CN115315291A - 提高药剂进入真核细胞的转染和/或胞内递送效率和/或蛋白表达的设备及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供改善一个或多个真核细胞的转染效率和/或胞内递送过程的方法和设备。所述方法包括以下步骤：提供适合转染和/或胞内递送的至少一种裸药剂，向一个或多个真核细胞引入所述至少一种裸药剂以形成混合物或转染混合物，并允许所述混合物或转染混合物经历转染过程或胞内递送过程以形成一个或多个经转染或经处理的真核细胞。所述方法还包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)产生混合物或转染混合物之前指引到所述至少一种裸药剂，在步骤b)指引到所述混合物或转染混合物，在步骤c)指引到所述混合物或转染混合物和/或在步骤c)后指引到经转染或经处理的细胞混合物。

Description

提高药剂进入真核细胞的转染和/或胞内递送效率和/或蛋白 表达的设备及其使用方法
本发明涉及实现提高药剂进入真核细胞的转染效率和/或胞内递送效率的设备和其应用方法。所述设备还能用于提高细胞中的蛋白表达和其使用方法。
尽管下列描述提到允许改进药剂转染和/或胞内递送到真核细胞中的设备如何能用于治疗或医疗目的，本领域技术人员应理解本发明能用于需要药剂向一个或多个真核细胞转染和/或胞内递送的任何目的或应用，如产生病毒载体、基因治疗或修饰、蛋白表达、自体细胞疗法等。应理解本发明的设备和方法能对于体外细胞、离体细胞和/或体内细胞采用。
通常，在递送药学药剂和/或其他药物用于某些治疗可能严重程度不同的医学病症时，需要允许所述药学药剂和/或其他药物透皮施用(即由患者皮肤吸收和通过患者皮肤)。然而，尽管这个过程的益处一直得到公认，但以实践、有效和可重复方式提供此技术用于一定范围的患者，长久以来是个挑战。
所述问题很大一部分在于人的皮肤天然结构作为屏障，防止和抵御物质经皮肤传送并进入体内。因此，目前仅相对小范围的高效药物能透皮(即经过皮肤)成功递送。这些药物的递送常规通过凝胶、乳膏和/或贴片装置实现，所述装置应用于人皮肤表面且随后经皮肤吸收并进入人的身体。
例如，粘附性贴片目前用于递送阿片类药物如芬太尼[1]。芬太尼是高效药物并因而仅需要微量药物通过人皮肤在患者毛细管系统皮下空间中提供充足量。然而，即使向患者毛细管系统递送足够量药物以进行治疗，以贴片提供的一定量药物不太可能进入患者体内。这使得当前的方法无效且浪费。
此外，由相对大分子形成的药物如生物药物抗体，由于其尺寸而无法透皮递送并因而使得其不能通过患者皮肤。类似问题也适用于其他药学和/或治疗分子，例如细胞毒性药物。
另外一个问题是向部分人身体提供定向治疗，无法在家中方便地实现。如此，患者一般需要去医院或看医生，通常是定期，以进行治疗。这可能是耗时的，且需要在安排人员、设备和患者在指定治疗时间可用方面作出大量管理精力。一个替代选择是在患者家中提供合适的治疗设备，但这意味着该治疗设备随后仅可用于一名患者。由于治疗设备通常昂贵，使得家庭治疗不可行。此外，治疗设备往往笨重且患者家庭难以容纳。
转染是核酸引入真核细胞的过程。转染可以是稳定的，其中转染的核酸可连续表达并传到子细胞。或者，转染可以是瞬时的，其中转染的核酸仅在转染后表达较短时间且不传到子细胞。任一类转染在基因治疗领域的应用是众所周知的[2]，并且着眼于利用核酸治疗性递送到患者细胞以用作疾病治疗药物。例如，目的可以是取代患者中的缺陷基因，若不治疗，可能导致患者受基因相关和遗传病症影响。在实验室环境中，永生细胞系通常用外源基因转染，一般是质粒形式。转染后，成功转染的细胞会表达外源基因。
在瞬时转染中，会将外源基因(通常包封于载体，如聚乙烯亚胺(PEI))引入细胞群。这些细胞的部分会成功转染，并开始表达外源基因。短暂时间后，表达水平会下降，且细胞通常在该点进行加工或丢弃。
在稳定转染中，细胞如上转染。部分细胞会以稳定方式整合外源基因。稳定转染的细胞能在外源基因表达基础上从细胞群分离并选择，且这些细胞增殖以在较长时间段中产生表达外源基因的永生细胞系。
转染效率(即用外源基因成功转染细胞的比率)在现有技术方法中通常较低。调整多种策略来尝试增加细胞系转染效率(如电穿孔、转染专用试剂等)。需要进一步改善转染操作的设备和方法以提高任何转染操作的转染效率。
最新的发展是操纵患者自身免疫细胞的遗传序列以将其转化入细胞，所述细胞会在患者体内识别并攻击特定癌细胞[3]。患者细胞受到基因操作的方法称为‘基因疗法’。治疗癌症的基因疗法的一种有希望途径是基因操作T细胞，其表达允许T细胞更有效靶向癌组织生长的嵌合抗原受体。这类细胞称为嵌合抗原受体T细胞(“CAR-T细胞”)且该疗法称为“CAR-T细胞疗法”。免疫细胞首先从患者体中移出，然后经历离体转染过程，将细胞转变成寻找癌症的杀伤细胞。转染细胞随后再施用于患者以治疗其癌症。这些细胞的转染通常用涉及关联外源遗传物质与载体分子的方法实现，所述分子例如纳米颗粒或脂质体载体。
常规转染过程示例包括在磷脂、双层囊泡或脂质体中封装靶DNA的步骤，其随之施用于真核细胞[4]。由于脂质体由磷脂形成，脂质体具有对真核细胞膜的亲和性，所述细胞膜同样具有磷脂双层，因而这些系统发生融合。外部DNA因而能经此促融合机制转入真核细胞并成为细胞的染色体外遗传信息。简单的常规转染过程包括在阳离子聚合物(PEI)中封装外源核酸(如含有感兴趣基因的DNA质粒)[6]。尽管这些过程有潜在显著优势，但这些常规过程缓慢且转染效率差。这些方法的低转染效率使得其浪费且耗时，因而变得昂贵。
本发明的一个目的是提供设备和/或其使用方法，其允许以更靶向和有效的方式、更低成本递送药剂、药物和/或治疗性处理通过患者皮肤。
本发明的另一个目的是提供设备和/或其使用方法，其能用于提供药剂、药物和/或治疗性处理递送到患者，且允许设备易携带和/或在患者家中使用。
本发明的另一个目的是提供克服上述问题，提高真核细胞转染效率、胞内递送效率和/或蛋白表达的设备。
本发明的另外一个目的是提供提高真核细胞转染效率、胞内递送效率和/或蛋白表达的方法。
本发明的另外一个目的是提供转染和/或胞内增强设备和/或其方法。
本发明的另外一个目的是提供改善动物或人中基因疗法和/或治疗性处理效力的设备。
本发明的另外一个目的是提供改善动物或人中基因疗法和/或治疗性处理效力的方法。
本发明的另一目的是提供改善病毒载体生产的设备和/或其使用方法。
本发明的另一个目的是提供提高人和/或动物细胞中的蛋白表达的设备和/或其使用方法。
本发明的另一个目的是允许制备和/或施用转染物质和/或胞内递送物质的速度提高，另外一个目的是允许经转染的细胞产量增加。
根据本发明的第一方面，提供提高真核细胞转染效率和/或胞内递送的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供适合在一个或多个真核细胞中转染和/或胞内递送的至少一种裸药剂；
b)向一个或多个真核细胞引入所述裸药剂以形成混合物或转染混合物；
c)允许所述混合物或转染混合物经历胞内递送过程或转染过程以形成一个或多个经转染或经处理的真核细胞；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)产生所述混合物或转染混合物之前指引到所述至少一种裸药剂，在步骤b)指引到所述混合物或转染混合物，在步骤c)指引到混合物或转染混合物和/或在步骤c)后指引到所述经转染或经处理的真核细胞。
申请人意外发现在转染前、期间和/或之后施用脉冲电磁(PEM)信号可显著增加转染和/或胞内递送过程产生的转染效率、胞内递送效率和/或蛋白表达产量。转染和/或胞内递送率显著提高且允许含药剂和/或外源核酸的经转染或经处理的细胞的频率增强。因此，本发明提供非侵入、非化学方法来提高细胞活力、基因转移、转染率、胞内递送一种或多种药剂从胞外环境到胞内环境和/或蛋白生产。本发明提高胞外物质或药剂从细胞外部环境向细胞内部环境的转运。
本文所用术语“脉冲电磁信号”优选定义为电磁谱范围中的信号顺序或模式，幅度变化从基线到更高或更低值，然后返回基线或基本回到基线。还优选信号幅度变化迅速短暂，并以重复顺序出现。在一个示例中，基线代表没有从电磁信号源或发射工具发射的电磁信号。优选基线被视作细胞和/或脉冲电磁信号的静息或放松期。
所述方法优选能完全体外、完全体内或部分体外和部分体内发生。例如，真核细胞能体外转染或处理并体外用于一个或多个目的或应用。在另一示例中，真核细胞能提取自患者，体外转染或处理，然后再引入回患者(这可互换地称为“离体”方法)。或者，所述至少一种裸药剂、转染混合物和/或混合物能注射或另外转运入患者，患者细胞能体内转染和/或处理。
所述至少一种裸药剂优选是适合转染和/或胞内递送的任何药剂和/或以下的任一者或任意组合：核酸、药学和/或治疗药剂或化合物、有治疗和/或药物益处的药剂、小于5千道尔顿的小分子或小分子物质、等于或大于约5千道尔顿的大分子或大分子物质、一种或多种蛋白、疫苗、一种或多种抗体、一种或多种有机药剂等。
术语‘药学和/或治疗药剂或化合物’优选指利用或开发用于临床的化合物，其具有确定的药效。
术语‘治疗和/或药学感兴趣的药剂’优选指开发用于和/或探索用于研究和/或临床应用的化合物。这些药剂或化合物可具有已知的作用机制，但临床适用性和相关性可能未证明或研究。在一些实施方案中，这些药剂或化合物的作用机制尚未发现。无论如何，本发明的潜在机制允许这些药剂或化合物的优越的胞内递送。
在一个示例中，所述药学和/或治疗药剂是蒽环类药物，例如阿霉素；化疗药物；抗癌药物；细胞毒性药物，例如顺铂等。
本文件定义内的术语裸药剂优选指不与两亲性构健体关联的药剂。(应注意在一些转染方案中，核酸分子一般与载体或构健体关联，所述构健体可以是两亲性构健体)。术语“不关联”通常指至少一种裸药剂未在至少一个两亲性构健体中提供，其不形成与两亲性构健体的复合体，其不含于两亲性构健体上和/或不键合两亲性构健体。
本发明中，所述方法和设备允许裸药剂转染入一个或多个真核细胞，而不用两亲性构健体，效率高于现有技术的方法和设备。
在一个实施方案中，所述真核细胞能包括以下的任一者或任意组合：贴壁细胞、悬浮细胞、血细胞、T细胞、淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞等。
在一些实施方案中，所述真核细胞悬于溶液、附于基质、或是悬浮和贴壁细胞的混合物。
在一些实施方案中，所述真核细胞是永生细胞或源自永生细胞系的细胞。例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞、人结肠肿瘤(HCT)116细胞或Jurkat E6细胞。
在一些实施方案中，所述真核细胞是人或动物对象的组织中的细胞或源自其的细胞。例如，细胞可提取自待转染对象，随后再引入该对象。在一些实施方案中，所述真核细胞源自对象血液。在一些实施方案中，所述真核细胞是T细胞、淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞和/或其他白细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是辅助T细胞或细胞毒性T细胞的任一者或任意组合。在一些实施方案中，所述T细胞包括CD4+细胞毒性T淋巴细胞和/或CD8+细胞毒性T淋巴细胞。
本发明设备和方法的一个示范性应用是过继性T细胞疗法(ACT)，涉及产生所谓的‘CAR-T’细胞。这种技术中，设备和/或方法用于衍生自对象的T细胞。细胞体外培养和转染以表达嵌合抗原受体，然后体外扩增，接着再引入患者。本设备和/或方法提高转染效率并因而提供更高产量的CAR-T细胞。
在一些实施方案中，所述方法可以不是在人或动物身体上完成的治疗或手术方法。在一些实施方案中，所述方法可以不是修饰人类种系遗传同一性的方法。
在一个实施方案中，步骤a)仅由裸药剂组成(即排除任何其他药剂、载体介质和/或组合物)。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：将所述至少一种裸药剂与一种或多种其他药剂、载体药剂、溶剂、非两亲性载剂和/或溶解剂等混合，然后将其引入一个或多个真核细胞。例如，一种或多种其他载体药剂或溶解剂能包括以下的任一者或任意组合：水、缓冲溶液、Tris-EDTA、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇和/或非极性或非质子药剂等。术语载体药剂可指任何药剂，其中所述至少一种裸药剂在其中溶解、在其中悬浮和/或与其混合等。
所述至少一种裸药剂优选是或包括核酸。所述核酸优选是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，或包括DNA和RNA组合(例如DNA/RNA混合寡核苷酸)。当所述至少一种裸药剂是或包含RNA时，其可优选地是mRNA、tRNA、siRNA和/或miRNA等。
在一个实施方案中，所述至少一种裸药剂是或包括一种或多种表达载体。例如，所述一种或多种表达载体可以是一种或多种DNA质粒，其包含要在一个或多个真核细胞中表达的一种或多种外源基因。
在一个实施方案中，当至少一种裸药剂是或包括核酸时，所述转染过程引起稳定表达，其中经转染的细胞中的转染核酸连续表达并传给子细胞。
在一个实施方案中，当至少一种裸药剂是或包括核酸时，所述转染过程引起瞬时表达，其中所转染的核酸仅表达相对短的时间且不传给子细胞。
在一个实施方案中，当至少一种裸药剂是或包括核酸时，所述方法还包括以下步骤：在转染过程后分离一个或多个真核细胞，测试在一个或多个分离真核细胞或其后代中由至少一种裸药剂所编码一种或多种肽的表达水平，基于表达水平来选择一个或多个分离真核细胞或其后代。
指引脉冲电磁信号的步骤优选在室温(例如20℃)进行，或在能设置为室温以上的温度(例如37℃)的孵化器中进行。
在一个实施方案中，所述指引脉冲电磁信号的步骤进行预定的时间段。在一个示例中，当在步骤a)产生转染复合体之前指引到至少一种裸药剂时，细胞接收电磁信号的时间是约15分钟或多至15分钟。然而，应理解若需要，能使用更长或更短的时间段。
在一个实施方案中，当在步骤c)形成经转染或经处理的细胞和/或在转染或处理步骤后指引到混合物或转染混合物时，所述细胞接收电磁信号的预定的时间段是约1-4小时或在此之间，进一步优选约3-4小时。然而，应理解若需要，能使用更长或更短的时间段。例如，在一个实施方案中，所述预定的时间段可多至16小时，或多至24小时。
脉冲电磁信号优选通过一个或多个电子装置产生。
所述一个或多个电子装置优选包括在使用时从其产生和/或发射脉冲电磁信号的发射工具。
所述发射工具优选包括一个或多个电子发射芯片，所述一个或多个电子发射芯片布置成在使用时产生、发出(emit)和/或发射脉冲电磁信号。
在一个实施方案中，提及发射工具或一个或多个电子发射芯片，可包括一个或多个传递器、至少一个传递器和至少一个接收器、或一个或多个收发器。因此，在一个示例中，脉冲电磁信号能发射自中心位置或主发射机，且能由一个或多个远程和/或从动接收器和/或收发器(用于后续从中重发射或发出)接收。
在一个实施方案中，所述电子装置具有单一发射工具或电子发射芯片。在一个示例中，这种单一发射工具或电子发射芯片足以提供脉冲电磁信号到组织培养板。在一个示范性实施方案中，提供单一发射工具或电子发射芯片附于或整合入含有一个或多个悬浮细胞的生物反应器。这种生物反应器通过用搅拌棒搅拌悬液来操作，如此细胞通常悬于培养基，经过发射工具或电子发射芯片，并因而暴露于本发明的脉冲电磁信号。
在一个实施方案中，所述电子装置具有2个或更多发射工具或电子发射芯片。所述2个或更多发射工具或电子发射芯片优选布置成彼此在电子装置中分开预定间隔距离。
所述预定间隔距离优选在使用时给以电磁脉冲信号脉冲的一个或多个物品或材料提供足以实现所需效果(即提高转染和/或胞内递送效率)的信号强度和/或提供平均或基本平均的电磁辐射/信号分布。
所述电子装置优选具有多个发射工具或电子发射芯片，以预定模式和/或阵列布置。
当单一发射工具或电子发射芯片足以提供本发明的有利特性时，发现具有多个发射工具或电子发射芯片可允许脉冲电磁信号跨更广范围表面区域递送，同时仍维持最大效果。申请人发现发射工具或电子发射芯片均匀分布成每18.5cm2至少一个芯片可提供足够最佳效果的覆盖率。
在一些实施方案中，所述设备包括一个或多个发射工具或电子发射芯片。在一些实施方案中，所述设备包括2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多发射工具或电子发射芯片。
在一些实施方案中，每约105-115cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，优选约110cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，有一个发射工具或电子发射芯片。
在一些实施方案中，每约50-60cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，优选约55cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，有一个发射工具或电子发射芯片。
在一些实施方案中，每约25-30cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，优选约27.5cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，有一个发射工具或电子发射芯片。
在一些实施方案中，每约15-20cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，优选约18.5cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，有一个发射工具或电子发射芯片。
在一些实施方案中，每约10-15cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，优选约12.2cm2本文所定义的设备壳体表面或物品表面，有一个发射工具或电子发射芯片。
本文所定义的物品优选包括细胞培养板、烧瓶、滚瓶和技术人员已知的其他容器。例如，如下定义的标准实验室微孔板T25、T75、T125、T175、T225和更大的细胞培养板。在使用时一个或多个发射工具或电子发射芯片根据装置上放置的这类容器表面积，和/或基于设备壳体表面设置成分开预定间隔。
在一个示范性实施方案中，6个发射工具或电子发射芯片在其上放置标准实验室微孔板的设备中提供。这些标准实验室微孔板以6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔和1536孔板(和如上)提供。这些微孔板一般具有标准化的尺寸，维度约为长度128mm，宽度85mm，从而使得板的表面积约110cm2。因此，在一个示范性实施方案中，所述6个发射工具或电子发射芯片能均匀间隔以提供最优预定间隔，用于提供有本发明所述脉冲电磁信号的任意这些板类型。在一个示例中，电子装置包括6个发射工具或电子发射芯片。所述6个发射工具或电子发射芯片优选布置成彼此分开预定距离，从而当使用时24孔板位于电子装置中、之上或与装置相对时，每个发射工具或芯片能够发送足够强度的电磁信号和/或被指引到板的4孔。
此外，发射工具或发射芯片优选位于24孔板的4孔附近，在中心或基本中心位置。
在一个实施方案中，需要多于一个发射工具或电子发射芯片，所述多个发射工具或电子发射芯片的间隔必需优化。为了实现每个发射工具或电子发射芯片之间的最优预定间隔，发射工具或电子发射芯片应以等于或基本等于所用电磁辐射频率波长一半的距离放置。此距离优选视作在任何定位平面相关或者2个或更多发射工具或电子发射芯片一起用作设备一部分。例如，若波长是12.4cm，发射芯片应放置成隔开约6.2cm，以在使用时生成最佳电磁场。
在一个示例中，所述预定间隔距离＝波长/2。
在一个示例中，X轴和/或Y轴的预定间隔距离在均匀间隔网格中每个发射工具或电子发射芯片之间是波长的一半。这种布置使得相消干涉的风险最小。
在一个实施方案中，所述电子装置包括壳体且一个或多个发射工具或电子发射芯片位于所述壳体。
所述壳体优选包括至少一个水平或平坦表面，以允许壳体以在使用时相对于一个或多个接收脉冲电磁信号的物品稳定的方式放置。或者，壳体能包括一个或多个弯曲或非平坦表面，以允许壳体以在使用时相对于一个或多个接收脉冲电磁信号的物品稳定的方式放置。
在一个示例中，所述壳体的至少一个表面包括一个或多个凹处用于定位一个或多个在使用时接收脉冲电磁信号的物品。
在一个示例中，所述电子装置是指用于实验室的转染板。
在一个实施方案中，所述壳体包括基底表面，以允许在使用时壳体直接或间接支撑于表面。所述壳体进一步优选包括与基底表面相对的上表面。上表面优选是其上能放置一个或多个在使用时接收脉冲电磁信号的物品的表面。
在一个示例中，所述物品可以是本领域技术人员已知的细胞培养板或烧瓶，其中可培养真核细胞。
在一个实施方案中，所述电子装置和/或壳体可附于容器和/或反应器等的外表面。例如，电子装置和/或壳体能经一个或多个附着工具或装置附着，包括任意或任意组合的一个或多个螺丝、螺母和螺栓、磁体、绳子、夹子、带子(strap)、啮合构件(inter-engaging member)、粘合剂和/或焊接等。
当位于壳体或电子装置上、之中或与其相对时，在使用时所述壳体上表面和/或发射工具与一个或多个接收脉冲电磁信号的物品之间的距离是约25cm或更少，20cm或更少，15cm或更少，10cm或更少或5cm或更少。所述距离进一步优选是约1cm。
脉冲电磁信号优选以预定顺序的脉冲提供。
在一个实施方案中，所述电子装置布置成以约2.2-2.6GHz范围的频率发射脉冲电磁信号，脉冲电磁信号进一步优选以约2.4GHz+/-50MHz或更优选2.45GHz+/-50MHz的频率发射。
在一个实施方案中，所述电子装置布置成以以2.4-2.4835GHz的工业、科学和医疗射频带(ISM带)范围内的频率发射脉冲电磁信号，优选2.45GHz+/-50MHz。
脉冲电磁信号优选以约50Hz或更低的频率脉冲，进一步优选约25Hz或更低，进一步优选约15Hz或更低。
各脉冲电磁信号优选持续约1ms-20ms。各脉冲进一步优选持续约1ms。
脉冲之间的时间段(也称为“静息期”或“放松期”)是约66ms或更少。
脉冲电磁信号的工作周期优选小于2％。
在一个实施方案中，所述电子装置中各发射工具或芯片提供的发射功率是+2dBm至+4dBm，约1mW，约2mW或约2.5119mW。
在一个实施方案中，所述脉冲电磁信号的预定频率是约2.2-2.6GHz,2.4GHz+/-50MHz或2.45GHz+/-50MHz，预定脉冲率是约15Hz或更少和/或工作周期小于2％，预定功率是+2dBm至+4dBm,约1mW,约2mW或约2.5119mW。
不希望受理论约束，将电磁波或信号用于本发明设备或方法被认为足以使H2O定期绕其偶极子旋转，静息期或放松期相对较长。H2O定期旋转被认为打断磷脂双层或真核细胞细胞膜中的氢键结合。此定期或间歇性低能扰动细胞膜因而被认为刺激与所述药剂、一些分子和/或细胞膜及其环境的相互作用增加，例如核酸或药剂与细胞膜。这被认为提高药剂跨细胞膜转运，引起一种或多种药剂如核酸、肽、小分子和其他药剂被一个或多个真核细胞的摄入增加。因此，可见本发明所述转染和/或胞内递送过程能用低能电磁波或信号显著改善。脉冲电磁信号脉冲之间的相对较长的静息期或放松期被认为足以维持细胞完整性。因而，在本发明上下文中，使用脉冲电磁信号、波或场被认为提供改善的分子跨细胞膜转运，引起更有效的转染和/或胞内递送药剂，如前所定义。
脉冲电磁信号优选用0.45-0.55的高斯频移键控(GFSK)发射。
脉冲电磁信号优选是射频(RF)数据信号。
脉冲电磁信号优选是脉冲电磁信号的数字顺序。
射频信号优选采用低功耗蓝牙(BLE)方案的公告(advertising)特征。公告的RF信号优选在频道37、38和39，分别对应频率2402MHz、2426MHz、2480MHz。
在一个实施方案中，脉冲电磁信号针对水性介质，所述介质包括所述至少一种裸药剂、所述混合物或转染混合物和/或转染后或处理后混合物。
在一个实施方案中，所述电子装置包括供电工具以向所用装置提供电力。供电工具优选包括供电器、一个或多个电池、动力电池、一个或多个充电电池和/或发电机等。
在一个实施方案中，所述电子装置包括在使用时控制电子装置和/或发射工具运转的控制工具。
在一个实施方案中，所述电子装置包括一个或多个电路板。发射工具优选能在一个或多个电路板上提供，通常采用集成电路形式，和/或定位其他组件如记忆工具。
在一个实施方案中，所述电子装置包括记忆工具，如记忆装置和/或数据存储器等。
所述电子装置的其他组件优选包括选择性操作设备所需的一个或多个组件，且当活跃时，其受控运转以产生脉冲电磁信号。例如，用户选择工具能在使用时在装置上提供以允许用户选择一种或多种条件、运转和/或一个或多个装置参数；展示工具以展示一种或多种设置和/或选择选项等。
在一个实施方案中，所述更多组件或供电工具包括一个或多个动力电池且其可全部包含于壳体内。
在一个实施方案中，所述电子装置的壳体以允许其相对于容器啮合和/或定位的形式提供，其中在使用时暴露于电磁信号的材料和/或一个或多个物品被定位。
在一个实施方案中，所述控制工具包括选项以允许用户选择以下的任一者或任意组合：所述脉冲电磁信号的信号频率、信号强度、信号功率、信号脉冲率和/或信号脉冲时间段等。在一个实施方案中，频率、强度、功率、脉冲率、脉冲时间段和/或其他参数等的选择可相对于在使用时暴露于脉冲电磁信号的材料和/或一个或多个物品特定形式、所述材料的量、定位设备供使用有关的容器尺寸和/或其他参数进行。
发现暴露于脉冲信号的细胞如同本发明的那些，在体外转染或处理期间提供了一致或基本一致的细胞分布或分散，与未使用脉冲技术且观察到细胞聚集的转染或处理相反[1]。
根据本发明的一方面，提供设备以提高真核细胞中的转染效率和/或保内递送，所述设备包括壳体、位于所述壳体中并布置成发射脉冲电磁信号的发射工具、控制至少所用发射工具运转的控制工具、向所用发射工具和/或控制工具提供电力的供电工具，在使用时所述脉冲电磁信号以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供。
所述设备的一个或多个预定参数优选能由设备厂商预设和/或可以根据用户需求由用户选择。
控制工具优选允许用户选定一个或多个用户可选择的预定参数。
在一个实施方案中，所述设备布置成直接或间接穿戴于人皮肤上或与之毗邻，以允许脉冲电磁信号在使用时被指引向人的身体区域，从而改善人的身体中的转染或处理过程。在此实施方案中，所述设备优选是穿戴式设备。
在一个实施方案中，能在设备上和/或与所述设备关联提供附着工具以允许与或相对于用户皮肤或身体外部，和/或用户穿戴的衣服或物品的内部和/或外部等可拆卸连接，以改善人的身体中发生的转染或处理过程。
在一个示范性实施方案中，所述设备是可穿戴设备，例如臂章，且臂章直接置于诸如给患者施用DNA或RNA疫苗的注射位点。
在一个示范性实施方案中，有施用疫苗的方法，包括将疫苗注射入对象，随后将本发明设备放置于注射位点并向注射位点提供本发明所述的脉冲电磁信号。
设备和/或发射工具或者一个或多个电子发射芯片优选布置于设备中，从而脉冲电磁信号针对所用用户皮肤或身体。例如，脉冲电磁信号能直接通过壳体第一表面，所述第一表面布置成直接或间接接触用户皮肤。
在一个实施方案中，所述设备布置成可植入人的身体或用户的皮肤下。例如，设备能在需要治疗的人的身体中的位点处植入。在此实施方案中，所述设备优选是植入物。
至少设备外壳优选由适合植入人的身体的材料包被和/或形成。
附着工具优选包括任意或任意组合的一个或多个带子、绳子、项链、坠子、带(belt)、手链、夹子、钥匙圈、挂带、
Figure BDA0003860455250000081
(钩环紧固)、按扣、钮扣、钮门、粘合剂、贴合剂(plaster)、缝线、回形针和/或生物相容性粘合剂等。
在一个实施方案中，提供所述设备，具有至少一个盛放工具或储库，以在使用时分别盛放或包含待转染入人的转染试剂。
所述盛放工具或储库优选布置于设备上，从而在使用时其可位于人的皮肤和/或与之毗邻。脉冲电磁信号能针对一个或多个人体部分以协助改善药剂经人皮肤吸收、递送和/或转染以及进入一个或多个人细胞。
在一个实施方案中，认为在使用时将脉冲电磁信号指引到用户皮肤可修饰用户皮肤渗透性以允许所述至少一种裸药剂摄取增加和/或提高。通常，皮肤渗透性修饰在脉冲电磁信号朝向用户皮肤期间发生至少一段时间。一般，用户皮肤渗透性修饰得到维持，然而一旦脉冲电磁信号终止，其随着时间减少。
在一个实施方案中，所述脉冲电磁信号的强度和范围在电子装置壳体相对于用户皮肤部分定位时足够，用于脉冲电磁信号穿过皮肤进入用户身体，且优选至少毗邻所述用户皮肤部分直接相邻的内部区域。
根据本发明的一方面，提供增加真核细胞转染效率和/或胞内递送的方法和/或增加真核细胞转染效率和/或胞内递送的设备。
根据本发明的另一方面，提供增加转染或非转染真核细胞中蛋白表达的方法和/或增加经转染的或非转染的真核细胞中蛋白表达的设备。
根据本发明的一方面，提供体内基因治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供适合在一个或多个真核细胞中转染和/或胞内递送的至少一种裸药剂；
b)将所述至少一种裸药剂引入或注入患者，以允许用至少一种裸药剂体内转染或处理所述患者的一个或多个细胞；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率和预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)指引或注射至少一种裸药剂之前指引到所述至少一种裸药剂，在步骤b)指引或注射至少一种裸药剂到所述患者期间指引到所述患者，转染或治疗步骤b)后指引到所述患者。
所述向患者引入至少一种裸药剂的方法优选包括口服、透皮、皮下和/或诸如此类。
根据本发明的一方面，提供体外基因治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供适合在一个或多个真核细胞中转染和/或胞内递送的至少一种裸药剂；
b)将至少一种裸药剂引入一个或多个在所述方法前取自患者的真核细胞，以形成混合物或转染混合物；
c)允许混合物或转染混合物经历胞内递送过程或转染过程以形成一个或多个经转染或处理的真核细胞；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率和预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)产生混合物或转染混合物之前指引到至少一种裸药剂，步骤b)指引到混合物或转染混合物，在步骤c)指引到混合物或转染混合物和/或在转染或治疗步骤c)后指引到经转染或经处理的细胞混合物。
根据本发明的另一方面，提供在真核细胞中提高转染效率和/或胞内递送的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供适合转染和/或胞内递送的裸核酸或蒽环类药物；
b)向一个或多个真核细胞加入裸核酸或蒽环类药物以形成混合物或转染混合物；
c)允许混合物或转染混合物经历转染过程或胞内递送过程以形成一个或多个经转染或经处理的真核细胞；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率和预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)产生混合物或转染混合物之前指引到裸核酸或蒽环类药物，在步骤b)指引到混合物或转染混合物，在步骤c)指引到混合物或转染混合物和/或在转染或胞内递送步骤c)后指引到经转染或经处理的细胞混合物。
一旦患者的细胞根据所述方法转染或处理，其随后任选地可以按需重新引入患者或另一患者。
根据本发明的一方面，提供协助真核细胞中基因疗法的设备，所述设备包括壳体、位于所述壳体中并布置成发射脉冲电磁信号的发射工具、控制至少所用发射工具运转的控制工具、向所用发射工具和/或控制工具提供电力的供电工具，在使用时所述脉冲电磁信号以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供。
根据本发明的另一方面，提供改变基因和/或蛋白表达的方法，所述方法包括步骤：
-提供一个或多个真核细胞
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率和预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号指引到所述真核细胞以在所述一个或多个真核细胞中改变基因表达和/或蛋白表达。
在一个实施方案中，所述方法杀死癌细胞并增强健康细胞和组织中的DNA修复。
在一个实施方案中，所述设备可植入患者，例如在癌组织区域或其毗邻区域，以治疗癌组织。此方法在癌组织距离患者皮肤较远时可能有用。
在一个实施方案中，所述设备由患者穿戴或与之毗邻，且能用于递送一种或多种药剂或药物至癌组织，例如位于皮下肿瘤如黑素瘤附近，和/或处理病毒。
因此，在一个实施方案中，所述设备能用于经患者皮肤递送脉冲电磁信号以与细胞DNA直接相互作用来促进细胞凋亡，与癌细胞中的细胞直接相互作用和/或协助产生健康细胞来修复DNA损伤。
在一个实施方案中，所述设备用于经患者皮肤递送脉冲电磁信以提供抗病毒效果。
在本发明的一方面，提供用本文所定义任一方法产生的细胞或其后代。
应注意本文提及转染和/或胞内递送效率提高，是指由至少一种裸药剂转染或处理的细胞数目增加和转染和/或胞内递送过程后细胞活力的增加或维持。
应理解本发明能用于基于实验室的环境或能扩大规模用于工业水平环境。
现在参考附图描述本发明的特定实施方案；其中
图1a和b阐明根据本发明一个实施方案的设备视图；
图2a和b阐明根据本发明第二个实施方案的设备视图；
图3阐明本发明另一个实施方案；
图4a和4b阐明本发明另外一个实施方案的立面图；
图5a和5b阐明在一个实施方案中采用本发明的试验；
图6阐明本发明一个实施方案的设备，其中电子装置包括6个发射芯片的阵列，以及在一个示例中能与电子装置一起使用的24孔板的示例；
图7显示来自根据本发明的实验的蛋白质印迹；
图8显示来自根据本发明的实验的另一蛋白质印迹。
在本发明的第一个实施方案中，提供采用电子装置形式的设备1，其能用于提高一种或多种药剂在真核细胞中的转染效率和/或胞内递送，用于向患者提供一种或多种治疗方法，用于增加药物和/或治疗剂递送到患者，用于提高/减少基因表达和/或蛋白表达等。
所述装置能够以预定频率、预定脉冲率、预定功率发射脉冲电磁信号，并持续预定时间段。预定参数能由厂商预设或可按需由用户选择。设备所用技术在下文中称为“根据本发明的脉冲技术”。
设备1包括壳体2，其包括含脉冲信号发射系统。特别地，在此示例中，脉冲信号发射系统包括线路板7，带有电子发射芯片4形式的发射工具，通常作为集成电路一部分提供，在使用时其允许当装置可操作时发射脉冲电磁信号。
在一个示例中，所述壳体能采用实验室转染板形式，包括基面3，与基面相对的上表面11，以及一个或多个位于上表面与基面3、11之间的侧壁13。
可提供采用控制单元10形式的控制工具以允许选择性操作设备1。在需要时，提供记忆装置6以允许存储和检索数据、一个或多个操作参数和/或软件等。控制单元优选包括微处理工具以允许处理数据等。
设备1还能包括一个或多个动力电池10以向设备提供电力。还可以任选地提供充电设施以允许动力电池从远程电源充电，而不是必须被替换。
应理解壳体2可以任何适当形式提供以用于其预期用途，且能提供有啮合工具以允许其位于例如容器内部或外部，在该容器中所述细胞待处理或定位。或者，壳体可作为容器一部分形成，在该容器中所述细胞待处理或定位。或者，上表面11能提供水平或平坦表面，其上能放置容器，所述细胞在该容器中处理或定位于该容器中。此外，凹处能限定在壳体的上表面11中以稳定支撑放置容器，容器采用例如细胞培养瓶、培养皿或其他细胞培养容器形式，从而壳体2位于容器下方且容器被支撑在凹处中。
电子发射芯片4布置在壳体2中以从设备1以一个或多个特定方向发射脉冲电磁信号。脉冲电磁信号的发射方向通常取决于设备1用于何种目的。例如，如果若设备1用作实验室转染板，在使用时信号一般通过上表面11被指引到可位于所述上表面的容器。如果设备用于用户穿戴，信号通常通过基面3被指引到用户。
在本发明的一个实施方案中，所述电子发射芯片布置在壳体2中，从而在使用时其与接触用户皮肤的壳体2表面或细胞储库间隔小于5cm，优选约1cm。这允许在使用时发射自芯片的电磁信号吧指引到患者或细胞储库。
本发明的设备设计成在室温(即约20℃)、冷于室温的温度例如制冷单元中使用，和/或能在高于室温的温度例如孵育单元或患者身体中使用。
在一个实施方案中，所述控制单元10编程成控制发射芯片，从而允许其以2.45GHz+/-50MHz频率，15Hz脉冲频率和约2mW功率发射脉冲电磁信号。应理解脉冲电磁信号相关参数能调整和/或可按需由用户选择。例如，若需要，脉冲电磁信号发射的时间可由用户选择。另外，功率能调整，尽管其通常保持在毫瓦特范围内，以避免使所用容器16内包含的细胞过度通电。在一个示例中，脉冲信号持续1ms，信号之间的静息期是66ms。这提供小于2％的工作周期。
在一个示例中，脉冲信号是RF信号，使用蓝牙LE操作的宣传特点，并以0.45-0.55的GFSK发射。
然而，应注意在工业、科学和医疗频率带(即2.4-2.4835GHz，优选2.45GHz+/-50MHz)中的任意频率发射通过所用电子设备是可行的。
在图1a的所述示例中，提供选择工具5以允许选择特定顺序的脉冲、频率、定时和/或脉冲强度，从而使设备能够根据用户需求配置。
在图1a和1b所示的实施方案中，设备1图解为直接放置于患者皮肤12的表面。此示例中，提供采用带14形式的附着工具以可拆卸地使设备1附着于用户身体。更特定地，带15绕患者手臂或肢体以将壳体2系紧在患者皮肤部分的所需位置。或者，接触皮肤的壳体基面3能在其上提供有粘附材料以允许其在所需位置附着于患者皮肤。当所用设备1运转时，发射自壳体2的脉冲电磁信号22进入至少一部分患者皮肤，且可能进一步进入患者身体的组织24和细胞。
在本发明的另一个实施方案中，如图2a和2b所示，所述设备壳体2位于药物递送“贴片”25(有时称为“透皮贴片”)顶部，其进而附着于一部分用户皮肤12。在此实施方案中，所述脉冲电磁信号22从壳体2发射，被指引进入贴片25并通过包括药剂或药物26的贴片到皮肤12。药物通过用户皮肤递送到用户组织和细胞24。使用脉冲电磁信号增强通过用户皮肤的药物吸收和摄取。
在本发明的另一个实施方案中，如图3所示，所述设备作为植入式装置提供。更特定地，设备的壳体2提供无菌外罩，其皮下植入用户皮肤12和/或用户组织24。植入后，设备从其发射脉冲电磁信号22。放置植入物使得信号22以想要的方向发射，朝向例如癌肿瘤28。
在本发明的另一个实施方案中，如图4a和4b所示，所述设备以坠子36形式提供。在插图中，坠子布置成戴在链37上，以将坠子置于患者或人39的喉咙/上胸部38水平。脉冲电磁信号22随后从坠子引入穿戴者身体，如图4a箭头41所示。当坠子戴在所需位置时，坠子36的面43布置成定位最接近人。
在一个示例中，本发明设备能够穿戴，以尽可能使病毒复制最小化和作为向穿戴者提供更多免疫学保护的工具。因此，在此实施方案中，当坠子36以喉咙/上胸部水平穿戴时，穿戴者的此关键呼吸区的免疫性增强。
通常，在任何一个实施方案中，本发明设备在用户皮肤部分提供或与之毗邻，其选择成在预定位置提供局部和集中治疗。
例如，若设备目的是提供患者的癌性肿瘤的治疗，则设备位于证实的癌性肿瘤附近或植入其中，例如，可存在于肝、肾、乳房或骨头。或者，如果提供设备以实现治疗益处或者限制或预防感染可能性，则设备能位于患者身体部分相邻外部，在该处，认为治疗或预防效果最有益，如在患者或人的喉咙区域。
因此，如果设备直接位于患者皮肤12，脉冲电磁信号经皮肤发射并进入肿瘤以提供肿瘤细胞状况的变化。如果设备与贴片或其他药物携带物品联用，如图2a和2b所示，则药物能够比常规更易穿过患者皮肤。认为脉冲电磁信号增加皮肤毛孔尺寸并允许药物通过空间更大。因而，使用本发明，药学药物或其他药剂能更有效递送。另外，目前不能透皮提供的药物或其他药剂，用本发明的方法则能够提供到体内。提供本发明设备可通过增加皮肤渗透性来提高药物递送和产生直接治疗益处。
在本发明的一个示例中，如图5a所示，制备备活性组装，包括本发明的细胞培养物与设备1的“夹心”布置，以产生脉冲电磁信号。含有结肠癌细胞的500ml培养容器32置于设备的壳体2之下，含有健康细胞的500ml培养容器34置于设备顶部。
培养容器的第二、相同组装如图5b所示制备，但没有本发明设备，其用作对照。
在测试进行中，活性和对照的2个组装培养“堆”置于37度培养箱18小时且在活性组装中，设备1操作产生2个方向40,42的电磁信号22以在所述18小时中穿过2个容器32,34至少一段时间。
结果随后通过显微镜观察评估，p53蛋白表达通过蛋白质印迹和分光光度法分析。
显微镜检测显示活性与对照培养物在细胞数及其条件方面的不同和主要差异。活性组装中的健康细胞34显示生长迅速且聚集在一起尝试形成组织，而癌性组织32中，细胞生长被中断。
关于图6，阐述了设备102的另一示例，用于提供另一实施方案所述脉冲电磁信号。而本发明的一些设备可包括单一电子芯片用于发射脉冲电磁信号，图6显示设备102，作为6个电子芯片104的阵列，用于发射脉冲电磁信号。尽管图3显示电子芯片104在设备102顶部，如此显示只是为清楚起见，芯片104实际包含于设备102内。壳体204包含基底105，与基底105相对的上表面107，以及一个或多个位于基底105与上表面107之间的侧壁109。
在设备102中间隔一定距离提供6个电子芯片104。芯片之间的间隔可以是任何所需距离，但在一个示例中，芯片间隔成当24孔细胞板106位于所用设备的上表面7时，一个发射芯片104位于4个孔的中央。因此，各电子芯片102将脉冲电磁信号指引到4个孔/24孔细胞板。打开/关闭操作开关108在设备102上提供以在使用时使设备在打开与关闭状态间移动。
作为简单的概述，在一个示例中，材料包含于适当容器如培养容器、瓶或皿，所述材料包括真核细胞与裸核酸(DNA、RNA或任一的小区段)的合并分散液。所述适当容器在一个实施方案中位于102上，脉冲电磁信号发射自设备并经过容器的壁且进入材料。
本发明的脉冲技术能用于转染发生前的裸药剂，例如核酸。本发明的脉冲技术还能用于或另外用于混合物或转染混合物，包括裸药剂和真核细胞。另外或替代地，一旦转染和/或胞内递送发生，本发明的脉冲技术能用于细胞，和/或未经历转染和/或胞内递送的真核细胞以增加那些细胞的蛋白表达。
在下列用于例证本发明的实验中，相同的本发明脉冲技术用于在与不同真核细胞系混合前的裸药剂，和/或转染过程和/或胞内递送过程中混合裸药剂的真核细胞系。
在处理前24小时，人结肠肿瘤(HCT)116细胞(贴壁细胞)(ATCC,美国-
Figure BDA0003860455250000121
CCL-247TM)以每孔3x105细胞的密度接种于两个
Figure BDA0003860455250000122
6孔板(9.6cm2)，终体积为5mLDulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(美国的赛默飞世尔(Thermo Fisher))+10％胎牛血清(FBS)(美国的海克隆(Hyclone))。
所用的裸药剂是溶于无水乙醇的阿霉素(0.25μM)(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich))并给予细胞1小时的处理期，37℃,5％CO2孵育。
处理后，移出培养基，向细胞加入新鲜培养基。一块板直接在37℃,5％CO2孵育，第二块板置于不同培养箱并用本发明脉冲技术进行脉冲，37℃,5％CO2。
蛋白提取物在治疗3小时、6小时、9小时、16小时或24小时时收集以用于SDS-page分析。
下列蛋白质印迹操作如参考文献[5]所列。
制备用于蛋白质印迹的蛋白提取物
1.对于蛋白提取，细胞用冰冷PBS洗2次，然后在NP-40提取缓冲液(50mM Trisph7.5；10％甘油；0.1％“NP-40Alternative”(美国的默克密理博(Merck Millipore))；100mM NaCl；0.2mM EDTA)中裂解，所述缓冲液补充有1X CompleteTM蛋白酶抑制剂混合物(瑞士的罗氏(Roche))。提取物进行超声波处理(20秒,20％振幅)，蛋白浓度用BCATM蛋白测定试剂盒(美国的赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))根据厂商建议测定。
蛋白质印迹方案
1.蛋白提取物(15/20μg，取决于实验)补充有0.1M二硫苏糖醇(DTT)和1X LDS缓冲液(美国的英杰公司(Invitrogen))，在95℃加热10分钟，然后加样于NuPAGE 10％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(美国的英杰公司)。
2.蛋白样品通过使用1X MOPS电泳缓冲液的电泳(100V)分离。蛋白在12V过夜转到1X转移缓冲液中的硝酸纤维膜(Protran 0.1μm，来自美国的通用电气医疗集团(GEHealthcare))上，所述转移缓冲液补充有20％甲醇。1X转移缓冲液制备自10X Wet印迹溶液，含有144g甘氨酸和30g Tris-Base，终体积为1L，milli-Q水。
3.膜在稀释于PBS-0.1％Tween20的5％BSA中封闭30分钟，然后用一抗(小鼠单克隆抗体DO1)过夜孵育。PBS-Tween20中洗涤15分钟后，膜用对应二抗(HRP缀合的驴抗小鼠)孵育1小时。所有缀合辣根过氧化物酶(HRP)的二抗购自杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoResearchlab)并以5％BSA–PBS-Tween20中1:10000/1:15000稀释度(取决于抗体)使用。
在孵育结束时，膜用PBS-Tween20洗2次，持续15分钟，接着用PBS最终洗10分钟。化学发光信号在HyperfilmTM ECL(美国的思拓凡(Cytiva))上检测，使用Amersham ECL蛋白质印迹检测系统(美国的思拓凡)。
结果
关于图7，从蛋白质印迹可见，p53α(p53蛋白的主要同种型)在用根据本发明的脉冲技术处理后上调。加入药物后3小时立即观察到效果，且在处理后24小时最明显。其他p53同种型在阿霉素处理后于根据本发明的脉冲技术影响下上调更多，即d133p53α,d133p53β和d160p53β。
在蛋白质印迹中，γH2AX用作标记物以确保如果观察到任何效果，其不是由电离辐射导致。γH2AX表达在电离辐射存在时变化，并且因为在根据本发明的脉冲技术与对照臂之间没有观察到变化，结论是本发明的脉冲技术不发射电离辐射。
Ku80用作加样对照以确保等同浓度的各样品加样到各孔。相等浓度的Ku80使得蛋白质印迹中的其余带可比。
关于图8，在另一实验中，一些细胞通过本发明的脉冲技术处理，一些细胞不接受本发明的脉冲技术作为对照，持续5天，不加入阿霉素。没有观察到p53α表达变化。当0.25μM阿霉素加入细胞1小时，受到根据本发明的脉冲技术影响的细胞显示在16小时后相较于对照显著过度生成p53α。
综上，有明确的证据表明，用根据本发明的脉冲技术处理细胞可增强细胞从培养基摄取阿霉素的能力，因为多种p53同种型在脉冲技术臂中的上调多于对照臂。结论是此效果并非由电离辐射导致，因为辐射标记物gH2AX在脉冲技术臂与对照臂之间保持不变。
因此，抗癌药物递送增强与根据本发明的脉冲技术直接治疗的综合效应有益地影响了经p53致癌基因的复制调节并改善癌治疗。此外，本发明的脉冲技术对健康细胞未突变p53的影响引起这些细胞的修复增加。
尽管上述示例显示仅胞内递送阿霉素形式的裸药剂在采用HCT 116细胞形式的真核细胞和阿霉素暴露于本发明脉冲技术后显著改善，申请人充分预期和预测向一个或多个真核细胞(使用HCT 116细胞或其他真核细胞)胞内递送一种或多种阿霉素以外的裸药剂，会在暴露于本发明的脉冲技术后显著改善。申请人还充分预期和预测一种或多种裸药剂的胞内递送会进一步显著改善，此时在与一个或多个真核细胞(单独或除了将混合物或转染混合物暴露于本发明的脉冲技术外)混合前和/或在胞内递送和/或转染步骤发生后，至少一种裸药剂暴露于本发明脉冲技术。这些预测和预期是基于申请人在共同未决申请中已经收集的数据，所述申请要求来自英国专利申请GB2004412.9,GB 2009296.1,GB2004411.1和GB2009297.9的优先权，其内容通过引用纳入本文，显示当a)加入真核细胞前的转染混合物；b)包括转染混合物与真核细胞在内的转染复合体，和/或c)转染过程中和/或之后暴露于本发明脉冲技术时胞内一种或多种与两亲性构健体关联的转染药剂在真核细胞中的转染效率显著提高。这些实验的数据可如下重复，显示支持本申请的权利要求组。申请人预测当药剂与两亲性构健体相关联时，转染效率和/或胞内递送改善的机制相同或类似，相比使用“裸药剂”(未与两亲性构建体关联)时。这是因为本发明的脉冲电磁波或信号被认为足以使H2O定期绕其偶极子旋转，静息期或放松期相对较长。H2O定期旋转被认为打断真核细胞的磷脂双层或细胞膜中的氢键结合。此定期或间歇性低能扰动细胞膜因而被认为刺激与药剂、一些分子和/或细胞膜及其环境的相互作用增加，例如核酸或药剂与细胞膜。脉冲电磁信号脉冲之间的相对较长的静息期或放松期被认为足以维持细胞完整性。
在下列获自申请人共同未决专利申请的实验中，相同的本发明脉冲技术在与不同真核细胞系混合前用于转染混合物(转染药剂+两亲性构健体)，和/或在转染过程中用于与转染混合物混合的真核细胞系。
用于实验的核酸包括DNA质粒材料，包含精氨酸升压素(AVP)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子或胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)启动子。还使用巨细胞病毒(Adluc)质粒、荧光素酶对照载体(Renilla)质粒或绿色荧光蛋白(GFP)质粒。
用于实验的两亲性构建体是含有阳离子聚合物(TurbofectTM)(美国的赛默飞世尔(Thermo Fisher))聚乙烯亚胺(PEI)(美国的飞世尔科技(Fisher Scientific))，或TransIT2020(美国的Mirus Bio)的转染试剂。
用于实验的细胞系是中国仓鼠卵巢–K1(CHO)细胞(贴壁细胞)(ATCC,USA-
Figure BDA0003860455250000141
CCL-61TM)、人胚肾(HEK)293freestyle细胞(悬浮细胞)(美国的赛默飞世尔)、人结肠肿瘤(HCT)116细胞(贴壁细胞)(ATCC,美国-
Figure BDA0003860455250000142
CCL-247TM)或Jurkat E6(悬浮T细胞)(ECACC),英国)。
为了用上述组分确定细胞转染过程的效率，荧光素酶活性或绿色荧光蛋白的量用适当设备测量。
所选的DNA质粒材料与两亲性构建体用已知技术复合，以形成转染混合物。在一些实验中，此转染混合物接受本发明的脉冲技术。转染混合物(有或没有暴露于脉冲技术)随后在适当细胞培养容器中混合于一种哺乳动物细胞系分散液，以形成转染复合体。此细胞容器随之置于本发明的设备的壳体上并接受预定时间段的上述脉冲技术。然后，脉冲电磁信号的发射终止且允许材料达到平衡。另外，对照实验也用相同材料实施，混合要求相同，但没有本发明的脉冲技术。
关于实验所用方法、结果和发现的更详细描述如下所提供。
方法
实验1-CHO K1和HCT116细胞用Adluc和Renilla质粒转染，使用任一PEI或 Turbofect作为两亲性构建体
进行此实验以探寻本发明的脉冲技术对贴壁中国仓鼠卵巢(CHO)K1细胞(ATCC,美国)和HCT116(人结肠癌细胞系)(ATCC,美国)中转染过程的效果，在PEI(美国的飞世尔科技)或Turbofect(美国的赛默飞世尔)两亲性构建体中使用Adluc和Renilla质粒。脉冲技术应用于a)仅转染过程中的细胞和转染混合物(转染复合体)；和b)在与细胞形成转染复合体前的转染混合物和随后转染过程中的转染复合体。
消耗品
Opti-MEMTMI减血清培养基(美国的赛默飞世尔)
Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)(美国的赛默飞世尔)
胎牛血清(FCS)(美国的海克隆(Hyclone))
2x24孔板Nunc(1.9cm2/孔)(美国的赛默飞世尔)
200ng AdLuc质粒/孔(表达荧光素酶的质粒/DNA)(由英国的邓迪大学制备)
2ng Renilla质粒/孔(表达荧光素酶的质粒/DNA)(由英国的邓迪大学制备)
Alfa AesarTM聚乙烯亚胺,线性,M.W.25,00(PEI)(美国的飞世尔科技)
Turbofect(美国的飞世尔科技)
方法步骤
对照-使用PEI
1. 650μL Opti-MEM培养基在第一管中混合2.6μg AdLuc质粒和26ng Renilla质粒；
2. 650μL Opti-MEM培养基在第二管中混合7.88μg PEI；
3.第二管的内容物以逐滴方式与第一管混合，同时温和涡旋，直至达到1.3mL混合物的终体积，使用Vortex-Genie 2,Model G560E,(美国的Scientific Industries)。
4.转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟；
5. 100μL的此经孵育转染混合物随后分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有A1-A6的孔。这形成转染混合物。
发明-在转染复合体产生前对转染混合物用PEI的脉冲技术
1.然后，重复上述步骤1-3，但在步骤4-通过将第一管置于本发明所述的脉冲电磁信号装置上，形成转染混合物的混合物室温(约20℃)孵育15分钟。脉冲装置如上所述运转(即脉冲装置在2.45GHz+/-50MHz,2mW功率用15Hz脉冲频率运转)。
2.100μL的此经孵育的经脉冲的转染混合物分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有B1-B6的孔；
对照-使用Turbofect
1. 650μL Opti-MEM培养基在第一管中混合2.6μg AdLuc质粒和26ng Renilla质粒；
2.加入13μL Turbofect并通过涡旋混合，使用Vortex-Genie 2,Model G560E,(美国的Scientific Industries)；
3.转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟
4. 100μL的此经孵育转染混合物分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有C1-C6的孔。
发明-在转染复合体产生前对转染混合物用脉冲技术的Turbofect
1.就Turbofect对照重复上述步骤1-2。在步骤3-通过将第一管置于本发明所述脉冲电磁信号装置上，转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟。脉冲装置在2.45GHz+/-50MHz,2mW功率用15Hz脉冲频率运转。
2. 100μL的此经孵育脉冲转染混合物分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有D1-D6的孔；
加入板1和2的细胞系
-对于板1和2，转染复合体如下产生：向两个24孔板的各孔以2x104细胞/孔加入CHO K1细胞或HCT116细胞，随之补足至终体积600μL Dulbecco修饰的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FCS)。特别地，A1-A3、B1-B3、C1-C3和D1-D3具有加入的CHO K1细胞；A4-A6、B4-B6、C4-C6和D4-D6具有加入的HCT 116细胞；
-板1和2在37℃，5％CO2的培养箱中孵育3小时；
-在板1中，没有脉冲技术在3小时孵育期中给予转染复合体，而板2在3小时孵育期中接受根据本发明的脉冲技术。
-4小时后，孔加满含Turbofect转染试剂的DMEM。
-测量和记录各实验条件的3个孔的平均值。
一些情况下，上述实验用第一类脉冲技术进行，其中仅在脉冲装置中提供单一传递器(技术1脉冲技术)。一些情况下，上述实验用第二类脉冲技术进行，其中多个传递器的阵列用于脉冲装置(技术2脉冲技术)。特别地，在使用2类脉冲技术的实验中，提供6个传递器且各传递器在24孔板的4个孔中央或基本中央布置，此时板位于脉冲装置上。
萤光素酶试验方案-使用双重萤光素酶报告试验系统(美国的普洛麦格 (Promega))
方法步骤
1.转染实验进行后24小时，从细胞移除培养基。
2.细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗2次。
3.向细胞加入100μL 1x被动裂解缓冲液(美国的普洛麦格)。
4.细胞在37℃孵育15分钟，同时在Belly
Figure BDA0003860455250000151
Orbital振荡器(西格玛-奥德里奇(Sigma,Aldrich))上温和摇动。
5. 10μL细胞取自各孔并置于白色96孔板。
6.细胞在微孔板光度计LB 96V(德国的(EG&G Berthold))中分析，使用双重萤光素酶试验系统操作(美国的普洛麦格)。
7.分析如下进行：注射30μL萤光素酶试验试剂II(美国的普洛麦格)以测量萤火虫荧光素酶活性，随后是30μL Stop&GloTM试剂以阻断萤火虫荧光素酶并测量海肾荧光素酶活性。
8.然后，裂解的提取物在-20℃保存以进行蛋白质印迹(如果需要)。
9.细胞中的转染效率如下获取：将细胞置于
Figure BDA0003860455250000161
活细胞分析系统(GermanyEssen Bioscience,USA)72-96小时。收集数据并在
Figure BDA0003860455250000162
中分析。
实验1的结果
表1显示CHO K1细胞实验的结果，其中技术1脉冲技术与Turbofect两亲性构健体和相关方法一起使用。
表1(技术1脉冲技术)
技术1&Turbofect 对照 脉冲技术
发光(a.u.) 40147 131502
发光(a.u.) 62199 100925
发光(a.u.) 94460 117862
平均发光(a.u.) 65602 116763
％脉冲技术相较于对照的增加–178％
脉冲技术相较于对照的平均增加倍数-1.8
T检验–0.024
表2显示CHO K1细胞实验的结果，其中技术2脉冲技术与Turbofect两亲性构健体和相关方法一起使用。
表2(技术2脉冲技术)
技术1&Turbofect 对照 脉冲技术
发光(a.u.) 58615 94228
发光(a.u.) 73946 184908
发光(a.u.) 91469 242183
平均发光(a.u.) 74676.67 173773
％脉冲技术相较于对照的增加–232.7％
脉冲技术相较于对照的平均增加倍数–2.3
T检验–0.044
表3显示HCT 116细胞实验的结果，其中脉冲技术与Turbofect两亲性构健体和相关方法一起使用。
表3
技术1&Turbofect 对照 脉冲技术
发光(a.u.) 16794 23706
发光(a.u.) 14626 24841
发光(a.u.) 15555 16510
平均发光(a.u.) 15658.33 21685.67
％脉冲技术相较于对照的增加–138.5％
脉冲技术相较于对照的平均增加倍数–1.4
T检验–0.044
关于表1和2，就对照和根据本发明的脉冲技术(Pulzar)显示与Turbofect两亲性构健体相关的CHO K1细胞中的转染效率。每种条件包含3次重复。就所有细胞测量荧光的量，作为荧光素酶活性的量度(即转染)。
可见CHO K1细胞中用技术1脉冲技术的转染效率相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.024，平均增加倍数为1.8且％增加为178.0。
还可见CHO K1细胞中用技术2脉冲技术的转染效率相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.044，平均增加倍数为2.3且％增加为232.7。
此外，可见用技术2脉冲技术(即6电子发射芯片阵列)的实验所产生的结果显著优于用技术1脉冲技术的实验。
关于表3，就对照和根据本发明的脉冲技术(Pulzar)显示与Turbofect两亲性构健体相关联的HCT 116细胞中的转染效率。每种条件包含3次重复。就所有细胞测量发光的量，作为荧光素酶活性的量度。
可见HCT 116细胞用脉冲技术的转染效率相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.044，增加倍数为1.4且％增加为138.5。
因此，可推断本发明的脉冲技术使贴壁CHO K1细胞和HCT 116细胞中的转染效率相较未用脉冲技术时显著增加。此外，6个电子发射芯片产生的转染效率相较于仅用单一电子发射芯片有进一步增加。
实验2-贴壁HCT细胞用含IGFBP3启动子的质粒或含SV40启动子的质粒转染，PEI作 为两亲性构建体
进行实验2以探寻本发明的脉冲技术对贴壁HCT116(人结肠癌细胞系)(ATCC,美国)中转染过程的效果，使用PEI(美国的飞世尔科技)两亲性构建体中含IGFBP3启动子或SV40启动子的Adluc和Renilla质粒。实验2遵循实验1的方法。
实验2的结果
表4
表4显示IGFBP3启动子的HCT 116细胞实验的结果，使用PEI两亲性构建体和相关方法。
Figure BDA0003860455250000171
％增加倍数＝168.4991974
t检验p<0.004154274
表5
表5显示SV40启动子的HCT 116细胞实验的结果，使用PEI两亲性构建体和相关方法。
Figure BDA0003860455250000172
％增加倍数＝155.2371016
t检验p<0.026953884
关于表4和5，显示与PEI两亲性构健体相关的DNA质粒在HCT 116细胞中的转染效率(对照和根据本发明的脉冲技术(Pulzar))，所述质粒包含IGFBP3启动子或SV40启动子。每种条件进行2次实验，其是3次重复。对所有细胞检测发光的量，作为荧光素酶活性的量度。
可见HCT 116细胞中用脉冲技术的转染效率(由IGFBP3启动子显示)相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.004，％增加为168.5。
可见HCT 116细胞中用脉冲技术的转染效率(由SV40启动子显示)相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.027，％增加为155.2。
因此，可得出结论，本发明的脉冲技术使贴壁HCT 116细胞的转染效率相较于未用脉冲技术时显著增加。
实验3-用GFP质粒转染悬浮HEK 293Freestyle细胞，PEI作为两亲性构建体
进行此实验以探寻本发明的脉冲技术对人胚肾(HEK)悬浮细胞293Freestyle中转染过程的效果，使用PEI两亲性构建体中的绿色荧光蛋白(GFP)质粒。脉冲技术仅在转染过程中应用于细胞和转染试剂。
消耗品
Opti-MEMTMI减血清培养基(美国的赛默飞世尔)
绿色荧光蛋白(GFP)质粒(由英国的邓迪大学制备)
293-Freestyle悬浮细胞(美国的赛默飞世尔)
293-自由表达培养基(美国的西格玛-奥德里奇)
Alfa AesarTM聚乙烯亚胺,线性,M.W.25,00(PEI)(美国的飞世尔科技)
脉冲技术仅用于试剂和细胞混合物时的方法步骤
1.转染前一天接种6x105-7x105 293-F细胞/mL。
2.转染前一天计数细胞，若需要稀释细胞到1x106细胞/mL密度。
3.转染15μg绿色荧光蛋白(GFP)质粒/瓶，具有30μL 293-自由表达培养基/瓶。
4.使用的DNA:PEI比为1:2。
5.根据厂商说明使用293-自由表达培养基(https://www.sigmaaldrich.com/ content/dam/sigma-aldrich/docs/SAJ/Brochure/2TB5515.pdf)–用户方案TB515 Rev.B0411JN[4]。
6.为制备DNA-转染混合物：
-向烧瓶加入2.4mL Opti-MEM
-向烧瓶加入30μg GFP质粒
加入60μL 293-自由表达培养基
-将所得混合物体积分入2个125mL锥瓶，各含有溶于28.8mL 293表达培养基的1x106细胞/mL；
-2个烧瓶在8％CO2,125rpm下孵育于Bellydancer定轨摇床(西格玛-奥德里奇)的2个单独培养箱中。用根据本发明的脉冲技术将一个烧瓶在一个培养箱中脉冲3小时，没有任何脉冲技术的另一烧瓶在第二培养箱中孵育。3小时后，2个烧瓶均置于同一培养箱而没有任何脉冲技术，以允许随着时间按需测量转染效率(实验情况下是120小时)。
实验3的结果
测量与PEI两亲性构健体相关的GFP质粒在HEK 293Freestyle悬浮细胞中的转染效率(对照和根据本发明的脉冲技术(Pulzar))。
HEK 293Freestyle悬浮细胞中用脉冲技术的转染效率(通过所测平均绿色荧光的量显示)相较于对照细胞显著提高，t检验值为0.05，观察到GFP表达峰值增加2.3倍。
HEK 293Freestyle悬浮细胞中用脉冲技术的转染效率(通过所测平均绿色荧光的量显示)相较于对照细胞显著提高，t检验值小于0.05，观察到GFP表达峰值增加超过50％。delta计算成标记实验时间段中GFP表达的％增加。
因此，可得出结论，本发明的脉冲技术使HEK 293Freestyle悬浮细胞中的转染效率相较未用脉冲技术时显著增加。
实验4-悬浮Jurkat E6细胞用Adluc和Renilla质粒转染，使用PEI或TransIT2020 作为两亲性构建体
进行此实验以探寻本发明的脉冲技术对Jurkat E6细胞(人白血病T细胞成淋巴细胞)(欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated CellCultures)(ECACC),英国)中转染过程的效果，使用PEI(美国的赛默飞世尔)或TransIT2020(美国的Mirus Bio)两亲性构建体中的Adluc和Renilla质粒。脉冲技术仅在转染过程中应用于细胞和转染药剂。脉冲技术a)仅应用于转染过程中的细胞和转染混合物(转染复合体)；和b)在与细胞形成转染复合体前应用于转染混合物和随后转染过程中应用于转染复合体。
消耗品
Opti-MEMTMI减血清培养基(美国的赛默飞世尔)
胎牛血清(FCS)(美国的海克隆)
RPMI培养基(英国的西格玛奥德里奇)
2x24孔板Nunc(1.9cm2/孔)(美国的赛默飞世尔)
1μg AdLuc质粒/孔(表达荧光素酶的质粒/DNA)(由英国的邓迪大学制备)
80ng Renilla质粒/孔(表达荧光素酶的质粒/DNA)(由英国的邓迪大学制备)
Alfa AesarTM聚乙烯亚胺,线性,M.W.25,00(PEI)(美国的飞世尔科技)
TransIT2020(美国的Mirus Bio)
方法步骤
对照-使用PEI
1. 650μL Opti-MEM培养基在第一管中混合13μg AdLuc质粒和1μg Renilla质粒；
2. 650μL Opti-MEM培养基在第二管中混合42μg PEI；
3.第二管的内容物以逐滴方式混合第一管，同时温和涡旋，直至达到1.3mL混合物的终体积，使用Vortex-Genie 2,Model G560E,(美国的Scientific Industries)；
4.转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟；
5. 100μL的此经孵育转染混合物随后分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有A1-A6的孔。这形成转染混合物。
发明-在转染复合体产生前对转染混合物用PEI的脉冲技术
1.然后，重复上述步骤1-3，但在步骤4-将第一管置于本发明所述脉冲电磁信号装置，形成转染混合物的混合物室温(约20℃)孵育15分钟。脉冲装置如上所述运转(即脉冲装置在2.45GHz+/-50MHz,2mW功率用15Hz脉冲频率运转)。
2. 100μL的此经孵育脉冲转染混合物分配入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有B1-B6的孔；
对照-使用TransIT2020
5. 700μL Opti-MEM培养基在第一管中混合13μg AdLuc质粒和1μg Renilla质粒；
6.加入42μL TransIT2020并通过涡旋混合，使用Vortex-Genie 2,Model G560E,(美国的Scientific Industries)；
7.转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟
8. 50μL的此经孵育转染混合物分散入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有C1-C6的孔；
发明-使用TransIT2020在转染复合体产生前对转染混合物用脉冲技术
3.就TransIT2020对照重复上述步骤1-2。在步骤3-将第一管置于本发明所述脉冲电磁信号装置上，转染混合物室温(约20℃)孵育15分钟。脉冲装置在2.45GHz+/-50MHz,2mW功率用15Hz脉冲频率运转。
4. 50μL的此经孵育脉冲转染混合物分散入两个24孔板(板1和2)中每一个上面标记有D1-D6的孔；
加入板1和2的细胞系
-对于板1和2，转染复合体如下产生：向两个24孔板的各孔以2x105细胞/孔加入含Jurkat E6细胞的RPMI和10％FCS，随之补足至600μL终体积。
-板1和2在37℃,5％CO2的培养箱中孵育过夜；
-在板1中，没有脉冲技术在过夜孵育期中给予转染复合体，而板2在过夜孵育期中接受根据本发明的脉冲技术3小时。
-测量和记录各实验条件的3个孔的平均值。
萤光素酶试验操作-使用双重萤光素酶报告试验系统(美国的普洛麦格)
方法步骤-如上所列
实验4的结果
表6
表6显示AdLuc和Renilla质粒的Jurkat E6细胞实验的结果，使用PEI或TransIT2020两亲性构建体和相关方法。
平均荧光素酶活性 对照 脉冲技术
发光(a.u.)Exp A 15840.33 26452.00
发光(a.u.)Exp B 15840.33 31919.00
发光(a.u.)Exp C 15840.33 35771.67
Exp A–其中脉冲技术仅应用于转染复合体(即转染混合物加入细胞之后且在孵育期间)。
Exp B–其中脉冲技术仅应用于转染混合物(加入Jurkat E6细胞前)。
Exp C–其中脉冲技术应用于转染混合物(加入Jurkat E6细胞前)和随后的转染复合体(即转染混合物加入细胞之后且在孵育期间)。
关于表6，图上各柱代表3次重复的平均值。当仅转染复合体接受脉冲技术时，观察到转染效率增加1.7倍。当仅转染混合物接受脉冲技术时，观察到转染效率增加2.0倍。当转染混合物和转染复合体都接受脉冲技术时，观察到转染效率增加2.3倍。因此，可得出结论，使用根据本发明的脉冲技术在单独用于转染混合物或转染复合体时显著增加转染效率，但在脉冲技术都应用于转染混合物和转染复合体时观察到转染效率进一步提高。
参考文献
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Claims (31)

1.一种提高真核细胞转染效率和/或胞内递送的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供适合在一个或多个真核细胞中转染和/或胞内递送的至少一种裸药剂；
b)向一个或多个真核细胞引入所述至少一种裸药剂以形成混合物或转染混合物；
c)允许所述混合物或转染混合物经历转染过程或胞内递送过程以形成一个或多个经转染或经处理的真核细胞；
其特征在于，所述方法包括以下步骤：将以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供的脉冲电磁信号，在步骤a)产生所述混合物或转染混合物之前指引到所述至少一种裸药剂，在步骤b)指引到所述混合物或转染混合物，在步骤c)指引到混合物或转染混合物和/或在步骤c)后指引到所述经转染或经处理的真核细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种裸药剂是适合转染和/或胞内递送的任何药剂和/或以下的任一者或任意组合：核酸、药学和/或治疗药剂或化合物、治疗和/或药学感兴趣的药剂、小于5千道尔顿的小分子或小分子物质、等于或大于5千道尔顿的大分子或大分子物质、一种或多种蛋白、疫苗、一种或多种抗体、或有机药剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述药学药剂是蒽环类药物或阿霉素。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述真核细胞悬于溶液和/或附于基质。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是永生细胞或者源自人和/或动物对象的组织的细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述真核细胞是源自人和/或动物对象的细胞，且包含T细胞、淋巴细胞、粒细胞和/或巨噬细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述至少一种药剂与一种或多种载体药剂和/或溶解剂混合的步骤。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种裸药剂是或包括核酸，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA与RNA的组合、mRNA、tRNA、siRNA或miRNA。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种裸药剂是或者包括一种或多种表达载体。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当所述至少一种裸药剂是或包括核酸，且转染过程导致瞬时表达时，或其中至少一种裸药剂是或包括核酸，且所述方法还包括以下步骤：在转染过程后分离一个或多个真核细胞，测试所述至少一种裸药剂所编码的一种或多种肽在一个或多个分离的真核细胞或其后代中的表达水平，和基于所述表达水平选择一个或多个分离的真核细胞或后代。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述指引脉冲电磁信号的步骤进行预定的时间段。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中当指引脉冲电磁信号到所述至少一种裸药剂时，所述预定的时间段是约15分钟；和/或当在转染和/或胞内递送期间或之后指引脉冲电磁信号到所述混合物或转染混合物时，所述预定的时间段是约1-4小时。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脉冲电磁信号由一个或多个电子装置产生，且其中所述一个或多个电子装置包括在使用时从其产生和/或发射脉冲电磁信号的发射工具或者一个或多个电子发射芯片。
14.如权利要求13所述的方法，其中每个电子装置包括单一发射工具或电子发射芯片，或每个电子装置包括多个发射工具或电子发射芯片，任选地，其中所述电子装置包括多个发射工具或电子发射芯片且所述发射工具或电子发射芯片的每一个布置成彼此间隔一定距离，从而所述间隔距离等于脉冲电磁信号波长的约一半；或其中所述电子装置包括至少一个发射工具或电子发射芯片/105-115cm2的所述装置壳体表面，或在使用时置于所述电子装置上一个或多个物品的表面；或其中当在使用时24孔板位于所述电子装置中、所述电子装置上或与所述电子装置相对时，所述电子装置包括6个发射工具或电子发射芯片且所述芯片布置成在装置内彼此间隔一定距离，从而一个发射工具或电子发射芯片被指引到所述24孔板中的4个孔。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述发射工具与在使用时所述接收脉冲电磁信号的一个或多个物品之间的距离是约25cm或更少，约20cm或更少，约15cm或更少，约10cm或更少，约5cm或更少，或者等于或约等于1cm或更少。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脉冲电磁信号的预定频率是约22.45GHz+/-50MHz，约2.2-2.6GHz，约2.4GHz+/-50MHz或约2.45GHz+/-50MHz，
和/或
其中所述脉冲电磁信号的预定脉冲率是约50Hz或更小，约25Hz或更小，约15Hz或更小和/或工作周期小于2％，
和/或
其中所述脉冲电磁信号的每个脉冲持续约1ms-20ms或是约1ms，任选地，其中所述脉冲电磁信号的每个脉冲之间的静息期持续约66ms或更少，
和/或
其中每个发射工具或电子发射芯片提供的预定功率是约+2dBm至+4dBm，约1mW，约2mW或约2.5119mW，
和/或
其中所述脉冲电磁信号用0.45-0.55的高斯频移键控(GFSK)发射。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脉冲电磁信号的预定频率是2.4GHz+/-50MHz或2.45GHz+/-50MHz，其中预定脉冲率是15Hz或更小和/或工作周期小于2％，且其中预定功率是+2dBm至+4dBm，约1mW，约2mW或约2.5119mW，任选地，其中所述至少一种裸药剂是或者包括核酸。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述一个或多个电子装置包括以下的任一者或任意组合：用于控制所述电子装置的运转和/或一个或多个参数的控制工具和/或发射工具，用于在使用时向所述一个或多个装置提供电力的供电工具，一个或多个线路板，其上保存数据的记忆工具，用户用于允许用户选择所述装置的运转、一种或多种条件和/或一个或多个参数的选择工具，或用于展示一种或多种设置或者设置选项的展示工具。
19.如权利要求18所述的方法，其中能由用户选择的所述装置的一种或多种条件或参数包括以下的任一者或任意组合：所述脉冲电磁信号的信号频率、信号强度、信号或发射功率、每个脉冲的时间段或信号脉冲之间的静息期、信号脉冲率。
20.一种提高真核细胞转染效率和/或胞内递送的设备，所述设备包括壳体、位于所述壳体中并布置成在使用时发射脉冲电磁信号的发射工具、在使用时控制至少所述发射工具运转的控制工具和在使用时向所述发射工具和/或控制工具提供电力的供电工具，所述脉冲电磁信号以预定频率、预定脉冲率或预定功率的任一者或任意组合提供。
21.如权利要求20所述的设备，其中所述设备包含一个或多个发射工具或电子发射芯片，或者2个或更多发射工具或电子发射芯片。
22.如权利要求20或权利要求21所述的设备，其中所述设备包含至少一个发射工具或电子发射芯片/105-115cm2的所述装置的壳体表面或在使用时置于所述设备上的一个或多个物品表面。
23.如权利要求20-22中任一项所述的设备，其中所述设备包括多个发射工具或电子发射芯片且所述发射工具或电子发射芯片布置成彼此间隔一定距离，从而所述间隔距离等于脉冲电磁信号波长的约一半。
24.如权利要求20-23中任一项所述的设备，其中所述脉冲电磁信号的预定频率是约2.2-2.6GHz，约2.4GHz+/-50MHz或约2.45GHz+/-50MHz，
和/或
其中所述脉冲电磁信号的预定脉冲率是约50Hz或更小，约25Hz或更小，约15Hz或更小和/或工作周期小于2％，
和/或
其中脉冲电磁信号的各脉冲持续约1ms-20ms或是约1ms，
和/或
其中脉冲电磁信号的各脉冲之间的静息期持续约66ms或更少，
和/或
其中发射所述脉冲电磁信号的每个所述发射工具提供的预定功率是约+2dBm至+4dBm，约1mW，约2mW或约2.5119mW，
和/或
其中所述脉冲电磁信号用0.45-0.55的高斯频移键控(GFSK)发射。
25.如权利要求20-24中任一项所述的设备，其中所述脉冲电磁信号的预定频率是2.2-2.6GHz，2.4GHz+/-50MHz或2.45GHz+/-50MHz，其中预定脉冲率是约15Hz或更小和/或工作周期小于2％，且其中每个发射工具的预定功率是+2dBm至+4dBm，约1mW，约2mW或约2.5119mW。
26.如权利要求20-25中任一项所述的设备，其中提供附着工具用于在使用时允许将所述设备直接或间接可拆卸附着于用户上和/或与之毗邻。
27.如权利要求26所述的设备，其中所述附着工具包括以下的任一或任意组合：一个或多个带子、绳子、项链、坠子、带、手链、夹子、钥匙圈、挂带、
Figure FDA0003860455240000031
(钩环紧固)、按扣、钮扣、钮门、粘合剂、贴合剂、缝线、回形针和/或生物相容性粘合剂。
28.如权利要求20-27中任一项所述的设备，其中所述壳体包含外罩，其中至少所述设备的外罩由某一材料包被和/或形成，以允许设备在使用时可以植入人的身体或用户皮肤之下。
29.如权利要求20-28中任一项所述的设备，其中提供所述设备，具有至少一个盛放工具或储库，以盛放或包含至少一种裸药剂，其在使用时转染和/或经历胞内递送到一个或多个真核细胞或人。
30.如权利要求29所述的设备，其中所述盛放工具或储库布置于所述设备上，从而在使用时其可位于人的皮肤或一个或多个待转染或处理的真核细胞和/或与之毗邻，且在使用时所述脉冲电磁信号可以被指引到人的身体的一个或多个部分和/或真核细胞以协助改善药剂的吸收、递送和/或转染。
31.根据权利要求1-19中任一项所述的方法产生的细胞或其后代。
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