상시킨다.
본원에서 사용된 "펄스된 전자기 신호(pulsed electromagnetic signals)"라는 용어는 기준선에서 더 높거나 또는 더 낮은 값으로 진폭이 변한 다음, 이어서 기준선으로의 복귀 또는 실질적으로 기준선으로 복귀되는, 전자기 스펙트럼 범위의 신호의 시퀀스 또는 패턴으로 정의된다. 더욱 바람직하게는, 신호 진폭의 변화는 신속하고, 일시적이며, 반복 시퀀스로 발생한다. 하나의 예시에서, 상기 기준선은 전자기 신호 소스 또는 전송 수단으로부터 방출되는 전자기 신호의 부재를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 기준선은 세포 및/또는 펄스 전자기 신호의 휴지(rest) 또는 이완(relaxation) 기간으로 간주된다.
바람직하게는, 상기 방법은 전적으로 시험관-내, 전적으로 생체-내, 또는 부분적으로 시험관-내 그리고 부분적으로 생체-내에서 실행될 수 있다. 예를 들면, 상기 진핵세포는 시험관-내 형질감염되고, 시험관-내 하나 또는 그 이상의 목적 또는 적용에 이용될 수 있다. 추가 예시에서, 상기 진핵세포는 환자로부터 추출되고, 시험관-내 형질감염되고, 그 다음 다시 이 환자에게 다시-도입될 수 있다 (즉, "생체-외" 방법과 호환 지칭됨). 대안으로, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제, 형질감염 혼합물 및/또는 혼합물은 환자에게 주사되거나, 그렇지 않으면 운송되고, 이 환자의 세포는 생체-내 형질감염된 및/또는 처리된 세포가 될 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 임의의 작용제, 및/또는 핵산, 약제학적 및/또는 치료요법적 작용제 또는 화합물중 임의의 것 또는 임의의 조합, 치료요법적 및/또는 약제학적 관심에 대한 작용제, 5 킬로달톤 미만의 소분자 또는 소분자 물질, 5 킬로달톤에 상응하는, 또는 이보다 더 큰 대분자 또는 대분자 물질, 하나 또는 그 이상의 단백질, 백신, 하나 또는 그 이상의 항체, 하나 또는 그 이상의 유기(organic) 작용제 및/또는 이와 유사한 것들이다.
용어 '약제학적 및/또는 치료요법적 작용제 또는 화합물'이란 바람직하게는, 특정된 의약 효과를 갖는, 임상에 배치되거나, 또는 배치하기 위해 개발 중인 화합물을 지칭한다.
용어 '치료요법적 및/또는 약제학적 관심 작용제'란 바람직하게는, 연구 및/또는 클리닉에서 사용을 위해 개발되었거나, 또는 사용하기 위해 조사 중인 화합물을 지칭한다. 이들 작용제 또는 화합물은 알려진 작용 기전을 가질 수 있지만, 임상적 적합성과 관련성은 입증되거나 또는 조사되지 않았을 수 있다. 일부 구체예들에서, 이들 작용제 또는 화합물의 작용 기전은 아직 밝혀지지 않았을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 기저 기전은 이들 작용제 또는 화합물을 세포내로 잘 전달한다.
한 실시예에서 상기 약제학적 및/또는 치료요법적 작용제는 안트라사이클린 약물, 이를 테면, 예를 들면 독소루비친; 화학요법 약물; 항-암 약물; 세포독성 약물, 이를 테면, 예를 들면 시스플라틴 및/또는 이와 유사한 것들이다.
바람직하게는, 본 명세서의 정의 내에서 네이키드 작용제라는 용어는 양친매성 구조체와 연합되지 않은 작용제를 의미한다. (일부 형질감염 프로토콜에서, 핵산 분자는 양친매성 구조체일 수 있는 담체 또는 구조체와 일반적으로 연합된다는 점에 유의해야 한다). "연관되지 않은(not-associated)"이라는 용어는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 네이키드 작용제가 하나 또는 그 이상의 양친매성 구조체에 제공되지 않고, 양친매성 구조체와 복합체를 형성하지 않고, 양친매성 구조체 상에 함유되지 않고, 및/또는 양친매성 구조체에 결합되지 않음을 의미한다.
본 발명에서, 이 방법 및 장치는 양친매성 구조체를 사용하지 않고, 기존 방법 및 장치보다 더 큰 효율로, 네이키드 작용제가 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 형질감염되도록 한다.
한 구체예에서, 상기 진핵세포에는 흡착 세포, 현탁 세포, 혈액 세포, T-세포, 림프구, 과립구, 대식세포 및/또는 이와 유사한 것들중 임의의 것 또는 임의의 조합이 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 진핵세포는 용액에 현탁되거나, 기질에 흡착되거나, 또는 현탁된 그리고 흡착된 세포의 혼합물이다.
일부 구체예들에서, 상기 진핵세포는 불사화된 세포이거나, 또는 불사화된 세포주로부터 파생된 세포다. 예를 들면, 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 인간 결장 종양 (HCT) 116 세포, 또는 Jurkat E6 세포.
일부 구체예들에서, 상기 진핵세포는 인간 또는 동물 대상체의 조직에 있는, 또는 이로부터 파생된 세포들이다. 예를 들면, 세포는 형질감염될 대상체로부터 추출할 수 있고, 그 다음 해당 대상체로 재-도입될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 진핵세포는 대상체의 혈액으로부터 유도될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 진핵세포는 T-세포, 림프구, 과립구, 대식세포 및/또는 기타 백색 혈액 세포다. 일부 구체예들에서, 상기 T-세포는 헬퍼 T-세포 또는 세포독성 T-세포중 임의의 것이거나, 또는 임의의 조합이다. 일부 구체예들에서, 상기 T-세포는 CD4+ 세포독성 T 림프구 및/또는 CD8+ 세포독성 T 림프구를 포함한다.
본 발명의 상기 장치 및 방법의 한 가지 예시적인 용도는 소위 'CAR-T' 세포 생성이 연루된 채택성 T-세포 요법 (ACT)이다. 이러한 기술에서, 상기 장치 및/또는 방법을 대상체로부터 유도된 T-세포 상에서 이용한다. 이들 세포를 배양하고, 시험관내 에서 형질감염시켜, 키메라 항원 수용체를 발현시키고, 그 다음 시험관내 에서 확장시킨 후, 해당 환자에게 재도입시킨다. 본 장치 및/또는 방법은 상기 형질감염 효율을 개선시키고, 따라서 더 높은 수율의 CAR-T 세포를 제공한다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 인간 또는 동물 신체 상에서 수행되는 치료 또는 외과술 방법이 아닐 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 인간의 생식선 유전적 정체성을 변형시키는 방법이 아닐 수 있다.
한 구체예에서, 단계 a)는 오로지 상기 네이키드 작용제 (즉, 임의의 다른 작용제, 담체 배지 및/또는 조성물을 배제하고)로만 구성된다.
한 구체예에서, 상기 방법에는 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제에 하나 또는 그 이상의 다른 작용제, 담체 작용제, 용매, 비-양친매성 비히클, 가용성 작용제 및/또는 이와 유사한 것들을 혼합하는 단계가 내포되며, 그 다음 이를 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시킨다. 예를 들면, 상기 하나 또는 그 이상의 다른 담체 작용제 또는 가용성 작용제에는 물, 완충 용액, Tris-EDTA, 인산 완충 식염수(PBS), 에탄올, 무극성 또는 비-양성자성 제제 및/또는 이와 유사한 것들중 임의의 것 또는 임의의 조합이 내포될 수 있다. 담체 제제라는 용어는 적어도 하나의 네이키드 작용제가 용해되거나, 현탁되거나, 이와 혼합되거나 및/또는 이와 유사한 것들과 혼합될 수 있음을 의미한다.
바람직하게는 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 핵산이거나, 또는 핵산이 내포된다. 바람직하게는, 상기 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA)이며, 또는 DNA와 RNA의 조합 (예를 들면, DNA/RNA 하이브리드 올리고뉴클레오티드)을 포함한다. 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제가 RNA이거나, 또는 RNA를 포함하는 경우, 이 작용제는 바람직하게는 mRNA, tRNA, siRNA, miRNA 및/또는 이와 유사한 것들일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터이거나, 또는 이를 내포한다. 예를 들면, 상기 하나 또는 그 이상의 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 발현시킬 의도의 하나 또는 그 이상의 외인성 유전자를 포함하는 하나 또는 그 이상의 DNA 플라스미드일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제가 핵산이거나, 또는 핵산이 내포될 때, 상기 형질감염 공정으로 안정적 발현이 결과되며, 이는 상기 형질감염된 세포에서 형질감염된 핵산이 연속적으로 발현되고, 딸 세포로 계대된다.
한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제 가 핵산이거나, 또는 핵산이 내포될 때, 상기 형질감염 공정으로 일과성 발현이 되면, 상기 형질감염된 핵산은 상대적으로 짧은 기간 동안에만 발현되고, 따라서 딸 세포로 계대되지 않는다.
한 구체예에서, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제 가 핵산이거나, 또는 핵산이 내포될 때, 상기 방법은 형질감염 공정 후 이들 하나 또는 그 이상의 진핵세포를 단리하는 단계, 상기 하나 또는 그 이상의 단리된 진핵세포 또는 이의 후손에서 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제에 의해 인코드된 하나 또는 그 이상의 펩티드의 발현 수준을 테스트하는 단계, 그리고 이 발현 수준을 기반으로 하나 또는 그 이상의 단리된 진핵세포 또는 이의 후손을 선별하는 단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계는 실온 (이를 테면, 예를 들면, 20℃)에서 실행되거나, 또는 실온 이상의 온도 (이를 테면, 예를 들면, 37℃에서)로 설정된 인큐베이터에서 실행된다.
한 구체예에서, 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계는 사전-결정된 기간 동안 실행된다. 하나의 예시에서, 단계 a)에서 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기 전, 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제에서 디렉팅될 때, 이들 세포가 펄스된 전자기 신호를 수용하는 시간은 대략적으로 15 분이거나 또는 최대 15 분이다. 그러나, 필요하다면, 더 길거나 또는 더 짧은 기간이 사용될 수 있다는 점을 이해할 것이다.
한 구체예에서, 단계 c)에서 형질감염된 세포 및/또는 처리된 세포를 형성하기 위해 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물에 디렉팅될 때 및/또는 상기 형질감염 단계 후 디렉팅될 때, 이들 세포가 펄스된 전자기 신호를 수용하는 사전-결정된 기간은 대략적으로 1~4 시간이거나, 또는 이 사이의 기간이며, 더 바람직하게는, 대략적으로 3~4 시간이다. 그러나, 필요하다면, 더 길거나 또는 더 짧은 기간이 사용될 수 있다는 점을 이해할 것이다. 예를 들면, 한 구체예에서, 상기 사전-결정된 기간은 최대 16 시간, 또는 최대 24 시간일 수 있다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 하나 또는 그 이상의 전자 장치에 의해 생성된다.
바람직하게는, 상기 하나 또는 그 이상의 전자 장치에는 펄스된 전자기 신호를 생성하고 및/또는 사용 중 이를 전송하기 위한 전송 수단이 내포된다.
바람직하게는, 상기 전송 수단에는 하나 또는 그 이상의 전자 전송 칩들이 내포되며, 상기 하나 또는 그 이상의 전자 전송 칩들은 사용 시, 하나 또는 그 이상의 펄스된 전자기 신호를 생성하고, 방출하고, 및/또는 전송하도록 배열된다.
한 구체예에서, 전송 수단 또는 하나 이상의 전자 전송 칩에 대한 참조는 하나 또는 그 이상의 전송기, 하나 또는 그 이상의 전송기 및 하나 또는 그 이상의 수신기, 또는 하나 이상의 송수신기들이 내포될 수 있다. 따라서, 하나의 예시에서, 상기 펄스된 전자기 신호는 중앙 위치 또는 마스터 전송기로부터 전송될 수 있고, 후속 재-전송 또는 이로부터 방출을 위한 하나 또는 그 이상의 먼거리 및/또는 슬레이브(slave) 수신기 및/또는 송수신기로 받을 수 있다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치는 단일 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 갖는다. 이러한 단일 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 하나의 예시에서, 조직 배양 플레이트로 펄스된 전자기 신호를 공급하는데 충분하다. 예시적인 하나의 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 현탁된 세포를 함유하는 바이오리엑터에 부착되거나, 또는 통합된 단일 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 제공된다. 이러한 바이오리엑터는 교반기로 현탁액을 교반시켜 작동되며, 배지에서 이렇게 현탁된 세포들은 전형적으로 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 통과하고, 따라서 본 발명의 펄스된 전자기 신호에 노출될 것이다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치는 두 개 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 갖는다. 바람직하게는, 상기 두 개 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 해당 전자 장치에서 서로 서로 사전-결정된 공간적 거리를 두고 배열된다.
바람직하게는, 이러한 사전-결정된 공간적 거리는 원하는 효과 (즉, 형질감염 효율 형질감염 및/또는 세포-내 전달 효율을 증가)를 얻기 위한 및/또는 사용 시, 전자기 방사(radiation)/신호의 일정한 또는 실질적으로 일정한 분포를 제공하기 위한 충분한 신호 강도로 전자기 펄스된 신호로 펄스되는 하나 또는 그 이상의 항목 또는 줄질을 제공하게 한다.
바람직하게는, 상기 전자 장치는 사전-결정된 패턴 및/또는 어레이(array)에서 배열된 다수의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 갖는다.
단일 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 본 발명의 유익한 장점을 제공하는데 충분한 하지만, 한편으로 다수의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 보유함으로써 상기 펄스된 전자기 신호는 최대 효과를 여전히 유지하면서 더 광범위한 표면 영역을 통하여 전달될 수 있다는 점을 발견했다. 고르게 분포된 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 갖는 경우, 최적의 효과를 위한 충분한 적용 범위를 갖기 위해서는 18.5cm2 마다 적어도 하나의 칩이 이어야 한다.
일부 구체예들에서, 상기 장치는 하나 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 장치는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면적 대략적으로 105 ~ 115cm2, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면 대략적으로 110cm2 마다 한 개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 있다.
일부 구체예들에서, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면적 대략적으로 50 ~ 60cm2, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면 대략적으로 55cm2 마다 한 개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 있다.
일부 구체예들에서, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면적 대략적으로 25 ~ 30cm2, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면 대략적으로 27.5cm2 마다 한 개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 있다.
일부 구체예들에서, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면적 대략적으로 15 ~ 20cm2, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면 대략적으로 18.5cm2 마다 한 개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 있다.
일부 구체예들에서, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면적 대략적으로 10 ~ 15cm2, 상기 장치의 하우징 표면 또는 본원에서 정의된 품목의 표면 대략적으로 12.2cm2 마다 한 개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 상기 품목은 바람직하게는, 세포 배양 플레이트, 플라스크, 롤러 병, 및 당업자에게 공지된 기타 용기들을 포함한다. 예를 들면, 하기에서 기술된 바와 같은 실험실 표준 마이크로플레이트, T25, T75, T125, T175, T225, 및 더 큰 세포 배양 플레이트. 상기 하나 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 사용 중인 장치에 배치된 이러한 용기의 표면적에 따라 및/또는 장치의 하우징 표면을 기반으로 사전- 결정된 공간 만큼 거리를 두도록 설정된다.
예시적인 구체예에서, 실험실 표준 마이크로플레이트가 배치될 때, 이 상치 안에는 6개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 제공된다. 이들 실험실 표준 마이크로플레이트는 6-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 (및 그 이상) 플레이트로 제공된다. 이들 마이크로플레이트는 길이가 대략적으로 128mm이며, 폭은 85mm인, 일반적으로 표준화된 크기를 갖고, 따라서 해당 플레이트는 대략적으로 110cm2의 표면적을 갖는다. 따라서, 상기 예시적인 구체예에서, 6개 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 본 발명에 따른 펄스된 전자기 신호로 이들중 임의의 유형을 제공하기 위한 최적의 사전-결정된 공간을 제공하기 위해 고르게 공간적으로 배치될 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 전자 장치에는 6개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 내포된다. 바람직하게는, 사용 시, 상기 전자 장치 상에 또는 이 장치와 관련하여 24 웰 플레이트가 배치될 때, 상기 6개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 서로 사전-결정된 거리만큼 떨어져 배열되어 있고, 각 전송 수단 또는 칩은 충분히 강한 전자기 신호를 방출할 수 있거나, 및/또는 해당 플레이트의 4개 웰로 디렉팅된다.
더 바람직하게는, 상기 전송 수단 또는 전송 칩은 중앙 위치 또는 실질적으로 중앙 위치에서 이 24-웰 플레이트의 4개 웰에 인접하게 위치한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 요구될 경우, 이들 다수의 전송 수단 또는 전자 전송 칩의 공간두기는 최적화되어야만 한다. 각 전송 수단 또는 전자 전송 칩 간의 최적의 사전-결정된 공간을 얻기 위해, 상기 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 사용될 전자기 방사(radiation) 주파수의 파장의 절반과 대등한 거리, 또는 실질적으로 대등한 거리에 위치해야 한다. 바람직하게는, 이 거리는 이 장치의 일부분으로 함께 이용될 두 개 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩의 임의의 방향 평면과 관련있는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 만약 파장이 12.4cm인 경우, 사용 시 최적의 전자기장을 생성하려면, 이 전송 칩들은 대략적으로 6.2cm 간격으로 배치해야 되어야 한다.
하나의 예시에서, 상기 사전-결정된 공간적 거리 = 파장/2이다.
하나의 예시에서, X-축 및/또는 Y-축에서 상기 사전-결정된 공간적 거리는 균등하게 이격된 그리드에서 각 전송 수단 또는 전자 전송 칩 간의 파장의 절반이다. 이러한 배열은 상쇄적 간섭 위험을 최소화시킨다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에는 하우징이 내포되며, 상기 하나 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전송 칩은 전술한 하우징 내에 배치된다.
바람직하게는, 상기 하우징에는 사용 중인 펄스 전자기 신호를 수신하는 하나 이상의 품목에 대해 해당 하우징이 안정적인 방식으로 위치될 수 있도록 하는 적어도 하나의 편평한- 또는 평면의 표면이 내포된다. 대안으로, 상기 하우징에는 사용 중인 펄스 전자기 신호를 수신하는 하나 이상의 품목에 대해 해당 하우징이 안정적인 방식으로 위치될 수 있도록 하는 하나 또는 그 이상의 곡선 또는 비-평면적 표면이 내포될 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 하우징의 적어도 하나의 표면에는 사용 중인 펄스 전자기 신호를 수신하는 상기 하나 또는 그 이상의 품목의 위치를 위한 하나 또는 그 이상의 리세스(recesses)가 내포된다.
하나의 예시에서, 상기 전자 장치는 실험실에서 사용하기 위한 형질감염 플레이트라고 지칭된다.
한 구체예에서, 상기 하우징에는 사용 중인 표면 상에 이 하우징이 직접 또는 간접적으로 지지될 수 있게 하는 바닥 표면이 내포된다. 더 바람직하게는, 상기 하우징에는 상기 바닥 표면에 대향하여 상부 표면이 내포된다. 바람직하게는, 상기 상부 표면은 사용시 펄스된 전자기 신호를 수신하는 하나 또는 그 이상의 품목이 배치될 수 있는 표면이다.
하나의 예시에서, 상기 하나 또는 그 이상의 품목은 진핵 세포가 배양될 수 있는, 당업자에게 공지된 세포 배양 플레이트 또는 플라스크일 수 있다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치 및/또는 하우징은 용기, 반응 용기 및/또는 이와 유사한 것들의 외측 표면에 부착가능하다. 예를 들면, 상기 전자 장치 및/또는 하우징은 나사, 너트 및 볼트, 자석, 타이(ties), 클립, 스트랩, 상호-채결 부재(inter-engaging members), 접착제, 용접, 및/또는 이와 유사한 것들중 하나 또는 그 이상의 임의의 것 또는 임의의 조합을 비롯한, 하나 또는 그 이상의 부착 수단 또는 장치를 통하여 부착될 수 있다.
바람직하게는, 사용되는 하우징 또는 전자 장치 상에, 이들 안에, 또는 이들과 관련하여 배치될 때, 상기 하우징의 상부 표면 및/또는 상기 전송 수단과 상기 펄스된 전자기 신호를 수신하는 하나 또는 그 이상의 품목 간의 거리는 대략적으로 25cm 또는 그 미만, 20cm 또는 그 미만, 15cm 또는 그 미만, 10cm 또는 그 미만 또는 5cm 또는 그 미만이다. 더 바람직하게는, 상기 거리는 대략적으로 1cm이다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 사전-결정된 펄스 시퀀스로 제공된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치는 대략적으로 2.2-2.6GHz 범위의 주파수에서 펄스된 전자기 신호를 전송하도록 배열되고, 그리고 더 바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 대략적으로 2.4 GHz +/-50MHz 또는 그 이상의 주파수, 바람직하게는, 2.45 GHz +/-50MHz의 주파수로 전달된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치는 2.4 ~ 2.4835GHz, 바람직하게는 2.45GHz +/- 50MHz의 산업, 과학 및 의료용 무선 주파수 대역 (ISM 대역) 범위 내의 주파수에서 펄스 전자기 신호를 전송하도록 배열된다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 대략적으로 15 Hz 또는 그 미만, 50Hz 또는 그 미만, 더 바람직하게는, 대략적으로 25Hz 또는 그 미만, 그리고 여전히 더 바람직하게는, 대략적으로 15Hz 또는 그 미만의 주파수로 펄스된다.
바람직하게는, 펄스된 전자기 신호의 각 펄스는 대략적으로 1ms~20ms 동안 지속된다. 더 바람직하게는, 각 펄스는 대략적으로 1ms 동안 지속된다.
바람직하게는, 펄스 간의 기간 ("휴지 주기" 또는 "이완 주기"로 지칭됨)은 대략적으로 66ms 또는 그 미만이다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 듀티 사이클(duty cycle)은 2% 미만이다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에서 각 전송 수단 또는 칩에 의해 제공되는 전송 파워은 +2dBm ~ +4dBm, 대략적으로 1mW, 대략적으로 2mW 또는 대략적으로 2.5119mW이다.
한 구체예에서, 상기 펄스된 전자기 신호의 사전-결정된 주파수는 대략적으로 2.2~2.6GHz, 2.4GHz +/- 50MHz 또는 2.45GHz +/-50MHz이며, 상기 사전-결정된 펄스율은 대략적으로 15Hz이거나, 또는 2% 미만의 사용율을 갖고, 그리고 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제가 핵산이거나, 또는 핵산이 내포될 때 추가 임의선택적으로 상기 사전-결정된 파워는 +2dBm ~ +4dBm, 1대략적으로 1mW, 대략적으로 2mW 또는 대략적으로 2.5119mW이다.
이론에 결부되지 않고, 본 발명의 장치 또는 방법에 사용되는 전자기파 또는 신호의 사용은 상대적으로 긴 휴식 또는 이완 주기를 갖는, 이의 쌍극자 주위에서 주기적으로 H2O를 회전시키기에 충분하다고 생각된다. H2O의 주기적인 회전은 진핵 세포의 인지질 이중층 및/또는 세포 막에서 수소 결합을 방해하는 것으로 생각된다. 따라서, 세포막의 이러한 주기적 또는 간헐적 저-에너지 섭동은 작용제, 일부 분자, 및/또는 세포막 및 이들의 환경과의 상호작용, 이를 테면, 예를 들면 핵산과 세포 막과의 상호작용 증가를 자극하는 것으로 생각된다. 이것은 세포막을 통한 작용제의 수송을 강화시켜, 하나 또는 그 이상의 진핵 세포에 의한 하나 또는 그 이상의 작용제 이를 테면, 핵산, 펩티드, 소분자 및 기타 작용제의 흡수를 증가시키는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 형질감염 및/또는 세포-내 전달 공정은 매우 낮은 에너지 전자기 파 또는 신호를 이용하여 상당히 개선될 수 있음을 볼 수 있다. 펄스 전자기 신호들의 펄스 간의 비교적 긴 휴식 또는 이완 주기는 세포 무결성을 유지시키는데 충분하다고 생각된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 펄스 전자기 신호, 파동 또는 필드의 사용으로 세포막을 가로질러 분자의 개선된 수송을 제공하는 것으로 생각되며, 앞서 정의한 작용제의 보다 효율적인 형질감염 및/또는 세포내 전달로 이어진다.
바람직하게는, 0.45 ~ 0.55의 Gaussian Frequency Shift Keying (GFSK)를 사용하여 상기 펄스된 전자기 신호가 전송된다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 무선 주파수 (RF) 데이터 신호다.
바람직하게는, 상기 펄스된 전자기 신호는 펄스 전자기 신호의 디지털 시퀀스다.
바람직하게는, 상기 무선 주파수 신호는 Bluetooth LE(BLE) 프로토콜의 광고 기능을 활용한다. 바람직하게는, 광고 RF 신호는 각각 주파수 2402MHz, 2426MHz, 2480MHz에 해당하는 채널 37, 38 및 39에 있다.
한 구체예에서, 상기 펄스된 전자기 신호는 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제, 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물 및/또는 형질감염-후 또는 처리-후 혼합물을 비롯한, 수성 매질로 디렉팅된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에는 사용 시 이 장치에 전력을 공급하기 위한 전원 공급 수단이 내포된다. 바람직하게는, 전력 공급 수단에는 주요 전력 공급, 하나 또는 그 이상의 배터리, 파워 셀, 하나 또는 그 이상의 재충전가능한 배터리, 전기 제너레이터 수단 및/또는 이와 유사한 것들이 내포된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에는 사용시 전자 장치 및/또는 전송 수단의 동작을 제어하기 위한 제어 수단이 내포된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에는 하나 또는 그 이상의 회로 보드가 내포된다. 바람직하게는, 상기 전송 수단은 일반적으로 집적 회로의 형태의 하나 또는 그 이상의 회로 보드에 제공될 수 있고 및/또는 다른 구성 요소들, 예를 들어, 메모리 수단이 배치된다.
한 구체예에서, 상기 전자 장치에는 메모리 수단, 이를 테면, 메모리 장치, 데이터 저장 장치 및/또는 이와 유사한 것들이 내포된다.
바람직하게는, 상기 전자 장치의 다른 구성 요소에는 이 장치의 선택적인 작동에 필요한 하나 또는 그 이상의 구성 요소들과 그리고 활성화되면 펄스형 전자기 신호를 생성하기 위해 이 장치의 제어된 작동에 요구되는 요소들이 내포된다. 예를 들면, 사용 중인 장치의 하나 또는 그 이상의 조건, 작동 및/또는 하나 또는 그 이상의 매개변수를 사용자가 선택할 수 있도록 장치에 사용자 선택 수단이 제공될 수 있고; 하나 또는 그 이상의 설정, 선택 옵션 및/또는 이와 유사한 것들을 도시하는 디스플레이 수단이 제공될 수 있다.
한 구체예에서, 전술한 추가 구성요소들, 또는 전원 공급 수단에는 하나 또는 그 이상의 파워 쎌이 내포되며, 이것은 모두 하우징 내에 함유될 수 있다.
한 구체예에서, 전자 장치의 하우징은 해당 전자 장치가 용기와 체결되도록 또는 용기에 대해 위치할 수 있는 형태로 제공되고, 여기에서 사용시 전자기 신호에 노출될 재료 및/또는 하나 또는 그 이상의 품목이 위치한다.
한 구체예에서, 제어 수단에는 상기 펄스 전자기 신호의 신호 주파수, 신호 강도, 신호 파워, 신호 펄스율, 신호 펄스의 시간 주기 및/또는 이와 유사한 것들중 임의의 것 또는 임의의 조합을 사용자가 선택할 수 있도록 옵션이 내포된다. 한 구체예에서, 주파수, 강도, 파워, 맥박수, 펄스 시간 주기, 기타 매개변수 및/또는 이와 유사한 것들의 선택은 사용 시 펄스 전자기 신호 노출될 재료 및/또는 하나 또는 그 이상의 품목, 전술한 재료의 양, 사용을 위해 장치가 위치하는 용기의 크기 및/또는 기타 매개변수와 관련하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 것과 같은 펄스 신호에 노출된 세포는 펄스 기술이 사용되지 않고, 세포 덩어리가 관찰되는 형질감염 또는 처리와 대조적으로, 시험관내 형질감염 또는 처리 동안 이들 세포의 균일하거나 또는 실질적으로 균일한 분포 또는 분산을 제공하는 것으로 밝혀졌다[1].
본 발명의 측면에 따르면, 진핵 세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 효율을 개선시키는 장치가 제공되며, 전술한 장치에는 하우징, 사용시 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것 또는 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 전송하도록 정렬된 전술한 하우징에 위치한 전송 수단, 사용시 적어도 상기 전송 수단의 작동을 제어하는 제어 수단, 그리고 사용시 상기 전송 수단 및/또는 제어 수단에 전력을 제공하는 전력 공급 수단이 내포된다.
바람직하게는, 상기 장치의 하나 또는 그 이상의 사전-결정된 매개변수는 해당 장치의 제조업체에 의해 미리 설정될 수 있고 및/또는 사용자의 요구 사항에 따라 사용자가 선택할 수 있다.
바람직하게는, 사용자가 선택 가능한 미리 결정된 매개변수 중 하나 또는 그 이상을 사용자가 선택할 때 상기 제어 수단 사용된다.
한 구체예에서, 상기 장치는 펄스 전자기 신호가 사람의 신체에서 형질감염 공정 또는 처리 공정 개선용으로 사용되는 사람의 신체 부위를 향하도록 하기 위해 사람의 피부에 직접 또는 간접적으로 착용하도록 배열된다. 이 구체예에서, 상기 장치는 바람직하게는, 착용식 장치다.
한 구체예에서, 상기 장치가 사용자의 피부 또는 신체의 외부, 사용 시 사용자가 착용하는 의복 또는 품목의 내부 및/또는 외부, 및/또는 사람의 신체에서 일어나는 형질감염 또는 처리 공정을 개선하기 위한 이와 유사한 것들에 탈부착가능도록, 부착 수단은 이 장치 상에 제공되거나, 및/또는 이 장치와 연합될 수 있다.
예시적인 구체예에서, 상기 장치는 착용식 장치, 예를 들면, 암밴드(armband)이며, 이 암밴드는 예를 들면, 환자에게 투여되는 DNA 또는 RNA 백신 주사 부위에 바로 배치된다.
예시적인 구체예에서, 대상체에게 상기 백신을 주사하고, 이 주사 부위에 본 발명의 장치를 배치시키고, 이 주사 부위로 발명에 따른 펄스된 전자기 신호를 공급하는 것을 포함하는 백신 투여 방법이 있다.
바람직하게는, 장치 및/또는 상기 전송 수단 또는 하나 또는 그 이상의 전자 전송 칩이 상기 장치에 배열되어, 상기 펄스된 전자기 신호가 사용시 사용자의 피부 또는 신체로 디렉팅된다. 예를 들면, 상기 펄스된 전자기 신호는 상기 하우징의 제 1 표면을 통하여 디렉팅될 수 있고, 전술한 제 1 표면은 사용자의 피부와 직접 또는 간접 접촉하도록 배열된다.
한 구체예에서, 상기 장치는 인체에 또는 사용자의 피부 아래 이식할 수 있도록 배열된다. 예를 들면, 상기 장치는 치료가 필요한 사람의 신체 부위에 이식될 수 있다. 이 구체예에서, 상기 장치는 바람직하게는, 임플란트다.
바람직하게는, 적어도 이 장치의 외부 케이싱은 사람의 신체에 이식하기에 적합한 재료로 코팅되거나, 및/또는 형성된다.
바람직하게는, 상기 부착 수단에는 스트랩, 타이, 목걸이, 펜던트, 벨트, 팔찌, 클립, 열쇠고리, 랜야드(lanyards), VELCRO®(후크 및 루프 고정), 프레스 스터드(press studs), 버튼, 버튼 홀, 접착제, 석고, 봉합사, 클립, 생체- 적합성 접착제 및/또는 이와 유사한 것들이 내포된다.
한 구체예에서, 상기 장치에는 사용 중인 사람에게 각각 형질감염될 형질감염 시약을 보유하거나 또는 함유하기 위한 적어도 하나의 보유 수단 또는 저장소가 제공된다.
바람직하게는, 상기 보유 수단 또는 저장소는 사용 중인 사람의 피부에 위치하거나, 및/또는 인접하여 위치할 수 있도록 장치에 배열된다. 상기 펄스된 전자기 신호는 사람의 피부를 통해 사람의 하나 또는 그 이상의 세포로의 작용제의 흡수, 전달 및/또는 형질감염을 개선하는 데 도움이 되도록 사람의 신체의 하나 또는 그 이상의 부분으로 디렉팅될 수 있다.
한 구체예에서, 펄스 전자기 신호를 사용자 피부로 디렉팅시키는 것은 사용 중인 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제의 흡수를 증가 및/또는 개선할 수 있도록 사용자 피부의 투과성을 변형시키는 것으로 생각된다. 전형적으로, 피부 투과성 변형은 적어도 펄스 전자기 신호가 사용자의 피부로 디렉팅되는 기간 동안 발생한다. 전형적으로, 사용자 피부의 투과성 수정은 유지되지만, 펄스 전자기 신호 방출이 중단되면 시간이 지남에 따라 감소된다.
한 구체예에서, 펄스 전자기 신호의 강도 및 범위는 이 전자 장치의 하우징이 사용자 피부의 일부에 위치할 때, 펄스 전자기 신호가 피부를 통해 사용자의 신체를 통과하도록, 바람직하게는 전술한 사용자의 피부 부분에 바로 인접한 내부 영역에 적어도 인접하여 통과하는데 충분하다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 효율을 증가시키는 방법 및/또는 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 효율을 증가시키는 장치가 제공된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 형질감염된 또는 비-형질감염된 진핵세포에서 단백질 발현을 증가시키는 방법 및/또는 형질감염된 또는 비-형질감염된 진핵세포에서 단백질 발현을 증가시키는 장치가 제공된다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 생체-내 유전자 요법을 제공하는 방법이 제공되며, 전술한 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a)
하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드 작용제를 제공하는 단계;
b)
상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 환자에게 도입 또는 주사하여, 이 환자의 생체-내 하나 또는 그 이상의 세포가 상기 형질감염 혼합물에 의해 형질감염 또는 처리되는 단계;
상기 방법에는 단계 a)에서 상기 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 디렉팅하거나 또는 주사하기 전 상기 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제에서 , 단계 b)에서 해당 환자에게 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 디렉팅하는 동안 또는 주사하는 동안 해당 환자에서 및/또는 b)에서 형질감염 또는 처리 단계 후 환자에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 그리고 사전 결정된 파워 중 임의의 것 또는 임의의 조합으로 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포된다.
바람직하게는, 해당 환자에게 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 도입시키는 방법에는 경구, 경피, 피하 및/또는 및/또는 이와 유사한 것들이 내포된다.
본 발명의 한 측면에 따르면, 시험관-내 유전자 요법을 제공하는 방법이 제공되며, 전술한 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a)
하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드 작용제를 제공하는 단계;
b)
상기 적어도 하나의 네이키드 작용제를 이 방법 이전에 환자로부터 취한 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시킴으로써, 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 형성하는 단계;
c)
상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 세포-내 전달 공정 또는 형질감염 공정을 거치게 하여 하나 또는 그 이상의 형질감염된 세포 또는 처리된 진핵세포가 형성되는 단계;
상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 형질감염 혼합물에서, 단계 b)의 의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 형질감염-후 형질감염된 또는 처리된 세포 혼합물 또는 처리 단계에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 그리고 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 추가 측면에 따르면 진핵세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포내 전달을 개선시키는 방법이 제공되며, 전술한 방법에는 다음의 단계들이 내포된다:
a)
형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 네이키드 핵산 또는 안트라사이클린 약물을 제공하는 단계;
b)
상기 네이키드 핵산 또는 안트라사이클린 약물을 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 추가하여 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 만드는 단계;
c)
상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형질감염 공정 또는 세포-내 전달 공정을 거치게 하여 하나 또는 그 이상의 형질감염된 세포 또는 처리된 진핵세포가 형성되는 단계;
상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 상기 네이키드 핵산 또는 안트라사이클린 약물에서, 단계 b)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 형질감염-후 또는 세포-내 전달 단계 후, 형질감염된 또는 처리된 세포 혼합물 또는 처리 단계에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 그리고 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
환자의 세포가 상기 방법에 따라 형질감염되었거나, 또는 치료되면, 필요에 따라 환자 또는 다른 환자에게 이들 세포를 선택적으로 다시-도입시킬 수 있다.
본 발명의 측면에 따르면, 진핵 세포에서 유전자 요법 준비를 지훤하기 위한 장치가 제공되며, 전술한 장치에는 하우징, 사용시 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것 또는 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 전송하도록 정렬된 전술한 하우징에 위치한 전송 수단, 사용시 적어도 상기 전송 수단의 작동을 제어하는 제어 수단, 그리고 사용시 상기 전송 수단 및/또는 제어 수단에 전력을 제공하는 전력 공급 수단이 내포된다.
본 발명의 추가 측면에 따르면, 유전자 및/또는 단백질 발현를 변경시키는 방법에 제공되며, 전술한 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
- 하나 또는 그 이상의 진핵세포를 제공하는 단계;
상기 방법에는 전술한 하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 유전자 발현 및/또는 단백질 발현을 변경시키기 위해 이들 진행 세포에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 그리고 사전-결정된 파워중 임의의 것 또는 임의의 조합에서 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다.
한 구체예에서, 상기 방법은 암 세포를 사멸시키고, 건강한 세포 및 조직에서 DNA 복구를 증가시킨다.
한 구체예에서, 상기 장치는 환자에게 이식가능한, 이를 테면, 예를 들면, 암 조직을 치료하기 위해 암 조직에, 또는 암조직에 인접한 영역에 이식가능하다. 이 방법은 암 조직이 환자의 피부에서 더 멀리 떨어져 있는 경우에 유용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 장치는 환자에 의해 착용되고, 하나 또는 그 이상의 약제 또는 약물을 암 조직, 예를 들어, 흑색종과 같은 피하 종양 부근에 위치하는 조직으로 전달하거나, 및/또는 바이러스 치료를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 상기 장치는 환자의 피부를 통해 펄스형 전자기 신호를 전달하여, 세포의 DNA와 직접 상호작용하여 암세포의 세포사멸을 촉진하고, DNA 손상을 복구하기 위해 건강한 세포를 생성하는 데 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 장치는 항-바이러스 효과를 제공하기 위해 환자의 피부를 통해 펄스 전자기 신호를 전달하는 데 사용된다.
본 발명의 한 측면에서, 본원에 정의된 방법 중 임의의 하나의 방법을 사용하여 생산된 세포 또는 이의 자손이 제공된다.
본원에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 효율의 개선에 대한 언급은 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제에 의해 형질감염된 또는 처리된 세포 수의 증가 및 형질감염 공정-후 및/또는 세포-내 전달 공정-후 세포 생존력의 증가 또는 유지를 지칭한다는 것을 주지해야 한다.
본 발명은 실험실 기반 환경에서 사용될 수 있거나 또는 산업 수준 환경에서 사용되도록 확장될 수 있음을 이해할 것이다.
이제 본 발명의 특정 구체예들이 첨부 도면을 참조하여 설명되고; 여기서
도 1a 및 1b는 본 발명의 한 구체예에 따른 장치 도면을 나타내고;
도 2a 및 2b는 본 발명의 제 2 구체예에 따른 장치 도면을 나타내고;
도 3은 본 발명의 추가 구체예를 나타내고;
도 4a 및 4b는 본 발명의 또 다른 실시예의 입면도를 도시하고;
도 5a 및 5b는 한 구체예에서 본 발명을 활용하는 시도를 도시하고;
도 6은 본 발명의 한 구체예에서 장치를 도시하는데, 이때 상기 전자 장치에는 하나의 예시에서 상기 전자 장치에 이용될 수 있는 24개-웰 플레이트의 예와 함께, 6개 전송기 칩 어레이가 내포되며;
도 7은 본 발명에 따른 실험으로부터의 웨스턴 블롯을 보여주고;
도 8은 본 발명에 따른 실험으로부터의 추가 웨스턴 블롯을 보여준다.
도 1a 및 1b는 본 발명의 한 구체예에 따른 장치 도면을 나타내고;
도 2a 및 2b는 본 발명의 제 2 구체예에 따른 장치 도면을 나타내고;
도 3은 본 발명의 추가 구체예를 나타내고;
도 4a 및 4b는 본 발명의 또 다른 실시예의 입면도를 도시하고;
도 5a 및 5b는 한 구체예에서 본 발명을 활용하는 시도를 도시하고;
도 6은 본 발명의 한 구체예에서 장치를 도시하는데, 이때 상기 전자 장치에는 하나의 예시에서 상기 전자 장치에 이용될 수 있는 24개-웰 플레이트의 예와 함께, 6개 전송기 칩 어레이가 내포되며;
도 7은 본 발명에 따른 실험으로부터의 웨스턴 블롯을 보여주고;
도 8은 본 발명에 따른 실험으로부터의 추가 웨스턴 블롯을 보여준다.
본 발명의 제 1 구체예에서, 환자에게 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 치료요법적 방법을 제공하기 위한 진핵 세포에서 하나 또는 그 이상의 작용제의 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달을 개선시키기 위해, 환자에게 약제학적 및/또는 치료요법적 작용제의 전달을 증가시키기 위해, 유전자 발현, 단백질 발현 및/또는 이와 유사한 것들의 발현을 증가 및/또는 감소시키기 위해, 전자 장치 형태의 장치(301)가 제공된다.
상기 장치는 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율로, 사전-결정된 파워 수준에서 사전-결정된 기간 동안 펄스 전자기 신호를 방출할 수 있다. 상기 사전-결정된 매개변수는 제조업체에서 사전- 설정하거나 또는 필요에 따라 사용자가 선택할 수 있다. 상기 장치에 사용된 기술은 이하 "본 발명에 따른 펄스 기술"로 지칭된다.
상기 장치(1)에는 하우징 (2)이 내포되며, 여기에는 펄스된 신호 전송 시스템이 내포된다. 구체적으로, 이 실시예에서, 상기 펄스된 신호 전송 시스템에는 일반적으로 집적 회로의 일부로 제공되는 전자 전송 칩(4) 형태의 전송 수단을 가진 회로 보드(7)가 내포되며, 이는 상기 장치가 사용 중일 때 펄스 전자기 신호를 전송하게 된다.
한 실시예에서, 상기 하우징은 실험실 형질감염 플레이트의 형태이고, 베이스 표면(3), 이 베이스 표면에 대향하는 상부 표면(11), 및 상부 및 베이스 표면(3,11) 사이에 위치한 하나 또는 그 이상의 측벽(13)이 내포된다.
장치(1)의 선택적인 작동을 허용하도록 제어 유닛(10) 형태의 제어 수단이 제공된다. 데이터, 하나 이상의 작동 매개변수, 소프트웨어 및/또는 이와 유사한 것들이 저장되고, 필요할 때 검색될 수 메모리 장치(6)가 제공된다. 상기 제어 유닛에는 바람직하게는, 데이터 및/또는 이와 유사한 것들의 처리를 허용하는 마이크로-공정 수단이 내포된다.
상기 장치(1)에는 이 장치에 전력을 제공하기 위해 하나 또는 이상의 전력 쎌(10)이 또한 내포될 수 있다. 재충전 가능한 설비가 또한 선택적으로 제공되어, 전력 쎌이 교체될 필요 없이, 원격 전원으로부터 재충전되도록 할 수 있다.
의도된 용도를 위해 임의의 적절한 형태로 하우징(2)이 제공될 수 있고, 예를 들어, 처리될 세포가 수용되는 용기의 내부 또는 외부와 함께 이 하우징이 위치될 수 있도록 결합 수단이 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 대안으로, 상기 하우징은 처리될 세포들이 위치하는 용기의 일부로 형성될 수 있다. 여전히 대안으로, 상부 표면(11)은 이들 세포가 처리되거나 또는 위치되는 용기가 배치될 수 있는 평면 또는 평평한 표면을 제공할 수 있다. 여전히 추가적으로, 리세스는 예를 들어, 세포 배양 플라스크, 페트리 접시 또는 기타 세포 배양 용기의 형태로 된 용기(16)의 배치를 안정적으로 뒷받침하도록 하우징의 상부 표면(11)에 형성될 수 있고, 이때 하우징(2)은 용기 아래에 위치하여, 이 용기는 리세스(17)에서 지지된다.
상기 전자 전송 칩(4)은 특정 방향 또는 사용 방향으로 장치(1)로부터 펄스형 전자기 신호를 방출하도록 하우징(2)에 배열된다. 펄스형 전자기 신호의 전송 방향은 일반적으로 장치(1)가 사용되는 목적에 따라 달라진다. 예를 들면, 상기 장치(1)가 실험실 형질감염 플레이트로 사용되는 경우, 신호는 일반적으로 사용 중인 상부 표면에 위치할 수 있는 용기를 향해 상부 표면(11)을 통해 디렉팅된다. 상기 장치가 사용자의 착용을 위해 사용되는 경우, 신호는 일반적으로 베이스 표면(3)을 통해 사용자를 향해 디렉팅된다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 전자 전송 칩은 사용 중인 사용자의 피부 또는 세포 저장기(cell reservoir)와 접촉하게 되는 하우징(2)의 표면으로부터 5cm 미만, 바람직하게는 대략적으로 1cm로 이격되도록 하우징(2)에 배열된다. 이를 통해 칩으로부터 방출되는 전자기 신호가 사용 중인 환자의 진핵 세포 또는 세포 저장기에게 전달될 수 있다.
본 발명의 장치는 실온 (즉, 대략적으로 20℃), 실온보다 낮은 온도, 이를 테면, 냉장 유닛에서 사용하도록 설계되고, 및/또는 실온 이상의 온도, 이를 테면, 예를 들면, 인큐베이터 유닛 또는 환자의 신체에서 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 제어 유닛(10)은 2.45GHz +/- 50MHz의 주파수, 15Hz의 펄스 주파수 및 대략 2mW의 전력에서 펄스 전자기 신호를 방출하도록 송신 칩을 제어하도록 프로그래밍된다. 펄스형 전자기 신호와 관련된 매개변수는 조정될 수 있고, 및/또는 필요에 따라 사용자가 선택할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 펄스 전자기 신호가 방출되는 시간은 필요한 경우 사용자가 선택할 수 있다. 또한, 전력은 일반적으로 밀리와트 범위로 유지되지만, 사용 시 용기(16) 내에 포함된 쎌에 과도한 에너지를 공급하는 것을 방지하도록 조정될 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 펄스된 신호는 1ms 동안 지속되며, 신호 간의 휴식 기간은 66ms이다. 이것은 2% 미만의 듀티 사이클을 제공한다.
하나의 예시에서, 상기 전자기 신호는 Bluetooth LE 프로토콜의 광고 기능을 사용하는 RF 신호이며, 0.45 ~ 0.55 사이의 GFSK를 사용하여 전송된다.
그러나, 산업, 의료 및 과학 주파수 대역(즉, 2.4 ~ 2.4835GHz, 바람직하게는 2.45GHz +/-50MHz)의 모든 주파수 전송은 사용 시 이 전자 장치에 의해 가능할 수 있다.
도 1a에 도시된 실시예에서, 장치가 사용자의 요구 사항에 따라 설정될 수 있도록 하기 위해, 특정 시퀀스의 펄스, 주파수, 타이밍 및/또는 펄스의 강도를 선택할 수 있도록 선별 수단(5)이 제공된다.
도 1a 및 도 1b에 나타낸 구체예에서, 상기 장치(1)는 환자의 피부(12)의 표면에 직접 배치시킨 것으로 도시되어 있다. 본 실시예에서, 장치(1)를 사용자의 신체에 탈착 가능하게 부착하기 위해 밴드(14) 형태의 부착 수단이 제공된다. 보다 구체적으로, 밴드(15)는 환자의 피부의 일부분 상의 필요한 위치에 하우징(2)을 고정하기 위해 환자의 팔 또는 팔다리를 에워싼다. 대안으로, 피부와 접촉하는 하우징의 베이스 표면(3)에는 필요한 위치에서 환자의 피부에 접착될 수 있도록 그 위에 접착 재료가 제공될 수 있다. 장치(1)가 사용 중에 작동될 때, 하우징(2)으로부터 방출된 펄스 전자기 신호(22)는 환자의 피부의 적어도 일부분으로, 가능하게는 더 나아가 환자의 신체의 조직(24) 및 세포로 전달된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 것과 같이, 상기 장치 하우징(302)은 약물- 전달 "패치"(25) (때때로, '경피 패치'로 지칭됨)의 상부에 위치되며, 이는 다시 사용자의 피부(12)의 일부분에 부착된다. 이 구체예에서, 펄스형 전자기 신호(22)는 하우징(2)으로부터 방출되고, 패치(25) 내로 그리고 제제 또는 약물(26)을 포함하는 패치의 부분을 통해 피부(12)로 디렉팅된다. 상기 약물은 사용자의 피부를 통과하여 사용자의 조직 및 세포(24)로 전달된다. 펄스 전자기 신호의 사용은 사용자의 피부를 통한 약물의 흡수 및 흡수를 향상시킨다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 도 3에 나타낸 것과 같이, 상기 장치는 이식가능한 장치로 제공된다. 더 구체적으로, 장치의 하우징(2)은 사용자의 피부(12) 아래 및/또는 사용자의 조직(24)에 피하로 이식되는 멸균 외부 케이싱을 제공한다. 일단 이식되면, 장치는 이 장치로부터 펄스 전자기 신호(22)를 방출한다. 상기 임플란트는 신호(22)가 예를 들어, 암성 종양(28)을 향해 원하는 방향으로 방출되도록 위치된다.
본 발명의 여전히 추가 구체예에서, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 것과 같이, 상기 장치는 펜던트(36)의 형태로 제공된다. 도면에서, 상기 펜던트는 환자 또는 사람(39)의 목/상부 흉부(38)의 높이에 펜던트를 위치시키기 위해 체인(37) 상에 착용되도록 배열된다. 상기 펄스 전자기 신호(22)는 도 4a의 화살표(41)로 표시된 바와 같이, 펜던트로부터 착용자의 신체로 디렉팅된다. 상기 펜던트(36)의 페이스(43)는 펜던트가 필요한 위치에 착용될 때, 그 사람에 가장 가깝게 위치될 수 있도록 배열된다.
하나의 예시에서, 본 발명의 장치는 바이러스 복제를 최소화하기 위해, 그리고 착용자에게 더 큰 면역학적 보호를 제공하기 위한 수단으로서 착용될 수 있다. 따라서, 이 구체예에서, 상기 펜던트(36)가 착용자의 목/상부 가슴 높이에서 착용될 때, 이 착용자의 중요한 호흡 구역의 면역에 부스트가 제공된다.
전형적으로, 어느 구체예이건 간에, 본 발명의 장치는 사전-결정된 위치에서 국소 및 집중 치료를 제공하도록 선택된 사용자의 피부 부분에 또는 인접하여 제공된다.
예를 들면, 만일 이 장치의 목적이 환자의 암성 종양에 대한 치료를 제공하는 것인 경우, 해당 장치는 예를 들어, 간, 신장, 유방 또는 뼈에 존재할 수 있는 인지된 암성 종양 부근에 위치하거나 또는 그 안에 이식될 수 있다. 대안으로, 만일 치료적 이점을 달성하거나 또는 감염 가능성을 제한하기 위해 또는 예방하기 위해 이 장치가 제공되는 경우, 해당 장치는 치료 또는 예방 효과가 가장 유익한 것으로 여겨지는 환자의 신체 부분, 이를 테면, 환자 또는 사람의 목 부위에 인접한 환자의 외부에 위치할 수 있다.
따라서, 만일 장치가 환자의 피부(12)에 직접 위치하는 경우, 펄스 전자기 신호는 피부를 통해 종양으로 방출되어, 해당 종양 세포의 상태를 변화시킨다. 예를 들어, 도 2a 및 도 2b에 표시된 것과 같이, 상기 장치를 패치 또는 기타 약물 운반 품목과 함께 사용하는 경우, 그러면 약물이 통상적으로 가능한 것보다 더 쉽게 환자의 피부를 통과할 수 있다. 상기 펄스된 전자기 신호는 피부 모공의 크기를 증가시키고, 이를 통해 약물이 통과할 수 있는 더 큰 공간을 허용하는 것으로 생각된다. 따라서, 약제학적 약물 또는 기타 작용제는 본 발명을 이용하여 더 효율적이고, 효과적으로 전달될 수 있다. 추가적으로, 현재 경피로 제공될 수 없는 약제학적 약물 또는 기타 작용제는 이제 본 발명의 방법을 사용하여 체내로 공급될 수 있다. 본 발명의 장치의 제공으로, 증가된 피부 투과성에 의해 약물의 전달을 향상시키고, 직접적인 치료 이점들이 제공된다.
도 5a에 도시된 본 발명의 예에서, 펄스 전자기 신호를 생성하기 위한 본 발명에 따른 세포 배양 및 장치(1)의 "샌드위치" 배열을 포함하는 활성 어셈블리가 준비되었다. 결장암 세포를 함유하는 500ml 배양 용기(32)를 장치의 하우징(2) 아래에 놓고 건강한 세포를 포함하는 500ml 배양 용기(34)를 장치의 상부에 놓았다.
배양 용기의 두 번째 동일한 어셈블리가 도 5b에 도시된 바와 같이 준비되었지만, 본 발명의 장치가 없었고, 이것이 대조군으로 작용하였다.
테스트 수행에서, 두 개, 활성군과 대조군의 어셈블리 배양 "스택(stacks)"을 18시간 동안 37℃에서 별도의 인큐베이터에 배치하고, 상기 활성 어셈블리에서 장치(1)는 전술한 18시간 동안의 적어도 시간 동안 양쪽 용기(32, 34)를 모두 통과하도록 양방향(40, 42)으로 전자기 신호(22)를 발생시키도록 작동되었다.
그런 다음, 결과를 현미경 관찰로 평가하였고, p53 단백질 발현을 웨스턴 블롯 및 분광광도측정법으로 분석했다.
현미경 검사는 세포 수와 상태 측면에서 활성 배양과 대조 배양 사이에 뚜렷하고 중요한 차이를 보여주었다. 활성 어셈블리에서 건강한 세포들(34)은 극적인 성장을 보였고, 조직을 형성하기 위해 함께 뭉쳤지만, 반면 암 조직(32)에서는 세포 성장이 중단되었다.
도 6을 참조하면, 추가 구체예에 따른 펄스형 전자기 신호를 제공하기 위한 장치(102)의 추가 예가 도시되어 있다. 본 발명의 일부 장치는 펄스 전자기 신호의 전송을 위한 단일 전자 칩을 포함하는 장치를 보여주는 반면, 도 6은 펄스 전자기 신호의 전송을 위한 6개의 전자 칩(104) 어레이를 갖는 장치(102)를 도시한다. 도 3은 전자 칩(104)이 장치(102)의 상단에 있는 것으로 도시하지만, 이것은 명확성을 위해 이와 같이 도시된 것이며, 이 칩(104)은 장치(102) 내에 실제로 함유된다. 하우징(204)은 베이스(105), 이 베이스(105)에 대향하는 상부 표면(107) 및 베이스(105)와 상부 표면(107) 사이에 위치된 측벽(109)을 포함한다.
6개의 전자 칩(104)은 장치(102)에서 이격된 거리로 제공된다. 칩 사이의 간격은 임의의 필요한 거리일 수 있지만, 그러나, 하나의 예시에서, 24-웰 셀 플레이트(106)가 사용 중인 장치의 상부 표면(7)에 위치하도록 칩들이 이격되어 있고, 한 개 전송 칩(104)은 이들 4개 웰의 중앙에 위치한다. 따라서, 각 전자 칩(102)은 펄스형 전자기 신호를 24-웰 셀 플레이트에서 4개의 웰로 디렉팅된다. 온/오프 작동 스위치(108)는 사용 시 이 장치를 온 상태와 오프 상태로 전환시키기 위해 해당 장치(102)에 제공된다.
단순화된 개요로서, 한 실시예에서, 진핵 세포 및 네이키드 핵산 (DNA, RNA 또는 이들의 작은 단편)의 조합된 분산액을 포함하는 물질이 적합한 용기, 이를 데면, 배양 용기, 플라스크 또는 접시에 함유되고, 한 구체예에서 장치 (102) 상에 위치하면, 펄스된 전자기 신호가 이 장치로부터 방출되어, 해당 용기 벽을 통하여 물질로 디렉팅된다.
본 발명의 펄스된 기술은 형질감염이 일어나기 전, 상기 네이키드 작용제(들), 이를 테면, 예를 들면, 상기 핵산 상에서 이용될 수 있다. 본 발명의 펄스된 기술은 상기 네이키드 작용제(들)과 상기 진핵세포가 내포된 혼합물 또는 형질감염 혼합물 상에서 또한 이용될 수 있거나, 또는 대안으로 이용될 수 있다. 추가적으로, 또는 여전히 대안으로, 세포에서 단백질 발현을 증가시키기 위해, 본 발명의 펄스된 기술은 형질감염 및/또는 세포-내 전달이 일어난 세포에서, 및/또는 아직 형질감염되지 않은 및/또는 세포-내 전달을 겪지 않은 진핵세포에 이용될 수 있다.
본 발명을 구체화시키는데 이용된 다음의 실험에서, 본 발명의 동일한 펄스된 기술은 상이한 진핵세포주와 혼합하기-전 네이키드 작용제(들) 상에서 이용되었고, 및/또는 형질감염 공정 및/또는 세포-내 전달 공정 형질감염 혼합물과 혼합된 진핵 세포주에서 이용되었다.
처리 전 24시간 시점에, 인간 결장 종양 (HCT) 116 세포 (흡착 세포) (ATCC, USA -ATCC® CCL-247™)를 Dulbecco 변형된 Eagle 배지 (DMEM) (Thermo Fisher, USA) + 10% 태아 소 혈청 (FBS) (Hyclone, USA)의 최종 용적 5mL에서 2개의 CELLSTAR® 6-웰 플레이트 (9.6cm2) 상에 웰당 3x105 세포의 밀로도 씨딩하였다.
이용된 네이키드 작용제는 순수 에탈올에서 독소루비친 (0.25μM) (Sigma Aldrich)이었고, 1 시간 처리 주기동안 해당 세포에 제공되었고, 37℃, 5% CO2에서 항온처리되었다.
처리 후, 이 배지를 제거하였고, 새로운 배지를 해당 세포에 추가하였다. 이들 플레이트중 하나는 37℃, 5% CO2에서 직접적으로 항온처리되었고, 상기 두 번째 플레이트는 상이한 인큐베이터에 위치시키고, 37℃, 5% CO2에서 본 발명의 펄스된 기술을 이용하여 펄스시켰다.
SDS-page에 의한 분석을 위해 처리 3시간, 6시간, 9시간, 16시간 또는 24시간 시점에 단백질 추출물을 수거하였다.
다음 Western Blot 프로토콜은 참고자료 [5]에 나와 있다.
웨스턴 블롯을 위한 단백질 추출물의 제조
1. 단백질 추출을 위해, 이들 세포를 얼음-냉각된 PBS로 두 차례 세척하였고, 그 다음 1X CompleteTM Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Switzerland)가 보충된 NP-40 추출 완충액 (50mM Tris ph 7.5; 10% 글리세롤; 0.1% "NP-40 Alternative" (Merck Millipore, USA); 100mM NaCl; 0.2mM EDTA)에서 용해시켰다. 추출물을 초음파파쇄시키고 (20초, 20% 진폭), 단백질 농도는 BCATM Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여, 제조업자의 권장사항에 따라 측정되었다.
Western Blot 프로토콜
1. 단백질 추출물 (실험에 따라 15/20μg)을 0.1M 디티오트레이톨 (DTT) 및 1X LDS 완충액 (Invitrogen, USA)과 함께 보충하였고, NuPAGE 10% Bis-Tris 폴리아크릴아미드 겔 (Invitrogen, USA) 상에 로딩시키기 전, 10분간 95℃에서 가열시켰다.
2. 단백질 샘플을 1X MOPS Running Buffer를 사용하여 전기영동(100V)에 의해 분리되시켰다. 단백질의 이동은 20% 메탄올이 보충된 1X Transfer Buffer에서 니트로셀룰로오스 막(Protran 0.1μm, GE Healthcare, USA)으로 12V에서 하룻밤 동안 수행되었다. 1X Transfer Buffer는 milli-Q 물의 1L 최종 부피에서144g의 글리신과 30g의 Tris-Base를 포함하는 10X Wet blot 용액에서 준비된다.
3. 막을 1차 항체(마우스 단일클론 항체 DO1)와 함께 하룻밤 동안 항온처리하기 전, PBS - 0.1% Tween20에 희석된 5% BSA에서 막을 30분 동안 차단시켰다. PBS-Tween20에서 15분 동안 세척한 후, 막을 상응하는 2차 항체(HRP 접합된 당나귀 항 마우스)와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. HRP(Horse Radish Peroxidase)와 콘쥬게이트된 모든 이차 항체는 Jackson ImmunoResearch lab에서 구입하여, 5% BSA - PBS-Tween20에서 1:10000/1:15000 희석액(항체에 따라 다름)으로 사용했다.
항온처리가 끝나면, 해당 막을 PBS-Tween20으로 15분 동안 두 번 세척한 다음, PBS로 마지막 10분 세척했다. 화학 발광 신호는 Amersham ECL Western Blotting Detection System(Cytiva, USA)을 사용하여 HyperfilmTM ECL(Cytiva, USA)에서 감지했다.
결과
도 7을 참조하면, Western Blot에서 p53 단백질의 주요 아이소형(isoform)인 p53alpha는 본 발명의 펄스 기술로 처리된 후 상향 조절되었음을 알 수 있다. 효과는 약물을 첨가한 지 3시간 후에 관찰되었으며, 처리-후 24시간 시점에 가장 분명했다. p53의 다른 아이소형, 즉 d133p53alpha, d133p53beta 및 d160p53beta 또한, 독소루비신 처리 후 본 발명에 따른 펄스 기술의 효과 하에 더 상향조절되었다.
Western Blot에서, 
H2AX를 마커로 사용하여 영향이 관찰되면 전리 방사선으로 인한 것이 아님을 확인했다. 
H2AX의 발현은 전리방사선이 존재할 때 변하며, 본 발명에 따른 펄스 기술과 대조군 부분 사이에 관찰된 변화가 없기 때문에, 본 발명의 펄스 기술은 전리 방사선을 방출하지 않는다고 결론지었다.
Ku80은 각 샘플의 동일한 농도가 각 웰에 로딩되도록 하기 위해 로딩 대조군으로 사용되었다. 동일한 농도의 Ku80은 Western Blot의 나머지 밴드를 비교할 수 있게 한다.
도 8을 참조하면, 다른 실험에서 일부 세포는 본 발명의 펄스 기술로 처리되었고, 일부 세포는 대조군으로서 독소루비신의 첨가 없이 5일 동안 본 발명의 펄스 기술을 제공받지 않았다. p53alpha 발현에서 변화는 관찰되지 않았다. 0.25μM 독소루비친을 이들 세포에게 1 시간 동안 추가하였을 때, 본 발명에 따른 펄스 기술의 효과 하에 있는 세포는 16시간 후 대조군과 비교하여 현저한 p53알파의 과잉 생산을 나타내었다.
결론적으로, 본 발명에 따른 펄스 기술로 세포를 처리하면, 다양한 p53 아이소형이 대조군과 비교하였을 때, 펄스 기술 군에서 더 많이 상향조절되기 때문에, 배지로부터 독소루비신을 흡수하는 세포의 능력이 증가한다는 분명한 증거가 있다. 펄스 기술 부분과 대조군 부분 사이에 방사선 마커 gH2AX가 변경되지 않은 채로 남아 있기 때문에, 이 효과는 전리 방사선에 의해 발생하지 않는다고 결론지을 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항암제의 전달 증진과 펄스 기술의 직접 치료의 조합 효과는 p53 종양 유전자를 통한 복제 조절에 유익한 영향을 미치고 암 치료를 개선시킨다. 더욱이, 건강한 세포의 돌연변이되지 않은 p53에 대한 본 발명의 펄스 기술의 효과는 이들 세포의 복구를 증가시킨다.
상시 실시예들은 독소루비친 형태의 네이키드 작용제의 세포-내 전달이 HCT 116 세포 형태의 진핵 세포와 독소루비친이 본 발명의 펄스형 기술에 노출 시 상당히 개선되었음을 보여주지만, 출원인은 독소루비친 이외의 하나 또는 그 이상의 네이키드 작용제를 하나 또는 그 이상의 진핵 세포 (HCT 116 세포 또는 다른 진핵세포를 이용)로의 세포-내 전달은 이들을 본 발명의 펄스형 기술에 노출시 상당히 개선될 것임을 충분히 기대하고, 예측한다. 또한, 출원인은 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제가 상기 하나 또는 그 이상의 진핵세포와 혼합되기 전 (단독으로, 또는 본 발명의 펄스형 기술에 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 노출시키는 것에 추가하여) 및/또는 세포-내 전달 및/또는 형질감염 단계가 일어난 후, 본 발명의 펄스형 기술에 노출될 때, 하나 또는 그 이상의 네이키드 작용제의 세포-내 전달은 추가로 상당히 개선될 것이라고 충분히 기대하고, 예측한다. 이들 기대 및 예측은 출원인의 공동 계류중인 우선권 출원 영국 특허 출원 GB2004412.9, GB 2009296.1, GB2004411.1 및 GB2009297.9 (이들의 내용은 본원의 참고자료에 편입됨)에서 이미 수집된 데이터를 기반으로 하며, 이들은 진핵 세포에서 양친매성 구조체와 연합된 하나 또는 그 이상의 형질감염 작용제의 형질감염 효율은 a) 진핵세포의 추가 전 형질 감염 혼합물에; b) 형질감염 혼합물 및 진핵세포가 내포된 형질감염 복합체에, 및/또는 c) 형질감염 공정 동안 및/또는 및/또는 공정 후에 본 발명의 펄스형 기술에 노출될 때, 상당히 개선된다는 것을 보여준다. 이러한 실험에 대한 데이터는 본 출원의 청구 범위의 범위에 대한 뒷받침하기 위해 아래에 재현된다. 본 출원인은 "네이키드 작용제"(즉, 양친매성 구성체와 연합되지 않음)가 사용될 때와 같이 이 작용제가 양친매성 구조체와 연합될 때, 형질감염 효율 및/또는 세포내 전달 개선과 동일하거나 유사한 기전을 예측한다. 이것은 본 발명에 따른 펄스 전자기파 또는 신호가 상대적으로 긴 휴지 또는 이완 기간을 갖는 쌍극자 주위에서 주기적으로 H2O를 회전시키기에 충분하다고 생각되기 때문이다. H2O의 주기적인 회전은 진핵 세포의 인지질 이중층 및/또는 세포 막에서 수소 결합을 방해하는 것으로 생각된다. 따라서, 세포막의 이러한 주기적 또는 간헐적 저-에너지 섭동은 작용제, 일부 분자, 및/또는 세포막 및 이들의 환경과의 상호작용, 이를 테면, 예를 들면 핵산과 세포 막과의 상호작용 증가를 자극하는 것으로 생각된다. 펄스 전자기 신호들의 펄스 간의 비교적 긴 휴식 또는 이완 주기는 세포 무결성을 유지시키는데 충분하다고 생각된다.
출원인의 동시 출원 중인 특허 출원에서 취한 다음 실험에서, 본 발명의 동일한 펄스된 기술은 상이한 진핵세포주와 혼합하기-전, 형질감염 혼합물(형질감염 작용제 + 양친매성 구조체) 상에서 이용되었고, 및/또는 형질감염 공정 동안 형질감염 혼합물과 혼합된 진핵 세포주에서 이용되었다.
이 실험에서 이용된 핵산은 아르기닌 바소프레신 (AVP) 프로모터, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 프로모터, 또는 인슐린 유사 성장 인자 결합 보호 3 (IGFBP3) 프로모터가 내포된 DNA 플라스미드 물질을 포함한다. 사이토메갈로바이러스 (Adluc) 플라스미드, 루시퍼라제 제어 벡터 (Renilla) 플라스미드 또는 녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드가 또한 이용되었다.
본 실험에 이용된 양친매성 구조체는 양이온 폴리머 (Turbofect™) (Thermo Fisher, USA), 폴리에틸렌이민 (PEI) (Fisher Scientific, USA), 또는 TransIT2020 (Mirus Bio, USA)를 함유하는 형질감염 시약이었다.
본 실험에 이용된 세포주는 중국 헴스터 난소 Ovary - K1 (CHO) 세포 (흡착 세포) (ATCC, USA -ATCC® CCL-61™), 인간 배아 신장 (HEK) 293 프리스타일 세포 (현탁 세포) (Thermo Fisher, USA), 인간 결장 종양 (HCT) 116 세포 (흡착 세포) (ATCC, USA -ATCC® CCL-247™) 또는 Jurkat E6 (현탁 T-세포) (ECACC), UK)이었다.
상기 성분들을 이용한 세포 형질감염 과정의 효율을 확인하기 위하여 적절한 장비를 이용하여 루시퍼라제 활성 또는 녹색 형광 단백질의 양을 측정하였다.
선택된 DNA 플라스미드 물질은 형질감염 혼합물을 형성하는 공지 기술을 이용하여 양친매성 구조체와 복합되었다. 일부 실험들에서, 본 발명의 펄스된 기술을 이 형질감염 혼합물에 적용하였다. 그 다음, 상기 형질감염 혼합물 (펄스된 기술에 노출되거나, 또는 노출없이)은 형질감염 복합체를 형성하기 위해 적합한 세포 배양 용기에서 포유류 세포주들중 하나의 분산물에서 혼합된다. 그 다음, 이 세포 배양 용기를 본 발명의 장치 하우징에 두고, 사전-결정된 주기 동안 이미 전술한 바와 같은 상기 펄스된 기술을 적용하였다. 그 다음, 상기 펄스된 전자기 신호 방출을 중단시키고, 해당 물질이 평형에 도달하도록 하였다. 추가적으로, 본 발명의 펄스 기술이 없이 동일한 재료 및 혼합 요건을 동일하게 사용하여 대조군 실험이 또한 수행되었다.
실험에 사용된 방법론, 결과 및 밝혀진 사실에 대한 자세한 설명은 아래에 나와 있다.
방법론
실험 1 - Adluc 및 Renilla 플라스미드를 이용하고, 양친매성 구조체로 PEI 또는 Turbofect를 이용하여 흡착 CHO K1 세포 및 HCT116 세포의 형질감염
PEI (Fisher Scientific, USA) 또는 Turbofect (Thermo Fisher, USA) 양친매성 구조체에서 Adluc 및 Renilla 플라스미드를 이용하여 흡착성 중국 헴스터 난소(CHO) K1 세포 (ATCC, USA) 및 HCT116 (인간 결장 암 세포주) (ATCC, USA)에서 형질감염 공정에 있어서 본 발명의 펄스된 기술의 효과를 확인하기 위해 본 실험이 착수되었다. 상기 펄스된 기술은 a) 오로지 형질감염 동안 상기 세포와 상기 형질감염 혼합물 (상기 형질감염 복합체); 그리고 b) 상기 세포와 함께 형질감염 복합체를 형성하기 전, 이 형질감염 혼합물, 그리고 상기 형질감염 공정 동안 형질감염 복합체에 적용되었다.
소모품
Opti-MEM™ I 환원된 혈청 배지 (Thermo Fisher, USA)
Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM) (Thermo Fisher, USA)
태아 송아지 혈청 (FCS) (Hyclone, USA)
2 x 24 웰 플레이트 Nunc (1.9cm2/웰) (Thermo Fisher, USA)
200ng의 AdLuc 플라스미드/웰 (플라스미드/DNA를 발현시키는 루시퍼라제) (Dundee University, UK에서 제작)
2ng Renilla 플라스미드/웰 (플라스미드/DNA를 발현시키는 루시퍼라제) (Dundee University, UK에서 제작)
Alfa Aesar™ 폴리에틸렌이민, 선형, M.W. 25,00 (PEI) (Fisher Scientific, USA)
Turbofect (Thermo Fisher, USA)
방법 단계
대조군 - PEI를 이용
1. 제 1 튜브에서 650 μL의 Opti-MEM 배지를 2.6μg의 AdLuc 플라스미드와 26ng의 Renilla 플라스미드와 혼합하였다;
2. 제 2 튜브에서 650μL의 Opti-MEM 배지를 7.88μg의 PEI와 혼합하였다;
3. Vortex-Genie 2, Model G560E, (Scientific Industries, USA)를 이용하여 최종 부피가 1.3mL인 혼합물을 얻을 때 까지 부드럽게 교반시키면서 제 2 튜브의 내용물을 제 1 튜브에 점적 방식으로 혼합했다;
4. 상기 형질감염 혼합물을 15분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리하였다;
5. 그 다음, 100μL의 이러한 항온처리된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 A1-A6로 라벨된 웰에 분배하였다. 이로써 형질감염 혼합물이 형성되었다.
발명 - 형질감염 복합체가 생성되기 전, 형질감염 혼합물에 PEI를 사용하는 펄스된 기술 사용
1. 그 다음, 상기 단계 1-3을 반복하였지만, 단계 4에서 - 형질감염 혼합물을 형성하는 혼합물은 본 발명에 따른 펄스된 전자기 신호 장치상에 제 1 튜브를 배치시킴으로써 15 분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리되었다. 상기 펄스된 장치는 상기와 같이 작동된다 (즉, 펄스된 주파수 15Hz를 이용하여, 2.45GHz +/- 50MHz, 전력 2mW에서 작동된 펄스 장치).
2. 100μL의 이러한 항온처리된 펄스된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 B1-B6로 라벨된 웰에 분배하였다;
대조군 - Turbofect 사용
1.
제 1 튜브에서 650 μL의 Opti-MEM 배지를 2.6μg의 AdLuc 플라스미드와 26ng의 Renilla 플라스미드와 혼합하였다;
2.
13 μL의 Turbofect를 추가하였고, Vortex-Genie 2, Model G560E, (Scientific Industries, USA)를 이용하여 볼텍싱함으로써 혼합시켰다;
3.
상기 형질감염 혼합물을 15 분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리하였다.
4.
100μL의 이러한 항온처리된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 C1-C6로 라벨된 웰에 분배하였다;
발명 - 형질감염 복합체가 생성되기 전, 형질감염 혼합물에 Turbofect를 사용하는 펄스된 기술 사용
1.
Turbofect 대조군의 경우 상기 단계 1-2를 반복하였다. 단계 3에서 -형질감염 혼합물은 본 발명에 따른 펄스된 전자기 신호 장치상에 제 1 튜브를 배치시킴으로써 15 분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리되었다. 상기 펄스된 장치는 펄스된 주파수 15Hz를 이용하여, 2.45GHz +/- 50MHz, 전력 2mW에서 작동되었다.
2.
100μL의 이러한 항온처리된 펄스된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 D1-D6로 라벨된 웰에 분배하였다;
플레이트 1 및 플레이트 2에 추가된 세포주
-
플레이트 1 및 플레이트 2의 경우, 2x104 세포/웰로 2개의 24-웰 플레이트의 각 웰에 CHO K1 세포 또는 HCT116 세포를 추가함으로써 형질감염 복합체를 만들었고, 그 다음 Dulbecco 변형된 Eagle Medium (DMEM) + 10% 태아 송아지 혈청 (FCS)으로 최대 최종 부피 600μL로 만든다. 구체적으로, A1-A3,B1-B3, C1-C3 및 D1-D3에는 CHO K1 세포가 추가되었고; A4-A6, B4-B6, C4-C6 및 D4-D6에는 HCT 116 세포가 추가되었고;
-
플레이트 1 및 플레이트 2는 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 3 시간 항온처리되었다;
-
플레이트 1에서는 3시간 항온처리 단계 동안, 형질감염 복합체에 펄스 기술이 제공되지 않았으며, 한편 플레이트 2에는 항온처리 단계 동안 3시간 동안 본 발명에 따른 펄스된 기술이 적용되었다.
-
4시간 후, Turbofect 형질감염 시약을 함유하는 DMEM으로 웰의 상단을 채웠다.
-
각 실험 조건에 대한 3개의 웰의 평균값을 측정하여 기록하였다.
일부 경우에서, 위의 실험은 펄스 장치에 단일 송신기만 제공되는 첫 번째 유형의 펄스 기술을 사용하여 수행되었다(기술 1 펄스 기술). 일부 경우에서, 위의 실험은 펄스 장치에 여러 송신기 어레이가 사용된 두 번째 유형의 펄스 기술을 사용하여 수행되었습니다(기술 2 펄스 기술). 특히, 유형 2 펄스 기술을 사용한 실험에서는 6개의 송신기가 제공되었고, 플레이트가 펄스 장치에 위치할 때 24웰 플레이트의 4개 웰의 중앙 또는 실질적으로 중앙에 각 송신기가 배치되었다.
루시퍼라제 분석 프로토콜 - 듀얼-루시퍼라제 리포터 분석 시스템 (Promega, USA) 이용
방법 단계
1.
형질감염 실험이 일어난 지 24시간 후, 세포에서 배지를 제거하였다.
2.
세포를 인산염 완충된 염수(PBS)로 2회 세척하였다.
3.
100μL의 1 x Passive 용해 완충액(Promega, USA)을 세포에 첨가했다.
4.
Belly Dancer® Orbital Shaker(Sigma, Aldrich)에서 부드럽게 흔들면서, 이들 세포를 37℃에서 15분 동안 항온처리했다.
5.
각 웰로부터 10μL의 세포를 취하여, 백색 96 웰 플레이트에 두었다.
6.
듀얼-루시퍼라제 분석 시스템 프로토콜 (Promega, USA)을 이용하여 마이크로플레이트 광도계 LB 96V (EG & G Berthold, Germany)로 세포를 분석하였다.
7.
이 분석은 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정하기 위해 30μL 루시퍼라제 분석 시약 II (Promega, USA)를 주사하고, 그 다음 반딧불이 루시퍼라제를 차단시키기 위해 30μL Stop & Glo™ 시약을 주사하고, 그리고 renilla 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 분석을 하였다.
8.
그 다음, 필요하다면, Western Blots을 행하기 위해, 용해된 추출물은 -20℃로 유지시켰다.
9.
세포의 형질감염 효율은 세포를 Incucyte® Live Cell Analysis System(Sartorius, Germany)에 72-96시간 동안 두어 수행하였다. Excel®에서 데이터를 수집하고 분석했다.
실험 1의 결과
표 1은 기술 1 펄스 기술이 Turbofect 양친매성 구조체 및 관련 방법과 함께 사용된 CHO K1 세포 실험의 결과를 보여준다.
표 1 (기술 1 펄스된 기술)
대조군에 비해 펄스 기술에서 증가% - 178%
대조군에 비해 펄스 기술에서 평균 증가 배수 - 1.8
T-test - 0.024
표 2는 기술 2 펄스 기술이 Turbofect 양친매성 구조체 및 관련 방법과 함께 사용된 CHO K1 세포 실험의 결과를 보여준다.
표 2 (기술 2 펄스된 기술)
대조군에 비해 펄스 기술에서 증가 % - 232.7%
대조군에 비해 펄스 기술에서 평균 증가 배수 - 2.3
T-test - 0.044
표 3은 기술 3 펄스 기술이 Turbofect 양친매성 구조체 및 관련 방법과 함께 사용된 HCT 116 세포 실험의 결과를 보여준다.
표 3
대조군에 비해 펄스 기술에서 증가 % - 138.5%
대조군에 비해 펄스 기술에서 평균 증가 배수 - 1.4
T-test - 0.044
표 1 및 표 2를 참고하면, Turbofect 양친매성 구축물과 관련된 CHO K1 세포의 형질감염 효율은 본 발명(Pulzar)에 따른 대조군 및 펄스 기술에 대해 표시된다. 각 조건에는 3개의 반복실험이 함유된다. 루시퍼라제 활성 (즉, 형질감염)의 척도로서 모든 세포에 대해 발광의 양이 측정되었다.
기술 1 펄스 기술을 사용한 CHO K1 세포의 형질감염 효율은 t-검정 값이 0.024이며, 평균 배수 증가가 1.8, 그리고 증가%가 178.0으로, 대조군 세포와 비교하여 상당히 개선되었음을 볼 수 있을 것이다.
기술 2 펄스 기술을 사용한 CHO K1 세포의 형질감염 효율은 t-검정 값이 0.044이며, 평균 배수 증가가 2.3, 그리고 증가%가 232.7로, 대조군 세포와 비교하여 상당히 개선되었음을 볼 수 있을 것이다.
또한, 기술 2 펄스 기술(즉, 6개 전자 송신기 칩 어레이)로 수행된 실험이 기술 1 펄스 기술을 사용하여 수행한 실험보다 훨씬 더 나은 결과를 낳았음을 알 수 있다.
표 3을 참조하면, Turbofect 양친매성 구조체와 관련된 HCT 116 세포의 형질감염 효율이 본 발명(Pulzar)에 따른 대조군 및 펄스 기술에 대해 표시된다. 각 조건에는 3개의 반복실험이 함유된다. 루시퍼라제 활성의 척도로서 모든 세포에 대해 발광의 양이 측정되었다.
펄스 기술을 사용한 HCT 116 세포의 형질감염 효율은 t-검정 값이 0.044이며, 배수 증가가 1.4, 그리고 증가 %가 138.5로, 대조군 세포와 비교하여 상당히 개선되었음을 볼 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 펄스 기술은 펄스 기술을 사용하지 않은 경우와 비교하였을 때, 부착성 CHO K1 세포 및 HCT 116 세포에서 형질감염 효율을 유의미하게 증가시켰다고 결론지을 수 있다. 더욱이, 6개의 전자 전송기는 단일 전자 전송기만 사용된 경우와 비교하였을 때, 형질감염 효율을 더욱 증가시켰다.
실험 2 - IGFBP3 프로모터 함유하는 플라스미드 또는 SV40 프로모터 함유하는 플라스미드를 이용하고, 양친매성 구조체로 PEI를 이용한 흡착 HCT 세포의 형질감염
실험 2는 PEI (Fisher Scientific, USA) 양친매성 구조체에서 IGFBP3 프로모터 또는 SV40 프로모터를 함유하는 Adluc 및 Renilla 플라스미드를 이용하여 흡착 HCT116 (인간 Colon 암 세포주) (ATCC, USA)의 형질감염 공정에 있어서 본 발명의 펄스된 기술 효과를 확인하기 위해 착수되었다. 실험 2의 경우 실험 1의 방법을 따른다.
실험 2의 결과
표 4
표 4는 PEI 양친매성 구조체 및 관련 방법과 함께 IGFBP3 프로모터에 대한 HCT 116 세포 실험의 결과를 보여준다.
증가 배수%= 168.4991974
t.test p< 0.004154274
표 5
표 5는 PEI 양친매성 구조체 및 관련 방법과 함께 SV40 프로모터에 대한 HCT 116 세포 실험의 결과를 보여준다.
증가 배수%= 155.2371016
t.test p< 0.026953884
표 4 및 표 5를 참고하면, HCT 116 세포에서 PEI 양친매성 구조체와 연합되며, IGFBP3 프로모터 또는 SV40 프로모터를 함유하는 DNA 플라스미드의 형질감염 효율이 본 발명(Pulzar)에 따른 대조군 및 펄스 기술에 대해 표시된다. 각 조건에 대해 3회 반복되는 두 실험이 수행되었다. 루시퍼라제 활성의 척도로서 모든 세포에 대해 발광의 양이 측정되었다.
펄스 기술을 사용한 HCT 116 세포의 형질감염 효율 (IGFBP3 프로모터에 의해 나타낸)은 t-검정 값이 0.044이며, 배수 증가가 0.004, 그리고 증가 %가 168.5로, 대조군 세포와 비교하여 상당히 개선되었음을 볼 수 있을 것이다.
펄스 기술을 사용한 HCT 116 세포의 형질감염 효율 (SV40 프로모터에 의해 나타낸)은 t-검정 값이 0.044이며, 배수 증가가 0.027이며, 그리고 증가%가 155.2로, 대조군 세포와 비교하여 상당히 개선되었음을 볼 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 펄스 기술은 펄스 기술을 사용하지 않은 경우와 비교하였을 때, 부착성 HCT 116 세포에서 형질감염 효율을 유의미하게 증가시켰다고 결론지을 수 있다.
실험 3 - GFP 플라스미드를 이용하고, 양친매성 구조체로 PEI를 현탁 HEK 293Freestyle 세포의 형질감염
PEI 양친매성 구조체 안에 녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드를 이용하여 인간 배아 신장 (HEK) 현탁 세포 293Freestyle의 형질감염 공정에 있어서 본 발명의 펄스된 기술의 효과를 확인하기 위해 본 실험이 착수되었다. 상기 펄스된 기술은 오로지 상기 형질감염 공정 동안에만 상기 세포와 상기 형질감염 혼합물에 적용되었다.
소모품
Opti-MEM™ I 환원된 혈청 배지 (Thermo Fisher, USA)
녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드 (Dundee University, UK에서 제작)
293-Freestyle 현탁 세포 (Thermo Fisher, USA)
293-Free 발현 배지 (Sigma-Aldrich, USA)
Alfa Aesar™ 폴리에틸렌이민, 선형, M.W. 25,00 (PEI) (Fisher Scientific, USA)
펄스 기술이 시약 및 세포 혼합물에만 사용되는 경우 방법 단계
1.
형질감염 전날에 6x105~ 7x105 293-F 세포/mL를 씨딩한다.
2.
형질감염 당일 세포 수를 카운트하고, 필요한 경우 세포를 희석하여 106 세포/mL의 밀도를 갖도록 희석시킨다.
3.
플라스크당 15μg의 녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드로 플라스크당 30μL의 293-Free 발현 배지를 형질감염시킨다.
4.
DNA:PEI 비율은 1:2를 이용한다.
5.
제작자의 지시에 따라 293-Free 발현 배지를 이용한다- 사용자 프로토콜 TB515 Rev. B 0411JN [4]
6.
DNA-형질감염 혼합물을 준비하기 위해:
-2.4mL의 Opti-MEM을 플라스크에 추가한다
-30μg의 GFP 플라스미드를 이 플라스크에 추가한다
-60μL의 293-Free 발현 배지를 추가한다
-이렇게 생성된 혼합물 부피를 2개의 125mL Erlennmeyer 플라스크에 나눠넣고, 각 플라스크는 28.8mL의 293 발현 배지 안에 1x106 세포/mL를 함유한다;
-두 개 별개 인큐베이터에서 125rpm에서 Bellydancer Orbital Shaker (Sigma, Aldrich) 상에서 37℃, 8% CO2에서 이들 두 개 플라스크를 항온처리한다. 인큐베이터 중 하나에서 본 발명에 따른 펄스된 기술을 사용하여 플라스크 중 하나를 3시간 동안 펄스하고, 두 번째 인큐베이터에서 펄스된 기술을 사용하지 않고, 다른 플라스크를 항온처리한다. 3 시간 후, 두 개 플라스크를 펄스된 기술이 없는 동일한 인큐베이터에 두고, 필요한 만큼 긴 시간에 걸쳐(본 실험의 경우 120시간) 시간 경과에 따른 형질감염 효율을 측정할 수 있다.
실험 3 결과
HEK 293 Freestyle 현탁 세포에서 PEI 양친매성 구조체와 연합된 GFP 플라스미드의 형질감염 효율이 본 발명(Pulzar)에 따른 대조군 및 펄스 기술에 대해 측정되었다.
펄스 기술을 사용하는 HEK 293 Freestyle Suspension Cells의 형질감염 효율(측정된 평균 녹색 형광의 양으로 표시)이 대조군 세포에 비해 크게 향상되었고, t-test 값은 0.05 미만이며, GFP 발현은 2.3배 이상의 피크 증가를 관찰하였다.
펄스 기술을 사용하는 HEK 293 Freestyle Suspension Cells의 형질감염 효율(측정된 평균 녹색 형광의 양으로 표시)이 대조군 세포에 비해 크게 향상되었고, t-test 값은 0.05 미만이며, GFP 발현은 50% 이상의 증가를 관찰하였다. 델타는 본 실험 기간 동안 GFP 발현의 증가%를 표시하기 위해 계산되었다.
따라서, 본 발명의 펄스 기술은 펄스 기술을 사용하지 않은 경우와 비교하였을 때, HEK 293 Freestyle 현탁 세포에서 형질감염 효율을 유의미하게 증가시켰다고 결론지을 수 있다.
실험 4 - Adluc 및 Renilla 플라스미드를 이용하고, PEI 또는 TransIT2020을 양친매성 구조체로 이용하여 현탁 Jurkat E6 세포에서 형질감염
PEI (Fisher Scientific, USA) 또는 TransIT2020 (Mirus Bio, USA) 양친매성 구조체에서 Adluc 및 Renilla 플라스미드를 이용하여 Jurkat E6 세포 (인간 백혈병 T-세포 림프아구 세포) (European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC), UK)에서 형질감염 공정에 있어서 본 발명의 펄스된 기술의 효과를 확인하기 위해 본 실험이 착수되었다. 상기 펄스된 기술은 a) 오로지 형질감염 동안 상기 세포와 상기 형질감염 혼합물 (상기 형질감염 복합체); 그리고 b) 상기 세포와 함께 형질감염 복합체를 형성하기 전, 이 형질감염 혼합물, 그리고 상기 형질감염 공정 동안 형질감염 복합체에 적용되었다.
소모품
Opti-MEM™ I 환원된 혈청 배지 (Thermo Fisher, USA)
태아 송아지 혈청 (FCS) (Hyclone, USA)
RPMI 배지 (Sigma-Aldrich, UK)
2 x 24 웰 플레이트 Nunc (1.9cm2/웰) (Thermo Fisher, USA)
1μg의 AdLuc 플라스미드/웰 (루시퍼라제 발현시키는 플라스미드/DNA) (Dundee University, UK에서 제작)
80ng Renilla 플라스미드/웰 (루시퍼라제 발현시키는 플라스미드/DNA) (Dundee University, UK에서 제작)
Alfa Aesar™ 폴리에틸렌이민, 선형, M.W. 25,00 (PEI) (Fisher Scientific, USA)
TransIT2020 (Mirus Bio, USA)
방법 단계
대조군 - PEI를 이용
1. 제 1 튜브에서 650 μL의 Opti-MEM 배지를 13μg의 AdLuc 플라스미드 및 1μg의 Renilla 플라스미드를 혼합하였다;
2. 제 2 튜브에서 650μL의 Opti-MEM 배지를 42μg의 PEI와 혼합하였다;
3. Vortex-Genie 2, Model G560E, (Scientific Industries, USA)를 이용하여 최종 부피가 1.3mL인 혼합물을 얻을 때 까지 부드럽게 교반시키면서 제 2 튜브의 내용물을 제 1 튜브에 점적 방식으로 혼합했다;
4. 상기 형질감염 혼합물을 15분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리하였다;
5. 그 다음, 100μL의 이러한 항온처리된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 A1-A6로 라벨된 웰에 분배하였다. 이로써 형질감염 혼합물이 형성되었다.
발명 - 형질감염 복합체가 생성되기 전, 형질감염 혼합물에 PEI를 사용하는 펄스된 기술 사용
1. 그 다음, 상기 단계 1-3을 반복하였지만, 단계 4에서 - 형질감염 혼합물을 형성하는 혼합물은 본 발명에 따른 펄스된 전자기 신호 장치상에 제 1 튜브를 배치시킴으로써 15 분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리되었다. 상기 펄스된 장치는 상기와 같이 작동된다 (즉, 펄스된 주파수 15Hz를 이용하여, 2.45GHz +/- 50MHz, 전력 2mW에서 작동된 펄스 장치).
2. 100μL의 이러한 항온처리된 펄스된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 B1-B6로 라벨된 웰에 분배하였다;
대조군 - TransIT2020을 이용
5.
제 1 튜브에서 700 μL의 Opti-MEM 배지를 13μg의 AdLuc 플라스미드와 1μg의 Renilla 플라스미드와 혼합하였다;
6.
42μL의 TransIT2020를 추가하였고, Vortex-Genie 2, Model G560E, (Scientific Industries, USA)를 이용하여 볼텍싱함으로써 혼합시켰다;
7.
상기 형질감염 혼합물을 15분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리하였다.
8.
50μL의 이러한 항온처리된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 C1-C6로 라벨된 웰에 분배하였다;
발명 - 형질감염 복합체가 생성되기 전, 형질감염 혼합물에 TransIT2020을 사용하는 펄스된 기술 사용
3.
TransIT2020 대조군의 경우 상기 단계 1-2를 반복하였다. 단계 3에서 -형질감염 혼합물은 본 발명에 따른 펄스된 전자기 신호 장치상에 제 1 튜브를 배치시킴으로써 15분 동안 실온 (대략적으로 20℃)에서 항온처리되었다. 상기 펄스된 장치는 펄스된 주파수 15Hz를 이용하여, 2.45GHz +/- 50MHz, 전력 2mW에서 작동되었다.
4.
50μL의 이러한 항온처리된 펄스된 형질감염 혼합물을 두 개의 24-웰 플레이트 (플레이트 1 및 플레이트 2) 각각에 D1-D6로 라벨된 웰에 분배하였다;
플레이트 1 및 플레이트 2에 추가된 세포주
-
플레이트 1 및 플레이트 2의 경우, RPMI 및 10% FCS 안에 Jurkat E6 세포를 24-웰의 플레이트 두 개에서 각 웰에 웰당 2x105 세포로 추가하고, 그 다음 최대 최종 부피 600μL로 만들어서 형질감염 복합체가 만들어졌다.
-
플레이트 1 및 플레이트 2는 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 항온처리되었다;
-
플레이트 1에서는 하룻밤 동안 항온처리 단계 동안, 형질감염 복합체에 펄스 기술이 제공되지 않았으며, 한편 플레이트 2에는 하룻밤 동안의 항온처리 단계 동안 3시간에 걸쳐 본 발명에 따른 펄스된 기술이 적용되었다.
-
각 실험 조건에 대한 3개의 웰의 평균값을 측정하여 기록하였다.
루시퍼라제 분석 프로토콜 - 듀얼-루시퍼라제 리포터 분석 시스템 (Promega, USA) 이용
방법 단계 - 상기에서 제시됨
실험 4에 대한 결과
표 6
표 6은 PEI 또는 TransIT2020 양친매성 구조체와 연합된 기술을 이용하여, AdLuc 및 Renilla 플라스미드에 대한 Jurkat E6 세포의 실험 결과를 나타낸다.
실험 A- 펄스 기술이 형질감염 복합체에만 적용된 경우 (즉, 일단 형질감염 혼합물이 세포에 첨가되었고, 항온처리하는 동안).
실험 B - 펄스된 기술이 상기 형질감염 혼합물에만 적용되는 경우 (Jurkat E6 세포를 추가하기 전).
실험 C - 펄스된 기술이 상기 형질감염 혼합물에 적용되었고(Jurkat E6 세포를 추가하기 전), 그리고 그 다음 상기 형질감염 복합체에도 적용된 경우 (즉, 일단 형질감염 혼합물이 세포에 첨가되었고, 항온처리하는 동안).
표 6을 참고하면, 그래프의 각 막대는 3개 리플레케이트의 평균을 나타낸다. 상기 형질감염 복합체가 펄스 기술만을 받은 경우, 형질주입 효율이 1.7배 증가하는 것으로 관찰되었다. 상기 형질감염 혼합물만 펄스 기술만을 받은 경우, 형질주입 효율이 2.0배 증가하는 것으로 관찰되었다. 상기 형질감염 혼합물과 상기 형질감염 복합체 모두 펄스 기술만을 받은 경우, 형질주입 효율이 2.3배 증가하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명에 따른 펄스 기술의 사용은 형질감염 혼합물 또는 형질감염 복합체에 단독으로 사용되는 경우 이들 둘 모두에서 형질감염 효율이 상당히 증가되었을 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 펄스 기술이 형질주입 혼합물과 형질주입 복합체 모두에 적용될 때 형질주입 효율의 추가 증가가 관찰되었다고 결론을 내릴 수 있다.
참고자료
[1] "Transdermal patches: history, development and pharmacology" - Michael N Pastore et al; British Journal of Pharmacology (2015) 172; 2179-2209.
[2] - Gene Therapy - An Industry Coming Of Age - The Cell Culture Dish Inc. 2020 pages 1-49
[3] - Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy - Bruce Levine et al; Molecular Therapy: Methods and Clinical Development, Vol. 4, March 207; 92-101; 2017 Novartis Pharmaceuticals Corp.
[4] Efficient Lipid-Mediated Transfection Of DNA Into Primary Rat Hepatocytes - Sheri L. Holmes et al; In Vitro Cell. Dev. Biol. 30; 347-351 - May 1995 - 1995 Society for In Vitro Biology.
[5] Bourdon et al., Genes Dev. 2005, PMID 16131611.
[6] Longo PA, Kavran JM, Kim MS, Leahy DJ. "Transient Mammalian Cell Transfection With Polyethylenimine (PEI). Methods Enzymol. 2013; 529-227-240. Doi:10.1016/B978-0-12-418687-3.00018-5.
Claims (31)
- 진핵세포에서 형질감염 효율 및 세포-내 전달 효율을 개선시키는 방법에 있어서, 전술한 방법에는 다음의 단계들이 내포된, 방법:
a) 하나 또는 그 이상의 진핵세포에서 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 적어도 하나의 네이키드 작용제를 제공하는 단계;
b) 상기 적어도 하나의 상기 네이키드 작용제을 하나 또는 그 이상의 진핵세포로 도입시켜, 혼합물 또는 형질감염 혼합물을 만드는 단계;
c) 상기 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형질감염 공정 또는 세포-내 전달 공정을 거치게 하여 하나 또는 그 이상의 형질감염된 세포 또는 처리된 진핵세포가 형성되는 단계;
상기 방법에는 a)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물이 형성되기-전 단계 형질감염 혼합물에서, 단계 b)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서, 단계 c)의 혼합물 또는 형질감염 혼합물에서 및/또는 단계 c)의 이후 형질감염된 또는 처리된 진핵세포에서 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것에서, 또는 이들의 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계가 내포되는 것을 특징으로 한다. - 청구항 1에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 형질감염 및/또는 세포-내 전달에 적합한 임의의 작용제, 및/또는 핵산, 약제학적 및/또는 치료요법적 작용제 또는 화합물중 임의의 것 또는 임의의 조합, 치료요법적 및/또는 약제학적 관심에 대한 작용제, 5 킬로달톤 미만의 소분자 또는 소분자 물질, 5 킬로달톤에 상응하는, 또는 이보다 더 큰 대분자 또는 대분자 물질, 하나 또는 그 이상의 단백질, 백신, 하나 또는 그 이상의 항체, 또는 유기(organic) 작용제 및/또는 이와 유사한 것들인, 방법.
- 청구항 2에 있어서, 이때 상기 약제학적 작용제는 안트라사이클린 약물 또는 독소루비친인, 방법.
- 청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 진핵세포는 용액에서 현탁되거나, 및/또는 기질에 흡착된, 방법.
- 청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 진핵세포는 불사화된 세포이거나, 또는 상기 세포는 인간 및/또는 동물 대상체의 조직으로부터 파생된, 방법.
- 청구항 5에 있어서, 이때 상기 진핵세포는 인간 및/또는 동물 대상체로부터 파생되며, 이들 세포는 T-세포, 림프구, 과립구 및/또는 대식세포를 포함하는, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 방법에는 상기 적어도 하나의 작용제와 하나 또는 그 이상의 담체 작용제 및/또는 가용성 작용제를 혼합하는 단계가 내포된, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 핵산이거나 또는 핵산이 내포되며, 이때 상기 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), DNA와 RNA의 조합, mRNA, tRNA, siRNA 또는 miRNA인, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 하나 또는 그 이상의 발현 벡터이거나, 또는 이를 내포하는, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 핵산이며, 상기 형질감염 공정으로 일과성 발현이 초래되며, 또는 이때 상기 적어도 하나의 네이키드 작용제는 핵산이거나, 또는 핵산이 내포되며, 상기 방법은 상기 형질감염 공정 후 이들 진핵세포중 하나 또는 그 이상을 단리시키는 단계, 상기 하나 또는 그 이상의 단리된 진핵세포 또는 이의 후손 세포에서 이들 적어도 하나의 네이키드 작용제에 의해 인코드된 하나 또는 그 이상의 펩티드의 발현 수준을 테스트하는 단계, 그리고 이들 발현 수준에 근거하여 하나 또는 그 이상의 단리된 진핵세포 또는 이의 후손을 선별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 이때 펄스된 전자기 신호를 디렉팅하는 단계는 사전-결정된 시간 주기 동안 일어나는, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 펄스된 전자기 신호가 적어도 하나의 네이키드 작용제로 디렉팅될 때 상기 사전-결정된 시간 주기는 대략적으로 15분이며; 및/또는 상기 펄스된 전자기 신호가 형질감염 및/또는 세포-내 전달 동안, 또는 형질감염 및/또는 세포-내 전달 후, 형질감염 혼합물로 디렉팅될 때 상기 사전-결정된 시간 주기는 대략적으로 1-4 시간인, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 펄스된 전자기 신호는 하나 또는 그 이상의 전자 장치에 의해 생성되며, 그리고 이때 상기 하나 또는 그 이상의 전자 장치에는 사용 중에 펄스 전자기 신호를 생성 및/또는 전송하기 위한 전송 수단 또는 하나 이상의 전자 전송 칩이 내포되는, 방법.
- 청구항 13에 있어서, 이때 각 전자 장치에는 단일 전송 수단 또는 전자 칩이 내포되며, 또는 각 전자 장치에는 임의선택적으로 다수의 전송 수단 또는 전자 칩이 내포되며, 이때 상기 전자 장치에는 다수의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 내포되고, 전술한 전송 수단 또는 전자 전송 칩들 각각은 서로 공간적으로 거리를 두고 배열되어, 전술한 공간적으로 이격된 거리는 상기 펄스된 전자기 신호 파장의 대략 절반에 대등하며; 또는 이때 상기 전자 장치에는 전술한 장치의 표면 또는 사용시 상기 전자 장치에 배치되는 하나 또는 그 이상의 품목의 표면 105 ~ 115 cm2 마다 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 내포되고, 또는 이때 상기 전자 장치에는 6개의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 내포되며, 전술한 칩들은 이 장치에서 서로 공간적 거리를 두고 배치되어, 하나의 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 24-웰 플레이트가 사용지 위치하는 전술한 전자 장치 상에 있거나, 또는 이에 대해 배지될 때, 이 플레이트의 웰중 4개 웰로 디렉팅되는, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 전송 수단과 사용시 펄스 전자기 신호를 수신하는 하나 또는 그 이상의 품목 간의 거리는 대략적으로 25cm 또는 그 미만, 대략적으로 20cm 또는 그 미만, 대략적으로 15cm 또는 그 미만, 대략적으로 10cm 또는 그 미만, 대략적으로 5cm 또는 그 미만, 또는 1cm 또는 그 미만에 대략적으로 대등한, 방법.
- 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 펄스형 전자기 신호의 미리-결정된 주파수는 대략 2.45GHz +/-50MHz, 대략 2.2-2.6GHz, 대략 2.4GHz +/- 50MHz 또는 대략 2.45GHz +/-50MHz이고,
및/또는
이때 펄스형 전자기 신호의 미리-결정된 펄스율은 약 50Hz 이하, 약 25Hz 이하, 약 15Hz 이하 및/또는 듀티 사이클이 2% 미만이고,
및/또는
이때 펄스형 전자기 신호의 각 펄스는 대략 1ms-20ms 동안 지속되거나, 또는 대략 1ms이고, 선택적으로 펄스형 전자기 신호의 각 펄스 사이의 휴지 기간은 대략 66ms 또는 그 이하 동안 지속되고,
및/또는
이때 각 전송 수단 또는 전자 전송 칩에 의해 제공되는 미리-결정된 전력은 대략 +2dBm ~ +4dBm, 대략 1mW, 대략 2mW 또는 대략 2.5119mW이고,
및/또는
이때 상기 펄스된 전자기 신호는 0.45 ~ 0.55의 Gaussian Frequency Shift Keying (GFSK)를 사용하여 상기 펄스된 전자기 신호가 전송되는, 방법. - 선행 청구항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 펄스된 전자기 신호의 사전-결정된 주파수는 2.4GHz +/- 50MHz 또는 2.45GHz +/- 50MHz이며, 이때 상기 사전-결정된 펄스율은 15Hz 또는 그 미만이거나, 및/또는 2% 미만의 사용률을 가지며, 이때 상기 사전-결정된 파워는 +2dBm ~ +4dBm, 대략적으로 1mW, 대략적으로 2mW 또는 대략적으로 2.5119mW이며, 임의선택적으로 이때 상기 작용제는 핵산이거나, 또는 상기 작용제에는 핵산이 내포된, 방법.
- 청구항 13에 있어서, 이때 상기 하나 또는 그 이상의 전자 장치에는 상기 전자 장치 및/또는 전송 수단의 작동 및/또는 하나 또는 그 이상의 매개변수를 제어하는 제어 수단, 사용시 상기 하나 또는 그 이상의 장치에 전력 공급을 위한 전력 공급 수단, 하나 또는 그 이상의 회로 보드, 여기에 데이터를 저장하는 메모리 수단, 사용자가 해당 장치의 작동, 하나 또는 그 이상의 조건 및/또는 하나 또는 그 이상의 매개변수를 선택할 수 있도록 사용자 선택 수단, 또는 하나 또는 그 이상의 설정을 표시하는, 또는 설정에 대한 옵션을 표시하는 디스플레이 수단중 임의의 것, 또는 임의의 조합이 내포된, 방법.
- 청구항 18에 있어서, 이때 사용자가 선택할 수 있는 해당 장치의 하나 또는 그 이상의 조건 또는 매개변수에는 신호 주파수, 신호 강도, 신호 또는 전송 파워, 각 펄스의 기간, 또는 신호 펄스 간의 휴지 주기, 펄스된 전자기 신호의 신호 펄스율중 임의의 것 또는 임의의 조합이 내포된, 방법.
- 진핵 세포에서 형질감염 효율 및/또는 세포-내 전달 효율을 개선시키는 장치에 있어서, 장치 전술한 장치에는 하우징, 사용시 사전-결정된 주파수, 사전-결정된 펄스율, 또는 사전-결정된 파워중 임의의 것 또는 임의의 조합에서 제공되는 펄스된 전자기 신호를 전송하도록 정렬된 전술한 하우징에 위치한 전송 수단, 사용시 적어도 상기 전송 수단의 작동을 제어하는 제어 수단, 그리고 사용시 상기 전송 수단 및/또는 제어 수단에 전력을 제공하는 전력 공급 수단이 내포된, 장치.
- 청구항 20에 있어서, 이때 상기 장치는 하나 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩, 또는 두 개 또는 그 이상의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 포함하는, 장치.
- 청구항 20 또는 청구항 21에 있어서, 이때 상기 장치는 전술한 장치의 하우징 표면 105 ~ 115 cm2당, 또는 사용시 이 장치에 위치될 하나 또는 그 이상의 품목의 표면 당 적어도 하나의 전송 수단 또는 전자 전송 칩을 포함하는, 장치.
- 청구항 20 ~ 22중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장치에는 다수의 전송 수단 또는 전자 전송 칩이 내포되며, 전술한 전송 수단 또는 전자 전송 칩은 상기 펄스된 전자기 신호의 파장의 대략 절반에 대등하는 거리로 공간적으로 이격되도록 배열된, 장치.
- 청구항 20 내지 23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 펄스형 전자기 신호의 미리-결정된 주파수는 대략 2.2-2.6GHz, 대략 2.4GHz +/- 50MHz 또는 대략 2.45GHz +/-50MHz이고,
및/또는
이때 펄스형 전자기 신호의 미리-결정된 펄스율은 약 50Hz 이하, 약 25Hz 이하, 약 15Hz 이하 및/또는 듀티 사이클이 2% 미만이고,
및/또는
이때 펄스된 전자기 신호의 각 펄스는 대략적으로 1ms~20ms 동안 지속되거나, 또는 대략적으로 1ms 지속되며,
및/또는
이때 펄스형 전자기 신호의 각 펄스 사이의 휴지 기간은 대략 66ms 또는 그 이하 동안 지속되고,
및/또는
이때 상기 펄스 전자기 신호를 송신하는 상기 송신 수단 각각에 의해 제공되는 미리-결정된 전력은 대략 +2dBm 내지 +4dBm, 대략 1mW, 대략 2mW 또는 대략 2.5119mW이고,
및/또는
이때 상기 펄스된 전자기 신호는 0.45 ~ 0.55의 Gaussian Frequency Shift Keying(GFSK)를 사용하여 상기 펄스된 전자기 신호가 전송되는, 장치. - 청구항 20 ~ 24중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 펄스된 전자기 신호의 사전-결정된 주파수는 2.2-2.6GHz, 2.4 GHz +/- 50MHz 또는 2.45GHz +/-50MHz이며, 이때 상기 사전-결정된 펄스율은 대략적으로 15Hz 또는 그 미만이며, 및/또는 2% 미만의 사용률을 갖고, 그리고 이때 각 전송 수단의 사전-결정된 파워는 +2dBm ~ +4dBm, 대략적으로 1mW, 대략적으로 2mW 또는 대략적으로 2.5119mW인, 장치.
- 청구항 20 내지 25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 사용 시 사용자에게 및/또는 인접하여 직접적으로 또는 간접적으로 이 장치의 탈착식 부착을 허용하기 위해 부착 수단이 제공되는, 장치.
- 청구항 26에 있어서, 이때 상기 부착 수단에는 스트랩, 타이, 목걸이, 펜던트, 벨트, 팔찌, 클립, 열쇠고리, 랜야드(lanyards), VELCRO®(후크 및 루프 고정), 프레스 스터드(press studs), 버튼, 버튼 홀, 접착제, 석고, 봉합사, 클립, 및/또는 생체- 적합성 접착제중 임의의 것 또는 이들의 임의의 조합이 내포된, 장치.
- 청구항 20 내지 27중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 하우징은 외부 케이스를 포함하고, 이때 상기 장치의 외부 케이스는 이 장치를 사람의 신체로 이식하도록 하는, 또는 사용시 피부 아래 둘 수 있도록 허용되는 재료로 코팅되거나, 및/또는 형성된, 장치.
- 청구항 20 내지 28중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 장치에는 사용시 하나 또는 그 이상의 진핵세포 또는 사람에게 형질감염되는 또는 세포-내 전달을 겪는 적어도 하나의 네이키드 작용제를 유지 또는 함유하기 위한 적어도 하나의 보유 수단 또는 저장소가 제공되는, 장치.
- 청구항 29에 있어서, 이때 상기 보유 수단 또는 저장소는 사용시 형질감염될 또는 처리될 사람의 피부 또는 하나 또는 그 이상의 진핵세포 상에 위치되거나, 또는 이에 인접하게 위치될 수 있도록 해당 장치 상에 배열되며, 상기 펄스된 전자기 신호는 사용시 작용제의 흡수, 전달, 및/또는 형질감염의 개선을 도울 수 있도록 인간의 신체 및/또는 진핵 세포의 하나 또는 그 이상의 부위로 디렉팅되는, 장치.
- 청구항 1-19중 임의의 한 항에 따라 생성된 세포 또는 이의 자손.
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