JPWO2021191623A5

JPWO2021191623A5 -

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Publication number: JPWO2021191623A5
Application number: JP2022558184A
Authority: JP
Publication date: 2024-03-29

Description

本発明は、真核細胞への試薬のトランスフェクション効率及び／又は細胞内送達効率の向上を実現するための装置並びにその使用方法に関する。本装置はまた、細胞のタンパク質発現を向上させるためにも使用することができる。

本出願人らは、意外にも、トランスフェクション前、その最中及び／又はその後にパルス化電磁（ＰＥＭ）信号を投与すると、トランスフェクション効率、細胞内送達効率及び／又はトランスフェクション及び／又は細胞内送達プロセスによって生み出されるタンパク質発現収率が有意に増加することを見出した。トランスフェクション率及び／又は細胞内送達率が有意に向上し、試薬及び／又は外因性核酸を納めるトランスフェクトされた又は処理された細胞の出現頻度の亢進を許容する。したがって、本発明は、細胞生存度、遺伝子導入、トランスフェクション率、細胞外環境から細胞内環境への１つ以上の試薬の細胞内送達及び／又はタンパク質産生を向上させる非侵襲性の非化学的な手法を提供する。本発明は、細胞にとって外部の環境から細胞の内側にある内部環境への細胞外（ｅｘｔｒａ－ｃｅｌｌｕｌａｒ）物質又は試薬の輸送を亢進させる。

一実施形態において、パルス化電磁信号の所与の周波数は約２．２～２．６ＧＨｚ、２．４ＧＨｚ±５０ＭＨｚ又は２．４５ＧＨｚ±５０ＭＨｚであり、所与のパルス率は約１５Ｈｚ以下であり、及び／又は２％未満のデューティサイクルを有し、及び所与の出力は＋２ｄＢｍ～＋４ｄＢｍ、約１ｍＷ、約２ｍＷ又は約２．５１１９ｍＷであり、及び更に任意選択で、少なくとも１つのネイキッド試薬が核酸であるか、又は核酸を含む。

したがって、一実施形態では、本装置を使用して患者の皮膚を通じてパルス化電磁信号を送達することにより、細胞のＤＮＡとの直接的な相互作用によって癌性細胞のアポトーシスを促進し、及び／又はＤＮＡ損傷が修復されるように健全な細胞を生み出すのを支援することができる。

図１ａ及び図１ｂに示される実施形態において、装置１は、患者の皮膚１２の表面に直接位置させるように例示される。この例では、装置１をユーザーの身体に着脱可能に取り付けるためのバンド１４の形態の取付手段が提供される。より詳細には、バンド１４が患者の腕又は肢に巻き付けられ、それにより筐体２が患者の皮膚の一部分に対して所要の位置に固定される。或いは、皮膚と接触することになる筐体の基面３には、それを患者の皮膚に所要の位置で付着させることを許容するように、その上に接着剤が提供されてもよい。使用時に装置１が操作されると、筐体２から発せられるパルス化電磁信号２２が患者の皮膚の少なくとも一部分に入り込み、恐らくは患者の身体の組織２４及び細胞に更に入り込む。

図６を参照すると、更なる実施形態に係るパルス化電磁信号を提供するための装置１０２の更なる例が示されている。本発明の一部の装置は、パルス化電磁信号を伝送するために単一の電子チップを含み得るが、図６は、パルス化電磁信号を伝送するために６個の電子チップ１０４のアレイを有する装置１０２を示す。図６は、電子チップ１０４を装置１０２の上にあるものとして示すが、これは単に明確にするためにこのように示されるに過ぎず、チップ１０４は実際には装置１０２の範囲内に納まっている。筐体２０４は、基部１０５と、基部１０５の反対側の上面１０７と、基部１０５と上面１０７との間に位置する側壁１０９（複数）とを含む。

６個の電子チップ１０４は、ある空間距離を離して装置１０２に提供される。チップ間の間隔は任意の所要の距離であり得るが、一例では、チップは、使用時に２４ウェルセルプレート１０６が装置の上面１０７に位置するとき、１個の伝送チップ１０４がウェルのうち４つの中心に位置するような間隔を離して置かれる。したがって、２４ウェルセルプレートにつき各電子チップ１０４が４つのウェルにパルス化電磁信号を指向させる。装置１０２上にはオン／オフ操作スイッチ１０８が提供され、使用時に装置をオン状態とオフ状態との間で動かす。

簡単な概要として、一例では、真核細胞とネイキッド核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はいずれかの小断片）とを合わせた分散体を含む物質が、一実施形態では装置１０２上に位置する培養容器、フラスコ又はディッシュなどの好適な容器に納められ、装置からパルス化電磁信号が発せられ、容器の壁を通じて物質内へと指向する。

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
２００ｎｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
２ｎｇＲｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド（英国ダンディー大学が作製）
２９３－Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ懸濁細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
２９３－Ｆｒｅｅ発現培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）

＜パルス化技術が試薬及び細胞混合物に対してのみ使用される場合の方法ステップ＞
１．トランスフェクション前日に６×１０5～７×１０5個の２９３－Ｆ細胞／ｍＬを播種する。
２．トランスフェクション当日に細胞数をカウントし、必要であれば密度が１×１０6細胞／ｍＬとなるように細胞を希釈する。
３．１５μｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド／フラスコを３０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地／フラスコでトランスフェクトする。
４．１：２のＤＮＡ：ＰＥＩ比を用いる。
５．製造者の指示に従い２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を用いる。（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／ＳＡＪ／Ｂｒｏｃｈｕｒｅ／２ＴＢ５５１５．ｐｄｆ）－ユーザープロトコルＴＢ５１５Ｒｅｖ．Ｂ０４１１ＪＮ［４］
６．ＤＮＡ－トランスフェクション混合物を調製するため：
－フラスコに２．４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを加える。
－フラスコに３０μｇのＧＦＰプラスミドを加える。
６０μＬの２９３－Ｆｒｅｅ発現培地を加える。
－得られた混合物容積を２つの１２５ｍＬエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコに分割し、各々に２８．８ｍＬの２９３発現培地中１×１０6細胞／ｍＬを納める；
－２つのフラスコを２つの別個のインキュベーターにおいてＢｅｌｌｙｄａｎｃｅｒオービタルシェーカー（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）上１２５ｒｐｍで８％ＣＯ2、３７℃にて培養する。フラスコのうちの一方は、インキュベーターのうちの一方において本発明に係るパルス化技術を用いて３時間パルスし、他方のフラスコは、第２のインキュベーターにおいていかなるパルス化技術もなしに培養する。３時間後、両方のフラスコとも、いかなるパルス化技術もない同じインキュベーターに配置することにより、必要に応じた長さの時間（この実験の場合は１２０時間）にわたって時間の経過に伴うトランスフェクション効率の測定を許容する。

＜消耗品＞
Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ低血清培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）
ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、英国）
２×２４ウェルプレートＮｕｎｃ（１．９ｃｍ2／ウェル）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、米国）
１μｇのＡｄＬｕｃプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
８０ｎｇＲｅｎｉｌｌａプラスミド／ウェル（ルシフェラーゼ発現プラスミド／ＤＮＡ）（英国ダンディー大学が作製）
ＡｌｆａＡｅｓａｒ（商標）ポリエチレンイミン、線状、分子量２５，０００（ＰＥＩ）（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）
ＴｒａｎｓＩＴ２０２０（ＭｉｒｕｓＢｉｏ、米国）

＜対照－ＴｒａｎｓＩＴ２０２０を使用＞
１．７００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を第１のチューブ内で１３μｇのＡｄＬｕｃプラスミド及び１μｇのＲｅｎｉｌｌａプラスミドと混合した；
２．４２μＬのＴｒａｎｓＩＴ２０２０を加え、Ｖｏｒｔｅｘ－Ｇｅｎｉｅ２、モデルＧ５６０Ｅ、（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、米国）を使用してボルテックスすることにより混合した；
３．トランスフェクション混合物を室温（約２０℃）で１５分間培養した
４．５０μＬのこの培養したトランスフェクション混合物を、２つの２４ウェルプレート（プレート１及び２）の各々のＣ１～Ｃ６と名付けたウェルに分注した。

表６を参照すると、表の各値が、３レプリケートの平均を表している。トランスフェクション複合体のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の１．７倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物のみがパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．０倍の増加が認められた。トランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方がパルス化技術を受けたとき、トランスフェクション効率の２．３倍の増加が認められた。したがって、本発明に係るパルス化技術を用いると、トランスフェクション混合物又はトランスフェクション複合体単独に対して使用したときのいずれも、トランスフェクション効率が有意に増加したが、パルス化技術をトランスフェクション混合物及びトランスフェクション複合体の両方に適用したとき、トランスフェクション効率の更なる増加が認められたと結論付けることができる。