JPWO2020160414A5

JPWO2020160414A5 -

Info

Publication number: JPWO2020160414A5
Application number: JP2021544183A
Authority: JP
Publication date: 2023-02-08

Description

本明細書に開示される方法の様々なステップまたは本明細書に開示されるシステムによって実施されるステップは、同じ時期もしくは異なる時期、および／または同じ地理的場所もしくは異なる地理的場所、例えば国において実施され得る。本明細書に開示される方法の様々なステップは、同じ人または異なる人々によって実施することができる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を単離する方法であって、
試験対象から得たｃｆＤＮＡの複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが産生され、前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットにおいて、前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも高い捕捉収率で捕捉される、ステップ
を含む、方法。
（項目２）
無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を単離する方法であって、
試験対象から得たｃｆＤＮＡに標的特異的プローブセットを接触させるステップであって、前記標的特異的プローブセットが、配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブおよびエピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブを含み、前記標的特異的プローブセットが、前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡを、前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡよりも高い捕捉収率で捕捉するように構成され、標的特異的プローブとｃｆＤＮＡとの複合体が形成される、ステップ、ならびに
標的特異的プローブに結合していないｃｆＤＮＡから前記複合体を分離し、それによって捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットを提供するステップ
を含む、方法。
（項目３）
前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットを、前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記ｃｆＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングするステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
腫瘍によって産生されたＤＮＡの存在を同定する方法であって、
試験対象からｃｆＤＮＡを収集するステップ、
前記ｃｆＤＮＡから複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが産生される、ステップ、
前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、ステップ
を含む、方法。
（項目５）
前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子より少なくとも２倍高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、項目３から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、シーケンシング前に前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子と共にプールされる、項目３から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子および前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、同じシーケンシングセルにおいてシーケンシングされる、項目３から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｃｆＤＮＡが捕捉前に増幅され、必要に応じて前記ｃｆＤＮＡの増幅が、バーコード含有アダプターを前記ｃｆＤＮＡにライゲーションするステップを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記エピジェネティック標的領域セットが、高メチル化可変標的領域セットを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記エピジェネティック標的領域セットが、低メチル化可変標的領域セットを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記エピジェネティック標的領域セットが、断片化可変標的領域セットを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記断片化可変標的領域セットが、転写開始部位領域を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記断片化可変標的領域セットが、ＣＴＣＦ結合領域を含む、項目１１または１２に記載の方法。
（項目１４）
ｃｆＤＮＡの前記複数の標的領域セットを捕捉するステップが、前記ｃｆＤＮＡに、前記配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブを接触させるステップを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブが、前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブより高濃度で存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブが、前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブより少なくとも４倍または５倍高い濃度で存在する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記エピジェネティック標的領域セットのフットプリントが、前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも２倍大きい、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記エピジェネティック標的領域セットのフットプリントが、前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも１０倍大きい、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記試験対象から得た前記ｃｆＤＮＡが、メチル化レベルに基づいて少なくとも２つの分画に分配され、前記方法のその後のステップが各分画について実施される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記少なくとも２つの分画が、高メチル化分画および低メチル化分画を含み、前記方法が、前記高メチル化分画および前記低メチル化分画を示差的にタグ付けするステップ、または前記高メチル化分画および前記低メチル化分画を別個にシーケンシングするステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記高メチル化分画および前記低メチル化分画が示差的にタグ付けされ、前記方法が、シーケンシングステップの前に、示差的にタグ付けされた前記高メチル化分画および示差的にタグ付けされた前記低メチル化分画をプールするステップをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子ががん関連変異を含むか否かを決定するステップをさらに含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、がん関連エピジェネティック改変またはコピー数変動（例えば、局所的増幅）を含むかまたは示すかを決定するステップをさらに含み、前記方法は、必要に応じて前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子ががん関連エピジェネティック改変およびコピー数変動（例えば、局所的増幅）を含むかまたは示すかを決定するステップを含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記がん関連エピジェネティック改変が、１つまたは複数の高メチル化可変標的領域において高メチル化を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記がん関連エピジェネティック改変が、ＣＴＣＦ結合の１つまたは複数の摂動を含む、項目２３または２４に記載の方法。
（項目２６）
前記がん関連エピジェネティック改変が、転写開始部位の１つまたは複数の摂動を含む、項目２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブおよびエピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブを含む、腫瘍細胞によって産生されたｃｆＤＮＡを捕捉するための標的特異的プローブの収集物であって、前記配列可変標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブの捕捉収率が、前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブの捕捉収率より少なくとも２倍高い、標的特異的プローブの収集物。
（項目２８）
前記配列可変標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブの捕捉収率が、前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な前記標的結合プローブの捕捉収率より少なくとも４倍または５倍高い、項目２７に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目２９）
前記エピジェネティック標的領域セットが、高メチル化可変標的領域プローブセットを含む、項目２７または２８に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３０）
前記エピジェネティック標的領域セットが、低メチル化可変標的領域プローブセットを含む、項目２７から３０のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３１）
エピジェネティック標的領域プローブセットが、断片化可変標的領域プローブセットを含む、項目２７から３０のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３２）
前記断片化可変標的領域プローブセットが、転写開始部位領域プローブを含む、項目３１に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３３）
前記断片化可変標的領域プローブセットが、ＣＴＣＦ結合領域プローブを含む、項目３１または３２に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３４）
前記配列可変標的領域セットに少なくとも１０個の領域が存在し、前記エピジェネティック標的領域セットに少なくとも１００個の領域が存在する、項目２７から３３のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３５）
前記エピジェネティック標的領域セットのフットプリントが、前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも２倍大きい、項目２７から３４のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３６）
前記エピジェネティック標的領域セットのフットプリントが、前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも１０倍大きい、項目３５に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３７）
前記配列可変標的領域セットのフットプリントが、少なくとも２５ｋＢまたは５０ｋＢである、項目２７から３６のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３８）
前記プローブが単一の溶液中に存在する、項目２７から３７のいずれか一項に記載の標的特異的プローブの収集物。
（項目３９）
捕捉されたｃｆＤＮＡを含む組成物であって、前記捕捉されたｃｆＤＮＡが、捕捉された配列可変標的領域および捕捉されたエピジェネティック標的領域を含み、前記配列可変標的領域の濃度が、前記エピジェネティック標的領域の濃度より高く、前記濃度が前記配列可変標的領域および前記エピジェネティック標的領域のフットプリントサイズに関して正規化されている、組成物。
（項目４０）
前記捕捉されたｃｆＤＮＡが配列タグを含む、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
前記配列可変標的領域の濃度が、前記エピジェネティック標的領域の濃度より少なくとも４倍または５倍高い、項目３９から４０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記エピジェネティック標的領域が、高メチル化可変標的領域、低メチル化可変標的領域、転写開始部位領域、およびＣＴＣＦ結合領域のうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含み、必要に応じて前記エピジェネティック標的領域がメチル化対照標的領域をさらに含む、項目３９から４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
対象ががんを有する可能性を決定する方法であって、
ａ．試験対象からｃｆＤＮＡを収集するステップ；
ｂ．前記ｃｆＤＮＡから複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが産生される、ステップ；
ｃ．前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、ステップ；
ｄ．前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子をシーケンシングするステップから、核酸シーケンサーによって生成された複数の配列リードを得るステップ；
ｅ．前記複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピングされた配列リードを生成するステップ；
ｆ．前記配列可変標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードを処理して、前記対象ががんを有する可能性を決定するステップ
を含む、方法。
（項目４４）
以下：
通信ネットワークを通して、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットをシーケンシングするステップから、核酸シーケンサーによって生成された複数の配列リードを受信する通信インターフェースであって、前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが、ｃｆＤＮＡ試料から複数の標的領域セットを捕捉することによって得られ、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、前記配列可変標的領域に対応する前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、通信インターフェース；ならびに
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に、
（ｉ）前記通信ネットワークを通して、前記核酸シーケンサーによって生成された前記配列リードを受信するステップ；
（ｉｉ）前記複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピングされた配列リードを生成するステップ；
（ｉｉｉ）前記配列可変標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードを処理して、対象ががんを有する可能性を決定するステップ
を含む方法を実行する非一過性コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることが可能なコントローラー
を含む、システム。
（項目４５）
前記試験対象ががんを有するとすでに診断されて１つまたは複数の以前のがん処置を受けており、必要に応じて前記ｃｆＤＮＡが前記１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で得られ、前記方法が、前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットをシーケンシングするステップであって、配列情報セットが産生される、ステップを含む、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの捕捉されたＤＮＡ配列よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、前述の項目に記載の方法。
（項目４７）
前記配列情報セットを使用して予め選択された時点で腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡの存在または非存在を検出するステップをさらに含む、項目４６または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記試験対象の前記腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来する前記ＤＮＡの存在または非存在を示すがん再発スコアを決定するステップをさらに含み、必要に応じて前記がん再発スコアに基づいてがん再発状態を決定するステップをさらに含み、がん再発スコアが既定の閾値であるかもしくはそれより上であると決定される場合、前記試験対象の前記がん再発状態はがん再発のリスクがあると決定され、または前記がん再発スコアが前記既定の閾値より下である場合、前記試験対象の前記がん再発状態はがん再発のリスクが低いと決定される、前述の項目に記載の方法。
（項目４９）
前記試験対象の前記がん再発スコアを、既定のがん再発閾値と比較するステップをさらに含み、前記がん再発スコアが前記がん再発閾値より上である場合、前記試験対象はその後のがん処置の候補として分類され、または前記がん再発スコアが前記がん再発閾値より下である場合、前記試験対象はその後のがん処置の候補ではないと分類される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
試験対象におけるがん再発のリスクを決定する方法であって、
（ａ）がんを有すると診断された前記試験対象からの腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡを、前記試験対象に対する１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で収集するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡから複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたＤＮＡ分子セットが産生される、ステップ；
（ｃ）前記捕捉されたＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされ、配列情報セットが産生される、ステップ；
（ｄ）前記配列情報セットを使用して予め選択された時点で腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡの存在または非存在を検出するステップ；ならびに
（ｅ）前記試験対象の前記腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来する前記ＤＮＡの存在または非存在を示すがん再発スコアを決定するステップであって、前記がん再発スコアが既定の閾値であるかもしくはそれより上であると決定される場合、前記試験対象のがん再発状態はがん再発のリスクがあると決定され、または前記がん再発スコアが前記既定の閾値より下である場合、前記試験対象の前記がん再発状態はがん再発のリスクが低いと決定される、ステップ
を含む、方法。
（項目５１）
試験対象をその後のがん処置の候補であると分類する方法であって、
（ａ）がんを有すると診断された前記試験対象からの腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡを、前記試験対象に対する１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で収集するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡから複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたＤＮＡ分子セットが産生される、ステップ；
（ｃ）前記ＤＮＡ分子セットから複数の捕捉されたＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされ、配列情報セットが産生される、ステップ；
（ｄ）前記配列情報セットを使用して１つまたは複数の予め選択された時点で腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来するＤＮＡの存在または非存在を検出するステップ；
（ｅ）前記腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来する前記ＤＮＡの存在または非存在を示すがん再発スコアを決定するステップ；ならびに
（ｆ）前記試験対象の前記がん再発スコアを既定のがん再発閾値と比較し、それによって、前記がん再発スコアが前記がん再発閾値より上である場合、前記試験対象を前記その後のがん処置の候補であると分類し、または前記がん再発スコアが前記がん再発閾値より下である場合、前記試験対象を治療の候補ではないと分類するステップ
を含む、方法。
（項目５２）
腫瘍細胞を起源とするまたはそれに由来する前記ＤＮＡが無細胞ＤＮＡである、項目５０から５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記がん再発スコアに基づいて前記試験対象の無病生存（ＤＦＳ）期間を決定するステップをさらに含む、項目４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記配列情報セットが、配列可変標的領域配列を含み、前記がん再発スコアを決定するステップが、配列可変標的領域配列に存在するＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ、および／または融合の量を示す少なくとも第１のサブスコアを決定するステップを含む、項目４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記配列情報セットが、エピジェネティック標的領域配列を含み、前記がん再発スコアを決定するステップが、前記エピジェネティック標的領域配列における異常な配列リードの量を示す第２のサブスコアを決定するステップを含む、項目４５から５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
腫瘍細胞を起源とすることを示す、１つまたは複数の特色を示す前記配列情報セットにおけるリードの割合から腫瘍ＤＮＡの割合を決定するステップをさらに含む、項目４５から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記腫瘍ＤＮＡの割合に少なくとも部分的に基づいてがん再発スコアを決定するステップをさらに含み、１０ ^－１１～１または１０ ^－１０～１の範囲の既定の値より大きいまたはそれに等しい腫瘍ＤＮＡの割合が、前記がん再発スコアをがんの再発に関して陽性であると分類するために十分である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記配列情報セットが、配列可変標的領域配列およびエピジェネティック標的領域配列を含み、前記がん再発スコアを決定するステップが、配列可変標的領域配列に存在するＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ、および／または融合の量を示す第１のサブスコアと、エピジェネティック標的領域配列における異常な配列リードの量を示す第２のサブスコアとを決定するステップ、ならびに前記第１のサブスコアおよび前記第２のサブスコアを組み合わせて前記がん再発スコアを提供するステップを含む、項目４５から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記第１のサブスコアおよび前記第２のサブスコアを組み合わせるステップが、閾値（例えば、配列可変標的領域における変異の既定の数（例えば、＞１）より大きい、およびエピジェネティック標的領域における異常な（例えば、腫瘍）リードの既定の割合より大きい）を各々のサブスコアに独立して適用するステップを含むか、または機械学習分類器を訓練して複数の陽性および陰性訓練試料に基づいて状態を決定するステップを含む、項目５８に記載の方法。

Claims

対象ががんを有する可能性を決定する方法であって、
ａ．メチル結合ドメインを使用して、試験対象から得られたｃｆＤＮＡをメチル化レベルに基づき２つまたはそれより多くの分画に分配するステップ；
ｂ．前記ｃｆＤＮＡから複数の標的領域セットを捕捉するステップであって、前記複数の標的領域セットが、配列可変標的領域セットおよびエピジェネティック標的領域セットを含み、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが産生され、前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子は、前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子よりも高い捕捉収率で前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットにおいて捕捉される、ステップ；
ｃ．前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子をシーケンシングするステップであって、前記配列可変標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子よりも高いシーケンシング深度までシーケンシングされる、ステップ；
ｄ．前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子をシーケンシングするステップから、核酸シーケンサーによって生成された複数の配列リードを得るステップ；
ｅ．前記複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピングされた配列リードを生成するステップ；
ｆ．前記配列可変標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードを処理して、前記対象ががんを有する可能性を決定するステップ
を含む、方法。
前記ｃｆＤＮＡが、前記捕捉するステップの前および／または後に増幅され、必要に応じて、ｃｆＤＮＡ増幅は、バーコード含有アダプターを前記ｃｆＤＮＡにライゲーションするステップを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記２つまたはそれより多くの分画が、
ｉ）示差的にタグ付けされ、集合的な試料調製および／またはシーケンシングのために共にプールされる、および／または
ｉｉ）高メチル化および低メチル化分画を含む、
請求項１または請求項２に記載の方法。
前記ｃｆＤＮＡの複数の標的領域セットを捕捉するステップが、前記ｃｆＤＮＡに、前記配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブを接触させることを含み、例えば、前記配列可変標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブは、
ｉ）前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブより高濃度、例えば、（ａ）少なくとも２倍高い濃度、または（ｂ）少なくとも４倍または５倍高い濃度で存在する、および／または
ｉｉ）前記エピジェネティック標的領域セットに対して特異的な標的結合プローブよりも高い標的結合親和性を有する、
前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記配列可変標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、シーケンシング前に前記エピジェネティック標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子と共にプールされる、および／または前記配列可変標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子および前記エピジェネティック標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、同じシーケンシングセルにおいてシーケンシングされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記エピジェネティック標的領域セットが、
ｉ）高メチル化可変標的領域セット、
ｉｉ）低メチル化可変標的領域セット、
ｉｉｉ）メチル化対照標的領域セット、および／または
ｉｖ）断片化可変標的領域セットであって、例えば、転写開始部位領域および／またはＣＴＣＦ結合領域を含む、断片化可変標的領域セット
を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）前記配列可変標的領域セットが、少なくとも１０、２０、３０、または３５個のがんに関係する遺伝子からの標的領域を含む、および／または
ｉｉ）前記配列可変標的領域セットのフットプリントが、少なくとも２５ｋＢまたは５０ｋＢである、
前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記エピジェネティック標的領域セットのフットプリントが、
ｉ）前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも２倍大きい、または
ｉｉ）前記配列可変標的領域セットのサイズより少なくとも１０倍大きい、
前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記配列可変標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子が、前記エピジェネティック標的領域セットの捕捉されたｃｆＤＮＡ分子より
ｉ）少なくとも２倍高いシーケンシング深度、
ｉｉ）少なくとも３倍高いシーケンシング深度、
ｉｉｉ）４～１０倍高いシーケンシング深度、または
ｉｖ）４～１００倍高いシーケンシング深度
までシーケンシングされる、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記配列可変標的領域セットに少なくとも１０個の領域が存在し、前記エピジェネティック標的領域セットに少なくとも１００個の領域が存在する、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）前記配列可変標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子ががん関連変異を含むか決定するステップ；および／または
ｉｉ）前記エピジェネティック標的領域セットに対応するｃｆＤＮＡ分子が、がん関連エピジェネティック改変および／またはコピー数変動（例えば、局所的増幅）を含むかまたは示すかを決定するステップであって、例えば、前記がん関連エピジェネティック改変は、１つもしくは複数の高メチル化可変標的領域における高メチル化、ＣＴＣＦ結合の１つもしくは複数の摂動、および／または転写開始部位の１つもしくは複数の摂動を含む、ステップ
をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記メチル結合ドメインが、固相支持体上に固定される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
以下：
通信ネットワークを通して、捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットをシーケンシングするステップから、核酸シーケンサーによって生成された複数の配列リードを受信する通信インターフェースであって、前記捕捉されたｃｆＤＮＡ分子セットが、請求項１のステップ（ａ）および（ｂ）に従って得られる、通信インターフェース；ならびに
少なくとも１つの電子プロセッサーによって実行された場合に、
（ｉ）前記通信ネットワークを通して、前記核酸シーケンサーによって生成された前記配列リードを受信するステップ；
（ｉｉ）前記複数の配列リードを１つまたは複数の参照配列にマッピングして、マッピングされた配列リードを生成するステップ；
（ｉｉｉ）前記配列可変標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードおよび前記エピジェネティック標的領域セットに対応する前記マッピングされた配列リードを処理して、対象ががんを有する可能性を決定するステップ
を含む方法を実行する非一過性コンピュータ実行可能命令を含むコンピュータ可読媒体を含むかまたはそれにアクセスすることが可能なコントローラー
を含む、システム。
前記試験対象ががんを有するとすでに診断されており、必要に応じて、前記試験対象は、１つまたは複数の以前のがん処置を受けたことがあり、さらに必要に応じて、前記ｃｆＤＮＡが、前記１つまたは複数の以前のがん処置後の１つまたは複数の予め選択された時点で得られている、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。