JPWO2021014958A5 - - Google Patents
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Description
＜アミノ基のジメチル化＞
上述した副反応を抑制するため、糖ペプチドまたは糖タンパク質のアミノ基を化学修飾で先にブロックしておくことを行った。乾固した糖タンパク質の消化物に、20μＬの100mM 重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）緩衝溶液（pH 8.5）を加えた。上記消化物をボルテックスミキサーを用いて溶解させた後、溶液に1.6μＬの2% ホルムアルデヒド水溶液を加え、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした。スピンダウンした後の溶液に、1.6μＬの300mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を加え、室温でボルテックスミキサーを用いて軽く混合しながら1時間反応させた。反応後の溶液に、3.2μＬの1%アンモニア水を加えてクエンチし、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした。スピンダウンした後の溶液に1.6μＬのギ酸を加え、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした後、72μＬの水を加え、脱塩用担体を用いて脱塩精製および余剰試薬の除去を行った。
上述した副反応を抑制するため、糖ペプチドまたは糖タンパク質のアミノ基を化学修飾で先にブロックしておくことを行った。乾固した糖タンパク質の消化物に、20μＬの100mM 重炭酸トリエチルアンモニウム（TEAB）緩衝溶液（pH 8.5）を加えた。上記消化物をボルテックスミキサーを用いて溶解させた後、溶液に1.6μＬの2% ホルムアルデヒド水溶液を加え、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした。スピンダウンした後の溶液に、1.6μＬの300mM シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液を加え、室温でボルテックスミキサーを用いて軽く混合しながら1時間反応させた。反応後の溶液に、3.2μＬの1%アンモニア水を加えてクエンチし、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした。スピンダウンした後の溶液に1.6μＬのギ酸を加え、ボルテックスミキサーを用いて軽く混合してスピンダウンした後、72μＬの水を加え、脱塩用担体を用いて脱塩精製および余剰試薬の除去を行った。
低m/z領域を拡大して示したMS2スペクトル（図９）では、結合様式特異的修飾によってメチルアミド化されたα2,3-シアル酸に由来する非脱水オキソニウムイオン（m/z 305）および脱水オキソニウムイオン（m/z 287）、ならびに、イソプロピルアミド化されたα2,6-シアル酸に由来する非脱水オキソニウムイオン（m/z 333）および脱水オキソニウムイオン（m/z 315）が観測された。α2,6-シアル酸しか含まない糖ペプチドAからは上記m/z 333とm/z 315のピークＯｉ，Ｄｉに対応するイオンが、α2,3-シアル酸とα2,6-シアル酸の両方を含む糖ペプチドBおよびCからはそれらに加えて上記m/z 305とm/z 287のピークＯｍ，Ｄｍに対応するイオンも観測された。このことから、シアル酸の結合様式に応じて異なったオキソニウムイオンが生じていることが分かる。さらに、α2,3-シアル酸に由来するオキソニウムイオンとα2,6-シアル酸に由来するオキソニウムイオンの比は、そのプリカーサイオンに含まれるα2,3-/α2,6-比をおおよそ反映している。
Claims (11)
- それぞれ異なる修飾がされた複数のシアル酸を有する糖鎖を含む試料の第１質量分析において、前記複数のシアル酸のそれぞれに由来する複数のオキソニウムイオンの検出を行うことと、
前記検出で得られたデータに基づいて、前記複数のオキソニウムイオンの強度の相対値を算出することとを備える質量分析方法。 - 請求項１に記載の質量分析方法において、
前記複数のシアル酸は、アミド修飾される、質量分析方法。 - 請求項１または２に記載の質量分析方法において、
前記第１質量分析は、２段階以上のタンデム質量分析により行われる、質量分析方法。 - 請求項１～３までのいずれか一項に記載の質量分析方法において、
シアル酸を有する糖鎖を含む試料を用意することと、
前記糖鎖に含まれる、それぞれ異なる結合様式の複数のシアル酸を結合様式特異的に修飾することとを備え、
修飾された前記複数のシアル酸を有する前記糖鎖を含む前記試料の前記第１質量分析が行われる質量分析方法。 - 請求項４に記載の質量分析方法において、
α２，３－シアル酸、α２，８－シアル酸またはα２，９－シアル酸と、α２，６－シアル酸とにそれぞれ異なる修飾がされる、質量分析方法。 - 請求項４または５に記載の質量分析方法において、
前記相対値に基づいて、前記試料に含まれる糖鎖における、結合様式の異なる複数のシアル酸の数の比を算出する、質量分析方法。 - 請求項１に記載の質量分析方法において、
前記第１質量分析の前に前記試料のクロマトグラフィーを行うことを備える、質量分析方法。 - 請求項７に記載の質量分析方法において、
前記複数のオキソニウムイオンの少なくとも一つに対応するピークを含む抽出イオンクロマトグラムを出力することを備える質量分析方法。 - 請求項７または８に記載の質量分析方法において、
走査させたｍ／ｚに基づいて前記試料のイオン化により生成されたイオンの質量分離を行い、質量分離された前記イオンの解離を行い、前記解離により生成されたイオンからオキソニウムイオンを検出する第２質量分析を行うことと、
前記第２質量分析の結果に基づいて、検出された前記オキソニウムイオンが由来する糖鎖を含む分子が前記クロマトグラフィーにおいて溶出される時間および前記分子の質量の少なくとも一つを得ることとを備える質量分析方法。 - それぞれ異なる修飾がされた複数のシアル酸を有する糖鎖を含む試料の第１質量分析において、前記複数のシアル酸にそれぞれ由来する複数のオキソニウムイオンを検出して得られたデータを取得するデータ取得部と、
前記データに基づいて、前記複数のオキソニウムイオンの強度の相対値を算出する算出部と
を備える質量分析装置。 - それぞれ異なる修飾がされた複数のシアル酸を有する糖鎖を含む試料の第１質量分析において、前記複数のシアル酸にそれぞれ由来する複数のオキソニウムイオンを検出して得られたデータを取得するデータ取得処理と、
前記データに基づいて、前記複数のオキソニウムイオンの強度の相対値を算出する算出処理とを処理装置に行わせるためのプログラム。
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